Bioquimica manual

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA

Departamento de Formación Básica Disciplinaria

Academia de Bioquímica Médica I

MANUAL DE LABORATORIO

DE

B I O Q U Í M I C A M É D I C A I

SEMESTRE: AGOSTO 2015 - ENERO 2016

M É X I C O , D . F .

2 0 1 5

DEPTO. DE FORMACIÓN BÁSICA DISCIPLINARIA ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA, IPN

MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA MÉDICA I

AGOSTO 2015 - ENERO 2016

= =

I

NOMBRE DEL ALUMNO(A):

GRUPO: 2CM8 EQUIPO:

PROFESORES

LABORATORIO: DR. FELICIANO TAMAY CACH

LABORATORIO: DRA. MÓNICA ORDORICA MORALES

LABORATORIO: DRA. MÓNICA YOSEFIT HERNÁNDEZ HINOJOSA

No. PRÁCTICA FECHA Vo. Bo.

PROFESOR (A)

1. 07-SEPTIEMBRE-2015



4. 12-OCTUBRE-2015

5. 19-OCTUBRE-2015

6. 26-OCTUBRE-2015

7. 23-NOVIEMBRE-2015

8. 30-NOVIEMBRE-2015

9. 07-DICIEMBRE-2015




= =

II

PROFESORES DE LA ACADEMIA

Alfredo Montiel Márquez

Argentina Hernández Ramos

Arturo Díaz Martínez

Carlos Castañeda González

Cristina López Gloria

Eunice Dalet Farfán García

Feliciano Tamay Cach

Francisco Javier Castañeda Ibarra

Io Stephanie Zamudio Vega

Jessica Elena Mendieta Wejebe

José Guadalupe Trujillo Ferrara

Juan Guillermo Ordorica Vargas

Leticia Araceli Ramírez Durán

Luz María Chirino Castillo

María De La Luz Velázquez Monroy

Miguel Angel Ordorica Vargas

Mónica Ordorica Morales

Mónica Yosefit Hernández Hinojosa

Reyna Elizabeth Barbosa Cabrera

Sandra Gissela Márquez Ramírez

PERSONAL TÉCNICO DE LABORATORIO

José Luis Martínez Vásquez

Julio César Aguilar Rentería




= =

III

MISIÓN

La Escuela Superior de Medicina del Instituto Politécnico Nacional es una institución de educación médica,

pública, laica y gratuita, con un legado histórico identificado con las necesidades de salud de la población

más desprotegida; cuenta con una planta de destacados profesores, instalaciones físicas y campos clínicos,

que garantizan una sólida formación médica. Forma médicos generales de alta calidad, creativos y eficientes;

con compromiso social, humanitario, de equidad, ético, ecológico y crítico, tanto en el sector público como

en el privado, contribuyendo a mejorar las condiciones de salud y de desarrollo social de la población.

Realiza investigación científica, genera y difunde el conocimiento y fomenta la educación médica continua y

el posgrado. Apoya al Sistema Nacional de Salud y participa en el desarrollo científico, tecnológico y social

del país.

VISIÓN

La Escuela Superior de Medicina del Instituto Politécnico Nacional, mantendrá su carácter de institución

pública de educación médica con sólidas bases en el conocimiento científico y tecnológico, en constante

actualización e innovación, en un marco de calidad, equidad y servicio. Incrementará desarrollo de la

investigación científica, el posgrado y la educación médica continua, manteniendo una vinculación con los

procesos formativos de los profesionales de la salud de alto nivel, para destacar dentro de las Escuelas y

Facultades de Medicina del país por la formación de médicos generales de alta calidad que conforme al

panorama epidemiológico sean competentes para atender los problemas de salud y la emergencia de nuevas

patologías, básicamente en el primer nivel de atención, contribuyendo así a mejorar la salud y el desarrollo

social de la población en constante interacción con todos los sectores de la sociedad. Continuará participando

en la rectoría de la educación médica en el país, en el desarrollo científico y reafirmando su compromiso con

la población más desprotegida, guiada siempre por un desarrollo basado en la calidad humana, la ética y la

excelencia académica.




= =

IV

CALENDARIO DE ACTIVIDADES

CURSO DE BIOQUÍMICA MÉDICA I

PRIMER SEMESTRE 2015-2016


FECHA DE INICIO: Martes, 1 septiembre de 2015

FECHA DE TERMINACIÓN: Martes, 19 de enero de 2016

DÍAS DE SUSPENSIÓN: Miércoles, 16 de septiembre de 2015

Lunes, 2 de noviembre de 2015

Lunes, 16 de noviembre de 2015

VACACIONES Lunes 21 de diciembre de 2015 al miércoles 6 de enero de 2016

EXÁMENES

Primer Examen Parcial: Miércoles, 7 de octubre de 2015

Temas de teoría: 1. Composición Química del Organismo Humano

2. Agua, Soluciones, Ácidos, Bases, pH y Soluciones Reguladoras

3. Estructura y Función de Proteínas

Prácticas de laboratorio: 1. Introducción 7 al 11 de septiembre de 2015

2. Soluciones 21 al 25 de septiembre de 2015

3. Proteínas 28 de septiembre al 2 de octubre de 2015

Segundo Examen Parcial: Miércoles, 18 de noviembre de 2015

Temas de teoría: 4. Termodinámica, Catálisis y Enzimas

5. Estructura, Función y Metabolismo de Glúcidos

Prácticas de Laboratorio: 4. Cinética Química 12 al 16 de octubre de 2015

5. Cinética Enzimática 19 al 23 de octubre de 2015

6. Glúcidos 26 al 30 de octubre de 2015

Tercer Examen Parcial: Miércoles, 13 de enero de 2016

Temas de teoría: 6. Bioenergética y Ciclo del ácido Cítrico

7. Estructura Función y Metabolismo de Lípidos.

8. Estructura y Función de Ácidos Nucleicos y Genética Molecular.

Prácticas de Laboratorio: 7. Oxidaciones Biológicas 23 al 27 de noviembre de 2015

8. Lípidos 30 de noviembre al 4 de diciembre

9. Ácidos Nucleicos 7 al 11 de diciembre de 2015

Examen Extraordinario: Lunes, 18 de enero de 2016

Temas: Todo el curso

Examen a Título de

Suficiencia:

Lunes, 25 de enero de 2016

Temas: Todo el curso




= =

V

Reglamento Interno de la Materia

CAPITULO I. DE LA INSCRIPCIÓN Y ORGANIZACIÓN DE

LOS ALUMNOS

Artículo 1. La materia de Bioquímica Médica I es impartida

por los profesores de la Academia de Bioquímica Médica I

del Departamento de Formación Básica Disciplinaria.

Artículo 2. Para quedar inscritos y tener derecho a asistir al

curso, los alumnos deberán:

a) Aparecer en las listas oficiales del Sistema Institucional

de Gestión y Unificación Escolar del IPN.

b) Llenar y entregar una forma de registro y control interno

que les proporcionarán los profesores de grupo el primer

día de clases.

c) Entregar una fotografía reciente, de tamaño infantil.

Artículo 3. Los incisos b y c mencionados en el artículo

anterior, deben cumplirse a más tardar una semana después

de iniciado el curso.

Artículo 4. Cada grupo deberá elegir en la primera semana

de clases un representante, que será su vocero oficial, quien

tratará los asuntos académicos relacionados con el curso ante

sus profesores o la Academia.

CAPÍTULO II. DE LA ORGANIZACIÓN DEL CURSO

Artículo 5. El curso de Bioquímica Médica I es Teórico-

Práctico y se desarrolla mediante tres tipos de actividades:

a) Clases de Teoría. Se imparten en las aulas de la Escuela

Superior de Medicina, asignadas a cada grupo al inicio del

curso.

b) Prácticas de Laboratorio. Que se realizan en los

Laboratorios de enseñanza de la Academia de

Bioquímica Médica I.

c) Actividades complementarias. Las que sean asignadas por los

profesores, y que complementen las actividades académicas.

Artículo 6. En las clases de Teoría se desarrollan los temas

del programa con la participación activa de los alumnos.

Artículo 7. En las prácticas de Laboratorio los alumnos

realizan experimentos sobre temas que complementan la

teoría, y resuelven problemas aplicativos.

Artículo 8. Las actividades complementarias, versarán sobre

tópicos de interés para la formación de los alumnos.

CAPITULO III. DE LA ASISTENCIA

Artículo 9. Como se indica en los incisos IV y VI del

artículo 107 del Reglamento Interno del I.P.N., es obligación

de los alumnos asistir con puntualidad y regularidad a las

clases de teoría y prácticas de laboratorio en los horarios que

les serán notificados al inicio del curso.

Artículo 10. Los profesores controlarán la asistencia a clases

de teoría y laboratorio, llamando lista de presentes al inicio de las sesiones, con un periodo de tolerancia de 15 minutos.

No hay retardos. En las sesiones de laboratorio, los alumnos

que lleguen después del periodo de tolerancia no podrán

permanecer en la sesión.

Artículo 11. Los alumnos (damas y caballeros) asistirán de

manera obligatoria a las clases de teoría, prácticas de

laboratorio y exámenes con uniforme blanco que incluye bata,

pantalón, zapato cerrado (no tenis) y sin ningún tipo de

accesorio o prenda así como portando en la solapa izquierda

del uniforme su credencial de alumno vigente, como lo marca

el inciso VII del artículo 107 del Reglamento Interno del

I.P.N. Quien no cumpla con este requisito no podrá

permanecer en la sesión, y se hará acreedor a la falta

correspondiente.

Artículo 12. Durante las sesiones tanto de Teoría como

Laboratorio, los alumnos deberán activar el modo silencioso

de sus teléfonos celulares, para no interrumpir el trabajo.

Artículo 13. Las inasistencias a teoría y laboratorio se podrán

justificar dentro de los tres días hábiles siguientes, con la

documentación oficial pertinente. Debido a la falta de

recursos, en caso de no asistir al laboratorio, el alumno

podrá justificar la falta pero no reponer la práctica.

Artículo 14. Las actividades de otras materias, realizadas en

el horario correspondiente a Bioquímica Médica I, no se

consideran justificantes de falta.

CAPÍTULO IV. DEL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Artículo 15. Por razones de disciplina y seguridad, ninguna

persona podrá trabajar en el laboratorio sin bata larga de

laboratorio blanca. El alumno que no cumpla este requisito deberá

abandonar el recinto y se hará acreedor a la falta respectiva.

Artículo 16. Queda estrictamente prohibido fumar e ingerir

alimentos o bebidas en el laboratorio. En la misma forma, los alumnos

deberán abstenerse de recibir visitas, así como sentarse en las mesas de

trabajo, o realizar cualquier tipo de acciones indisciplinadas.

Artículo 17. Para trabajar en el laboratorio los alumnos

formarán equipos, con base en las instrucciones que reciban

del profesor al inicio del curso.

Artículo 18. Cada equipo de trabajo será responsable del

material de vidrio, utensilios, reactivos, aparatos, etc. que utilice

durante el desarrollo de la práctica. Antes de iniciar la práctica

deberán revisar cuidadosamente dicho material y anotar en el vale

cualquier anomalía que observe, ya que de no hacerlo se harán

responsables de los daños que presente el material y deberán

reponerlo en un plazo máximo de quince días, con nota de compra.

Artículo 19. Al terminar la práctica, el equipo deberá dejar la

mesa de trabajo limpia y en orden, como la recibió.

Artículo 20. Los alumnos no podrán abandonar el laboratorio

hasta que la práctica termine, o cuando sean autorizados por el

maestro. Sí un alumno abandona el laboratorio sin

autorización, se hará acreedor a la falta de ese día.




= =

VI

Artículo 21. El alumno deberá entregar un reporte escrito de

la práctica, que formará parte de su evaluación de

laboratorio.

CAPITULO V. DE LA EVALUACIÓN

Artículo 22. La evaluación final de la materia, se hará con

base en tres Evaluaciones Parciales Ordinarias, y los

Exámenes Extraordinario y a Título de Suficiencia.

Artículo 23. Las calificaciones quedarán registradas en el

acta de examen correspondiente con un número entero de

cero a diez. En calificaciones superiores a 6 con fracciones

de cinco décimas o más, la calificación se aumentará al

entero inmediato superior. En calificaciones inferiores a 6,

las fracciones decimales serán consideradas nulas.

Artículo 24. La evaluación parcial ordinaria de la materia se

hará tomando en cuenta los resultados obtenidos en:

a) El examen parcial departamental de los temas revisados

en el aula.

b) La calidad de su trabajo en el laboratorio y de sus

informes de las prácticas.

c) Las actividades académicas complementarias.

Artículo 25. Los exámenes departamentales ordinarios,

extraordinario y a título de suficiencia, se realizarán en el

lugar, fecha y hora que se dará a conocer al inicio del curso.

Artículo 26. Todos los grupos deberán iniciar los exámenes

departamentales a la hora programada. Los sinodales de

examen controlarán la asistencia, llamando lista de presentes

al inicio del examen, con un periodo de tolerancia de 15

minutos, los alumnos que lleguen después del periodo de

tolerancia no podrán presentar examen.

Artículo 27. Durante los exámenes, los alumnos no podrán

llevar consigo teléfonos celulares.

Artículo 28. Para tener derecho a presentar cada uno de los

exámenes departamentales ordinarios, los alumnos deberán

tener un mínimo del 80% de asistencia global (en teoría y

laboratorio) en el periodo examinado, siempre y cuando no

hayan acumulado más del 20% de faltas en el laboratorio

(del total de prácticas del curso).

Artículo 29. Cuando por causa justificada (ver artículo 13

del presente Reglamento) un alumno no pueda asistir a

presentar un examen ordinario, deberá proceder según el

artículo 29 del Reglamento de Estudios Escolarizados.

Artículo 30. Cada evaluación departamental ordinaria se

integrará por el 50% de la calificación del examen de teoría,

más 30% de la calificación de laboratorio, más 20% de la

calificación de actividades complementarias del periodo

correspondiente.

Artículo 31. La calificación final de la materia de

Bioquímica Medica I se obtendrá promediando las tres

evaluaciones parciales ordinarias. La calificación mínima

aprobatoria es de 6 (seis).

Artículo 32. Cuando un alumno no apruebe o intente

mejorar su calificación ordinaria, deberá presentar el

Examen Extraordinario, presentando el total de los

contenidos de la materia.

Artículo 33. Para tener derecho a presentar el Examen

Extraordinario de la materia, los alumnos deberán contar

con un mínimo de 80% de asistencia a las clases de teoría y

también 80% de asistencia a las prácticas de laboratorio, del

total de clases del curso.

Artículo 34. La calificación mínima aprobatoria del

Examen Extraordinario será de 6 (seis). Cuando un alumno

presente este examen para mejorar la calificación ordinaria

obtenida, su calificación final será la más alta.

Artículo 35. Los alumnos que al término del curso

tengan calificación reprobatoria y como mínimo 50% de

asistencia a las sesiones de teoría y prácticas de laboratorio,

tendrán derecho a presentar el Examen a Título de

Suficiencia.

CAPITULO VI. OTROS

Artículo 36. Cualquier caso no contemplado en este

Reglamento deberá someterse por escrito, a la Academia de

Bioquímica Médica I, para su discusión y resolución

inapelable.

ACADEMIA DE BIOQUÍMICA MÉDICA I

AGOSTO 2015




= =

VII

Normas de Seguridad en el Laboratorio

El manejo inapropiado de sustancias, materiales y equipo que se

encuentran en el laboratorio, representa peligro tanto a la salud de

las personas, como a la integridad de las instalaciones y equipo de

trabajo. Es por ello que se deben obedecer las Reglas de

seguridad que se enlistan a continuación, clasificadas en los

siguientes grupos:

1. Sustancias químicas

2. Material biológico y animales de laboratorio

3. Material de vidrio

4. Equipo eléctrico e instalaciones de gas

5. Orden y limpieza

1. Sustancias químicas.

o Cada sustancia debe tener etiqueta de identificación, si no es

así, no los utilice.

o Antes de utilizar una sustancia, verifique que se trata del

reactivo correcto y que tiene la concentración requerida.

o Identifique la naturaleza de la sustancia y el tipo de peligro

que implica su manejo; ¿es veneno?, ¿qué tan tóxico es?, ¿es

inflamable?, ¿es corrosivo?

o Evite el contacto o exposición innecesaria con sustancias

químicas, utilice el equipo de protección adecuado y

disponible: bata larga, lentes, guantes, campana extractora, etc.

o No pipetee sustancias químicas directamente, utilice la prepipeta.

o Evite inhalar productos químicos y sus vapores.

o Trabaje y mantenga bajo la campana los reactivos corrosivos

o volátiles.

o Los hidrocarburos ligeros y solventes deben manejarse lejos del

fuego u otras fuentes de calor. Empleé baño maría para calentarlos.

o Para diluir los ácidos, estos deben verterse lentamente en el

agua, agitando cuidadosamente.

o No vierta agua directamente sobre el ácido porque provocará

salpicaduras.

o No deje sobre la mesa tapones de frascos de ácidos u otras

sustancias corrosivas, porque se pueden contaminar o dejar

residuos corrosivos que podrían causar quemaduras.

2. Material biológico y animales de laboratorio.

o Para el manejo de estos materiales protéjase adecuadamente

según sea el caso. Usando guantes, cubre boca, etc.

o Para la manipulación y el sacrificio de los animales de

experimentación siga las indicaciones del Profesor.

o Maneje cuidadosamente las muestras biológicas (sangre, orina,

saliva, etc.) para evitar contaminaciones de personas y materiales.

o Todo el material biológico, equipos y de desecho (cadáveres,

muestras biológicas, algodón, gasas, guantes, jeringas, etc.)

deberán ser incinerados adecuadamente, para lo cual, deberá

usted seguir las instrucciones del Profesor para dejarlos convenientemente preparados.

3. Material de vidrio.

o Debe examinar todo el material de vidrio antes de utilizarlo,

para detectar la existencia de grietas o roturas. En el caso de

que encuentre material defectuoso, repórtelo de inmediato al

encargado del laboratorio para que se lo cambie.

o No use el material de vidrio con orillas cortantes, con

cuarteadoras, o en general en mal estado.

o Debe transportar, mover o manipular sólo la cantidad de

material de vidrio que pueda manejar con seguridad.

o Use pinzas, franela o guantes de asbesto para transportar o

mover recipientes de vidrio calientes.

o Nunca deje material roto para ser lavado, repórtelo y tírelo a la basura.

o No deje vidrios rotos sobre la mesa o en cualquier otro lugar

en donde pueda causar accidentes.

o Al calentar recipientes de vidrio, use llama suave al principio

del calentamiento.

o Limpie inmediatamente los materiales que goteen o se

derramen, mediante uso de la franela u otros materiales para

embeber el líquido y evitar que se disperse.

o En caso de líquidos tóxicos derramados, protéjase

adecuadamente y ventile el área.

4. Equipo eléctrico e instalaciones de gas.

o No use equipo eléctrico defectuoso.

o Verifique que los enchufes y conexiones estén en buenas

condiciones; en caso de que existan cables desnudos o en mal

estado, repórtelos inmediatamente.

o Maneje el equipo eléctrico y sus conexiones con las manos

secas y cerciórese que el piso se encuentra seco. Mantenga

seco el espacio alrededor del equipo eléctrico.

o Antes de encender el mechero, revise que tanto éste como la

manguera se encuentren en buen estado, verifique que esté

adecuadamente conectado a la tubería de gas (tubos de color

amarillo) y retire todo material inflamable cercano.

o En caso de accidente, retírese inmediatamente y cierre la llave

de paso que se encuentra bajo la tarja de cada mesa.

5. Orden y limpieza.

o Una vez verificado el buen estado del material de vidrio,

lávelo para asegurar su limpieza.

o Mantenga siempre limpia y en orden su área de trabajo.

o No intercambie el contenido de los frascos de reactivo. Use

sólo los tapones de los recipientes correspondientes.

o Cuando requiera volver a llenar sus frascos reactivos, transfiera

del frasco de almacenamiento, la cantidad necesaria a través de

un vaso de precipitados, no devuelva el sobrante al envase

original, busque otro frasco reactivo y vierta el sobrante. Nunca

emplee pipetas para efectuar este procedimiento.

ACADEMIA DE BIOQUÍMICA MÉDICA I

AGOSTO 2015




= =

VIII

SIMBOLOS DE SEGURIDAD

INFLAMABLE

EXPLOSIVO

OXIDANTE

NIVEL DE RIESGO BAJO

CORROSIVO IRRITANTE

VENENO DAÑO AMBIENTAL

FLAMABLE

EXPLOSIVO

CORROSIVO

VENENO

RADIOACTIVO

GAS COMPRIMIDO




= =

IX

ÍNDICE

No. Páginas

1. INTRODUCCIÓN…………………………………… 1

2. SOLUCIONES………………………………………… 8

3. PROTEÍNAS…………………………………………… 16

4. CINÉTICA QUÍMICA Y CATÁLISIS……………… 24

5. CINÉTICA ENZIMÁTICA…………………………… 33

6. GLÚCIDOS…………………………………………….. 40

7. OXIDACIONES BIOLÓGICAS……………………… 46

8. LÍPIDOS………………………………………………. 52

9. ÁCIDOS NUCLEICOS………………………………. 56




= = 1

PRÁCTICA No. 1

INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO

Se revisarán conceptos y procedimientos de importancia para el trabajo en el laboratorio. El alumno deberá

previamente haber leído y sujetarse al Reglamento de la Academia de Bioquímica I.

Las actividades de laboratorio constituirán una parte importante del aprendizaje de la bioquímica médica

y complementarán las actividades de la materia impartidas en el aula.

Es obligación del alumno la asistencia puntual, así como participar de forma activa, obtener resultados de

los experimentos y entregar el reporte del mismo.

Será de suma importancia cumplir meticulosamente con las medidas de seguridad, comportamiento,

uniforme y accesorios como: guantes, anteojos de protección o caretas transparentes, cubre bocas, bata

larga y pre-pipetas.

EJERCICIO 1. DISTRIBUCIÓN DE LOS ALUMNOS.

a. Antes de entrar al laboratorio, todos los alumnos deberán portar, debidamente abotonada la bata de

laboratorio y tener listo su material de trabajo.

b. Cuando el profesor lo indique, los alumnos colocarán su mochila en el lugar que les sea asignado.

c. Siguiendo las instrucciones de su profesor, localizar la mesa de trabajo de su equipo, dirigirse a ella e

inmediatamente antes de realizar cualquier actividad, deberán colocarse los gogles y guantes de forma

obligatoria. No podrán permanecer durante la sesión del laboratorio si no cumplen con este requisito.

d. En la mesa de trabajo, localizar la toma de corriente, desagües, tuberías y sitios donde puede trabajar.

e. Ubicar cómo se ubica la mesa de trabajo con respecto a la campana de extracción, regadera, extintores,

zonas de seguridad y rutas de evacuación.

f. Identificar el uso de cada una de las tuberías que encuentre en la mesa de trabajo y marcarlas con masking

tape. Esperar a que su profesor confirme que el etiquetado es correcto.

g. Localizar la posición de las válvulas de apertura de cada tubería.

Evidencia de Aprendizaje:

1. Ilustrar la mesa de trabajo señalando la posición de las tomas de corriente, desagües y válvulas de flujo.

2. Ilustrar la distribución del laboratorio e indique las zonas de seguridad, posición del equipo de seguridad y

la ruta de evacuación desde la mesa.

3. En el esquema anterior, marcar la posición de las válvulas de apertura.




= = 2

EJERCICIO 2. VALE DE RESGUARDO DEL MATERIAL DE LABORATORIO.

a) Localizar en la charola el vale de resguardo del material de laboratorio (documento que enlista el

material para realizar cada práctica) seguidamente revisar cuidadosamente cada una de las piezas,

indicando en el vale cualquier defecto en el material. Bajo ninguna circunstancia se deberá desplazar la

charola de la mesa de trabajo a ningún otro sitio.

b) Etiquetar con masking tape cada pieza que lo identifique. Reunir en la charola el material que desconozca y

preguntar a su Profesor. Para esta Práctica y las posteriores, favor avisar al Profesor o Profesores para

para que le revisen el ejercicio o experimento, en caso de no avisar y se desecha el ejercicio o

experimento, no se podrá incluir en el Reporte de Laboratorio.

c) Al terminar de revisar todo el material, completar los datos solicitados en el vale, (fecha, grupo, equipo,

responsable, etc.) y entregarlo al personal técnico de laboratorio. En las siguientes prácticas, el vale se

entregará al inicio de cada sesión con tolerancia de 10 minutos.

d) Al terminar cada práctica el equipo tiene la obligación de ordenar el material limpio dentro de la charola,

limpiar la mesa y solicitar al personal técnico que tendrá que revisar y levantar el material de su mesa de

trabajo, quienes les tendrán que devolver el vale que se entregó al inicio de la práctica.

Evidencia de aprendizaje:

1. ¿Cuál es el uso de cada una de las siguientes piezas de material de laboratorio?

Pipeta Mortero

Bureta Tubo de ensayo

Probeta Válvula de Bunsen

Matraz Erlenmeyer Matraz aforado

Pinza para tubo de ensayo Vaso de precipitados

Reóforos Cristalizador

Tubos para centrífuga clínica Tubos Falcón

EJERCICIO 3. MANEJO DEL MECHERO.

a) No encender el mechero hasta que su profesor se lo indique.

b) Conectar el tubo de látex del mechero a la llave de gas, la que debe estar completamente cerrada, con la

manija en posición transversal respecto de la salida del gas. No olvidar que la tubería de gas es de color

amarillo.

c) Verificar que el tornillo de control de flujo de gas esté abierto más o menos a la mitad de su capacidad

total. El flujo de gas se puede disminuir girando el tornillo en el sentido de las manecillas del reloj y

aumentar en sentido contrario.




= = 3

d) Encender el mechero aproximando la flama de un cerillo o encendedor al borde de la parte superior del

mechero e inmediatamente abrir la llave de gas, lo cual debe hacerse lentamente, avanzándola hasta que

esté aproximadamente a 45 grados con el tubo del gas. Tener cuidado de no acercar su rostro, pelo u

objetos inflamables al mechero al momento de encender, ni cuando esté encendido. Al usar el mechero no

deberá portar guantes clínicos hechos de látex o polietileno, tener cuidado, ya que son inflamables.

e) Ajustar la cantidad de aire que entra, usando el arillo de control de flujo de aire, hasta que la flama tenga

una zona central de color azul claro rodeada de otra de color azul oscuro o violeta. La parte más caliente

se encuentra en la punta de la zona interna. Cuando la combustión es incompleta, por falta de oxígeno, la

flama presenta color amarillo.

Evidencia de aprendizaje.

1) En el esquema siguiente, indicar el tipo de mechero, así como las partes que se indican.

2) Ilustrar la forma correcta de encender el mechero.

EJERCICIO 4. COMO CALENTAR UN LÍQUIDO EN UN TUBO DE ENSAYO.

a) A un tubo de ensayo agregar agua de la llave hasta un 20% de su capacidad y sujetarlo con pinzas para

tubo de ensayo.

b) NO olvidar quitarse los guantes de látex cuando se emplee el mechero.

c) Colocar el tubo sobre la flama del mechero, inclinarlo aproximadamente a 70oC y cuidar que la flama

caliente la parte superior del líquido. Nunca calentar un tubo de ensayo en el fondo o en posición vertical

debido a que se puede proyectar su contenido.

d) Mover el tubo cuidadosamente casi sobre la flama de arriba hacia abajo, para que el líquido se caliente de

manera uniforme.

e) Durante el calentamiento dirigir la boca del tubo hacia un lugar donde no se encuentre ninguna persona o

material que se pueda dañar.

f) No observar de ninguna manera directamente la boca de un tubo de ensayo que se está calentando, aunque

esté fuera de la flama del mechero.

g) Continuar calentando hasta lograr que el agua hierva, sin proyectarse.

1

2

3

4

5

C

a

b




= = 4

h) PROHIBIDO calentar tubos de ensayo con solventes orgánicos directamente a la flama del mechero.

Realizar siempre en baño María.

i) Al terminar cualquier experimento apague el mechero por precaución.


1. Describir e ilustrar la forma correcta de manejar la pinza para tubo ensayo

2. Ilustrar la forma correcta de calentar un líquido en un tubo de ensayo.

EJERCICIO 5. INSTALACION DE UN BAÑO MARÍA.

a) Identificar y reunir el siguiente material: soporte universal, anillo de hierro, rejilla de asbesto, mechero de

Fischer o Bunsen y un vaso de precipitados de 600 mL.

b) Ensamblar el anillo en el soporte a la altura adecuada para que la parte más caliente de la flama del

mechero quede a nivel del anillo. Colocar la rejilla de asbesto sobre el anillo.

c) Llenar el vaso con agua de la llave a la mitad y colocarlo sobre la rejilla. Agregar pequeños trozos de

papel en el vaso con agua a modo de “cuerpos de ebullición”.

d) Encender el mechero y calentar a la temperatura que le indique su profesor.


1) Ilustrar el montaje del aparato.

2) ¿Por qué no se debe llenar el vaso completamente?

3) ¿Por qué se emplean los cuerpos de ebullición?

EJERCICIO 6a. MANEJO DE REACTIVOS LÍQUIDOS: SEGURIDAD.

a) Usar siempre la pre-pipeta, nunca pipetear con la boca para manejar con seguridad los reactivos líquidos.

b) Al abrir un frasco de reactivo, colocar el tapón sobre la mesa en posición invertida, para evitar

contaminación. Vertir la cantidad necesaria en un vaso de precipitados y de ahí usar el reactivo.

c) Para extraer el líquido utilizar una pipeta o un gotero limpio. Nunca vertir reactivos directamente del

frasco para evitar escurrimiento.

d) Usar una pipeta de 10 mL, para transferir 5 mL de agua de un vaso de precipitados a un tubo de ensayo en

su mesa y en la campana de extracción. Repetir hasta que pueda realizarlo con seguridad.


1) Describir la forma de uso de la pre-pipeta.

2) Utilizar las técnicas que se aprendió para medir los volúmenes de los utensilios que le solicite su profesor.

EJERCICIO 6b. MANEJO DE REACTIVOS LÍQUIDOS: PREPARACION DE SERIES.

a) Preparar una serie de 4 tubos de ensayo, etiquetar y numerar del 1 al 4.




= = 5

b) Agregar en el tubo 1 la cantidad de 2.5 mL de agua. En el tubo 2 la cantidad de 1.25 mL de agua. En tanto

que en el tubo tres deposite 8 mL de agua y en el tubo 4, deposite 0.6 mL de agua.

c) Utilizar para cada tubo de ensayo una pipeta de capacidad adecuada. Repetir este ejercicio hasta que

pueda realizarlo con seguridad y precisión.


1. Elaborar un esquema que describa este experimento.

2. Describir que pipetas utilizó para cada uno de los volúmenes indicados.

3. ¿Cuántos tipos de pipetas existen?

EJERCICIO 6c. MANEJO DE REACTIVOS LÍQUIDOS: TITULACIÓN.

a) Reunir el material siguiente: Soporte universal, pinza para bureta (Lincoln), bureta, matraz Erlenmeyer.

b) Instalar la pinza para bureta sobre el soporte a una altura conveniente para colocar adecuadamente la bureta.

c) Armar la bureta colocando la llave del lado derecho de la escala, la cual debe quedar correctamente

orientada (escala de 0 arriba y escala de 25 abajo).

d) Sujetar la bureta con las pinzas teniendo cuidado que quede bien sujeta, con la escala hacia el observador

y a la altura adecuada por arriba del matraz Erlenmeyer.

e) Emplear siempre un vaso de precipitados de 100 mL para llenar la bureta, teniendo cuidado que la llave se

encuentre cerrada. Como precaución, colocar un vaso de precipitados debajo de la bureta y “purgarla”.

f) Para “purgar” la bureta abrir completamente la llave para que el líquido salga rápidamente y pueda

arrastrar las burbujas de aire. Posteriormente, aforar al volumen total y colocar el matraz Erlenmeyer.

g) Manejar con soltura y seguridad la llave de la bureta y el matraz Erlenmeyer. Familiarícese con el

procedimiento dejando gotear el líquido de la bureta, en este caso agua, o dejar salir cantidades fijas como

por ejemplo, de 1 mL cada vez, de 5 mL cada vez, etc. Asimismo, deberá aprender a leer con precisión la

escala de la bureta.


1) Ilustrar el dispositivo de titulación.

2) Identificar el tipo de aforo de la bureta utilizada.

3) Describir la forma correcta de leer el volumen en la bureta.

EJERCICIO 7. MANEJO DE REACTIVOS SÓLIDOS.

a) Preparar una charola de papel usando una hoja de papel limpio, de preferencia encerado. Esta charola se preparará

doblando el papel aproximadamente a un centímetro de cada borde y colocándolos en ángulo recto para formar una

pared en la periferia del papel. El tamaño de la charola dependerá de la cantidad de reactivo a pesar.




= = 6

b) Encender la balanza y esperar a que se estabilice la lectura. Colocar la charola de papel en el plato de la

balanza. Cuando se estabilice, por medio del botón de tarar, tare a cero la balanza.

c) Abrir el recipiente del reactivo y colocar la tapa sobre la mesa, boca arriba, para evitar la contaminación.

d) Por medio de una espátula sacar el reactivo del recipiente y colocarlo sobre la charola de papel. Si se

rebasa la cantidad deseada, regresar el exceso de reactivo al respectivo recipiente usando la espátula.

Nunca regresar al recipiente original un reactivo que caiga fuera de la charola de papel o sobre la mesa.

e) Pesar la cantidad de cloruro de sodio que le indique su profesor y colocarlo en el sobre de papel que se le

proporciona. Escribir en el sobre el nombre y cantidad de reactivo, número de equipo y grupo. Conservar

para utilizar en la siguiente práctica.

f) Cerrar inmediatamente el frasco de reactivo para evitar que se hidrate o contamine. Asegurarse que la

mesa y la balanza queden limpias.


1) Ilustrar la balanza, señalando la posición del botón de encendido-apagado y del botón de tara.

2) Pesar las muestras que le solicitó su profesor.

EJERCICIO 8. TARAR TUBOS PARA CENTRIFUGAR.

a) Localizar la balanza de dos platillos y la centrífuga refrigerada.

b) Añadir a dos tubos Falcon de capacidad de 15 mL la cantidad de 5 mL de agua de la llave como marca la

escala del propio tubo.

c) Colocar en dos frascos gerber cada tubo y mantenerlos a la mano cuando se requiera en la balanza.

d) Ajustar las pesas de medición en la posición de cero en una balanza de dos platillos. Asegurarse de que la

aguja o fiel de la balanza esté en posición cero. Si no lo está, girar cuidadosamente las pesas de ajuste en

el sentido que sea necesario hasta lograr el equilibrio.

e) Retirar los tubos de los frascos gerber, colocar cada frasco en cada platillo, cuidando que el más pesado

quede del lado izquierdo.

f) Deslizar las pesas de medición de la balanza hasta lograr que el fiel vuelva a la posición de equilibrio,

posteriormente colocar los tubos nuevamente en cada frasco y observar que se encuentren balanceados.

g) De no estar en equilibrio, use una pipeta y añadir agua de la llave al tubo más ligero hasta lograr que el

fiel de la balanza regrese al equilibrio. Al equilibrar los tubos ya puede centrifugar.


1) Ilustrar la balanza de platillos señalando la posición de las pesas de ajuste y las de medición.

2) Explicar por escrito el resultado de la centrifugación.




= = 7

PRÁCTICA No. 2

SOLUCIONES

Una solución es un sistema homogéneo, formado por dos o más sustancias químicas. Está formada por un

solvente en el cual se dispersa uno o más solutos. Cuando ambos son líquidos miscibles, se acostumbra nombrar

solvente al que se encuentra en mayor cantidad. En las soluciones acuosas siempre se considera el agua como

solvente. La relación que existe entre las cantidades de soluto y solvente en una solución se llama concentración.

Existen varias formas de expresar la concentración de una solución. Las de uso más frecuente son:

MOLARIDAD (M). Número de moles de soluto en un litro de solución. Un mol se define como el peso

molecular en gramos de una sustancia, o sea la masa de una sustancia que contiene el mismo número de

átomos o moléculas que hay en 12 g de 12C. (6.022 x 1023 o Número de Avogadro).

MOLALIDAD (m). Número de moles de soluto en 1000 g de solvente.

NORMALIDAD (N). Número de equivalentes químicos de soluto en un litro de solución. Si dividimos los

gramos de un mol entre la valencia del compuesto se obtiene el peso equivalente químico.

OSMOLARIDAD (Osm): Número de osmoles en un litro de solución. Un osmol es la cantidad de soluto

en gramos que proporciona el número de Avogadro de partículas en solución.

PORCENTUAL (%). Expresa el porcentaje de soluto en una solución. Existen diferentes tipos:

Porciento en peso (% p/p). Número de gramos de soluto en 100 g de solución. Esta es la forma como se

expresa la pureza de los reactivos químicos.

Porciento en volumen (% v/v). Número de mililitros de soluto en 100 mL de solución.

Porciento en peso-volumen (% p/v). Número de gramos de soluto en 100 mL de solución. Si no se indica

expresamente la modalidad de porcentaje, esta es la concentración porcentual que se debe usar.

FRACCIÓN MOLAR (xi). Número de moles de una sustancia en una solución entre la suma de los moles

de todos los componentes de la misma.

DIÁLISIS

Ejemplo de membranas dialíticas son el celofán y el colodión. La base del tratamiento de pacientes renales

descompensados es la diálisis, la cual es útil también para eliminar sustancias nitrogenadas, medicamentos en

exceso o exceso de acidez en sangre. Médicamente se refieren diversos tipos de diálisis de los cuales

mencionaremos la hemodiálisis y la diálisis peritoneal.




= = 8

ÓSMOSIS Y PRESIÓN OSMÓTICA

Si dos soluciones de diferente concentración están separadas por una membrana semipermeable, el solvente

de la solución menos concentrada difunde a la de mayor concentración. Esto se explica termodinámicamente

porque la solución diluida tiene una tendencia de escape o presión de vapor muy grande. Esta tendencia de

escape o presión de vapor es muy baja cuando la solución está concentrada. Este fenómeno es conocido

como ósmosis y ejerce una presión osmótica, propiedad coligativa de gran importancia fisiológica ya que

interviene en la regulación del volumen de sangre circulante, así como en la formación o eliminación de

edemas tisulares, y es la razón por la cual el paciente diabético elimina frecuentemente grandes cantidades de

orina (poliuria). Esta última está ocasionada por la alta concentración de glucosa en sangre y forma parte de

la triada sintomática clásica del diabético: polifagia, polidipsia y poliuria. La medición de la presión

osmótica se lleva a cabo mediante el dispositivo llamado OSMÓMETRO. Este requiere de una membrana

semipermeable y aunque las que más se acercan a la perfección son las de ferrocianuro de cobre y las de

pergamino, por ser más fácil de conseguir, se utilizará una membrana dialítica de colodión (celulosa) que

proporciona una medida aproximada de la presión osmótica. La columna de sacarosa ejercerá finalmente una

presión que se opone al paso del agua (Presión Hidrostática). Calculando ésta, se puede conocer la presión

osmótica ya que ambas son iguales.

Esto se hace mediante la fórmula: π = hρg donde,

π = presión osmótica

h = altura a la que asciende la solución de sacarosa (en metros)

ρ = densidad de la solución de sacarosa (1.088 g/mL), (convertirla a kg/m3)

g = aceleración debida a la gravedad (9.81 m/s2)

Efectuando esta operación encontramos la presión osmótica en pascales. Para obtener atmósferas usamos la

siguiente equivalencia: una atmosfera igual a 1.013 x 105 pascales

SOLUCIONES REGULADORAS

A las soluciones reguladoras se les pueden añadir cantidades relativamente grandes de ácidos o álcalis sin

alterar de manera significativa su pH. Esta acción amortiguadora se debe a la presencia en la solución de un

sistema formado por un ácido o una base débil y su sal correspondiente. Si se toma como ejemplo una solución

que contenga un ácido débil, al que representaremos por HA y su sal, representada por BA los hidrogeniones

existentes en ella procederán únicamente de las moléculas ácidas, que se disocian como sigue:

HA -- H++ A-




= = 9

El equilibrio de la reacción está dado por la siguiente ecuación:

[H+] [A- ]

--------------------- = Ka

[HA]

Donde Ka es la constante de disociación del ácido. De esta ecuación se deduce que la concentración de

hidrogeniones es:

Ka [HA]

[H+] = ------------------

[A- ]

La relación entre estas dos constantes es, sin embargo, tan sensiblemente constante en condiciones ordinarias

que podemos afirmar que la concentración de A- es igual a la concentración de la SAL. Sustituyendo una

expresión por otra en la ecuación anterior tenemos:

[Ácido]

[H+] = Ka ---------------

[Sal]

Si se toman logaritmos negativos en ambos términos de la ecuación, (manipulación matemática para manejar

números muy pequeños o muy grandes), queda así:

[Ácido]

- log [H+] = - log Ka – log ---------------

[Sal]

Ahora bien, si -log [H+] es igual a pH, por analogía podemos decir que –log de Ka es igual a pKa por lo que:

[Ácido]

pH = pKa – log ---------------

[Sal]

Por otra parte por las leyes de los logaritmos, las expresiones –log de ([Ácido]/[Sal]) y + log de

([Sal]/[Ácido]) son iguales y la segunda puede reemplazar a la primera, de tal modo que hechas todas las

modificaciones la ecuación queda finalmente como sigue:

[Sal]

pH = pKa + log ----------

[Ácido]




= = 10

Esta ecuación se conoce con el nombre de Ecuación de Henderson–Hasselbalch y nos indica que el pH de

una solución que contenga un ácido débil y su sal está determinado por el valor de pKa (constante para cada

ácido) y por el logaritmo del cociente que resulta de dividir la concentración de la sal entre la concentración

del ácido. Por ejemplo, el valor de la constante de disociación Ka del ácido acético es de 1.8 x10-5. El valor

de su pKa es por lo tanto igual a 4.74. Si tenemos una solución reguladora que posea iguales cantidades de

ácido acético y acetato de sodio en concentración 0.1 N, el pH de esa solución sería de:

0.1 N

pH = 4.74 + log ---------- = 4.74

0.1 N

Además de servir para la preparación de soluciones de pH conocido, las soluciones reguladoras tienen dentro

del organismo un papel de importancia capital que es el de evitar que aumente o disminuya de manera

importante la concentración de iones hidrógeno, ya que la vida humana es posible en límites muy estrechos

de pH, es decir, para la sangre arterial un pH de 7.40 y para sangre venosa y líquidos intersticiales 7.35. Este

último es menor por tener más CO2 y por lo tanto más H2CO3 producido metabólicamente. Se sabe que los

límites máximos de pH en los que por algunos minutos puede permanecer el organismo sin sufrir muchas

alteraciones son de 7.0 a 7.8. En los líquidos donde existen y actúan al mismo tiempo varios sistemas

amortiguadores, como sucede en la sangre, el ácido o la base que entra es amortiguado por todos los sistemas

presentes de manera proporcional a la eficacia de cada uno de ellos. La regulación fisicoquímica tiene lugar

en todos los medios que contienen reguladores, constituidos principalmente por ácidos o bases débiles y sus

sales. Por ejemplo el de fosfatos H2PO4-/HPO4

= con un pKa2 de 7.2 (o de 6.8 a la temperatura corporal), es el

principal amortiguador intracelular. El principal amortiguador extracelular en la sangre y líquidos

intersticiales es el sistema bicarbonato H2CO3/HCO3- con un pKa de 6.1. En el interior del eritrocito, además

del bicarbonato, el amortiguador de mayor importancia es el de hemoglobina reducida/oxihemoglobinato

(HHb/HbO2). Otros sistemas son los de proteínas y aminoácidos. Todos estos sistemas funcionan de manera

inmediata cuando existen excesos de álcali o ácido ya que un cambio del pH afecta la estructura y la

actividad de las proteínas, la distribución de otros iones entre las células y el líquido extracelular, la actividad

de hormonas y fármacos, etc. Por otro lado, existen sustancias de mucha importancia en bioquímica como los

aminoácidos y las proteínas los cuales tienen grupos titulables y que actúan como anfolitos aceptando iones

H+ o iones OH-. Siendo posible realizar experimentos donde se determinan a través de curvas de titulación

del aminoácido de glicina con HCl y con NaOH.




= = 11

EXPERIMENTO 1. DIALISIS.

a) Humedecer por inmersión en agua destilada durante 10 minutos la sección del tubo de colodión o celofán

de aproximadamente 6 cm de largo por 2.5 cm de diámetro.

b) En el tiempo de 5 minutos, preparar una solución de NaCl al 5% que le indique su profesor, considerar la

pureza del reactivo de 100%.

c) Preparar dos tubos de ensayo limpios. Añadir en uno de ellos 2 mL de NaCl al 5% y 5 gotas de AgNO3

(nitrato de plata). Al otro tubo agregar 2 mL de solución de almidón al 1% y 2 gotas de solución de lugol.

Observar la reacción que ocurre en cada tubo. Etiquetar como testigo de cloruros y testigo de almidón

respectivamente.

d) Pasado los 10 minutos, cerrar un extremo del tubo de colodión atándolo con hilo de algodón para obtener

un saco. Desechar el agua destilada utilizada, enjuagar el vaso y llenar con agua destilada nueva a un

tercio de su volumen.

e) Llenar el saco con una mezcla de 1 mL de solución de NaCl al 5% y 10 mL de solución de almidón al 1%.

f) Cerrar cuidadosamente el otro extremo del saco, enjuagar con agua destilada y suspender en un vaso de

precipitados con agua destilada, cuidar de no tocar las paredes.

g) Determinar la presencia de almidón y de cloruros en el líquido que rodea al saco del vaso de precipitados,

a tiempo 0 (inmediatamente después de sumergir el saco), 15, 30, 45 y 60 minutos.

h) Repetir las dos pruebas del líquido contenido en el saco, cuando se hayan realizad todas las lecturas.


1) Describir detalladamente los cálculos que hizo para conocer la cantidad de agua destilada que es necesario

añadir al NaCl del sobre para que la solución sea al 5%.

2) Calcular las concentraciones siguientes y detalle los cálculos correspondientes del NaCl al 5%: Molaridad,

Normalidad, mEq/mL, mg/mL, moles%, Osmolaridad.

3) Ilustrar el montaje del experimento.

4) Explicar los resultados de la diálisis.

EXPERIMENTO 2. MEDIDA DE LA PRESIÓN OSMÓTICA POR EL MÉTODO DIRECTO.

El osmómetro consiste en un recipiente que contiene una solución de sacarosa 1 M teñida con rojo neutro

conectado a un capilar de polietileno por el cual asciende el nivel del líquido (ver esquema de la tabla). El

recipiente es el cuerpo de una jeringa hipodérmica de 5 mL que presenta dos bandas de hule; la del extremo

inferior permite la fijación de una membrana de celofán humedecido previamente durante 5 minutos en agua

destilada. La banda superior sirve para sellar el orificio de llenado de la cámara. Por la parte correspondiente




= = 12

al pivote, se le agrega el trocar metálico de un catéter el cual se introduce en el extremo de un capilar de

polietileno. El extremo inferior de la jeringa se sumerge en un vaso de precipitados con agua destilada. El

dispositivo lo instala el personal técnico del laboratorio. Nota: cualquier error en el montaje del osmómetro

se manifestará por salida de solución coloreada del dispositivo. Una vez hecho esto se marca el nivel de la

solución de sacarosa en el tubo capilar, que se toma como el tiempo cero. Medir cada 15 minutos el nivel

ascendido hasta los 90 minutos, registrar sus resultados en la tabla de evidencias.


1. Registrar sus resultados en la tabla siguiente:

Tiempo

min.

Altura

mm

π

Atm

0

15

30

45

60

75

90

2. Graficar el tiempo en las abscisas (eje x) y la altura en milímetros en las ordenadas (eje y).

3. Calcular la presión osmótica en atmosferas y complete la tabla.

4. ¿Cuándo deberá detenerse el proceso osmótico?

5. ¿Depende sólo de la altura la presión osmótica? Explique.

6. ¿Influye el radio del capilar en la presión osmótica? Explique.

7. ¿La sacarosa y el colorante dializan? Explique.

8. Identificar en el esquema de la tabla de resultados todas las partes del osmómetro.




= = 13

EXPERIMENTO 3. PODER AMORTIGUADOR DE SOLUCIONES.

Preparar 50 mL de las soluciones amortiguadoras con los valores de pH que le indicará su profesor (7.0,

7.2, 7.4 y 8.0), emplear KH2PO4 (fosfato diácido de potasio) 0.01 M y Na2HPO4 (fosfato monoácido

disódico) 0.01 M (pKa2 = 7.2).

Preparar 50 mL de las soluciones amortiguadoras con los valores de pH que le indicará su profesor (7.0,

7.2, 7.4 y 8.0), emplear KH2PO4 0.1 M y Na2HPO4 0.1 M (pKa2 = 7.2).

Medir el pH potenciométrico y colorimétrico de las soluciones anteriores.

Añadir una alícuota de 10 mL de la solución amortiguadora que preparó en un matraz Erlenmeyer de

250 mL, medir con una pipeta volumétrica de 10 mL. Añadir 5 gotas de azul de timol y titular con HCl

(ácido clorhídrico) 0.1 N hasta observar el cambio de color a rojo.

Agregar una alícuota de 10 mL de la solución amortiguadora que preparó en otro matraz Erlenmeyer de

250 mL, medir con una pipeta volumétrica de 10 mL. Añadir 5 gotas de azul de timol y titular con NaOH

(hidróxido de sodio) 0.1 N hasta observar el cambio de color a azul.

Evidencia de aprendizaje.

1) Describir detalladamente los cálculos que realizó para cada uno de los pH solicitados.

2) Con los datos a obtener y las de todo el grupo llenar la tabla siguiente:

pH

teórico Concentración

pH Gasto de

HCl 0.1 N

Gasto de

NaOH 0.1 N Colorimétrico Potenciométrico

7.2 0.01

7.2 0.1

7.4 0.01

7.4 0.1

8.0 0.01

8.0 0.1

3) Explicar la coincidencia o no, entre sus resultados y el cálculo teórico.

4) Explicar los resultados con base en la teoría.

EXPERIMENTO 4. CURVAS DE TITULACIÓN.

Añadir 30 mL de solución de glicina 0.1 N en un vaso de precipitados de 150 mL, con la ayuda de su

Profesor agregar una barra magnética y colocar sobre una placa de agitación, medir el pH y sin retirar el

electrodo titular con NaOH 0.1 N como se encuentra indicado en la tabla y registrar sus resultados.




= = 14

Añadir 30 mL de solución de glicina 0.1 N en otro vaso de precipitados de 150 mL, con la ayuda de su

Profesor agregar una barra magnética y colocar sobre el agitador, medir el pH y sin retirar el electrodo

titular con HCl 0.1 N, como se encuentra indicado en la tabla y registrar sus resultados.

Titulación con

HCl 0.1N Glicina 0.1 N

Titulación con

NaOH 0.1 N Glicina 0.1 N

mL Acumulativo pH mL Acumulativo pH

0 0 0 0

2 2 2 2

3 5 3 5

4 9 4 9

5 14 5 14

5 19 5 19

5 24 5 24

1 25 1 25

1 26 1 26

1 27 1 27

1 28 1 28

0.5 28.5 0.5 28.5

0.5 29 0.5 29

Evidencias de aprendizaje:

1) Graficar los valores acumulativos de HCl signo negativo y a los de NaOH signo positivo, en el eje de las

abscisas (X) y el pH en el eje de las ordenadas (Y).

2) Identificar en la gráfica los valores de pK1 y pK2.

3) Calcular el punto isoeléctrico (pI) sabiendo que: pK1 + pK2

pI = ----------------

2




= = 15

PRÁCTICA No. 3

PROTEÍNAS

Su nombre deriva del griego proteios que significa “primordial” o fundamental; contienen en su molécula C,

H, O, N y en ocasiones P y S. El nitrógeno constituye en promedio el 16%. Por hidrólisis dan aminoácidos,

los cuales varían en número, cantidad y posición en cada proteína. La actividad de una proteína depende de

su conformación espacial, por lo que agentes físicos y químicos que alteran los diferentes enlaces son

capaces de anularla. Algunos de los agentes desnaturalizantes más comunes son ácidos o bases, detergentes,

metales pesados, solventes orgánicos, alcaloides, calor, radiaciones ultravioleta, rayos x, ondas ultrasónicas,

sales inorgánicas, sustancias orgánicas como urea, guanidina, agentes reductores, agentes oxidantes, etc. Las

proteínas desnaturalizadas pierden su actividad, modifican su solubilidad y precipitan. Tal como existen en la

naturaleza se denominan proteínas nativas. Las propiedades fisicoquímicas y biológicas características de las

proteínas se deben a los aminoácidos que las constituyen y las reacciones coloridas que se utilizan para su

análisis en realidad detectan la presencia de un aminoácido específico. Muchas de las propiedades químicas

de las proteínas son comunes a varias especies por que contienen el mismo tipo de aminoácidos, por lo que

para caracterizar una proteína es necesario estudiar sus propiedades fisicoquímicas las cuales dependen del

peso molecular, de su carga eléctrica neta y de la conformación que adopte la molécula.

REACCIONES QUÍMICAS.

REACCIÓN DE MILLÓN: Es específica para el grupo fenólico y por lo tanto, la dan positiva todas las

sustancias que poseen esta función, como el fenol, ácido salicílico, timol, tirosina y todas aquellas

proteínas que contengan tirosina.

REACCIÓN DEL BIURET: Todas las moléculas que contengan dos o más uniones peptídicas, por lo

tanto todas las proteínas y péptidos no menores de 3 unidades, dan positiva la reacción del biuret. El

nombre se debe al compuesto biurea (NH2-CO-NH-CO-NH2) el cual da positiva la prueba. Cuando una

proteína o un polipéptido se hacen reaccionar con sulfato CuSO4 en solución alcalina se produce un color

característico púrpura o violeta. El color se debe a un complejo que resulta al unirse el cobre con los

átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Esta reacción nos sirve para diferenciar las proteínas y

péptidos de los aminoácidos y su utilidad principal es la de seguir el proceso de hidrólisis, la reacción será

negativa cuando la hidrólisis sea completa.

REACCIÓN DE AMINOÁCIDOS AZUFRADOS: Las proteínas que contengan los aminoácidos cisteína

y cistina cuando se tratan con álcalis concentrados, desprenden H2S, el cual se puede reconocer por su olor




= = 16

desagradable y característico, o bien, por la formación de un precipitado negro de PbS al reaccionar con

(CH3COO)2Pb.

REACCIÓN XANTOPROTÉICA: Esta reacción se debe a la formación de nitroderivados aromáticos por

reacción del ácido nítrico sobre grupos aromáticos que poseen algunos aminoácidos como la fenilalanina,

la tirosina y el triptófano. Por lo tanto, la dan positiva todas aquellas proteínas que tengan aminoácidos

aromáticos en su molécula.

REACCIÓN DE NINHIDRINA: Es una de las reacciones más sensibles para identificar aminoácidos en

general, ya que detecta una parte de aminoácido en 1 500 000 partes de agua. Aminoácidos y muchas

aminas primarias dan un color violeta característico. La prolina da coloración amarilla. Por su sensibilidad

esta reacción se emplea para valoración cuantitativa de aminoácidos por colorimetría.

PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS.

DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS: Cuando la estructura altamente ordenada de una proteína se

somete a la acción de agentes fisicoquímicos desnaturalizantes, queda reducida al llamado polímero

estadístico o cadena de aminoácidos y además pierde toda actividad biológica. Algunos de los agentes

desnaturalizantes más importantes son los metales pesados, los ácidos fuertes y el alcohol.

PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR METALES PESADOS: Las proteínas cuando se encuentran en

solución a pH superiores a su punto isoeléctrico son capaces de reaccionar con diferentes metales pesados

formando los correspondientes proteinatos insolubles. Tomaremos como ejemplo dos proteínas, la

peptona y la gelatina y observaremos su reacción, en forma simultánea frente a los metales pesados: Fe,

Ag, Hg, y Pb.

PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR EFECTO DE ÁCIDOS FUERTES: Los ácidos fuertes son

capaces de desnaturalizar a las proteínas formando productos de desnaturalización insolubles conocidos

como metaproteínas.

PUNTO ISOELÉCTRICO: Las proteínas al igual que los aminoácidos son moléculas anfóteras. Es decir,

pueden reaccionar con ácidos o con álcalis. En medio ácido las proteínas se combinan con los iones hidrógeno

y quedan con carga positiva. En medio alcalino liberan protones y quedan con carga negativa. El pH en el cual

una proteína no posee carga eléctrica neta se denomina punto isoeléctrico, a este pH la proteína presenta su

mínima solubilidad y generalmente precipita, teniendo además una viscosidad máxima.




= = 17

EXPERIMENTO 1. REACCIÓN DE MILLÓN.

Preparar una serie de 5 tubos de ensayo, etiquetar y enumerar del 1 al 5, colocar en cada tubo 2 mL de las

soluciones siguientes:

Tubo Soluciones

1 Agua

2 Peptona al 2%

3 Caseína al 2%

4 Gelatina al 2%

5 Albúmina al 2%

Añadir 5 gotas del reactivo de Millón.

Incubar en baño María a ebullición durante 10 minutos. ¡PRECAUCIÓN!

La presencia de tirosina se pone de manifiesto por la aparición de un precipitado blanco el cual por acción del

calor se vuelve rojo. La presencia de sales y soluciones muy alcalinas, pueden interferir en esta reacción.

Evidencias de aprendizaje

1) Registrar sus resultados en la tabla que se encuentra al final de esta práctica.

2) Ilustrar sus resultados.

3) Escribir la composición del reactivo de Millón y explicar cuál es el mecanismo propuesto para esta reacción.

EXPERIMENTO 2. REACCIÓN DEL BIURET.

Preparar una serie de 5 tubos de ensayo, etiquetar y numerar del 1 al 5, añadir 1 mL de las siguientes

soluciones:

Tubo Soluciones

1 Agua

2 Peptona al 2%

3 Caseína al 2%

4 Gelatina al 2%

5 Albúmina al 2%

Añadir 2 mL de solución de NaOH al 10% ¡PRECAUCIÓN!

Agregar de 3 a 5 gotas de solución de CuSO4 al 1%.

Agitar los tubos y observar la reacción que se produce en cada caso. La aparición de una coloración

violeta o rosa en no más de 20 minutos debe considerarse como prueba positiva.






= = 18

2) Ilustrar sus resultados

3) ¿Se puede considerar la reacción del Biuret como característica para todas las proteínas? ¿Por qué?

4) Escribir la reacción.

EXPERIMENTO 3. REACCIÓN XANTOPROTÉICA.

Preparar una serie de 5 tubos de ensayo, etiquetar y numerar del 1 al 5, añadir en cada uno 2 mL de las


Tubo Soluciones

1 Agua

2 Peptona al 2%

3 Caseína al 2%

4 Gelatina al 2%

5 Albúmina al 2%

Añadir 1 mL de HNO3 concentrado ¡CON CUIDADO!

Incubar en baño María a ebullición durante 2 minutos. Observar una coloración amarilla característica.

Enfriar esta solución y añadir 3 gotas de NH4OH concentrado, haciéndolas resbalar cuidadosamente por

las paredes del tubo, para estratificar.

Observar un anillo naranja en la interfase.



2) Ilustrar sus resultados

3) Escribir la reacción.

4) ¿Se puede considerar esta reacción general para todas las proteínas?

5) Explicar por qué se tiñe de amarillo la piel al contacto con el HNO3.

EXPERIMENTO 4. REACCIÓN DE AMINOÁCIDOS AZUFRADOS.

Preparar una serie de 5 tubos de ensayo, etiquetar y numerar del 1 al 5, añadir en cada uno 2 mL de las


Tubo Soluciones

1 Agua

2 Peptona al 2%

3 Caseína al 2%

4 Gelatina al 2%

5 Albúmina al 2%




= = 19

Agregar 2 mL de NaOH al 10% a cada tubo. ¡PRECAUCIÓN!

Incubar en baño María a ebullición durante 2 minutos.

Añadir a todos los tubos 0.5 mL de solución de Pb(CH3COO)2.

Colocar los tubos en baño María a ebullición por 10 min. El oscurecimiento de la solución o la formación

de un precipitado negro indica la presencia de aminoácidos azufrados.



2) Escribir la reacción química que se ha efectuado.


4) ¿Qué sustancias pueden interferir en esta reacción?

EXPERIMENTO 5. REACCIÓN DE NINHIDRINA.

Emplear 6 cuadros de papel filtro Whatman No. 1 de medidas 2 x 2 cm sobre una hoja blanca y numerar

del 1 al 6 sobre la misma hoja.

Agregar 1 gota de las soluciones siguientes:

Papel Soluciones

1 Agua

2 Prolina al 2%

3 Peptona al 2%

4 Caseína al 2%

5 Gelatina al 2%

6 Albúmina al 2%

¡PRECAUCIÓN! Usar guantes o pinzas para manipular el papel.

Añadir una gota de solución de Ninhidrina en butanol al 0.1%.

Colocar el papel en el horno a 110 °C durante 10 minutos. ¡PRECAUCIÓN! Avisar a su Profesor.

Registrar sus resultados.


1) Describir el aspecto de la reacción.




5) ¿Qué sustancias dan positiva la reacción de la Ninhidrina, además de las proteínas, péptidos y

aminoácidos?




= = 20

EXPERIMENTO 6. PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR METALES PESADOS.

(PROPIEDADES FÍSICO–QUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS)

Preparar una serie de 4 tubos de ensayo, etiquetar y numerar del 1 al 4, agregar 1 mL de peptona al 2% a

cada tubo. Rotúlelos como P1–P4 (P=peptona).

Preparar una serie de 4 tubos de ensayo, etiquetar y numerar del 1 al 4, agregar 1 mL de gelatina al 2% a

cada tubo. Rotúlelos como G1–G4 (G=gelatina).

A los tubos 1 agregar 2 gotas de solución de FeCl3 al 2%

A los tubos 2 agregar 2 gotas de solución de AgNO3 al 2%

A los tubos 3 agregar 2 gotas de solución de HgCl2 al 2%

A los tubos 4 agregar 2 gotas de solución de Pb(CH3COO) 2 al 2%

Observar y registrar los cambios; posteriormente agregar un exceso de 5 gotas a cada tubo y repita la

observación.


1) Registrar sus observaciones en la tabla, evaluando por medio de cruces (de x a xxx según la turbiedad del

precipitado).

Solución 2 gotas 5 gotas

Serie P Serie G Serie P Serie G

FeCl3

AgNO3

HgCl2

Pb(CH3COO) 2


3) ¿Tiene alguna influencia el pH en el efecto de los metales pesados sobre las proteínas?

4) ¿Tienen todos los metales pesados el mismo efecto precipitante sobre las proteínas?

EXPERIMENTO 7a. PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR EFECTO DE ÁCIDOS FUERTES.

Prepare una serie de 4 tubos de ensayo, etiquetar y numerar del 1 al 4, al tubo 1 agregue 2 mL de peptona

al 2%, al tubo 2 agregue 2 mL de caseína al 2%, al tubo 3 agregue 2 mL de gelatina al 2% y al tubo 4

agregue 2 mL de albúmina al 2%. Seguidamente, añada a cada tubo estratificando 2 mL de CCl3COOH al

5%. Observe y registre sus resultados.






= = 21

2) Registrar sus resultados valorando la turbidez con cruces (de cero a tres cruces) en la siguiente tabla:

Sustancia CCl3COOH

Peptona

Gelatina

Caseína

Albúmina

3) ¿Cómo puede explicar el efecto desnaturalizante del CCl3COOH y en general de cualquier ácido?

EXPERIMENTO 7b. PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS EN ORINA

Preparar 2 tubos de ensayo, etiquetar y marcar como orina normal y orina de paciente nefrótico, agregar

3 mL de la orina correspondiente a cada tubo.

Añadir 2 mL de la mezcla HNO3-metanol resbalando lentamente por la pared de los 2 tubos, para estratificar.


1) Observar, ilustrar y describir lo que sucede en la interfase.

2) Explicar el fenómeno observado.

EXPERIMENTO 8. PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR EFECTO DEL ALCOHOL.

Preparar una serie de 4 tubos de ensayo, etiquetar y numerar, al tubo 1 agregue 2 mL de peptona al 2%, al

tubo 2 agregue 2 mL de caseína al 2%, al tubo 3 agregue 2 mL de gelatina al 2% y al tubo 4 agregue 2 mL

de albúmina al 2%.

Agregar cuidadosamente 3 mL de CH3CH2OH al 96°, observar que sucede en la interfase.


1) ¿Observa turbidez en todos los tubos?

2) Registrar los resultados valorando la turbidez con cruces (de cero a tres cruces) en la siguiente tabla:

Sustancia CH3CH2OH

Peptona

Gelatina

Caseína

Albúmina

EXPERIMENTO 9. DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE LA CASEÍNA.

Preparar una serie de 9 tubos de ensayo, etiquetar y numerar del 1 al 9.

Agregar los reactivos, según se indica en la tabla siguiente:




= = 22

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Agua destilada mL 8.4 7.8 8.8 8.5 8.0 7.0 5.0 1.0 7.4

Ácido acético 1N mL - - - - - - - - 1.6

Ácido acético 0.1N mL - - 0.2 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 -

Ácido acético 0.01N mL 0.6 1.2 - - - - - - -

Caseína al 5% en acetato de sodio 0.1N mL 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Agitar los tubos y observe el grado de turbidez o la precipitación que se produce en el tiempo cero (en el

momento) y después de 15’ y 30’.


1) Ilustrar los resultados.

2) Registrar sus observaciones en la tabla valorando con cruces.

3) Calcule el pH teórico de cada tubo, aplicando la ecuación de Henderson-Hasselbalch y registrelo en la tabla.

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9

pH teórico

Observación al tiempo cero

Observación a los 15 minutos

Observación a los 30 minutos

4) ¿Cuál es el punto isoeléctrico de la caseína? Discuta sus resultados comparando con el teórico.

TABLA DE RESULTADOS DE ALGUNAS PROPIEDADES QUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS

SUSTANCIA REACCIÓN

Millon Biuret Xantoprotéica a.a. azufrados Ninhidrina

Agua

Glicina

Prolina

Peptona

Gelatina

Caseína

Albúmina




= = 23

PRÁCTICA No. 4

CINÉTICA QUÍMICA Y CATÁLISIS

De acuerdo con la Ley de Acción de Masas, la velocidad de una reacción química depende de la

concentración de las sustancias que intervienen en la reacción. Esta Ley establece que: “La magnitud de

una reacción es proporcional a la masa activa de las sustancias reaccionantes presentes en ese

momento”. El término masa activa significa la concentración molecular o sea, la cantidad presente por

unidad de volumen. Si reaccionan:

V1

A + B C + D

V2

La velocidad V1 con que reaccionan A y B para producir C y D depende de la concentración de cada reactivo

y de la afinidad que tengan para reaccionar entre sí, pero como esto se puede considerar constante, podemos

decir que: V1 = k1[A][B].

La velocidad V2 con que reaccionan C y D para producir A y B depende a su vez, de la concentración de C y

D y de la afinidad. Por lo tanto podemos decir también que: V2 = k2[C][D]. Cuando se alcanza el equilibrio

químico, las dos velocidades son iguales. Es decir: V1 = V2

Sustituyendo estos valores por sus equivalentes, tenemos:

k1[A][B] = k2[C][D]

k1 [C][D]

---- = ---------

k2 [A][B]

Como el cociente de dos constantes es siempre igual a una constante podemos decir que:

[C][D]

keq = ---------

[A][B]

Que es la expresión matemática de la Ley de Acción de Masas y keq se conoce como Constante de Equilibrio.




= = 24

VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN QUÍMICA

Las reacciones químicas de acuerdo al número de moléculas que toman parte de ellas se clasifican en:

Monomoleculares: Cuando participa una sola molécula. Ejemplo: A B

Bimoleculares: Cuando participan dos moléculas. Ejemplo: A + B AB

Trimoleculares: Cuando participan tres moléculas simultáneamente. Ejemplo: A + B + C ABC

Las reacciones trimoleculares son muy raras y reacciones de más de tres reaccionantes no se conocen.

Cuando se estudia la cinética de una reacción, tiene más importancia conocer el orden de la reacción que el

tipo. El orden de una reacción nos indica la relación entre la velocidad y la concentración de los reactivos,

por lo que se clasifican en:

Reacciones de orden cero. Su velocidad no es afectada por la concentración. Está determinada por algún

otro factor limitante como absorción de luz, velocidad de difusión, etc.

Reacciones de primer orden. Su velocidad de reacción es directamente proporcional a la concentración de

una de las sustancias reaccionantes.

Reacciones de segundo orden. Su velocidad de reacción es proporcional a la concentración de dos

sustancias reaccionantes.

Reacciones de tercer orden. Su velocidad de reacción es proporcional a la concentración de tres

sustancias reaccionantes.

La mayor parte de las reacciones enzimáticas se caracterizan por seguir el modelo correspondiente a las

reacciones de primer orden. Matemáticamente la reacción puede representarse así:

dc

----- = Ke

dt

dt = tiempo, dc = concentración del material, Ke = constante específica de velocidad de reacción

Si representamos por a la concentración inicial de material y por x la cantidad que ha reaccionado en el

tiempo t, la expresión a-x significa concentración del material en el tiempo t. La ecuación anterior puede

expresarse en función de a, x y t y al integrarla nos queda:

2.303 a

Ke =------------ x log --------

t (a – x)

Cuando se ha completado la descomposición de la mitad del material, la ecuación se simplifica y queda:




= = 25

2.303 (log 2)

Ke =-------------------------

t1/2

Donde t1/2 es el período de vida media, es decir, el tiempo necesario para que se descomponga la mitad de

una cantidad dada de material reaccionante.

Desde hace muchos años se sabía en forma empírica que la velocidad de muchas reacciones aumenta al

aumentar la temperatura. Arrhenius encontró una relación que expresa matemáticamente la forma como la

temperatura afecta la velocidad de una reacción, la cual está dada por la siguiente ecuación:

d(ln K) E

----------- = ----------

dt RT2

La cual indica que el cambio en el logaritmo natural de la constante de velocidad de una reacción es

inversamente proporcional al cuadrado de la temperatura absoluta multiplicada por la constante de los gases.

E es la energía de activación. Actualmente se considera que para que las moléculas puedan reaccionar deben

ser primero activadas, es decir, requieren una cantidad de energía E. Integrando entre límites la ecuación de

Arrhenius:

K2 E (t2 - t1)

log ------- = -------------

K1 2.3 (R t1 t2)

K2 E (t2 - t1)

log ------- = ----------------

K1 2.3 (1.99) (t1 t2)

K2 0.219E (t2 - t1)

log ------- = ----------------------

K1 (t1 t2)

Si consideramos que E = 1200 calorías al aumentar la temperatura de 22°C a 32°C, tendríamos:

K2 0.219 x 1200 x (305 - 295)

log ------- = --------------------------------------- = 0.29

K1 (295 x 305)

K2

antilog log ------- = antilog 0.29

K1




= = 26

K2

------- = 2

K1

Esto quiere decir que por cada 10°C de aumento la velocidad de la reacción se duplica. En la mayor parte de

las reacciones se observa este aumento bajo ciertas temperaturas límites.

Se sabe que muchas reacciones químicas son afectadas por el pH del medio o el aumento de [H+], sobre todo

aquellas en las que participan ácidos. Actualmente se acepta que las moléculas deben ser activadas antes de

que puedan reaccionar. Aparentemente el pH ácido favorece la ionización y el estado iónico se puede

considerar como un estado activado.

La velocidad de una reacción química frecuentemente es afectada por la presencia de “sustancias extrañas”

que permanecen inalteradas al terminar la reacción. Cualquier sustancia que sea capaz de acelerar una

reacción química y que no sea consumida por ellas, se denomina catalizador y el proceso se conoce con el

nombre de catálisis. La función de un catalizador es disminuir la energía de activación, por lo que las

moléculas son activadas con menor cantidad de energía produciéndose reacciones más rápidas. En un

principio se supuso que los catalizadores actuaban por “presencia”. Es decir, que no intervenían en los

procesos que catalizaban. Sin embargo, actualmente se acepta que el catalizador se combina con el sustrato

formando un complejo intermediario inestable y altamente reactivo. Supongamos la reacción: A + B AB.

Esta reacción en condiciones normales se efectúa muy lentamente pero si se añade un catalizador C

apropiado, tenemos: A + B + C (AC) + B AB + C. Estas reacciones son rápidas y el catalizador

puede ser usado una y otra vez. Estas sustancias pueden ser de naturaleza inorgánica o bien sustancias

orgánicas complejas producidas por las células y son denominadas enzimas. La sacarosa es un disacárido no

reductor, pero al hidrolizarse, cada molécula libera una molécula de glucosa y una de fructosa, ambas

reductoras. Basándose en esto es posible visualizar y cuantificar la hidrólisis de la sacarosa midiendo la

concentración de azúcares reductores con algún reactivo apropiado. Una de las principales diferencias entre

los catalizadores inorgánicos y las enzimas es que los primeros solo son capaces de acelerar un proceso que

ya está en marcha, mientras que las enzimas son capaces de iniciar una nueva reacción. Para esta práctica

emplearemos como enzima la sacarasa, también conocida como invertasa o fructofuranosidasa la cual es

una de las enzimas mejor conocidas y estudiadas. Actúa hidrolizando los azúcares que contienen fructosa.

Así hidroliza la estaquiosa (tetrasacárido), la rafinosa (trisacárido), y alcanza su máxima velocidad con la

sacarosa (disacárido). Se puede medir la hidrólisis observando el cambio en la rotación óptica o valorando el

poder reductor de los productos obtenidos.




= = 27

EXPERIMENTO 1. COMPROBACIÓN DE LA LEY DE ACCIÓN DE MASAS.

Agregar en un vaso de precipitado de 250 mL de capacidad: 100 mL de agua destilada, 1 mL de solución

de sulfocianuro de amonio (NH4SCN) 0.2 M y 1 mL de solución de cloruro férrico (FeCl3) 0.2M en HCl

0.1N mezclando hasta lograr la completa homogeneidad. Observar la aparición de una coloración roja,

debido a la formación de sulfocianuro férrico (Fe(SCN)3).

Añadir en cuatro frascos de gerber 25 mL en cada uno la mezcla reaccionante anterior, enseguida agregar

a cada vaso los reactivos descritos en la tabla siguiente.

Frasco Reactivo

FeCl3 0.2M en HCl 0.1N NH4SCN 0.2M NH4Cl

1 0.5 mL 0.5 mL --

2 1.0 mL 1.0 mL --

3 -- -- 5.0 mL

4 Testigo --

Registre sus observaciones para el reporte de laboratorio.

Evidencia de aprendizaje


2) Describir que observó de acuerdo a la intensidad de la coloración en cada frasco y según a la Ley de

Acción de Masas y al principio de Le Chatelier, explique el fenómeno.

EXPERIMENTO 2. VELOCIDAD DE DESCOMPOSICIÓN DEL PERÓXIDO DE HIDRÓGENO (H2O2).

Colocar un dispositivo de titulación. Llenar la bureta de 25 mL con una solución de permanganato de

potasio (KMnO4) 0.01M.

Depositar en un matraz Erlenmeyer de 250 mL un volumen de 5 mL de una solución problema de H2O2

(pregunte a su profesor) y 2 mL de H2SO4 (1:6). ¡PRECAUCIÓN!

Calentar la mezcla en un soporte universal con tela de asbesto hasta casi ebullición y en caliente titule. El

punto final de la titulación lo observará cuando persista un ligero color rosa, por exceso de la solución de

permanganato. El H2SO4 y el calentamiento tienen por objeto impedir la formación de MnO2. Haga esta

determinación por duplicado y calcule el promedio de las dos determinaciones (esta será su concentración

del problema al tiempo cero).

Preparar una mezcla de 50 mL de sangre desfibrinada al 0.06% y 50 mL de una solución problema de

peróxido de hidrógeno, al momento de realizar la mezcla comienza a contar el tiempo.




= = 28

Depositar alícuotas de 10 ml de la mezcla de reacción en un matraz Erlenmeyer a los 5, 10, 20, 30 y 40

minutos para titular en cada caso, recordando agregar 2 mL de solución de H2SO4 (1:6), calentar hasta

ebullición y titular en la forma ya explicada.


1) Registrar sus resultados en la siguiente tabla para el reporte de laboratorio:

2) Determinar el orden de reacción gráficamente. Para calcular la Ke a cada tiempo se debe utilizar la

ecuación:

2.303 a

Ke = ------------ x log -----------------

t (a – x)

3) Escribir las reacciones químicas que se han efectuado.

EXPERIMENTO 3. INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA

REACCIÓN QUÍMICA.

Disponer de baños María a diferentes temperaturas (una por equipo) pregunte al Profesor.

Añadir 0.25 g de yoduro de potasio (KI) y agregar 25 mL (medir con PROBETA) de solución de H2SO4

1:6 en un vaso de precipitado de 100 mL.

Agitar hasta disolución completa y agregar agua destilada completando a 50 mL (medir con PROBETA).

Esta solución se denominará Solución de ácido yodhídrico (HI, rotúlelo con este nombre). Nota:

Considere que se utilizará en este experimento (25 mL) y en el siguiente (25 mL).

Preparar una serie de 5 tubos de ensaye, etiquetar y numerar del 1 al 5, agregar los reactivos que se

muestra en la tabla siguiente y preincube cada tubo según corresponda.

Tiempo/seg KMnO4 0.01M/mL (a – x) moles/litro log a/(a-x) Ke

0

300

600

1200

1800

2400




= = 29

Tubo

Solución 1 2 3 4 5

HI mL 5 5 5 5 5

Na2S2O3 0.02N

(tiosulfito de sodio) mL 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

Almidón No. gotas 5 5 5 5 5

Preincubar 5 minutos a: 5 °C 25 °C 40 °C 60 °C 90 °C

Agregar a cada tubo H2O2 al 0.2% como se indica en la tabla, considere realizar cada tubo por separado

con el objetivo de poder medir con mayor precisión posible el tiempo en que aparece súbitamente un color

azul intenso.

Tubo

Solución

1 2 3 4 5

H2O2 al 0.2% mL 2 2 2 2 2


1. Registrar sus resultados en la tabla para el reporte de laboratorio:

Temperatura

(°C)

Tiempo de aparición del color azul

(segundos)

5

25

40

60

90

2. Escribir las reacciones químicas que se han efectuado.

3. Trazar la gráfica de 1/tiempo de reacción en las ordenadas contra la temperatura en las abscisas.

EXPERIMENTO 4. EFECTO DE LA [H+] SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN QUÍMICA.

Prepare una serie de 5 tubos de ensaye, etiquételos y numérelos del 1 al 5.

Agregue los reactivos según se indica en la tabla siguiente:




= = 30

Frasco

Solución

1 2 3 4 5

HI mL 5 5 5 5 5

Na2S2O3 0.02N mL 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

Almidón gotas 5 5 5 5 5

H2O destilada mL 5

HCl 0.01N mL 5

HCl 0.1N mL 5

HCl 1N mL 5

HCl 2N mL 5

Agregar a cada tubo H2O2 al 0.2% como se indica en la tabla, considere realizar cada frasco por separado

con el objetivo de poder medir con mayor precisión posible el tiempo en que aparece súbitamente un color

azul intenso.

Frasco

Solución

1 2 3 4 5

H2O2 al 0.2% mL 2 2 2 2 2


1) Registrar sus resultados en la siguiente tabla para el reporte de laboratorio:

[H+] Tiempo de reacción

(segundos)

1 x 10-7

1 x 10-2

1 x 10-1

1

2

2) Trazar una gráfica con el 1/tiempo en segundos en las ordenadas y la concentración de H+ en las abscisas

según los resultados obtenidos.




= = 31

EXPERIMENTO 5. EFECTO DE UN CATALIZADOR INORGÁNICO SOBRE LA VELOCIDAD

DE HIDRÓLISIS DE LA SACAROSA

Preparar dos tubos de ensayo y añadir en cada uno 2 mL de solución de sacarosa 0.05M.

Un tubo quedará como testigo (etiquetar con la inicial T) y al otro se agregar 3 gotas de ácido sulfúrico

1:6 (etiquetar como H2SO4).

Incubar en baño María a ebullición durante 15 minutos.

El tubo que contiene H2SO4 neutralizar con 1 mL de Hidróxido de Sodio al 10%.

Añadir al tubo testigo el reactivo de Fehling, agregando 2 mL de la solución “A” más 2 mL de la

solución “B”. Repetir este mismo paso para el tubo que contiene ácido sulfúrico 1:6.

Incubar ambos tubos en baño María a ebullición por 10 minutos al cabo de los cuales se retiran del

baño, dejándose enfriar. Observar si existe un precipitado rojo de óxido cuproso (Cu2O) en ambos tubos y

anote sus resultados.


1) ¿Se puede considerar al H2SO4 como un catalizador? ¿Por qué?

EXPERIMENTO 6. EFECTO DE UN CATALIZADOR BIOLOGICO (ENZIMA) SOBRE LA

VELOCIDAD DE HIDRÓLISIS DE LA SACAROSA

Preparar dos tubos de ensayo, añadir a un tubo 2 mL de solución de sacarosa 0.05M y 1 mL de solución

reguladora o buffer de acetato de sodio 0.05M a pH de 4.7. Repetir este mismo paso para el otro tubo.

Un tubo quedará como testigo (etiquetar con la inicial T) y al otro añadir 0.2 mL de solución de invertasa

(etiquetar como Invertasa), mezclando bien el contenido del tubo.

Incubar en baño María a 40°C durante 15 minutos.

Añadir al tubo testigo el reactivo de Fehling, agregando 2 mL de la solución “A” más 2 mL de la

solución “B” y agitar hasta que se mezcle bien. Repetir este mismo paso para el tubo que contiene la

invertasa.

Incubar ambos tubos en baño María a ebullición por 10 minutos al cabo de los cuales se retiran del

baño, dejándose enfriar. Observar si existe un precipitado rojo de óxido cuproso (Cu2O) en ambos tubos y

anote sus resultados.


1) Comparar este experimento con el anterior y explique qué sucede.




= = 32

PRÁCTICA No. 5

CINÉTICA ENZIMÁTICA

FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

La vida depende de una serie de reacciones químicas cuyo curso y velocidad están determinados por la presencia

de diversos catalizadores orgánicos denominados enzimas: (del griego en = en, zymo = fermento). La mayor parte

de las reacciones biológicas serían cinéticamente insignificantes si no fuera por las enzimas. Las enzimas desde el

punto de vista químico son compuestos que pertenecen al grupo de las proteínas (aunque algunas solo funcionan

asociadas a un grupo no proteico, grupo prostético o coenzima). Debido a su carácter proteínico, las enzimas son

muy sensibles a cualquier cambio físico, químico, o fisicoquímico. Así, cualquier cambio en la temperatura, en el

pH, en la fuerza iónica, la adición de sales, la presencia de agentes oxidantes o reductores, la presencia de metales

pesados, etc., producen modificaciones profundas en su actividad. En general, cualquier factor que sea capaz de

desnaturalizar a las proteínas será capaz de alterar su actividad.

NATURALEZA QUÍMICA DE LAS ENZIMAS

Estructuralmente todas las enzimas son proteínas simples o complejas. La parte proteínica de las enzimas se

denomina apoenzima, la parte no proteínica puede ser coenzima, si se separa fácilmente de la proteína. Las

coenzimas pueden ser comunes a varias enzimas y no actúan como catalizadores ya que se transforman en la

reacción que catalizan y requieren de otra enzima para regenerar su actividad. La mayor parte de las

coenzimas están relacionadas con las vitaminas. Si la parte no proteínica se encuentra firmemente unida a la

proteína por enlace covalente y no es posible separarla por diálisis, se denomina grupo prostético. Hay

varios factores que afectan la velocidad de una reacción catalizada por enzimas. Algunos de ellos son:

temperatura, pH, concentración de sustrato, concentración de enzima e inhibidores.

Temperatura. La velocidad de las reacciones químicas aumenta al incrementar la temperatura, originando

aumento en la energía cinética y en las velocidades medias de las moléculas con el resultado de una mayor

probabilidad de colisiones efectivas. Sin embargo, las enzimas se inactivan y desnaturalizan a temperaturas

elevadas. La mayor parte de las enzimas tienen una temperatura óptima, en la cual catalizan con una

velocidad máxima.

pH. La actividad de la mayoría de las enzimas depende del pH debido a la participación de iones [H+] o iones

[OH-] en las reacciones, además que se afecta la de los grupos funcionales. La mayoría de las enzimas tienen

un pH óptimo en el cual su actividad es máxima.




= = 33

Concentración de la enzima. La velocidad de una reacción aumenta en proporción directa a la concentración

de la enzima que la cataliza. La interacción enzima – substrato cumple la Ley de Acción de Masas. Se emplea

con frecuencia la velocidad de una reacción como medida de concentración de la enzima manteniendo fija la

concentración de substrato.

Concentración de sustrato. Si se trabaja con una concentración fija de enzima la velocidad inicial de

reacción aumenta incrementando la concentración del sustrato. Con el tiempo se alcanza un máximo y la

adición de más sustrato ya no influye sobre la velocidad, ya que la enzima se saturó.

La velocidad de cualquier reacción cambia al modificarse la temperatura (T°), debido a los cambios de

energía cinética. Generalmente por cada 10 grados centígrados de aumento en la T° se duplica la velocidad,

esto se conoce como la relación de Van´t Hoff o coeficiente de temperatura QT10. Sin embargo, debido a la

constitución proteínica de las enzimas, las temperaturas altas pueden producir desnaturalización y una

disminución marcada en la actividad catalítica. Para la gran mayoría de enzimas de animales homeotermos,

la T° óptima está alrededor de 37°C; cerca de los 60°C la mayor parte de las enzimas se inactivan, hecho que

se aprovecha en la técnica de pasteurización.

El pH es uno de los factores que más afecta la actividad de las enzimas, ya que puede afectar la estabilidad

de la molécula por desnaturalización o bien afectar su carga eléctrica. Muchos de los grupos ionizables

presentes en la molécula de la enzima pueden ser necesarios para la catálisis y los cambios de pH afectan el

grado de ionización. Para que se realice la unión en el complejo enzima–sustrato (ES) es necesaria una

adecuada distribución de cargas en ambas moléculas. El pH óptimo es aquel en el cual ciertos grupos

funcionales poseen la carga apropiada para asegurar la formación del complejo ES en las mejores

condiciones. Además, como ya se mencionó, los pH extremos provocan desnaturalización de la molécula

enzimática y por tanto inactivación de la misma. Cada enzima posee un pH óptimo en el cual su actividad es

máxima, para la mayoría de las enzimas la actividad óptima se encuentra entre los valores de pH= 6 a 8. Sin

embargo existen excepciones, por ejemplo, para la pepsina del jugo gástrico es máxima a un pH=1.5 que es

muy ácido, o para la fosfatasa alcalina que se encuentra en huesos y otros órganos cuyo pH=9.5.

Actualmente se acepta que la reacción enzimática se efectúa a través de la formación de un complejo enzima-

sustrato, lo cual puede representarse en forma muy simplificada así:

S + E [ES] P + E

Si [E] es la concentración total de enzima y [ES] es la enzima combinada, entonces [E – ES] es la

concentración de enzima libre. Recordando la Ley de Acción de Masas, tenemos:




= = 34

V1 = K1 – [E – ES] [ES]; V2 = K2 – [ES]; V3 = K3 – [ES]

La velocidad de formación (Vf) del complejo [ES] depende de V1 mientras que la velocidad de degradación

(Vd) depende de V2 + V3. Por lo tanto en el equilibrio tenemos:

Vf = Vd es decir: V1 = V2 + V3

Sustituyendo sus valores nos queda: K1[E – ES] [S] = K2[ES] + K3[ES]. Dividiendo ambos miembros entre

K1 y [ES] nos queda:

K1[E – ES] [S] (K2 + K3)[ES]

---------------------------- = ------------------------------

K1[ES] K1[ES]

Simplificando:

[E – ES] [S] (K2 + K3)

------------------------ = ---------------------- = Km (Constante de Michaelis-Menten)

[ES] K1

La constante de Michaelis – Menten se utiliza como una medida de la afinidad entre la enzima y el sustrato,

aunque no es propiamente la constante de afinidad. La constante de Michaelis – Menten (Km) se define como

la concentración de sustrato cuando la reacción adquiere la mitad de su velocidad máxima. Cuando esto

sucede: [E – ES] = [ES]. Y por lo tanto, sustituyendo: Km = [S]. Si en una reacción enzimática se mantiene

constante la concentración de la enzima y todos los demás factores que pueden modificar la actividad, se

observa experimentalmente que al aumentar la concentración del sustrato, aumenta progresivamente la

velocidad de la reacción hasta llegar a un máximo (velocidad máxima) después del cual ya no se afecta la

velocidad aunque se trabaje a concentraciones más altas de sustrato. En algunas enzimas se observa incluso

una disminución en la actividad si se aumenta demasiado la concentración de sustrato.

Durante mucho tiempo se pensó que los catalizadores eran sustancias que actuaban por presencia debido a las

concentraciones tan pequeñas y a que podían recuperarse inalterados al final de la reacción. Sin embargo, se

sabe que la velocidad de reacción de acuerdo a la Ley de Acción de Masas depende de su concentración de

tal manera que la velocidad es directamente proporcional a la concentración de enzima, lo que se expresa

como: V = K[E]. Así que la gráfica que se obtiene al expresar la velocidad de reacción en función de la

concentración de enzima es una recta con pendiente positiva.




= = 35

EXPERIMENTO 1. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Preparar una serie de 7 tubos de ensaye, etiquetar y numerar del 1 al 5.

Agregar los reactivos y preincubar, según se indica en la tabla siguiente:

Tubos

Reactivos 1 2 3 4 5 6 7

Sustrato almidón 8 mg/mL en Buffer

de fosfatos 0.02M, pH=7 mL --- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Buffer de fosfatos 0.02M, pH = 7 mL --- 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

Agua destilada mL 5.5 3 3 3 3 3 3

Preincubar 5 minutos a 25°C 5°C 25°C 40°C 50°C 60°C 90°C

Posterior a este tiempo, agregar la enzima conservada en hielo, como se indica en la tabla siguiente:

Tubos

Reactivos 1 2 3 4 5 6 7

Enzima (sol. de amilasa) mL --- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Agitar todos los tubos y colocar nuevamente cada tubo en su respectivo baño como se indicó en la primera

tabla, incubar durante 15 minutos.

Agregar a todos los tubos, 1 mL del reactivo de ácido 3,5 dinitrosalicílico (este reactivo desarrolla un

color rojo caoba en presencia de azúcares reductores).

Agitar bien y colocar en baño María a ebullición durante 10 minutos.

Retirar y enfríar en baño de hielo.

Leer en el espectrofotómetro a 540 nm, empleando el tubo 1 como blanco.


1) Registre sus resultados en la siguiente tabla para el reporte de laboratorio.

EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

Tubo Temperatura Absorbancia

1 25 °C Blanco

2 5 °C

3 25 °C

4 40 °C

5 50 °C

6 60 °C

7 90 °C

2) Trazar una gráfica con los datos obtenidos, donde la densidad óptica serán las ordenadas y la To las abscisas.




= = 36

EXPERIMENTO 2. EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA



Reactivos Tubos

1 2 3 4 5 6

Sustrato (sol. de almidón 8 mg/mL) mL --- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Buffer de fosfatos al pH indicado 7 5 6 7 8 9

mL 5 4 4 4 4 4

Preincubar a 40ºC por 5 minutos

Agregar la enzima conservada en hielo, como se indica en la tabla siguiente:

Reactivos Tubos

1 2 3 4 5 6

Enzima (sol. de amilasa) mL --- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Agitar los tubos e incubar nuevamente en el baño María a 40oC, durante 15 minutos.

Agregar a todos los tubos, 1 mL del reactivo de ácido 3,5 dinitrosalicílico.


Retirar y enfríar en un baño de hielo.

Determinar la densidad óptica en el espectrofotómetro a 540 nm empleando el tubo 1 como blanco.


1) Registrar sus resultados en la tabla siguiente para el reporte de laboratorio.

EFECTO DEL pH EN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

TUBO pH D.O.

1 7 Blanco

2 5

3 6

4 7

5 8

6 9

2) Trazar la gráfica correspondiente donde las densidades ópticas serán las ordenadas y el pH las abscisas.

3) Basándose en sus resultados diga ¿Cuál es el pH óptimo de la amilasa?

4) ¿Cuál es el azúcar que se libera en la hidrólisis de este polisacárido?




= = 37

EXPERIMENTO 3. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO SOBRE LA

VELOCIDAD DE REACCIÓN



Tubo

Reactivos 1 2 3 4 5 6 7 8

Sustrato almidón 8 mg/mL en Buffer de

fosfatos 0.02M, pH=7 mL 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 7.5 ---

Buffer de fosfatos 0.02M, pH=7 mL 7.0 6.5 5.5 4.5 3.5 2.5 0.0 8.0

Preincubar a 40ºC por 5 minutos


Tubo

Reactivos 1 2 3 4 5 6 7 8

Sol. de enzima (amilasa) mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 ---

Agitar todos los tubos e incubar nuevamente en el baño María a 40oC, durante 15 minutos.



Retirar y enfriar en un baño de hielo.




EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO EN LA

ACTIVIDAD ENZIMATICA

Tubo

Concentración de

sustrato: mg/mL

Absorbancia

1 0.5

2 1

3 2

4 3

5 4

6 5

7 7.5

8 ------ Blanco

2) Trazar una gráfica con los resultados obtenidos donde las densidades ópticas serán las ordenadas y las

concentraciones del sustrato las abscisas.

3) Determinar el valor de KM para el sistema almidón/amilasa en estas condiciones. KM=____ mg de almidón/mL.




= = 38

EXPERIMENTO 4. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA



Reactivos Tubos 1 2 3 4 5 6

Sustrato almidón 8 mg/mL en Buffer de fosfatos 0.02M, pH=7 mL --- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Buffer de fosfatos 0.02M, pH=7 mL 1 1 1 1 1 1

Agua destilada mL 5.5 4.9 4.8 4.6 4.2 3.4

Preincubar a 40°C durante 5 minutos


Tubos

Reactivos

1 2 3 4 5 6

Solución de enzima (amilasa) mL --- 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6

Agitar todos los tubos e incubar nuevamente en baño María a 40oC, durante 15 minutos.



Retirar y enfríar en un baño de hielo.



1) Registar sus resultados en la tabla siguiente para el reporte de laboratorio.

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA EN LA ACTIVIDAD

ENZIMÁTICA

Tubo Concentración de

enzima mg/mL

Absorbancia

1 ------- Blanco

2 0.1

3 0.2

4 0.4

5 0.8

6 1.6

2) Trazar una gráfica con base en sus resultados con los valores de Absorbancia en las ordenadas y la

concentración de enzima expresada en mg/mL en las abscisas e interpretar la gráfica obtenida.




= = 39

PRÁCTICA No. 6

GLÚCIDOS

Los glúcidos o carbohidratos se definen como derivados aldehídicos o cetónicos reales o en potencia de

alcoholes polivalentes que poseen en su molécula uno o más carbonos asimétricos. Estos compuestos se

encuentran presentes en todos los seres vivos, en cantidades variables, desempeñando importantes funciones

estructurales y energéticas. Debe recordarse que todas las propiedades químicas de los glúcidos dependen

de sus grupos funcionales, o sea, grupos alcohol y grupo carbonilo (aldehídico o cetónico). Los glúcidos se

clasifican, según el número de compuestos hidrocarbonados simples que los constituyen, en 3 grupos;

monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. Los monosacáridos no se pueden desdoblar por hidrólisis en

compuestos más sencillos. A su vez se subdividen, según el número de carbonos que contengan, en: triosas,

tetrosas, pentosas, hexosas, etc. Los oligosacáridos, por hidrólisis, dan pocas moléculas de monosacáridos.

En la naturaleza existen varios disacáridos (sacarosa, lactosa, maltosa etc.) y unos cuantos trisacáridos,

tetrasacáridos y pentasacáridos libres. Se pueden obtener por síntesis química en el laboratorio o por

degradación hidrolítica de polisacáridos. Los oligosacáridos poseen propiedades físicas similares a las de los

monosacáridos. Los polisacáridos, por hidrólisis dan muchas moléculas de monosacáridos. Desde el punto

de vista fisiológico se dividen en dos grupos; polisacáridos estructurales y polisacáridos de reserva. Entre

los primeros tenemos en vegetales: la celulosa, los ácidos pecticos y las hemi celulosas. En animales los más

importantes son los llamados mucopolisacáridos, tales como el ácido hialurónico y el condroitin sulfato,

abundantes en varios tejidos y líquidos como el cuerpo vítreo del ojo, el cordón umbilical, el líquido sinovial,

tendones, cartílagos, etc. Entre los polisacáridos nutrientes o de reserva los más importantes son, en

vegetales, los almidones e inulina y en animales, el glucógeno.

Los glúcidos reciben este nombre debido a que la mayor parte de ellos se caracterizan por tener sabor dulce.

Sin embargo, esta propiedad la presentan solamente los mono y oligosacáridos, ya que los polisacáridos son

generalmente insípidos. Otras propiedades que nos permiten diferenciar glúcidos de bajo peso molecular

(monosacáridos y oligosacáridos) de los de elevado peso molecular (polisacáridos), son su solubilidad en

agua y su capacidad para cristalizar.

Las propiedades químicas de los glúcidos dependen de sus grupos funcionales. Todos los glúcidos poseen en

su molécula grupos alcohol y grupos carbonilo, ya sean aldehídicos o cetónicos. Sin embargo, en algunos

glúcidos estos grupos pueden estar bloqueados y por lo tanto, su reactividad química estará ausente. Una

característica química de los aldehídos y cetonas es su carácter reductor, todos los monosacáridos u

oligosacáridos que tengan libre el grupo aldehídico o cetónico serán reductores, mientras que los




= = 40

polisacáridos y oligosacáridos que tengan bloqueados estos grupos serán no reductores. Todos los glúcidos

formados por varios azúcares (oligo o polisacáridos) se pueden hidrolizar por acción enzimática o de ácidos

dando como producto final los monosacáridos y liberando los grupos reductores bloqueados. Existen varias

reacciones químicas que se utilizan para la identificación de los glúcidos, algunas son generales y otras son

específicas para determinar tipo o incluso específicas para cada azúcar. Entre las más utilizadas tenemos: la

formación de osazonas, esta reacción es una de las de mayor utilidad para la identificación de azúcares por

ser específica para cada azúcar. La dan positiva tanto los monosacáridos como los disacáridos reductores

sirviendo para identificarlos el tiempo que tardan en formar la osazona correspondiente, la forma cristalina de

ellas, la solubilidad en caliente o en frío y los puntos de fusión.

Existen métodos para la determinación de las propiedades de los glúcidos. Molish-Udranski es una reacción

general para todos los glúcidos, debido a que el ácido sulfúrico concentrado que contiene el reactivo hidroliza y

deshidrata a los azúcares obteniéndose furfural o hidroximetil furfural como producto final y estas sustancias

son capaces de reaccionar con el alfa naftol formando un compuesto colorido (violeta): Esta prueba es una de

las más sensibles, la dan positiva soluciones de glucosa al 0.001%. Sin embargo, la reacción no es específica,

ya que la dan positiva los aldehídos, las cetonas, y algunos ácidos orgánicos tales como el fórmico, oxálico,

cítrico, etc. La reacción de Fehling, se emplea para el análisis cualitativo y cuantitativo de azúcares se basan

en su propiedad reductora, aunque esta propiedad no sea específica de ellos. Se sabe que los azúcares

reductores son capaces de reducir diversos iones metálicos como el cobre, bismuto, mercurio, plata, etc.,

cuando se encuentran estos en solución alcalina. Este tipo de reacciones son muy empleadas porque los

reactivos son estables, existe poca interferencia con otras sustancias, las reacciones son sensibles y puede usarse

la misma reacción para un análisis cualitativo o cuantitativo. El mecanismo de reacción se lleva a cabo debido

a que algunos compuestos orgánicos que contienen uno o más grupos alcohólicos en su molécula, en este

caso el tartrato de sodio, reaccionan en solución alcalina con los hidróxidos metálicos, formando un complejo

soluble, el cual se disocia muy poco, pero los iones que deja en libertad son suficientes para que produzcan

las reacciones de coloración. La formación de este complejo es esencial para que se produzca un precipitado

con la mayor parte de los metales pesados. El reactivo de Barfoed es una solución de acetato cúprico en ácido

acético y una vez más, se determina la capacidad de los azúcares para reducir el ión cúprico a cuproso (Cu2O).

Esta reacción sirve para diferenciar un monosacárido de un disacárido, ya que los primeros a los tres minutos

reducen el reactivo y los disacáridos necesitan más tiempo para que se lleve a cabo la reacción de reducción,

más o menos unos 15 minutos. La reacción de Bial, sirve para diferenciar pentosas de hexosas, el reactivo

consiste en una solución de orcinol en ácido clorhídrico (HCl) concentrado con una pequeñísima cantidad de

cloruro férrico (FeCl3). El fundamento de esta reacción, igual que la reacción de Molisch, Seliwanoff y otras, se




= = 41

basa en la producción de furfural o hidroximetil furfural cuando se calienta con ácidos concentrados y la

reacción de estos con otras sustancias dando productos coloridos, en este caso las pentosas dan color azul y

las hexosas dan color amarillo o café. La reacción de Seliwanoff sirve para diferenciar aldosas de cetosas.

Las cetosas reaccionan rápidamente mientras que las aldosas lo hacen lentamente. El reactivo es una

solución de resorcinol 0.05% en HCl 1:3 recién preparado. Este compuesto es el que se condensa con el

furfural o sus derivados dando productos coloridos. El reactivo de lugol es una solución de yodo en yoduro

de potasio. Este reactivo reacciona con algunos polisacáridos como los almidones, glucógeno y ciertas

dextrinas formando un complejo de inclusión termolábil que se caracteriza por ser colorido, dando un color

diferente según las ramificaciones que presenta la molécula.

EXPERIMENTO 1. ESTRUCTURA CRISTALINA

Examinar al microscopio los siguientes glúcidos: glucosa, sacarosa, almidón y celulosa.


1) Realizar los esquemas respectivos.

2) Registrar los resultados para el reporte de laboratorio.

3) ¿Cuáles de estos glúcidos tienen estructura cristalina? ¿Por qué?

EXPERIMENTO 2. FORMACIÓN DE OSAZONAS DE ARABINOSA, GLUCOSA, FRUCTOSA,

GALACTOSA, MALTOSA Y LACTOSA (PROPIEDADES DE LOS GLÚCIDOS).

Agregar en un tubo de ensayo 0.1 g de un carbohidrato (arabinosa, glucosa, fructosa, galactosa, maltosa

o lactosa), 0.2 g de clorhidrato de fenilhidrazina (manejar con guantes debido a que es neurotóxica y

cancerígena), 0.3 g de acetato sódico y 4 mL de agua.

Agitar y cubrir el tubo con un tapón de papel procurando que no quede muy cerrado.

Colocar en baño María a ebullición, agitando ocasionalmente.

Determinar el tiempo en que tardan en aparecer los precipitados y si lo hacen en frío o en caliente. La

arabinosa, glucosa, fructosa y galactosa precipitan en caliente, pero la maltosa y la lactosa en frío por

lo que después de 20 minutos de calentamiento se deben retirar del fuego.

Observar al microscopio los cristales de la osazona y de sus compañeros de grupo.


1) Realizar un esquema de los cristales.

2) ¿Por qué la glucosa, la manosa y la fructosa dan la misma osazona?

3) Escribir la reacción que se efectúa.




= = 42

EXPERIMENTO 3. REACCIÓN DE MOLISCH – UDRANSKY

Colocar en una gradilla 6 tubos de ensayo, etiquetar y numerar del 1 al 6.

Al tubo 1 añadir 3 mL de Formaldehído, al tubo 2 añadir 3 mL de Glucosa, al tubo 3 añadir 3 mL de

Fructosa, al tubo 4 añadir 3 mL de Arabinosa, al tubo 5 añadir 3 mL de Sacarosa y al tubo 6 añadir 3

mL de Almidón.

Agregar a todos los tubos 2 gotas del reactivo de Molisch-Udransky (solución de alfa-naftol al 5% en

alcohol) y agitar para mezclar.

Añadir EN LA CAMPANA DE EXTRACCIÓN a todos los tubos ¡PRECAUCIÓN! 1 mL de ácido

sulfúrico concentrado, estratificando (inclinando el tubo y dejando resbalar el ácido LENTAMENTE por

las paredes). La reacción es positiva si aparece en la interfase un anillo de color violeta.



Tubo Solución Clasificación

Mono, di o polisacárido

Resultado

(positivo o negativo)

1 Formaldehído

2 Glucosa

3 Fructosa

4 Arabinosa

5 Sacarosa

6 Almidón

2) Diga por qué la solución de formaldehído da positiva la reacción.

3) ¿Se puede considerar como una reacción útil para diferenciar un glúcido de otro? ¿Por qué?

4) ¿Qué utilidad puede tener la reacción de Molisch–Udransky?


EXPERIMENTO 4. REACCIÓN DE FEHLING


Al tubo 1 añadir el reactivo de Fehling, agregando 2 mL de la solución “A” más 2 mL de la solución “B”

y agitar hasta que se mezcle bien. Repetir este mismo paso para los tubos 2 al 5.

Posteriormente al tubo 1 agregar 3 gotas de solución de Glucosa, al tubo 2 agregar 3 gotas de solución de

Fructosa, al tubo 3 agregar 3 gotas de solución de Arabinosa, al tubo 4 agregar 3 gotas de solución de

Sacarosa y al tubo 5 agregar 3 gotas de solución de Almidón.




= = 43

Colocar los tubos en baño María a ebullición durante 3 minutos.

Dejar enfriar a temperatura ambiente.

Observar y registrar sus resultados.




(reductor o no reductor)

Resultado

(rojo o azul)

1 Glucosa

2 Fructosa

3 Arabinosa

4 Sacarosa

5 Almidón

2) ¿Qué azúcares dan positiva la reacción de Fehling?

3) Explicar por qué algunos azúcares dan negativa la reacción.

4) Mencionar 3 sustancias que usted considere puedan dar positiva la reacción de Fehling y no sean azúcares.


EXPERIMENTO 5. REACCIÓN DE BARFOED


Al tubo 1 añadir 3 mL del reactivo de Barfoed. Repetir este mismo paso para los tubos 2 al 4.

Posteriormente al tubo 1 agregar 1 mL de solución de Glucosa, al tubo 2 agregar 1 mL de solución de

Arabinosa, al tubo 3 agregar 1 mL de solución de Lactosa y al tubo 4 agregar 1 mL de solución de Maltosa.

Colocar los tubos en baño María a ebullición.

Observar y registrar el tiempo que tarda en aparecer el precipitado rojo de óxido cuproso durante la incubación.




(Monosacárido, disacárido, etc.)

Resultado

(minutos)

1 Glucosa

2 Arabinosa

3 Lactosa

4 Maltosa





= = 44

EXPERIMENTO 6. REACCIÓN DE BIAL


Agregar en los 3 tubos de ensayo 3 mL del reactivo de Bial ¡PRECAUCIÓN!

Al tubo 1 agregar 0.5 mL de solución de Glucosa, al tubo 2 agregar 0.5 mL de solución de Arabinosa y al

tubo 3 agregar 0.5 mL de Agua.

Colocar los tubos en baño María a ebullición durante 5 minutos.

Retirar, diluir cada tubo con 5 mL de agua destilada y agregar2 mL de butanol.

Agitar los tubos, dejar reposar durante 5 minutos.

Observar y registrar sus resultados.




(pentosa o hexosa)

Resultado

(azul o amarillo)

1 Glucosa

2 Arabinosa

3 Agua

2) Explicar las diferencias observadas.

EXPERIMENTO 7. REACCIÓN DE SELIWANOFF


Al tubo 1 agregar 1 mL de solución de Glucosa, al tubo 2 agregar 1 mL de solución de Fructosa y al tubo 3

agregar 1 mL de Agua.

Añadir en los 3 tubos de ensayo 0.5 mL del reactivo de Seliwanoff. ¡PRECAUCIÓN!

Colocar los tubos en baño María a ebullición, mida el tiempo exactamente 60 segundos.

En el mismo baño observar los cambios y registrar sus resultados.

Continuar calentando, observar el cambio de color a intervalos de 1 a 5 minutos y registrar sus resultados.

Las cetosas dan una coloración rojo fuego y las aldosas la dan muy débil y muy lentamente.




= = 45




(aldosa o cetosa)

Resultado

(color y minutos)

1 Glucosa

2 Fructosa

3 Agua

2) ¿Observar alguna diferencia en las soluciones?


EXPERIMENTO 8. REACCIÓN DEL LUGOL

Preparar 2 tubos de ensayo y etiquetar.

En un tubo de ensayo añadir 2 mL de solución de almidón, en otro tubo añadir 2 mL de glucógeno.

Agregar una gota de Lugol y registrar el color producido en cada uno de los tubos.

Colocar el tubo que contiene el almidón en baño María a ebullición durante 5 a 10 minutos.

Dejar enfriar a temperatura ambiente observando lo que sucede con la coloración.

Registrar sus resultados.


1) Registrar sus resultados para el reporte de laboratorio.

2) ¿Por qué el complejo almidón – yodo es termolábil?

3) ¿Se puede considerar la reacción del lugol característica para cualquier polisacárido?




= = 46

PRÁCTICA No. 7

OXIDACIONES BIOLÓGICAS

La Bioenergética es la manera en que el ser vivo, utiliza y transforma la energía del medio ambiente. A estos

procesos químicos y físicos se les denominaba respiración. Sin embargo para evitar ambigüedades con el

proceso de la entrada y salida de aire de un compartimiento a otro, se aplica el concepto bioquímico de

bioenergética, incluyendo este término los procesos fotosintéticos. Todos los procesos químicos que

constituyen la respiración conducen a la oxidación de sustancias denominadas metabolitos, hasta CO2 y

H2O. Por regla general todas las reacciones de oxidación son exergónicas, es decir, liberan energía cuando

se efectúan; en ocasiones toda la energía se libera en forma de calor, como cuando se quema u oxida un

pedazo de madera. Sin embargo un organismo viviente no es una máquina térmica y, por tanto, debe poseer

un mecanismo enzimático que le permita capturar y almacenar la energía liberada en los procesos de

oxidación. La utilización o captura de la energía involucra la participación de enzimas específicas capaces de

catalizar la conversión del ADP en ATP (reacción endergónica).

REACCIONES DE OXIDO REDUCCIÓN

Un compuesto químico puede oxidarse de diferentes maneras. La oxidación típica es aquella en la cual el

oxígeno se une a un compuesto (oxigenación), por pérdida de hidrógeno (deshidrogenación) y cuando se

oxida un compuesto perdiendo electrones o cuando gana valencias positivas.

Ejemplos de oxidaciones

Oxigenación 2Cu + O2 2CuO

Deshidrogenación H2S S0 + H2

Pérdida de electrones o

ganancia de valencia positiva

-1e

Fe++ Fe+++

Siempre que se efectúa una oxidación, simultáneamente se efectúa una reducción. Es decir, cuando un

compuesto se oxida, otro forzosamente debe reducirse. Como son fenómenos que ocurren simultáneamente

se denominan fenómenos de óxido reducción o reacciones REDOX.




= = 47

La acción de una sustancia reductora como el hidrosulfito de sodio (NaHSO3), forma leucobases (incoloras)

cuando actúa sobre colorantes oxidados como el azul de metileno (indicador de oxido–reducción). El

proceso inverso (oxidación por pérdida de hidrógeno) se puede realizar en diferentes condiciones y

determinar el tiempo de reacción.

La mayor parte de la energía que utilizan los seres vivos deriva de los procesos de oxidación, y en cada

oxidación se desprende una determinada cantidad de energía que el organismo aprovecha para realizar las

funciones vitales y para efectuar fenómenos sintéticos endergónicos. Todas las oxidaciones biológicas se

caracterizan por su rapidez y por la suavidad con que se realizan, todas se llevan a cabo en medio acuoso, a

pH generalmente neutro y a bajas temperaturas. Esto hace pensar que todos estos procesos están catalizados

por enzimas. Warburg fue uno de los primeros investigadores que trató de explicar las oxidaciones

biológicas suponiendo una activación del oxígeno. Actualmente se sabe que en los tejidos existe un sistema

de enzimas que contienen hierro, mediante el cual el oxígeno molecular se activa y actúa como un agente

oxidante. Wieland Consideraba que el proceso básico en la oxidación de los metabolitos es la activación del

hidrógeno por la acción de enzimas denominadas deshidrogenasas, las cuales transportan el hidrógeno a

diferentes aceptores que pueden ser el oxígeno u otros agentes oxidantes. Szent Györgyi concilió las dos

teorías al suponer que es necesaria la activación del hidrógeno y también la del oxígeno. Keilin supuso que

interviene como eslabón intermediario el citocromo. Sin embargo, las oxidaciones biológicas no son tan

sencillas, pues se ha comprobado que en la oxidación de cada metabolito interviene una gran cantidad de

aceptores de hidrógeno. La glucosa es el más común de los metabolitos debido a que es una molécula

altamente reducida. Cuando se oxida y pierde sus hidrógenos, la liberación de energía de oxidación no se

realiza en forma brusca, sino que intervienen varios transportadores de hidrógeno y se inicia por la acción de

una deshidrogenasa específica que no reacciona directamente con el oxígeno sino que requiere de

intermediarios como el NAD+, flavoproteínas y citocromos. La DESHIDROGENASA SUCCÍNICA

(DHS) cataliza la siguiente reacción:

Por otro lado para la obtención de la fracción mitocondrial del hígado de ratón, se tiene que conocer que

el tejido hepático se dispersa en soluciones isotónicas, el núcleo y las mitocondrias permanecen relativamente

inalterados y pueden separarse con facilidad por centrifugación diferencial.

La citocromo – oxidasa es la última enzima de la cadena respiratoria y es la responsable de la “activación del

oxígeno” para oxidar a los citocromos. Tanto los citocromos como la citocromo – oxidasa son metaloproteínas

(porfirinas). La citocromo – oxidasa se caracteriza por su elevada sensibilidad al cianuro (CN) y al monóxido de




= = 48

carbono (CO). En el año de 1885 Ehrlich reportó la reacción del indofenol. Observó que inyectando alfa naftol y

dimetil-para-fenilendiamina en animales se formaba en los tejidos una sustancia azul llamada azul de indofenol. La

enzima se denominó indofenol-oxidasa, pero posteriormente se ha podido comprobar que esta enzima sólo oxida al

citocromo c, el cual a su vez oxida al indofenol; por lo cual ahora se le conoce como citocromo-oxidasa.

EXPERIMENTO 1. OXIDACIÓN POR PÉRDIDA DE ELECTRONES

En un matraz provisto de tapón con válvula de BUNSEN, agregar 0.5g de fibra de hierro (Fe°) y 5 mL de

H2SO4 al 10%.

Calentar a ebullición y observar la disolución parcial del Fe°, formando con el H2SO4 al 10% el producto

sulfato ferroso (FeSO4). Dejar enfriar a temperatura ambiente.

Diluir el FeSO4 obtenido, con 50 mL de agua destilada. La válvula deja escapar el hidrógeno, pero impide

la entrada de aire evitando así la oxidación de la sal ferrosa formada mediante la siguiente reacción:

Fe° + H2SO4 FeSO4 + H2 .

Seguidamente, con un plumón divida un mosaico blanco (proporcionado en su charola de material de

laboratorio) en cuadrantes, como se indica en la figura.

Cuadrante

superior

izquierdo

Cuadrante

superior

derecho

Cuadrante

inferior

izquierdo

Cuadrante

inferior

derecho

En el cuadrante superior izquierdo agregar 1 gota de solución de sulfato ferroso y 1 gota de ferricianuro de

potasio (K3[Fe(CN)6]) con el objetivo de comprobar la presencia de sales ferrosas. La obtención de una

coloración o precipitado de color azul indicará la presencia de sales ferrosas.

En el cuadrante superior derecho agregar 1 gota de la solución de sulfato ferroso y 1 gota de sulfocianuro

de potasio (KSCN) al 0.5%. La aparición de un color rojo intenso indicará la presencia de sales férricas.

A continuación se oxidará la sal ferrosa a sal férrica, añadir en un matraz Erlenmeyer 10 mL de la solución de

sulfato ferroso y 3 mL de H2SO4 al 10%, calentar a ebullición agregando gota a gota una solución de

permanganato de potasio (KMnO4) 0.1M hasta que persista un color rosa pálido.

Para comprobar el paso de sal ferrosa a sal férrica, repetir las reacciones con ferricianuro de potasio

K3[Fe(CN)6] al 0.5% y sulfocianuro de potasio (KSCN) al 0.5% en los cuadrantes inferiores del

mosaico.




= = 49


1) Registrar los resultados (positivo, si observa presencia de sales ferrosas o férricas o negativo si no

observa nada) en la tabla siguiente para el reporte de laboratorio.

Solución K3[Fe(CN)6] KSCN

Sulfato ferroso

Sulfato férrico

2) Escribir las reacciones de identificación que se han efectuado en cada caso.

3) Si el KMnO4 es capaz de oxidar al sulfato ferroso, ¿Qué compuesto se reduce?

4) Escribir la reacción de óxido-reducción que se ha efectuado.

EXPERIMENTO 2. OXIDACIÓN POR DESHIDROGENACIÓN


Añadir a cada uno 5 mL de una solución diluida de azul de metileno.

Al tubo 1 añadir gota a gota una solución recién preparada de hidrosulfito de sodio y cuente el número de

gotas necesario para decolorar completamente la solución de azul de metileno. Repetir este mismo paso

para los tubos 2 al 5.

El tubo No. 1 quedará como testigo en reposo.

El tubo No. 2 colocar en baño maría a ebullición y se registrará el tiempo necesario para recuperar su

color azul.

El tubo No. 3 se agitará enérgicamente a temperatura ambiente, hasta que recupere su color.

Al tubo No. 4 sin agitarlo y a temperatura ambiente, se le agregarán gotas de peróxido de hidrógeno

(H2O2) al 0.4%.

El tubo No. 5 se le agregarán gotas de cloruro férrico (FeCl3) al 1% contando el número de éstas

necesario para reoxidar al azul de metileno.



Tubo 1

testigo

2

calor

3

temp. amb.

4

H2O2

5

FeCl3

Tiempo de reoxidación del azul de

metileno o número de gotas

2) Escribir la reacción química que se ha efectuado en cada caso.




= = 50

EXPERIMENTO 3. REACCIONES BIOLÓGICAS DE OXIDO - REDUCCIÓN

Sacrificar un ratón, extraer el hígado y depositar en un mortero frío.

Macerar hasta obtener una masa homogénea.

Añada gradualmente 7 volúmenes de cloruro de potasio (KCl) 0.15M frío.

Pasar el contenido del mortero en un tubo Falcon de 15 mL.

Centrifugar a 500 rpm durante 15 minutos a 4oC.

Separar el sobrenadante a otro tubo Falcon limpio, afore a 7 mL con KCl 0.15M y nuevamente centrifugar a

3000 rpm durante 15 minutos a 4oC.

Durante este tiempo de centrifugación, preparar un tubo de ensaye con la etiqueta de “SOBRENADANTE

DE HÍGADO” y otro tubo de ensaye con la etiqueta de “SUSPENSIÓN DE HÍGADO” y mantenerlos en

frío. Estos serán utilizados más adelante.

Terminado el centrifugado, separar el sobrenadante en el tubo de ensaye con la etiqueta de

“SOBRENADANTE DE HÍGADO” y conservar en frío.

Posteriormente, el residuo o pellet que quede en el Tubo Falcon añadir 7 mL de KCl 0.15M para resuspender

y pasar en el tubo de ensaye con la etiqueta de “SUSPENSIÓN DE HÍGADO”. Conservar en frío.


Agregar los reactivos según se indica en la tabla siguiente:

Reactivo Tubo 1 2 3 4 5 6

Azul de metileno 0.002M mL 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3

Succinato de sodio 0.1M mL --- 0.5 0.5 --- 0.5 0.5

Malonato de sodio 0.1M mL --- --- 0.5 --- --- 0.5

Agua destilada mL 1.5 1.0 0.5 1.5 1.0 0.5

Suspensión de hígado mL 0.5 0.5 0.5 --- --- ---

Sobrenadante de hígado mL --- --- --- 0.5 0.5 0.5

Mezclar bien el contenido de cada tubo

Vaselina mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Una vez agregada la vaselina no agitar el contenido de los tubos e incubar en baño María de 37-40°C.

Realizar lecturas en los tiempos 0, 5, 10 y 15 minutos, registrando el grado de decoloración con cruces (de

una a tres) para el reporte de laboratorio.


1) Registrar sus resultados en la tabla siguiente:




= = 51

Tubo

Tiempo 1 2 3 4 5 6

0 min.

5 min.

10 min.

15 min.

2) ¿En cuál de las fracciones de hígado deben encontrarse las mitocondrias y por qué?

3) Describir cómo actúa el malonato de sodio en esta reacción.

4) Explicar sus resultados sobre la base del análisis del contenido de cada tubo.

EXPERIMENTO 4. LOCALIZACIÓN Y DEMOSTRACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA

CITOCROMO - OXIDASA



Reactivo Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Alfa naftol al 0.15% en etanol al 10% mL 0.5 --- 0.5 0.5 0.5 0.5 --- 0.5 0.5 0.5

Dimetil-para-fenilendiamina al 0.15% mL 0.5 0.5 --- 0.5 0.5 0.5 0.5 --- 0.5 0.5

Agua destilada mL 1.0 1.5 1.5 2.0 0.5 1.0 1.5 1.5 2.0 0.5

KCN al 0.01% NO PIPETEAR

0.5 mL = 10 gotas

mL --- --- --- --- 0.5 --- --- --- --- 0.5

Sobrenadante de hígado mL 1.0 1.0 1.0 --- 1.0 --- --- --- --- ---

Suspensión de hígado mL --- --- --- --- --- 1.0 1.0 1.0 --- 1.0

Agitar los tubos y dejar incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Observar y registrar la aparición del azul de indofenol.



Tubo

Tiempo

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0 min.

5 min.

10 min.

15 min.

2) Escribir la reacción de formación del azul de indofenol.

3) Explicar por qué no se usó vaselina en este experimento.

4) Explicar sus resultados sobre la base del análisis del contenido de cada tubo.




= = 52

PRÁCTICA No. 8

LÍPIDOS

Este es un conjunto heterogéneo de moléculas orgánicas cuyas propiedades comunes son su insolubilidad en

agua y solubilidad en solventes no polares como el benceno, cloroformo, éter, etc. Por lo que este grupo

incluye sustancias de muy diversa estructura. Suelen ser moléculas de número relativamente alto de átomos

de carbono e hidrógeno y bajo en átomos de oxígeno; ciertos lípidos también poseen átomos de fósforo,

nitrógeno y azufre en su molécula. Cualquier clasificación presenta sus limitaciones y la nomenclatura puede

producir falsas interpretaciones ya que idéntica terminología ha sido empleada por diferentes autores para

denominar a distintos grupos de lípidos. Los lípidos son los compuestos más recientemente estudiados por

ejemplo: prostaglandinas, tromboxanos, leucotrienos, etc., ya que este tipo de sustancias hace poco se

consideraban complejas y de poco interés. Las funciones de los lípidos son muy variadas y las más aceptadas

actualmente son las siguientes:

a) Función estructural, principalmente en las membranas celulares,

b) Actúan como material energético y de reserva,

c) Intervienen en el transporte de compuestos energéticamente activos,

d) Componentes protectores de la pared celular de ciertas bacterias, plantas, insectos y vertebrados,

e) Sustancias de gran actividad biológica como vitaminas y hormonas; las cuales se consideran como

verdaderos reguladores metabólicos,

f) Actúan como aislante térmico y protección alrededor de determinados órganos

Una de las formas de identificación en la práctica es la reacción de Hanus a través del grado de insaturación

de los ácidos grasos que forman parte de un lípido es uno de los factores determinantes de sus propiedades

físicas, químicas y fisiológicas. Se ha observado que aparecen más dobles enlaces en los triacilgliceroles de

almacenamiento y en los lípidos estructurales cuando la temperatura ambiente disminuye. Los dobles

enlaces disminuyen el punto de fusión por lo que se cree que sea un mecanismo del organismo para impedir

la cristalización de los lípidos en los tejidos. El reactivo de Hanus es una solución de yodo y bromo que

nos permite determinar el grado de insaturación de un lípido midiendo la capacidad que tiene para fijar

halógenos en su molécula. Una de las reacciones más usadas para la identificación de acilglicéridos es la

formación de acroleína o aldehído acrílico, el cual se puede obtener por deshidratación del glicerol o de

cualquier glicérido y se reconoce fácilmente por su fuerte olor acre característico.

En esta práctica de lípidos no podemos dejar de mencionar a las membranas ya que hacen posible la

existencia de organismos complejos porque separan las células en el interior de los tejidos y los organelos

celulares, formando compartimientos con propiedades fisicoquímicas diferentes, lo que permite una diferente




= = 53

organización; y cada compartimiento se vuelve una parte individual de un conjunto más complejo. Se ha

comprobado que las membranas son complejos lipoprotéicos que contienen de 60% a 75% de proteína y

de 25% a 40% de lípidos. En este experimento se usarán monocapas lipídicas como modelos de membrana.

Al estratificar butanol sobre agua y agregar un lípido, éste se situará en la interfase, orientandose la parte

polar lipídica a la fase acuosa, y la parte hidrofóbica a la fase orgánica. Si ahora se coloca un colorante

se puede observar la difusión pasiva a través de la membrana.

La reación de LIEBERMANN – BURCHARDS, es a través de que el anhídrido acético se puede

condensar con los grupos –OH en posición 3 de los esteroles como en el colesterol y dar los correspondientes

ésteres. Si el esterol tiene un doble enlace en posición 5, se produce además una epimerización y una

deshidratación en presencia de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado, dando como resultado una serie de

compuestos de estructura desconocida que se caracterizan por tener colores que van del rojo al azul y del

azul al verde. Esta reacción es por lo tanto específica para todos los esteroles que contengan un OH en

posición 3 y un doble enlace en posición 5.

EXPERIMENTO 1. REACCIÓN DE HANUS

Preparar una serie de 4 tubos de ensayo etiquetar y numerar del 1 al 4.

Al tubo 1 agregar 6 mL de la solución clorofórmica al 10% de aceite de algodón, al tubo 2 agregar 6 mL

de la solución clorofórmica al 10% de aceite de cártamo, al tubo 3 agregar 6 mL de la solución

clorofórmica al 10% de monoestearilglicerol y al tubo 4 agregar 6 mL de la solución clorofórmica al

10% de aceite de ricino.

Añadir a cada tubo 10 gotas del reactivo de Hanus y agitar vigorosamente. Con una bolsa negra

protegerlo de la luz y colocarlo debajo de la mesa.

Registrar lecturas a tiempos de 20, 40, 60 y 80 minutos, observando el grado de decoloración de cada

tubo.


Registrar sus resultados en la tabla siguiente para el reporte de laboratorio.

Lípido Lecturas 20 min. 40 min. 60 min. 80 min.

Aceite de algodón

Aceite de Cártamo

Monoestearilglicerol

Aceite de ricino Nota: Puede interpretar la decoloración de la siguiente forma: +++++= Rosa intenso, +++=Rosa pálido += decolorado




= = 54

EXPERIMENTO 2. EXTRACCIÓN DE LÍPIDOS DE CEREBRO

Macerar completamente la muestra de cerebro en un mortero, hasta obtener una consistencia homogénea.

En este paso NO AGREGAR NINGÚN TIPO DE SOLUCIÓN, hasta obtener la consistencia deseada.

Agregar gradualmente 20 mL de una mezcla 200:100:1 de cloroformo-metanol-ácido clorhídrico y con

el pistilo del mortero mezclar perfectamente bien.

Agregar 2 mL de HCl 1N (NO OLVIDAR), mezclar y centrifugar a 2000 rpm durante 10 minutos.

Después de centrifugado el tubo, separar la fase metanólica, el paquete celular y la clorofórmica.

Desechar el paquete celular. La fase Clorofórmica se usará para la identificación del colesterol,

(separación cromatográfica de fosfolípidos y la formación de membranas) y la Metanólica servirá para la

identificación de cerebrósidos.

Registrar sus resultados para el reporte de laboratorio.

EXPERIMENTO 3. IDENTIFICACIÓN DE FOSFOLÍPIDOS DE CEREBRO POR CROMATOGRAFÍA

EN CAPA FINA

De la fase clorofórmica obtenida, aplicar una gota con una pipeta Pasteur en una cromatoplaca,

aproximadamente a 2 cm de altura de la base y una gota con una pipeta Pasteur en otra cromatoplaca.

Permitir que el cloroformo se evapore y entonces introducirlo en una cámara de vidrio que contenga como

solvente de elución, una mezcla de cloroformo–metanol–ácido acético–agua (65:25:8:4).

Dejar desarrollar las cromatoplacas hasta el frente del solvente ya marcado; retirar las cromatoplacas y

dejarlas secar.

Una cromatoplaca se revelará con ninhidrina que pondrá de manifiesto a los fosfoaminolípidos, la

reacccion se lleva a cabo al calentarse a 100°C por 10 minutos.

La otra cromatoplaca será revelado con Iodo sublimado.


EXPERIMENTO 4. REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DE LÍPIDOS Y DE CEREBRÓSIDOS

Utilizar 1 mL de la fase metanólica obtenido en la extracción de lípidos de cerebro y comprube la

presencia de cerebrósidos utilizando la reacción de Molisch–Udransky cuya técnica y fundamento ya han

sido descritos anteriormente.





= = 55

EXPERIMENTO 5. REACCIÓN DE LA ACROLEÍNA

Preparar 2 tubos de ensayo y etiquételos.

Agregar a los dos tubos de ensayo una pequeña cantidad de bisulfato de potasio (KHSO4).

A un tubo de ensayo añadir 5 gotas de glicerina.

A otro tubo de ensayo agregar 5 gotas de cualquiera de estas soluciones: aceite de algodón, cártamo o

girasol.

Colocar en Baño María ebullición durante 5-10 minutos, procurando observar el desprendimiento de los

vapores

Retirar del Baño los tubos y percibir los vapores de forma indirecta y tratar de identificarlos.

¡PRECAUCIÓN!



1) ¿Se puede considerar esta reacción general para cualquier lípido? ¿Por qué?

2) Escribir la reacción que se ha efectuado.

EXPERIMENTO 6. REACCIÓN DE LIEBERMANN-BURCHARDS

Preparar 2 tubos de ensayo y etiquetar.

En el tubo 1 agregar 3 mL de solución clorofórmica de colesterol puro.

En el tubo 2, agregar 3 mL de la fase clorofórmica obtenido de la extracción de lípidos de cerebro en el

experimento 2.

Añadir a ambos tubos, 1 mL de anhídrido acético y mezclar.

Finalmente añadir 1 mL de H2SO4 concentrado de forma lenta, resbalándolo por las paredes del tubo.



1) Describir los cambios de coloración que se llevaron a cabo.




= = 56

EXPERIMENTO 7. PERMEABILIDAD DE LA BICAPA LIPÍDICA


Agregar los reactivos según se indica en la siguiente tabla. Al añadir las soluciones, realizar con mucho

cuidado resbalando por las paredes del tubo para estratificar.

Reactivo Tubo 1 2 3 4

Agua destilada mL 5 5 5 5

Azul de metileno más monoestearato de glicerilo en butanol mL 2 --- --- ---

Azul de metileno más fosfolípidos en butanol *(VER NOTA) mL --- 2 --- ---

Azul de metileno más colesterol en butanol mL --- --- 2 ---

Azul de metileno en butanol mL --- --- --- 2

*NOTA: A 2 mL de la fase clorofórmica (exp. 2) evaporar hasta sequedad (cuidando que no se queme), el

residuo disolver con 2 mL de azul de metileno en butanol y agregar este contenido al tubo 2 de la serie.

Dejar los tubos en reposo procurando moverlos lo menos posible y haga observaciones a las 2, 4, y 24 horas.



1) ¿Observó el paso del colorante en todos los tubos? Explique a qué se debe esa diferencia.




= = 57

PRÁCTICA No. 9

ÁCIDOS NUCLEICOS

El control de todos los procesos vitales en la forma tan ordenada que realiza una célula, como son la

transformación de energía en sus diferentes formas, la síntesis de moléculas propias, la degradación de los

metabolitos, el transporte de diferentes materiales a través de sus membranas, la formación de nuevas células,

la diferenciación celular, la creación de nuevos seres, etc.; se puede explicar debido a la existencia de

proteínas específicas, fundamentalmente enzimas. Sin embargo, para la biosíntesis de proteínas las

moléculas que poseen la información necesaria son el ácido desoxirribonucléico (DNA) y el ácido

ribonucléico (RNA). Estas moléculas son los llamados ácidos nucléicos. Rompiendo la máxima bioquímica

de que todas las enzimas son proteínas, se descubrió que algunos RNA pueden funcionar como catalizadores.

Los ácidos nucléicos reciben este nombre debido a que en el año de 1871 el químico suizo Friedrich

Miescher logró aislar del núcleo celular una sustancia que llamó nucleína, la cual debido a su carácter ácido

se denominó posteriormente ácido nucleico.

Sin embargo, existen otros tipos de ácidos nucléicos. El ácido desoxirribonucléico se encuentra

fundamentalmente en el núcleo y es el que posee la información genética y la transmite al citoplasma y por

ser capaz de replicarse puede transmitir la información de padres a hijos. En la célula, fuera del núcleo,

normalmente existen tres tipos de ácidos ribonucléicos que son: el ácido ribonucléico ribosomal (RNAr), el

ácido ribonucléico mensajero (RNAm), y el ácido ribonucléico soluble o de transferencia (RNAt). El RNAr

se encuentra en los ribosomas y su peso molecular es de 2 000 000. El RNAm tiene un peso molecular de 300

000, se forma en el núcleo y lleva la información al citoplasma. El RNAt tiene un peso molecular de 25 000 a

30 000 y se encuentra disuelto en el citoplasma. El DNA es una de las biomoléculas más grandes que se

conocen hasta ahora y su peso molecular es mayor a un billón.

Tanto el DNA como el RNA se encuentran asociados con proteínas fuertemente básicas (histonas o

protaminas) formando las llamadas nucleoproteínas. La estructura química es similar en todos los ácidos

nucléicos, todos están constituidos por bases púricas, bases pirimídicas, pentosa y ácido fosfórico. El

DNA tiene como bases púricas adenina y guanina, como bases pirimídicas, citosina y timina, como

pentosa la 2-desoxiribosa y ácido fosfórico H3PO4. Los ácidos ribonucléicos tienen como bases púricas la

adenina y guanina y como bases pirimídicas uracilo y citosina, como pentosa la D–ribosa y H3PO4.

Los ácidos nucléicos son macromoléculas formadas por la unión de varios nucleótidos. Un nucleótido se

puede considerar como un éster fosfórico de un nucleósido, que es la unión de una base púrica o




= = 58

pirimídica con una pentosa. Los mononucleótidos se unen entre sí por medio de un enlace fosfodiester 3’-

5’, formando los polinucleótidos.

Por otro lado cuando se desea purificar una sustancia se deben seleccionar las células o tejidos que se van a

utilizar como materia prima. En el caso del DNA esta selección es en especial importante porque el

contenido de DNA es pequeño en la mayor parte de las células. La célula ideal será aquella que tenga una

relación núcleo/citoplasma alta, como en los linfocitos y células del tumor ascítico de Ehrlich. Sin

embargo, no es fácil obtener este tipo de células por lo que frecuentemente se usan órganos típicamente

linfoides como el timo y el bazo. El primer paso en la extracción del DNA es la homogeneización del

tejido. Este paso puede degradar en parte la molécula del DNA si no se toman las precauciones necesarias, la

solución reguladora es de citrato 0.01M y NaCl 0.14M, a pH de 7.2 a 7.4; la fuerza iónica de esta solución

hace insoluble a la desoxirribonucleoproteína. Si se centrifuga este homogeneizado, en el residuo quedarán

los restos celulares y las desoxirribonucleoproteínas insolubles. En el sobrenadante se encuentran

compuestos solubles como la mayor parte de los ácidos ribonucléicos.

Al homogeneizar el tejido se liberan las enzimas de los lisosomas, entre ellas la DNAasa, la cual hidroliza el

DNA. Se sabe que el Mg++ es indispensable para la actividad de esta enzima; si en la solución existe citrato,

éste se une al Mg++ e impide la acción de la DNAasa. Otra forma de evitar la acción hidrolítica de la

enzima es trabajar a temperaturas bajas (0°C a 2°C). El siguiente paso en la purificación está basado en

que las desoxirribonucleoproteínas y el DNA son solubles en soluciones salinas concentradas, mientras

que la mayor parte de las proteínas precipitan en estas condiciones. Si el residuo se suspende en solución de

NaCl 2.6M y se centrifuga, el residuo insoluble estará formado fundamentalmente por proteínas, mientras

que el DNA permanecerá en solución. Este DNA se puede precipitar selectivamente por la adición selectiva

de 2 volúmenes de alcohol etílico al 95% formándose un precipitado blanco fibroso, el cual se puede

recoger por rotación de un agitador de vidrio con pequeños salientes.

Existen varios métodos para identificar y cuantificar a los ácidos nucléicos. El método más utilizado es el

espectrofotométrico, el cual está basado en que tanto el DNA como el RNA absorben a 260 nm. La

absorbancia es proporcional a la concentración del ácido, por lo tanto, el medir la absorbancia es un método

cuantitativo muy sensible y sencillo, pero no distingue entre DNA y RNA. Es de gran utilidad cuando las

muestras están puras. Una reacción muy utilizada para identificar y cuantificar DNA es la llamada reacción

de Dische, la cual está basada en que el reactivo de difenilamina reacciona específicamente con el DNA

dando una coloración azul cuya intensidad es proporcional a la concentración de DNA. En realidad, la

especificidad de esta reacción no es absoluta, ya que la difenilamina es un reactivo específico para las 2-




= = 59

desoxipentosas en general, pero en condiciones normales la cantidad de azúcares capaces de interferir es

despreciable.

EXPERIMENTO 1. OBTENCIÓN DEL DNA DE BAZO.

Agregar 300 mL de solución reguladora de Citrato 0.01M-NaCl 0.14M, pH=7.2 fría, en un vaso de

licuadora previamente enfriado.

Se hace funcionar la licuadora a baja velocidad y se van añadiendo los trozos de bazo de todos los

equipos, esperando a que se homogeneice completamente el primero antes de añadir el segundo y así

sucesivamente.

Una vez terminada la adición, continuar homogeneizando por 30-60 segundos más.

Al obtener el homogenizado, pasar a tubos Falcon de 50 mL teniendo cuidado de tarar perfectamente

los tubos opuestos ¡PRECAUCIÓN! (CONSULTE A SU MAESTRO).

Centrifugar a 5 000 rpm durante 15 minutos.

Al terminar la centrifugación, DESECHAR EL SOBRENADANTE, tener cuidado de NO DESECHAR

EL RESIDUO INSOLUBLE O BOTÓN.

Añadir 15 mL de solución de NaCl 2.6M fría al residuo insoluble que contiene el DNA y residuos

celulares.

Agitar el tubo hasta obtener un completo homogenizado. El ácido desoxirribonucléico es soluble en esta

solución mientras que la mayor parte de las proteínas son insolubles.

Centrifugar a 8 000 rpm durante 30 minutos.

Al terminar la centrifugación, SEPARAR EL SOBRENADANTE que contiene el DNA en solución y

DESECHAR EL RESIDUO INSOLUBLE, que contiene restos celulares y proteínas insolubles.

Agregar el sobrenadante en un vaso de precipitados de 100 mL y añadir lentamente el doble del volumen

obtenido del sobrenadante de alcohol etílico al 95%, procurando que la fase alcohólica quede en la

parte superior.

Observar la formación de un precipitado blanco, denso, en la interfase.



1) Explicar por qué se utilizó bazo como materia prima y no otro órgano cualquiera.

2) ¿Sería conveniente utilizar solución reguladora de fosfatos para la extracción del DNA? ¿Por qué?

3) ¿Por qué es conveniente trabajar durante toda la extracción a baja temperatura?




= = 60

EXPERIMENTO 2. CARACTERIZACIÓN Y ANÁLISIS CUANTITATIVO DEL DNA.


Al tubo 1 agregar 2 mL de la solución patrón de DNA [1 mg/mL]. Medir el volumen cuidadosamente.

A los tubos 2, 3, 4, 5 agregar 2 mL de agua destilada.

Pipetear 2 mL de la solución patrón DNA [1 mg/mL] y agregar al tubo 2; mezclar perfectamente.

Transferir 2 mL de la mezcla anterior al tubo 3; mezclar bien el contenido.

Transferir 2 mL de la mezcla anterior al tubo 4. De este tubo pipetear 2 mL y descartarlo.

El tubo 5 emplear como blanco.

En el tubo 6 añadir 2 mL de la solución de DNA problema.

Añadir a todos los tubos 4 mL de reactivo de Dische y agitar vigorosamente.

Incubar los tubos en baño María a ebullición por 10 minutos.

Después de 5 minutos colocar los tubos en baño de hielo-agua durante 5 minutos con objeto de

disminuir la temperatura rápidamente.

Determinar la densidad óptica a 600 nm. Utilizar el tubo 5 como blanco.

Evidencias de aprendizajes

1) Registrar los resultados en la tabla siguiente para el reporte de laboratorio.

Tubo [DNA]

mg/mL

Densidad Óptica

Abs

1 1

2 0.5

3 0.25

4 0.125

5 -------- Blanco

6 Problema

2) Construir la curva tipo con los datos de la tabla, donde la densidad óptica serán las ordenadas y los mg de

DNA las abscisas.

3) Interpolar la absorbancia del tubo No. 6 para encontrar la concentración de DNA (mg/mL) y calcular la

cantidad total de DNA en su problema.




= = 61

EXPERIMENTO 3. CARACTERIZACIÓN Y ANÁLISIS CUANTITATIVO DEL RNA


Al tubo 1 añadir 3 mL de la solución patrón de RNA [0.1 mg/mL].

A los tubos 2, 3, 4 y 5 agregar 3 mL de agua destilada.

Pipetear 3 mL de la solución patrón de RNA [0.1 mg/mL] y agregar al tubo 2; mezclar perfectamente.

Transferir 3 mL de la mezcla anterior al tubo 3; mezclar bien el contenido.

Transferir 3 mL de la mezcla anterior al tubo 4. De este tubo pipetear 3 mL y descartarlo.

El tubo 5 emplear como blanco.

En el tubo 6 añadir 1 mL de la solución de RNA problema.

Añadir a todos los tubos 6 mL del reactivo de orcinol ácido y 0.4 mL del reactivo de orcinol-alcohol y

agitar vigorosamente.

Incubar los tubos en baño María a ebullición por 20 minutos.

Después de 5 minutos colocar los tubos en baño de hielo-agua durante 5 minutos con objeto de

disminuir la temperatura rápidamente.

Determinar la densidad óptica a 660 nm. Utilizar el tubo 5 como blanco.



Tubo [RNA] mg/mL Densidad Óptica

1 0.1

2 0.05

3 0.025

4 0.0125

5 ------- Blanco

6 Problema

2) Construir la curva tipo con los datos de la tabla, donde la densidad óptica serán las ordenadas y los mg de

RNA las abscisas.

3) Interpolar los valores de absorbancia de su problema y determinar la concentración real en mg/mL.




= = 62

EXPERIMENTO 4. DETERMINACIÓN DE FOSFATO TOTAL



Tubo

Reactivo 1 2 3 4 5 6

Buffer de acetato 0.1M pH 4.0 mL 7 7 7 7 8 8

Reactivo molibdato al 2.5% mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Solución de vitamina C al 1% reciente mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Agua destilada mL 2

Solución tipo 1 M/mL 2

Solución tipo 2.5 M/mL 2

Solución tipo 5 M/mL 2

Problema DNA 1

Problema RNA 1

Incubar los tubos a temperatura ambiente por 10 minutos.

Leer a una absorbancia de 660 nm tomando como blanco el tubo 1.



Tubo [FOSFATO]

M/mL

Densidad Óptica

1 ------- Blanco

2 1

3 2.5

4 5

5 Problema DNA

6 Problema RNA

2) Construir la curva tipo para fosfato con los datos de la tabla, donde la densidad óptica serán las ordenadas

y los M/mL de las soluciones tipo las abscisas.

3) ¿Cómo afecta el medio ácido al enlace 3’-5´diéster fosfato?

4) ¿Cómo afecta el medio alcalino al enlace 3’-5´diéster fosfato?

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Bioquimica manual