Ultimate Manual de Bioquimica Basica

Embed Size (px)

Citation preview

MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA BASICAUNIVERSIDAD VERACRUZANA CAMPUS CIUDAD MENDOZA MEDICO CIRUJANO DRA. MARIA DE JESUS HUERTA CORTES DR. RAUL MARISCAL REYES DRA. MIRIAM DEL CARMEN SANCHEZ FLORES E. E.: INICIACION DISCIPLINAR FORMACIN: BSICA ACADEMIA MORFOLOGICAS

2

INDICEPractica 1 - Reglamento Interno De Laboratorio Y Explicacin De RPBI .......... 3 Practica 2 - Material Y Equipo De Laboratorio ................................................. 12 Practica 3 - Toma De Muestra Sangunea ....................................................... 16 Practica 4 - Separacin De Plasma Y Coagulo ............................................... 19 Practica 5 - Determinacin De Glucosa Sangunea......................................... 22 Practica 6 - Determinacin De Colesterol ........................................................ 26 Practica 7 - Determinacin De Triglicridos ..................................................... 31 Practica 8 - Determinacin De Lpidos Totales ................................................ 35 Practica 9 - Determinacin Protenas Totales.................................................. 39 Practica 10 - Determinacin De Enzimas: Transaminasas .............................. 42 Practica 11 - Determinacin De Enzimas: Amilasas ........................................ 45 Practica 12 - Determinacin De Enzimas. Fosfatasa Alcalina ......................... 48 Practica 13 - Determinacin De Enzimas: Fosfatasa Acida ............................. 50 Practica 14 - Examen General De Orina ......................................................... 52

3 PRACTICA NO. 1 REGLAMENTO INTERNO DE LABORATORIO Y EXPLICACION DE RPBI GENERALIDADES El laboratorio tiene una ubicacin especifica dotada de espacios fsicos como: rea de trabajo con medad provistas de instalaciones de agua, gas, regadera, cuarto de preparacin de reactivos, almacn de reactivos y materiales, cuarto de aparatos y equipos, lavabos, pizarrones, bancos y gavetas. Cuenta con personal de laboratorio especficamente capacitado para el trabajo de estos. Se trabaja con reactivos qumicos, equipo de reactivos de determinacin cuantitativa para diagnstico, frmacos, medios, reactivos de tincin, desinfectantes, antispticos. El material biolgico de trabajo incluye: animales, cepas microbiolgicas vivas, atenuadas y muertas, rganos, tejidos, fluidos corporales (principalmente sangre, plasma, suero y orina), heces fecales, exudados (principalmente de mucosas). El alumno debe de contar con: y Bata blanca de manga larga y Guantes desechables y Cubrebocas y Estuche de diseccin y Manual o libro de texto y Atlas (Por ejemplo de Orina microscopio del sedimento urinario- de microbiologa) y Libreta de apuntes y Lpices o plumines de colores REGLAS BASICAS DE SEGURIDAD y Usar siempre la bata y Cargar la bata y los guantes en una bolsa, el cubrebocas y los pauelos en otra y No introducir ni consumir alimentos y No fumar y Al finalizar, dejar limpia el rea de trabajo y comprobar que las llaves y vlvulas de gas queden cerradas y Terminando el trabajo, lavarse minuciosamente las manos antes de salir MANEJO DE REACTIVOS y Los reactivos nicamente sern provistos por el(la) encargado(a) del laboratorio y No debern ser manejados de manera directa sino usando siempre guantes, lentes de seguridad y material especifico para su manipulacin (pipetas, esptulas, perillas, pinzas, etc) y bajo la estricta supervisin del profesor(a) o del encargado

4 Las sustancias toxicas o venenosas, causticas, irritantes o que constituyan un riesgo o peligro (explosivas, inflamables, corrosivas) nicamente podrn ser manejadas por el profesor(a) o por el(la) encargado(a). Cualquier reactivo derramado no deber tocarse directamente para recogerlo. Llmese inmediatamente al profesor(a) y/o encargado(a) del laboratorio para que se ocupe de ello. Nunca se proceda a utilizar un reactivo si se desconocen su identidad y manejo Toda duda acerca del manejo y disposicin de un reactivo deber ser aclarada por el profesor(a) antes de proceder a utilizarlo.

y

y

y y

MANEJO DE ESPECIMENES y Vigilar antes de sacar los especmenes de los frascos, que el rea este bien ventilada, abrir ventanas. y Portar cubrebocas. y Usar lentes de seguridad. y Usar guantes desechables. y Siempre manejar el espcimen dentro de una charola Nota: Si accidentalmente cae formol en los ojos y/o boca, lavar nicamente con abundante agua. MANEJO DE PREPARACIONES O LAMINILLAS y Las preparaciones o laminillas requieren ser transportadas preferentemente en charolas. y No deber haber grasa o crema en las manos para revisar el microscopio. y Marcar con plumn el campo por sealar. y Nunca usar aceite de inmersin sin indicacin del acadmico y Si alguna preparacin o laminilla se rompe, avisar inmediatamente al acadmico o encargado(a). MANEJO Y DISPOSICION DE RESIDUOS BIOLOGICOS (DE ADUERDO A LA NORMA OFICIAL PARA EL MANEJO DE RESIDUOS PELIGROSOS BIOLOGICOS-INFECCIOSOS Y TOXICOS MANUAL DE PROCEDIMIENTOS BI-UV-OP-01- ) EN TODOS LOS CASOS DEBERA USARSE: BATA, GUANTES, CUBREBOCAS, Y SI ES NECESARIO, LENTES DE SEGURIDAD) 1. SANGRE: sangre caduca o contaminada, sangre coagulada, muestras de sangre de anlisis, suero, plasma, paquete globular, depositar en RECIPIENTE HERMETICO ROJO (lquidos). 2. SANGRE: bolsas de sangre de transfusin, tubos de ensaye, algodones con sangre, se depositaran en BOLSA ROJA (slidos). 3. PATOLOGICOS: orinas, salivas, vomito, liquido amnitico, liquido cefalorraqudeo, liquido espermal, depositar en RECIPIENTE HERMETICO AMARILLO (lquidos)

5 4. PATOLOGICOS: rganos, partes del cuerpo, tejidos, heces fecales, cadveres de animales pequeos (conejos, ratas, etc), partes corporales y desechos de animales, depositar en BOLSA AMARILLA (slidos). 5. CEPAS Y CULTIVOS: Cultivos, inoculos, mezcla de microorganismos en medio de cultivo inoculados, caldos de cultivo con caja de Petri desechable, depositar en BOLSA ROJA (slidos). 6. NO ANATOMICOS: Guantes, cubrebocas, cofias, gasas, torundas, algodones, abatelenguas, hisopos, aplicadores, papel, vendas, curitas, batas desechables, paales, toallas sanitarias, espejos vaginales, dispositivo intrauterino, equipo de venoclisis sin aguja, equipo de dilisis, aserrn de camas de bioterio, se deben depositar en BOLSA ROJA (slidos). 7. PUNZOCORTANTES: Agujas hipodrmicas, ampolletas, jeringas (con o sin aguja acoplada), lancetas, bistures, recipientes de vidrio rotos o intactos tales como pipetas de Pasteur, pipetas graduadas, vacutainers, tubos para sangre, placas de cultivos, cajas de Petri, portaobjetos, cubreobjetos, etc. Depositar en RECIPIENTE ROJO. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS BI UV OP 01 PARA EL MANEJO DE RESIDUOS PEIGROSOS BIOLOGICO-INFECCIOSOS Y TOXICOS Separacin y Envasado de Residuos Biolgico Infecciosos 1. OBJETIVO: Separar y envasar los residuos biolgicos-infecciosos que se generen en las diversas reas que se realicen prcticas de docencia, investigacin y de centro de atencin medica. 2. REFERENCIAS 2.1 NOM-052-ECOL-1993. Que establece las caractersticas de los residuos peligrosos, el listado de los mismos y los limites que hacen peligrosos a un residuo por su toxicidad el medio ambiente. 2.2 NOM-087-ECOL-1995. Que establece que los requisitos de separacin, envasado, almacenamiento, recoleccin, trasporte, tratamiento y disposicin final de los residuos peligrosos biolgicos-infecciosos que se generan en los establecimientos que presentan atencin mdica. 2.3 NOM-001-ECOL-1996. Que establece los lmites mximos permisibles de contaminantes en las descargas residuales en aguas y bienes nacionales. 2.4 NOM-001-STPS-1994. Relativa a las condiciones de seguridad e higiene en los edificios, locales, instalaciones, y reas de los centros de trabajo. 2.5 NOM-004-STPS-1994. Relativa a las condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo donde se produzcan, almacenen o manejen sustancias qumicas capaces de generar contaminacin en el medio ambiente laboral.

6 2.6 NOM-017-STPS-1993. Relativa al equilibrio de proteccin personal para los trabajadores. 3. POLITICAS 3.1 El personal que genere los residuos deber portar obligatoriamente el equipo bsico de seguridad acorde a la actividad que est desarrollando. 3.2 Los recipientes para envasar los diferentes tipos de residuos, estarn colocados en lugares estratgicos dentro de las reas de generacin. 3.3 De acuerdo al tipo y estado fsico del residuo se llevara a cabo su envasado. 3.4 Los recipientes para almacenamiento temporal de Residuos Biolgicos no son reciclables. 3.5 Los recipientes debern estar rotulados con el smbolo de riesgo biolgico. 3.6 Se llevara a cabo una supervisin operativa por lo menos una vez a la semana, para observar el cumplimiento de las disposiciones oficiales e institucionales 4. DESARROLLO Una vez generado el residuo lo identifica, lo separa y lo envasa de acuerdo a la siguiente tabla CLASIFICACIO N TIPO DE RECIPIENTE PARA ENVASADO RESIDUO

RPNE 1.2/01 SANGRE

RPNE 1.2/02 PATOLOGICO S

RPNE 1.2/03 CEPAS Y CULTIVOS

Sangre caduca o contaminada, sangre Recipiente Hermtico coagulada, muestras de Rojo (lquidos) sangre de anlisis, suero, plasma, paquete globular. Bolsas de sangre de transfusin, tubos de ensaye, Bolsa Roja (slidos) algodones con sangre. Orinas, saliva, vomito, liquido Recipiente Hermtico amnitico, liquido Amarillo (liquido) cefalorraqudeo, liquido espermal. rganos, partes del cuerpo, tejidos, heces fecales, cadveres de animales Bolsa Amarilla (slidos) pequeos (conejos, ratas, etc.), partes corporales y desechos animales. Cultivos, inoculos, mezcla de microorganismos en medios Bolsa Roja (slidos) de cultivo inoculados, caldos de cultivo con caja Petri desechable.

7 Guantes, cubrebocas, cofias, gasas, torundas, algodones, abatelenguas, isopos, aplicadores, papel, vendas, curitas, batas desechables, paales, toallas sanitarias, espejos vaginales, dispositivo intrauterino, equipo de venoclisis sin aguja, equipo de dilisis, aserrn de camas de bioterio Agujas hipodrmicas, ampolletas, jeringas (con o sin aguja acoplada), lancetas, bistures, recipientes de vidrio rotos o intactos, tales como pipetas de Pasteur, pipetas graduadas, vacutainers, tubos para sangre, placas de cultivos, cajas Petri, portaobjetos, cubreobjetos, etc.

RPNE 1.2/04 NO ANATOMICOS

Bolsa Roja (slidos)

RPNE 1.2/05 PUNZOCORTA Recipiente Rojo NTES

Recoleccin Interna de Residuos Peligrosos 1. OBJETIVO: Recolectar los residuos peligrosos de las reas de generacin y enviarlas al almacn temporal respectivo. 2. REFERENCIAS 2.1 Reglamento de la Ley General del Equilibrio Ecolgico y la Proteccin al Ambiente en Materia de Residuos Peligrosos 2.2 NOM-087-ECOL-1995. Que establece los requisitos para la separacin, envasado, almacenamiento, recoleccin, transporte, tratamiento y disposicin final de los residuos peligrosos biolgicoinfecciosos que se generan en los establecimientos que prestan atencin medica. 2.3 NOM-017-STPS-1993. Relativa al equipo de proteccin personal para los trabajadores. 3. POLITICAS 3.1 El personal encargado de la recoleccin interna deber portar obligatoriamente el equipo bsico de seguridad personal. 3.2 El personal encargado de la recoleccin deber realizar esta por separado de la recoleccin de los residuos biolgico-infecciosos de los residuos qumicos, radiactivos y municipales. 3.3 La recoleccin de los residuos desde el rea de generacin hasta el almacn temporal, se deber llevar a cabo bajo una ruta de recoleccin establecida.

8 3.4 La recoleccin de los residuos deber llevarse a cabo en horarios de bajo flujo de personas, para evitar al mximo accidente. 3.5 La recoleccin interna se debe llevar a cabo con materiales y equipo de seguridad de acuerdo al tipo de residuo. 3.6 Se llevara a cabo una supervisin operativa por lo menos una vez a la semana, para observar el cumplimiento de las disposiciones oficiales e institucionales. 4. DESARROLLO 4.1 La recoleccin interna de los Residuos Peligrosos BiolgicoInfecciosos se debe realizar de acuerdo a una ruta de recoleccin acorde a las caractersticas de la edificacin de las instalaciones de la institucin. 4.1.1 Se debern depositar los recipientes perfectamente cerrados en el carrito recolector exclusivo de Residuos Biolgico-Infecciosos. 4.1.2 El personal deber verificar en el momento de la recoleccin que los residuos biolgico-infecciosos se encuentren perfectamente envasados 4.1.3 Los recipientes para envasar residuos de punzocortantes, los retirara solo cuando alcancen su capacidad al 90% 4.1.4 Los residuos envasados en las bolsas rojas, deben estar perfectamente cerrados, antes de ser depositados en el carrito recolector. 4.1.5 Los recipientes que contengan residuos en estado liquido deben estar perfectamente cerrados, antes de depositarlos en el carrito recolector. 4.1.6 Concluida la recoleccin, se dirigir al almacn temporal, para su respectivo almacenamiento de los residuos. 4.1.7 Los carritos manuales no deben rebasar su capacidad de carga durante su uso. 4.1.8 Una vez depositados los residuos en el almacn, se debe lavar y desinfectar el carrito recolector. 4.2 La recoleccin de reactivos qumicos debe hacerse con cuidado para evitar algn derrame, debern estar envasados en recipientes de acuerdo a su estado fsico y a sus caractersticas fsico-qumicas y debidamente etiquetados de acuerdo a sus caractersticas CRETI: corrosivo, reactivo, explosivo, toxico y su smbolo universal, como requisito, para poder ser retirados del rea de generacin. Almacenamiento temporal de Residuos Peligrosos 1. OBJETIVO: Almacenar temporalmente los residuos que han sido recolectados, en un rea especfica asignada dentro de la institucin, cuidando que cumplan con las normas de seguridad e higiene. 2. REFERENCIAS 2.1 Reglamento de la Ley General del Equilibrio Ecolgico y la Proteccin al Ambiente en Materia de Residuos Peligrosos.

9 2.2 NOM-087-ECOL-1995. Que establece los requisitos para la separacin, envasado, almacenamiento, recoleccin, transporte, tratamiento y disposicin final de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos que se generan en los establecimientos que prestan atencin medica. 2.3 NOM-001-STPS-1999. Relativa a las condiciones de seguridad e higiene en los edificios, locales, instalaciones y reas de los centros de trabajo. 2.4 NOM-002-STPS-1994. Relativa a las condiciones de seguridad para la prevencin y proteccin contra incendios en los centro de trabajo 2.5 NOM-004-STPS-1993. Relativa a los sistemas de proteccin y dispositivos de seguridad en la maquinaria, equipos y accesorios en los centros de trabajo. 2.6 NOM-005-STPS-1998. Relativa a las condiciones de seguridad en los centros de trabajos para el mantenimiento, transporte y manejo de sustancias inflamables y combustibles. 2.7 NOM-009-STPS-1999. Relativa a las condiciones de seguridad e higiene para el almacenamiento, transporte y manejo de sustancias corrosivas, irritantes y toxicas en los centros de trabajo. 2.8 NOM-010-STPS-1994. Relativa a las condiciones de seguridad e higiene en los centro de trabajo donde se produzcan, almacenen o manejen sustancias qumicas capaces de generar contaminacin en el medio ambiente. 2.9 NOM-017-STPS-1993. Relativa la equipo de proteccin personal para los trabajadores. 2.10 NOM-026-STPS-1994. Seguridad Colores y su aplicacin. 2.11 NOM-026-STPS-1997. Colores y seales de seguridad e higiene, e identificacin de riesgos por fluidos conducidos por tuberas. 2.12 NOM-114-STPS-1994. Sistemas para la identificacin y comunicacin de riesgos por sustancias qumicas en los centros de trabajo. 3. POLITICAS 3.1 El personal que maneje los residuos en el almacen temporal deber portar obligatoriamente el equipo bsico de seguridad personal. 3.2 Los residuos biolgico-infecciosos no podrn almacenarse con otro tipo de residuos peligrosos 3.3 El almacn temporal debe contar con sealizacin y acceso restringido 3.4 El personal responsable del almacenamiento debe tener la capacitacin adecuada para esa actividad. 3.5 El almacn temporal debe cumplir con los requerimientos de construccin de acuerdo a las normas oficiales mexicanas vigentes. 3.6 Se llevara a cabo una supervisin operativa por lo menos una vez a la semana, para observar el cumplimiento de las disposiciones oficiales e institucionales. 4. DESARROLLO 4.1 Los residuos biolgico-infecciosos debern cuantificarse y anotar los datos en las bitcoras correspondientes, previo a su almacenamiento temporal.

10 4.1.1 Los residuos los debern depositar en los contenedores con el smbolo universal de riesgo biolgico correspondientes ubicados en el almacn de la siguiente manera: y Bolsas rojas: contenedores rojos. y Bolsas amarillas y recipientes hermticos amarillos: en refrigeracin (4C) y Recipientes de punzocortantes: en los anaqueles del almacn. 4.2 Los residuos de tipo qumico antes de enviarlos a su almacenamiento se debern tomar en cuenta su estado fsico, sus caractersticas fisicoqumicas y de compatibilidad. 4.3 Los residuos del rea de Rayos X, deber colocarlos en los estantes de forma segura y en la que observe la etiqueta de recipiente que contiene el residuo. 4.3.1 Las placas de Rayos X deben mantenerse fuera de toda posible humedad 4.4 Terminado de estibar los recipientes, cerrar de forma segura el almacn temporal. Seguridad en Laboratorios y Centros de Trabajo 1. OBJETIVO: Proveer de un ambiente seguro de trabajo en los laboratorios de la Universidad Veracruzana. 2. REFERENCIA Reglamento Federal de Seguridad, Higiene y Medio Ambiente de Trabajo. 3. DEFINICIONES 3.1 Actividades peligrosas. Es el conjunto de tareas derivadas de los procesos de trabajo, que generan condiciones inseguras y sobreexposicin a los agentes fsicos, qumicos o biolgicos capaces de provocar daos a la salud de los trabajadores o al centro de trabajo. 3.2 Contaminantes del medio de trabajo. Son los agentes fsicos, qumicos y biolgicos capaces de modificar las condiciones del medio ambiente de trabajo, que por sus propiedades, concentracin, nivel y tiempo de exposicin o accin pueden alterar la salud de los trabajadores. 3.3 Material. Es todo elemento, compuesto o mezcla, ya sea de materia prima, producto, subproducto, residuo o desecho que se utiliza o genera en las operaciones y procesos en los centro de trabajo. 3.4 Materiales y sustancias qumicas peligrosas. Son aquellos que por sus propiedades fsicas y qumicas al ser manejados, transportados, almacenados o procesados, presentan la posibilidad de inflamabilidad, explosividad, toxicidad, reactividad, radiactividad, corrosividad o reaccin biolgica daina, y pueden afectar a la salud de las personas expuestas o causar daos materiales a instalaciones o equipos. 3.5 Microorganismo patgeno. Organismo viviente microscpico, causante de enfermedades. 4. DESARROLLO

11 4.1 Identificar el tipo de riesgos a los que se exponen los profesores, estudiantes, trabajadores y visitantes que ingresan a cada uno de los laboratorios y centros de trabajo. 4.2 Utilizar el equipo de proteccin personal indicado por el responsable del laboratorio o centro de trabajo. 4.3 El profesor, jefe de rea y jefe de departamento son los responsables de realizar la primera demostracin de cmo se debe usar el equipo de proteccin personal, as como de efectuar demostraciones peridicas. 4.4 Dependiendo del grado de riesgo de cada rea o centro de trabajo, algunos equipos de proteccin personal debern ser manejados como residuos peligrosos despus de su uso. 4.5 Los profesores, estudiantes, trabajadores y visitantes que entran en contacto con materiales potencialmente infecciosos, deben de lavarse las manos tan pronto como sea posible. El lavado debe de hacerse vigorosamente por al menos diez segundos utilizando un detergente suave. Las manos deben de lavarse tan pronto como sea posible despus de haberse quitado los guantes y antes de salir del laboratorio o centro de trabajo. 4.6 Queda prohibido comer, beber, fumar, aplicarse cosmticos y manipular lentes de contacto en el laboratorio o centro de trabajo. 4.7 Queda prohibido almacenar alimentos y bebidas en los refrigeradores donde se guarde material de laboratorio. 4.8 Mantener ordenados los bancos de trabajo y limpiarlos con un desinfectante al menos una vez por da e inmediatamente despus de un derrame de material potencialmente peligroso. 4.9 queda prohibido pipetear directamente con la boca. 4.10 Queda prohibido dejar que el contenido de la pipeta caiga desde la altura hasta el contenedor. Esta operacin debe hacerse dejando resbalar por la pared contenedor. 4.11 El uso de agujas y otros materiales punzocortantes debe eliminarse tanto como sea posible. 4.12 Los materiales empleados en las prcticas deben de desinfectarse tan pronto como sea posible. 4.13 Los derrames de sangre y fluido corporales deben de limpiarse inmediatamente con toallas absorbentes desechables, lavarse con detergente y agua, y desinfectarse con blanqueadores casero diluido a 1:10 si la superficie es porosa y 1:100 si la superficie es dura.

BIBLIOGRAFIA Manual de procedimientos para el manejo de residuos peligrosos biolgicoinfecciosos y txicos.

12 PRACTICA # 2 MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO OBJETIVO: y Conocer los aspectos generales y usos del material de laboratorio y del equipo empleado para la realizacin de las prcticas.

MARCO TEORICO: El laboratorio de bioqumica debe tener el material adecuado para la realizacin de sus prcticas, con el propsito de favorecer y apoyar el proceso de aprendizaje. En el laboratorio se utiliza material de vidrio de uso variado y delicado, como los vasos de precipitado de vidrio refractario que sirven para contener diferentes volmenes de sustancias y para preparar soluciones y mezclas. El matraz es un instrumento til para contener lquidos y as generar reacciones; tiene por lo regular varias presentaciones: redondo, de fondo plano, de destilacin y el de Erlenmeyer. Los tubos de ensayo son tambin de vidrio refractario y se usan para contener pequeas cantidades de sustancias con las que se realizan las pruebas o ensayos. En el laboratorio hay adems instrumentos de vidrio GRADUADOS para medir volmenes de lquidos como la probeta, vasos de pp, matraz erlenmeyer y, los VOLUMETRICOS como los matraces aforados y las pipetas volumtricas y pipetas automticas. El material de uso especfico es til para determinadas prcticas por ejemplo el termmetro instrumento utilizado para medir la temperatura y el densmetro, el cual es utilizado para medir la densidad de los lquidos. El material de soporte est integrado por las pinzas para tubos de ensayo, y la gradilla que sostiene los tubos de ensayo en determinada posicin. Como material de porcelana se utiliza la placa de porcelana. Los aparatos de laboratorio de bioqumica son: A.- Centrfuga: La centrifugacin es un mtodo muy til en el laboratorio para separar sustancias de diferente densidad suspendidas en un lquido; en ella, la accin de la fuerza centrfuga da como resultado que las partculas ms pesadas se sedimenten ms rpido que las partculas ligeras. Las centrfugas ordinarias operan a rotaciones menores de 10 000 revoluciones por minuto (rpm). Las condiciones que limitan esta velocidad son la

13 resistencia de la parte de la centrfuga que sostiene el rotor (brazo), la friccin con el aire y el calentamiento. Precauciones para el uso de la centrfuga: 1. Los tubos en la centrfuga debern colocarse por pares para que no quede desnivelada. Enfrente de un tubo con un volumen determinado, debe estar otro, en la misma posicin, con el mismo volumen. El descuido de esta regla implica un desnivel que, a las velocidades y fuerzas sealadas puede daar el aparato. 2. Para no forzar el motor arrnquese gradualmente la centrfuga hasta alcanzar la velocidad requerida. 3. Nunca se frene una centrfuga; djese parar por su propia inercia; el no hacer esto conduce a que se agite el contenido de los tubos y se eche a perder el trabajo. 4. No alzar las tapas de la centrfuga cuando est en movimiento ya que podra proyectase el contenido de los tubos 5. Ante cualquier dificultad o duda consulte al profesor o tcnico de laboratorio. B.- Espectofotmetro: El espectrofotmetro es un aparato utilizado para medir la variacin del poder difusor de una superficie determinada ( cociente entre el flujo luminoso difundido y el incidente) en funcin de la longitud de onda y de la radiacin incidente. Por medio de la espectrofotometra se puede determinar la longitud de onda correspondiente a cada componente de un espectro y medir su intensidad. C.- Microscopio: El microscopio es un instrumento ptico que aumenta la imagen de objetos pequeos. Puede ser simple y compuesto. El simple est constituido por una lente convergente y equivalente a una lupa. El compuesto cuenta bsicamente con 3 sistemas: MECANICO, OPTICO Y ELECTRICO, y, algunas de sus partes son: y y y y y y Un sistema de iluminacin y uno de observacin tiene una base y soporte en forma de V U. Una plataforma llamada platina donde se coloca el objeto que se ilumina por transparencias. Un sistema de lentes llamado condensador, colocado debajo de la platina y precedido de un diafragma o iris y de un portafiltros. Un dispositivo porta objetos que puede ser de revlver o de corredera. Un tornillo macromtrico que enfoca por medio de cremallera y un tornillo micromtrico. Una fuente de luz que enva los rayos al objeto

14 Un ocular por donde el observador examina la imagen aumentada del objeto.

y

El ocular tiene una distancia focal de 1 a 5 cm. A menudo el instrumento lleva varios oculares intercambiables de aumentos diferentes.

NORMAS DE SEGURIDAD: y y y y y Utiliza la bata de laboratorio (blanca, manga larga y con un largo que cubra hasta la rodilla). Evita introducir alimentos y sobre todo consumirlos Adopta una actitud de responsabilidad y disciplina No manipules las sustancias qumicas con los dedos. Utiliza una esptula, cuchara o papel. No utilices la pipeta con la boca

ACTIVIDADES: 1. Lectura previa de la prctica. 2. Efectuar la identificacin y uso de cada uno de los materiales 3. Por qu razn se debe colocar el material en la parte media de la mesa de trabajo? _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ ____________________________ 4. Representar con dibujos el material y equipo expuestos en la prctica. Material:

15

Equipo:

BIBLIOGRAFA. Manual de Bioqumica y biologa molecular. Facultad de medicina UNAM

16 PRACTICA # 3 TOMA DE MUESTRA SANGUINEA OBJETIVOS: y Aprender a realizar una extraccin de sangre para las determinaciones de pruebas de qumica sangunea. MARCO TEORICO: La sangre de un tejido contenido dentro del sistema vascular, corazn, arterias, venas y capilares, est constituida por un lquido, el plasma sanguneo en el cual circulan elementos que son las clulas: glbulos rojos, blancos y plaquetas. Al extravasar la sangre en un recipiente se coagula, separndose en dos partes una lquida de color pajizo que es el suero y la otra slida que es el cogulo. El suero carece de los factores de la coagulacin uno de ellos es el fibringeno que se ha transformado en fibrina constituyendo una red que aprisiona a los elementos formes de la sangre dejando solo la parte lquida que es el suero. MATERIAL: y y y y y Torunda con alcohol Ligadura Tubos Vacutainer de tapn rojo Agujas Vacutainer verde (21 x 28 mm) Gradilla.

PROCEDIMIENTO: El sitio ms usado es la fosa antecubital (hueco del codo); otros sitios son la mueca y el dorso de la mano o el pie. Se le pedir al paciente que se siente en una silla y se apoye en el portabrazos o mesa. 1. Se debe colocar adecuadamente al paciente, segn se encuentre sentado o en decbito prono, para tener acceso fcil a la fosa antecubital. 2. Se debe de preparar todo el material, incluidos los tubos, la ligadura, los objetos para limpiar la piel, las jeringas, etc. 3. Insertar (roscar) la aguja Vacutainer en el adaptador (cada equipo deber contar con el suyo propio). 4. Rotular con el nombre del paciente el tubo Vacutainer de tapn rojo (sin anticoagulante), agregando adems el tipo de estudio a realizar, as como la fecha de la toma. 5. Se solicita al paciente que cierre el puo para que las venas resulten ms palpables.

17 6. Se selecciona la vena adecuada para la puncin. Las ms frecuentemente usadas son la baslica y la mediana, 7. Colocar firmemente el torniquete en el brazo completamente firme estirado y recargado en una almohadilla indicndole que abra y cierre varias veces su mano. 8. Se limpia la zona con una torunda humedecida con alcohol. Se comienza en el punto de la puncin y se prosigue la limpieza hacia fuera siguiendo un movimiento espiral. 9. Fijar la piel junto con la vena con la mano izquierda y con la derecha insertar la aguja con el bisel hacia arriba y empleando un movimiento firme y rpido. 10. Insertar el tubo Vacutainer de tapn rojo al adaptador y extraer la sangre. 11. Cuando se tiene la cantidad necesaria se debe retirar el tubo Vacutainer, aflojar el torniquete con la mano izquierda, oprimir el sitio de la puncin con la torunda alcoholada y extraer la aguja rpidamente, indicar al paciente que l mismo comprima el sitio de la puncin y doble o eleve su brazo para prevenir la extravasacin de sangre a travs del sitio de puncin 12. Separar la aguja del adaptador y colocarla en el contenedor de punzocortantes (bote rojo proporcionado por el Tcnico acadmico y/o catedrtico responsable). MEDIDAS DE SEGURIDAD. Es una regla de laboratorio que todos los accidentes personales, por triviales que sean, se comuniquen inmediatamente al profesor, as como el uso obligatorio de la bata, la cual deber permanecer cerrada durante todo el tiempo que se permanezca en el laboratorio. La sangre, el plasma o el suero y todos los recipientes que lo contengan deben considerarse como material potencialmente infectante, por lo que (torundas y punzocortantes) debern colocarse en los recipientes especiales para dicho fin.(RPBI) ACTIVIDADES: 1.- Efectuar una toma de muestra por equipo. 4.-Representar los dibujos de la prctica realizada.

18

BIBLIOGRAFIA Obtencin de muestras sanguneas de calidad analtica Asociacin Mexicana de Bioqumica Clnica A.C. Moran Villatoro, Luis. Editorial Mdica Panamericana, 2001

19 PRACTICA NO 4 SEPARACION DE PLASMA Y COAGULO OBJETIVOS: Diferenciar al suero del plasma y la importancia de cada uno en las determinaciones de bioqumica clnica. MARCO TEORICO Para obtener el plasma es necesario detener la coagulacin cuando se extravasa la sangre esto se consigue por medio de los anticoagulantes. Por medio de los anticoagulantes se obtiene la sangre en forma parecida a como se encuentra dentro del sistema vascular, y se centrfuga, se separan los elementos formes en un paquete llamado paquete globular y queda un lquido, el plasma. Tanto el suero como el plasma contienen numerosas sustancias disueltas accesibles a ser detectadas y cuantificadas. MATERIAL y Torunda con alcohol y Ligadura y Tubos Vacutainer de tapn rojo y Agujas Vacutainer verde (21 x 28 mm) y Gradilla. y Centrfuga. y Bao Mara PROCEDIMIENTO: El sitio ms usado es la fosa antecubital (hueco del codo); otros sitios son la mueca y el dorso de la mano o el pie. Se le pedir al paciente que se siente en una silla y se apoye en el portabrazos o mesa. 1. Se debe colocar adecuadamente al paciente, segn se encuentre sentado o en decbito prono, para tener acceso fcil a la fosa antecubital. 2. Se debe de preparar todo el material, incluidos los tubos, la ligadura, los objetos para limpiar la piel, las jeringas, etc. 3. Insertar (roscar) la aguja Vacutainer en el adaptador (cada equipo deber contar con el suyo propio). 4. Rotular con el nombre del paciente el tubo Vacutainer de tapn rojo (sin anticoagulante), agregando adems el tipo de estudio a realizar, as como la fecha de la toma. 5. Se solicita al paciente que cierre el puo para que las venas resulten ms palpables. 6. Se selecciona la vena adecuada para la puncin. Las ms frecuentemente usadas son la baslica y la mediana, 7. Colocar firmemente el torniquete en el brazo completamente firme estirado y recargado en una almohadilla indicndole que abra y cierre varias veces su mano.

20 8. Se limpia la zona con una torunda humedecida con alcohol. Se comienza en el punto de la puncin y se prosigue la limpieza hacia fuera siguiendo un movimiento espiral. 9. Fijar la piel junto con la vena con la mano izquierda y con la derecha insertar la aguja con el bisel hacia arriba y empleando un movimiento firme y rpido. 10. Insertar el tubo Vacutainer de tapn rojo al adaptador y extraer la sangre. 11. Cuando se tiene la cantidad necesaria se debe retirar el tubo Vacutainer, aflojar el torniquete con la mano izquierda, oprimir el sitio de la puncin con la torunda alcoholada y extraer la aguja rpidamente, indicar al paciente que l mismo comprima el sitio de la puncin y doble o eleve su brazo para prevenir la extravasacin de sangre a travs del sitio de puncin 12. Separar la aguja del adaptador y colocarla en el contenedor de punzocortantes (bote rojo proporcionado por el Tcnico acadmico y/o catedrtico responsable). 13. Incubar el tubo con la sangre en posicin vertical en Bao Mara a 37 grados C, durante 20 minutos. 14. Retirar del bao y con la ayuda de un palillo de madera desprender el cogulo de las paredes del tubo. 15. Centrifugar el tubo con la sangre a 2 500 rpm (revoluciones por minuto) durante 5 minutos. 16. Separar el suero por decantacin en otro tubo de ensaye 17. Debe evitarse que el suero se mezcle con porciones de cogulo; si esto sucede, es necesario centrifugar y volver a separar el suero con una pipeta Pasteur. 18. Para obtener plasma, hay que evitar la coagulacin por medio de un anticoagulante (heparina o EDTA) en el tubo que recibe la sangre (en ste caso se utiliza tubo Vacutainer con tapn lila). Mezclar suavemente por inversin. Centrifugar a 2 500 rpm durante 5 minutos y extraer enseguida el plasma sobrenadante con una pipeta Pasteur; pasarlo a otro tubo. MEDIDAS DE SEGURIDAD. Es una regla de laboratorio que todos los accidentes personales, por triviales que sean, se comuniquen inmediatamente al profesor, as como el uso obligatorio de la bata, la cual deber permanecer cerrada durante todo el tiempo que se permanezca en el laboratorio. La sangre, el plasma o el suero y todos los recipientes que lo contengan deben considerarse como material potencialmente infectante, por lo que (torundas y punzocortantes) debern colocarse en los recipientes especiales para dicho fin.(RPBI) 1.- Efectuar una toma de muestra por equipo. 2.- Separar el suero de la muestra de sangre. 3.- Cul es la diferencia entre suero y plasma y cul su importancia? _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ ______________________________________________________

21 4.-Representar los dibujos de la prctica realizada.

BIBLIOGRAFIA Obtencin de muestras sanguneas de calidad analtica Asociacin Mexicana de Bioqumica Clnica A.C. Moran Villatoro, Luis. Editorial Mdica Panamericana, 2001

22 PRACTICA NO. 5 DETERMINACION DE GLUCOSA SANGUINEA OBJETIVOS: y y Realizar el mtodo enzimtico para la determinacin de glucosa en suero. Conocer que la determinacin de glucosa sangunea es una de las mediciones qumicas ms usada en clnica, y que se emplea para determinar el metabolismo de los carbohidratos y llevar el control de los diabticos.

FUNDAMENTO DEL METODO El esquema de la reaccin es el siguiente: Glucosa + O2 -------GOD--------------------cido glucnico + H2O2

2 H2O2 + 4 AF + fenol ---------POD--------- quinona coloreada + 4 H2O GOD= solucin de glucosa oxidasa POD = peroxidasa MARCO TEORICO: La glucosa es el energtico principal del organismo y se obtiene bsicamente de la alimentacin, aunque puede producirse durante el propio metabolismo del cuerpo. Los azcares distintos a la glucosa por lo general son convertidos a glucosa lo mismo que la mayor parte de los carbohidratos ingeridos. Los azcares simples como la glucosa son usados con rapidez, mientras que los dems nutrimentos, como las protenas, cuando se ingieren en cantidad mayor de la necesaria, son convertidos de manera gradual a glucgeno y almacenados en el hgado para ser usados en la conservacin de los valores sricos normales de glucosa entre comidas. La conservacin de los valores sricos normales en ayunas depende de la interaccin de cierto nmero de estructuras corporales, entre ellas el hgado, los tejidos perifricos y las hormonas, todos los cuales actan para elevar o reducir la glucosa srica. Tambin los riones realizan la gluconeognesis, ya que pueden sintetizar hasta 10% de la capacidad del hgado. Debido a que la concentracin de glucosa srica por lo general se vuelve anormal slo cuando hay un trastorno grave de esta interaccin, verificar la glucosa srica ayuda a evaluar la funcin e integridad del sistema. La patologa ms comn relacionada con el metabolismo de los hidratos de carbono es la Diabetes Mellitus. El diagnstico precoz y el control de los pacientes diabticos, tienen por objeto evitar la cetoacidosis y las complicaciones de los sntomas resultantes de la hiperglucemia, mediante el tratamiento adecuado. Dado que existen mltiples factores causales de hiper o hipoglucemia, debe

23 considerarse en cada caso la condicin fisiolgica y / o la patologa presente en el paciente en cuestin. MATERIAL: y y y Espectrofotmetro o analizador para lecturas a 505 nm Cubetas de 1,0 cm de paso de luz Equipamiento habitual de laboratorio

MUESTRAS Suero o plasma libre de hemolisis El suero debe separarse lo antes posible de coagulo Estabilidad: la glucosa en suero o plasma es estable 3 dias a 2-8 C REACTIVOS: segn el kit que sea utilizado PROCEDIMIENTO: Segn el kit que sea utilizado 1. Efectuar la extraccin de sangre y obtener el suero sanguneo. 2. En tres tubos de ensaye marcados con B (blanco) S (standar) y D (desconocido) colocar : B Standard Muestra Reactivo de trabajo 2 ml. S 20 ul 2 ml. D 20 ul 2ml

3. Incubar 10 minutos en bao de agua a 37 0C. Luego leer en espectrofotmetro a 550 nm llevando el aparato a cero con el blanco.

CALCULO DE LOS RESULTADOS: Glucosa g/l = D x f VALORES DE REFERENCIA: Suero o plasma: 0.70 1.10 g/l donde f = 1,00 g/l ---------S

24

ACTIVIDADES: 1. Definir hiper e hipoglucemia y explicar su fisiologa. _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 2. Explique el papel de las hormonas en la regulacin de la glucosa. _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 3. Defina los tipos de diabetes. _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ ______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 4. Cundo aumentan y cundo disminuyen las concentraciones sricas de glucosa? _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ Caso clnico: Hipoglucemia secundaria a intoxicacin alcohlica. Paciente de 58 aos, alcohlico crnico, cuyos familiares relatan que ha ingerido una gran cantidad de alcohol en los dos ltimos das con un consumo muy escaso de alimentos. Inici su padecimiento con nusea, vmito, mareo, sudacin, cefalea, visin borrosa y confusin; present en una sola ocasin, una convulsin,

25 por lo que es llevado al servicio de urgencias. A la exploracin se encuentra semiconsciente con aliento alcohlico e hipotermia. Se procede a un lavado gstrico para remover el alcohol an no absorbido; se mantienen permeables las vas respiratorias; se instala oxigenoterapia y se le administra solucin glucosada por va endovenosa. Los resultados de laboratorio demuestran: Alcohol mmol/l, Lactato 9.0 mmol/l, PH 7.2 300 mg/dl, Glucosa 2.0

1. Cules son los sntomas de la hipoglucemia? _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 2. De que forma el etanol produce acidosis lctica e hipoglucemia? _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 3. El alcoholismo es la base de muchas deficiencias vitamnicas .Qu implicaciones metablicas tienen estas deficiencias ( complejo B) ? _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ BIBLIOGRAFA. Kathleen Morrison Treseler. Laboratorio clnico y pruebas de diagnstico. Editorial Manual Moderno S.A. de C.V. Rex Montgomery. Bioqumica : Casos y texto. Editorial Mosby-Year Book. Wolfe Publishing. Manuales Departamentales. Bioqumica y Biologa celular. Facultad de Medicina UNAM Editorial Mc.Graw Hill.

26 PRACTICA NO. 6 DETERMINACION DE COLESTEROL TOTAL OBJETIVOS: y Conocer uno de los mtodos utilizados para el anlisis de colesterol. y Determinar los valores normales y anormales en una muestra tomada en el laboratorio. INTRODUCCIN: Las concentraciones sricas de colesterol permanecen en forma notablemente constante de un da a otro en una persona sana, pero tiende a aumentar con la edad y cambia con las poblaciones adems de que hay variacin amplia entre individuos. La mayor parte de colesterol corporal es producido por sntesis, alrededor de 1 g/ da. Slo cerca de un tercio de esa cantidad es proporcionada por los alimentos. Aunque hay una proporcin inversa de la sntesis a la ingestin oral, la produccin endgena no es suprimida del todo por el consumo, ya que slo se deprime la sntesis heptica.. Ningn nivel srico de colesterol ha sido determinado como valor anormal crtico, sin embargo, en individuos mayores de 30 aos, una concentracin de colesterol elevada sigue siendo uno de los mejores indicadores de las poblaciones en riesgo para el desarrollo de cardiopata isqumica ( Harvey y colaboradores, 1991). El colesterol es un constituyente primario de las lipoprotenas de baja densidad (LDL, del ingls low-density lipoproteins), pero puede encontrarse tambin en las lipoprotenas de alta densidad ( HDL high-density lipoproteins) y en las de muy baja densidad ( VLDL very-low density lipoproteins). La medicin de colesterol srico solo tiene valor limitado. Sin embargo, cuando se considera junto con mediciones del complejo lipoprotenas de alta densidad-colesterol (HDL-c), es posible determinar el riesgo de coronariopata ( CRP). Este riesgo aumenta 25 % con cada 5 mg/100 ml. que decrece HDL-c debajo de la media. Los riesgos pueden calcularse usando la proporcin de HDLC a LDL-c o al colesterol total. Existe una relacin inversa entre HDL-c y la incidencia y prevalencia de CRP. Otro clculo rel riesgo puede hacerse calculando la proporcin de HDL-c a LDL-c o al colesterol total. El colesterol de los alimentos se absorbe con facilidad. Los vegetales no contienen colesterol pero poseen otros esteroles, mal absorbidos por el cuerpo, los cuales inhiben l absorcin del primero cuando se administran en cantidades abundantes- una base para incrementar los regmenes dietticos de grasas no saturadas en el tratamiento de hipercolesterolemia ( Howard y Herbold, 1982).

27 El colesterol y todos los lpidos son digeridos en el duodeno. Despus de emulsificacin biliar, el colesterol difunde a la sangre y a la linfa. Slo el hgado se encarga de retirar al colesterol de la circulacin. Es secretado directamente en la bilis y tiene una ligera utilizacin a cidos biliares. La mayor parte del colesterol de la bilis se reabsorbe del intestino, pero , en las heces se excreta una cantidad pequea , la cual constituye alrededor de la mitad de todo el colesterol excretado del cuerpo. El colesterol es secretado del hgado a la sangre y a la bilis , incluyendo los cidos biliares, y el primer paso en la sntesis de esteroides a partir del colesterol tiene lugar dentro del hgado. Alrededor de tres cuartas partes del colesterol esterificado por rl hgado es transportado a los tejidos corporales donde penetra a las clulas y es usado. En la corteza suprarrenal, el colesterol acta como un precursor para la pregnenolona, que a su vez es precursora de progesterona, testosterona, estrgeno, aldosterona y cortisol. En la piel, el colesterol es precursor de la vitamina D que es activada por la aplicacin de la luz ultravioleta. MATERIAL: y y y y y y y y y 3 Tubos de ensayo. 2 pipetas de 1 .0 ml. Una pipeta de 5.0 ml. 1 vaso de precipitado Termmetro. Suero Centrfuga Bao mara Espectrofotmetro.

PROCEDIMIENTO: 1. Marcar 3 tubos de ensayo: B (blanco) , M (muestra) y P (patrn) y proceder como sigue: Suero Solucin patrn Agua destilada Reactivo de colesterol BLANCO ---------0.05 ml.2.0 ml. MUESTRA 0.05 ml. ----------2.0 ml PATRON -----0.05 ml. -----2.0 ml.

28 2- Despus de 10 minutos, pipetear sobre la pared de cada tubo sobre la superficie del lquido 0.5 ml de cido sulfrico. 3- Colocar los tubos inmediatamente despus de la adicin de cido sulfrico en un bao de agua a temperatura de 15 25 oC durante 5 minuto. 4- Medir la absorcin de la muestra y el patrn contra en blanco de reactivo de 10 30 minutos despus de la adicin del cido sulfrico.

CALCULOS: mg/100 ml. = Absorbancia de la muestra x 300 Absorbancia del patrn Valores de referencia: (La concentracin de colesterol depende de la edad, sexo, caracteres tnicos y la alimentacin.) 200-250 mg/ 100 ml. ACTIVIDADES: 1.- Cundo se encuentran disminuidas las concentraciones sricas de colesterol? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________ 2.- Las concentraciones sricas de colesterol aumentan en : __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________ Caso clnico : Hipercolesterolemia y aterosclerosis. Un hombre de 56 aos acudi al mdico por presentar dolor precordial en reposo, que se incrementaba con el esfuerzo. Se le detect hipercolesterolemia que, al anlisis de los lpidos, mostr que la mayora del colesterol plasmtico elevado se encontraba en la fraccin de lipoprotena de baja densidad (LDL). Se le realiz una arteriografa coronaria la cual mostr un estrechamiento de las arterias. La

29 evaluacin de la dieta indic que consuma gran cantidad de alimentos ricos en colesterol, aunque en los ltimos meses haba seguido una dieta baja en grasas. Fue diagnosticado de aterosclerosis en las arterias coronarias. El tratamiento consisti en una dieta sin colesterol y en administrar preparados de lovastatina, un inhibidor de la HMG-CoA reductasa. Fue tratado tambin con colestiramina, una resina que capta las sales biliares. La resina no se absorbe y permanece en la luz intestinal donde se une a las sales y aumenta la cantidad de las mismas que se excreta con las heces. 1.-Cules son algunos alimentos ricos en colesterol? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________ 2.-Cul es la funcin de la bilis en la digestin? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________ 3.-Por qu el hecho de disminuir la concentracin plasmtica de colesterol puede ser til para la salud de este paciente? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________ 4.- Qu papel desempea la HMG-CoA reductasa en la biosntesis de colesterol? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________ BIBLIOGRAFA. Kathleen Morrison Treseler. Laboratorio clnico y pruebas de diagnstico. Editorial Manual Moderno.

30 Manual departamental. Bioqumica y Biologa Molecular. Facultad de medicina UNAM Editorial Mc.Graw Hill Montgomery R. Bioqumica Casos y Texto. Quinta edicin. Editorial Mosby Year Book Wolfe publishing.

31 PRACTICA 7 DETERMINACIN DE TRIGLICRIDOS. OBJETIVOS: y Conocer el mtodo por medio del cual se puede determinar el valor de los triglicridos en una muestra sangunea. y Determinar los valores de una muestra tomada en el laboratorio. FUNDAMENTO: Los triglicridos son extrados selectivamente mediante una mezcla de heptanolisopropeno-cido sulfrico. Se forman dos capas : la superior, no polar contiene los triglicridos y la inferior contiene los fosfolpidos, bilirrubina,glucosa, protenas y glicerol. INTRODUCCION Los dos lpidos de la sangre con un mximo inters en el diagnstico clnico son el colesterol y los triglicridos; ambos se transportan en las lipoprotenas, que son partculas globulares de alto peso molecular con un ncleo formado por lpidos hidrofbicos, triglicridos y steres de colesterol, los cuales aportan la mayor parte de la masa de la partcula, y por una sola capa superficial de molculas de fosfolpidos, colesterol y protenas o polipptidos que rodean al ncleo y estabilizan la partcula para que permanezcan en solucin dentro del plasma. La mayora de los tejidos del cuerpo humano puede convertir los cidos grasos en triglicridos; hgado y tejido adiposo son los sitios principales de sntesis. Los triglicridos son almacenados en el tejido adiposo; en el msculo esqueltico y cardiaco se guardan solo para consumo local. La sntesis heptica de los triglicridos se utiliza para la produccin de las lipoprotenas. La sntesis y la hidrlisis de los triglicridos constituyen un proceso contnuo en el tejido adiposo. Sin embargo en condiciones normales, los sistemas de sntesis e hidrlisis estn bien equilibrados y los almacenes de triglicridos se mantienen relativamente constantes. Cuando el almacenamiento de energa en forma de triglicridos mediante el tejido adiposo es excesivo, se establece una condicin llamada obesidad . Las estadsticas indican que la obesidad est bien correlacionada con un promedio de vida menor y con un aumento en los problemas de salud, principalmente los cardiovasculares. Muchos factores conducen a ella, pero la causa bsica es por supuesto una ingestin calrica por encima de los requerimientos energticos estndar.

32

MATERIAL EMPLEADO: y y y y y y Tubos de ensaye Pipeta graduada Bao maria Espectrofotmetro Suero sanguneo Reactivos de la prctica

METODO. 1. Agitar fuertemente la solucin extractora antes de usarla. Si se presentase turbiedad, incubar en bao mara ligeramente a 370 C y agitar bien. 2. En un tubo de ensaye de 12 x 100 depositar 0.5 ml. de suero problema ms 4 ml. de solucin extractora. Agitar vigorosamente durante 10 segundos. Dejar en reposo en posicin vertical hasta que se formen y separen 2 capas. 3. Marcar tres tubos de ensaye con las letras B ( blanco ), M (muestra), y P (patrn). 4. Enseguida depositar en el fondo de cada uno de los tubos las alcuatas del extracto (capa superior), etilato de sodio y patrn segn lo siguiente:

BLANCO Extracto ( capa superior) Solucin patrn Etilato de sodio 4 gotas

MUESTRA 0.2 ml.

PATRON 0.2 ml.

4 gotas

5. Mezclar bien y colocar en bao mara a 56 C. Durante 1 minuto. 6. Agregar a cada uno de los tubos anteriores la solucin oxidante. Solucin oxidante BLANCO 0.5 ml. MUESTRA 0.5 ml. PATRON 0.5 ml.

7. Mezclar bien y mantener en bao mara a 56 grados C por 30 segundos. Agregar a cada uno de los tubos 5 ml. de reactivo de color. 8. Mezclar los tubos con agitacin suave y colocarlos nuevamente en el bao de agua a 56 0 C durante 5 minutos.

33 9. Sacar los tubos y colocarlos en agua fra. Leer las absorbancias en el espectrofotmetro a 410 nm. CALCULOS: Triglicridos ( mg / 100 ml. ) = Absorbancia de la muestra x 200 Absorbancia del patrn Valores de referencia: Mujeres 37 189 mg/ 100 ml. Hombres 34 252 mg/ 100 ml.

ACTIVIDADES: 1. Mencione los padecimientos en los cuales se encuentran los triglicridos elevados. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 2. En que consiste la condicin txica llamada hgado graso. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 3. Defina que es la Obesidad. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

34

Caso clnico: Obesidad. Chica de 19 aos, busca ayuda mdica por un exceso de peso de 30 kg. La mayor parte de su exceso de peso era en forma de triacilgliceroles en el tejido adiposo. Al estudiar su dieta se comprob que era muy pobre, gran parte de su ingesta calrica era en forma de carbohidratos ( dulces, galletas, pasteles, bebidas azucaradas y cerveza ) ; en realidad, su ingesta de grasas era bastante moderada. 1. Cmo es posible que se formen cantidades excesivas de triacilgliceroles en el cuerpo si la dieta contiene predominantemente carbohidratos? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 2. Cmo llega al citoplasma el acetil CoA generado dentro de las mitocondrias para entrar en la va de biosntesis de novo de los cidos grasos? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 3. Cul es la enzima limitadora de la velocidad en la biosntesis de novo de los cidos grasos? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ BIBLIOGRAFA: Kathleen Morrison Treseler. Laboratorio Clnico y pruebas de diagnstico. Editorial Manual Moderno, S.A. de C.V. Daz Zagoya- Hicks. Bioqumica. Editorial Interamericana. McGraw-Hill. Montgomery R. Bioqumica: Casos y texto. Quinta edicin. Editorial Mosby Year Book Wolfe publishing.

35 PRACTICA NO 8 DETERMINACION DE LPIDOS TOTALES OBJETIVOS: y Conocer uno de los mtodos utilizados para la determinacin de los lpidos totales. y Determinar los valores totales de lpidos de una muestra sangunea obtenida en el laboratorio. FUNDAMENTO: Los lpidos insaturados reaccionan con el cido sulfrico formando un in carbonio que reacciona con el carbonilo de la fosfovainillina produciendo un complejo de color rosa, que es estabilizado por resonancia. La intensidad del color del complejo es proporcional a la concentracin de los lpidos en el suero. INTRODUCCIN: La concentracin total de lpidos aumenta cuando hay un incremento en cualquier fraccin de lpidos plasmticos ( excepto triglicridos), como en el sndrome nefrtico, cetosis y enfermedades cardiovasculares ( aterosclerosis). Puede encontrarse disminucin en las concentraciones totales de lpidos en sndromes de malabsorcin. Se produce un incremento fisiolgico despus de una comida grasosa, y varios frmacos aumentan los lpidos totales (por ejemplo, anticonceptivos orales, estrgeno). MATERIAL: y y y y y y y Espectrofotmetro. Tubos de ensayo Suero.. Reactivos para lpidos totales ( Bioxon) Parilla elctrica 2 vasos de precipitado Pipetas graduadas de 1 y 5 ml.

PROCEDIMIENTO: 1.- Marcar 3 tubos de ensayo con las letras MMA ( Mezcla Muestra Acida ), MPA ( Mezcla Patrn Acida) y B ( Blanco) y proceder como sigue: Muestra Patrn B MMA 0.1 ml. MPA 0.1 ml.

36 Acido conc. sulfrico 2.0 ml. 2.0 ml.

2.- Mezclar bien y poner en bao de agua hirviendo durante 10 minutos . 3.- Colocar 5 minutos en bao de agua fra. Proceder como sigue: MMA MPA Acido sulfrico conc. Reactivo de color B 0.1 ml. 2.5 ml. MUESTRA 0.1 ml. 2.5 ml. PATRON 0.1 ml. 2.5 ml.

4.- Mezclar bien e incubar a 37 o C durante 15 minutos. Determinar las absorbancias de las muestras y del patrn a 540 nm igualando a cero con el blanco. El color es estable por 15 minutos.

CALCULOS: Lpidos totales ( mg/100 ml) = Absorbancia de la muestra Absorbancia del patrn X 1000

Como el sistema colorimtrico sigue la ley de Beer, puede ser usado el factor para el clculo de los resultados. Factor de calibracin = 1000 ________ Absorbancia del patrn

Valores de Referencia: 400 1000 mg/ 100 ml.

37 ACTIVIDADES: 1.- En que consiste el sndrome nefrtico? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 2.- Explique en que consiste la cetosis. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 3.- Como se relaciona la concentracin elevada de lpidos totales con las enfermedades cardiovasculares ( aterosclerosis )? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ Caso clnico: Cetosis por inanicin. Obesidad Mujer de 27 aos llega al servicio de urgencias mdicas despus de haber sufrido un desmayo. Al interrogarla, relata que lleva 15 das a dieta de agua, t, y verduras cocidas para bajar de peso, sin ningn control mdico. Se detect aliento con olor a manzanas, cetonuria, cetonemia, cidos grasos libres elevados, triacilgliceroles elevados, hipoglucemia y presin arterial baja; su peso era de 74 kg y su estatura de 1.59 m. Se diagnostica cetoacidosis por inanicin y obesidad exgena. Su dieta mostr que gran parte de su ingesta calrica era en forma de carbohidratos ( galletas, chocolates, pasteles, refrescos, dulces, etc.). El tratamiento consisti en administrar parenteralmente solucin glucosada y continuar con una dieta normocalrica. 1. Cmo es posible que se formen grandes almacenes de energa en formas de grasas, si la dieta contiene predominantemente carbohidratos? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

38

2. Cul es el papel de los cuerpos cetnicos en el metabolismo? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 3. Qu rgimen diettico recomendara a esta persona para bajar de peso? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________ BIBLIOGRAFA: Katkleen Morrison Treseler. Laboratorio clnico y pruebas de diagnstico. Editorial Manual Moderno. Montgomery R. Bioqumica: Casos y texto. Quinta edicin. Editorial Mosby Year Book Wolfe publishing.

39 PRACTICA 9 DETERMINACIN DE PROTEINAS TOTALES OBJETIVOS: y Determinar los valores normales y anormales de protenas totales en una muestra sangunea extrada en el laboratorio. FUNDAMENTO: Las protenas del suero reaccionan con el reactivo de Biuret formando una coloracin violeta, cuya intensidad es proporcional a la concentracin de las mismas en la muestra. INTRODUCCIN: Al conjunto de protenas del plasma se les denomina Protenas.Totales (PT) y tiene una concentracin aproximada de 7 g/ 100 ml. La disminucin de las PT, que es casi siempre un reflejo de reduccin de la fraccin albmina, se observa en varios trastornos. Por lo general, las globulinas y, con mayor frecuencia la fraccin de globulina alfa, aumentan al mismo tiempo, lo que resulta en una concentracin de PT dentro de lmites normales. Cuando la concentracin de PT baja de 5.3 g/ 100 ml., se considera un nivel crtico, y casi de modo invariable se produce edema. En muchos estados patolgicos no relacionados la hipoproteinemia aparece con lentitud e insidia. Puede ser secundaria a ingestin inadecuada de protena-incluyendo la falta de uno o de todos los aminocidos esenciales- o a una absorcin deficiente, secundaria a una sntesis inadecuada de protena dentro del cuerpo ( como en la disfuncin heptica o en trastornos genticos ), o secundaria a una prdida elevada de protena por disfuncin renal o por estados patolgicos que aumentan la cantidad de protenas de peso molecular bajo en la circulacin, que pueden filtrarse y perderse ( hemlisis intravascular ). La prdida tambin tiene lugar debido a un catabolismo exagerado de protena ( desgaste caquctico en neoplasias malignas ), aumento de la concentracin de enzimas catablicas o en enteropatas gastrointestinales. Por lo general, la hiperproteinemia se presenta secundaria a la prdida patolgica de lquido o una reduccin importante en la ingestin de agua. La cantidad absoluta de protenas sricas no cambia, pero hay un aumento en la concentracin, resultante de la prdida del solvente agua. Una elevacin absoluta de la concentracin srica de protenas se observa en el mieloma mltiple. MATERIAL EMPLEADO: y y y Tubos de ensaye Pipetas Espectrofotmetro

40 Suero sanguneo

y

METODO: 1.- Marcar 3 tubos de ensayo con las letras B ( Blanco ) , P ( Patrn ) y M ( Muestra ) y agregar: Agua destilada Muestra ( suero ) Patrn de protenas Reactivo de Biuret BLANCO 0.1 ml. 5 ml. MUESTRA 0.1 ml 5.0 ml. PATRON 0.1 ml5.0 ml.

2.- Mezclar bien y dejar en reposo por 15 minutos. 3.- Determinar las absorbancias del patrn y de la muestra a 545 nm ajustando a cero con el blanco. El color es estable por tres horas CALCULOS: Protenas Totales ( g )/ 100 ml. = Absorbancia de la muestra Absorbancia del patrn Valores de Referencia: Protenas Totales : 6.0 a 8.0 g/ 100 ml. ACTIVIDADES: 1.- Mencione cuando aumentan las concentraciones sricas de Protenas Totales. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 2.- Mencione cuando disminuyen las concentraciones sricas de Protenas Totales. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 3.- Explique cmo intervienen las protenas en el metabolismo del agua en el espacio extracelular y por consiguiente, como contribuye su carencia a la formacin de edema. X 7

41 __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ BIBLIOGRAFA: Kathleen Morrison Treseler. Laboratorio Clnico y pruebas de diagnstico. Editorial El Manual Moderno, S.A. de C.V.

42 PRACTICA NO 10 DETERMINACION DE ENZIMAS: TRANSAMINASAS OBJETIVOS: y Conocer la utilidad que tiene la determinacin de la actividad de la TGP y la TGO en el suero. y Interpretar bioqumicamente la elevacin de las enzimas en el suero. y Conocer su importancia como enzimas de diagnstico clnico. FUNDAMENTO: La GOT cataliza la siguiente reaccin: L aspartato + a- cetoglutarato GOT > glutamato + oxalacetato La GPT cataliza la siguiente reaccin: L alanina + a- cetoglutarato GOT > glutamato + piruvato El piruvato formado ( el oxalacetato es inestable y se transforma en piruvato), reacciona con la 2,4 dinitrofenilhidrazina producindose, en medio alcalino, un compuesto coloreado que se mide a 505 nm. INTRODUCCIN: Las transaminasas son enzimas ampliamente difundidas en el organismo, que catalizan la transferencia de un grupo amino de un aminocido a un cetocido, en una de las ms importantes reacciones del metabolismo proteico. El inters clnico est centrado especialmente en dos de ellas: GOT ( transaminasa glutmico oxalactica ) y GPT (transaminasa glutmica pirvica ). Estas enzimas tienen accin eminentemente intracelular por lo que la actividad srica en condiciones normales es baja o nula. Un aumento de la actividad ser evidencia de un deterioro de los tejidos en que se encuentran, de los cuales resultan particularmente importantes corazn e hgado. Se ha observado que luego de un infarto de miocardio se produce en suero un marcado aumento de la actividad de GOT, debido a la liberacin al torrente sanguneo de esta enzima, tan abundante en el msculo cardaco. En este caso no existir aumento en la actividad srica de GPT o ser mnimo. En hepatitis virale y otras formas de enfermedad heptica que involucren necrosis de tejido, habr tambin un incremento considerable de la actividad srica en transaminasas, incluso antes de la aparicin de sntomas clnicos como la ictericia. En este caso, GPT ser la enzima predominante debido a su gran concentracin en el tejido heptico. Una elevada actividad de transaminasas puede detectarse tambin en traumas accidentales y quirrgicos y en distrofias musculares y miositis. Aplicaciones clnicas de las enzimas:

43 La medicin de la actividad enzimtica es til para el seguimiento de enfermedades declaradas, de tendencias genticas hacia ciertos estados patolgicos y de la respuesta de un paciente a ciertos tratamientos. MATERIAL EMPLEADO: y Espectrofotmetro y Micropipetas y Pipetas y Tubos de ensayo y Bao de agua a 37C y Suero y Reactivos de transaminasas. METODO: En dos tubos de fotocolormetro marcados B ( blanco) y D (desconocido), colocar: B D Sustrato ( GOT o GPT ) 0.5 ml. 0.5 ml. Colocar en bao de agua a37 oC unos minutos. Luego agregar: Suero 0.1 ml. Agua 0.1 ml Mezclar por agitacin suave e incubar exactamente 30 minutos y agregar: Diluyente para enzimas 5 ml. 5 ml. Mezclar por inversin y retirar del bao. Despus de dos minutos leer la absorbancia en el espectrofotmetro a 505 nm llevando el aparato a cero D.O. con agua destilada. CALCULOS: Empleando tablas de conversin. Valores de referencia: ( varan con el mtodo empleado) TGO : 0-41 UI/L TGP : 0- 45 UI/L ACTIVIDADES: 1. Cul es la funcin de las transaminasas? _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

44 2. En que casos aumenta las concentraciones de TGO (transaminasa glutmico oxalactica). _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 3. Cul es el diagnstico principal de la TGP? (transaminasa glutmico pirvica). _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ Caso clnico: Hepatitis Un hombre de 37 aos ingres en un hospital por glomerulonefritis, que se trat conservadoramente. A pesar de ello, la enfermedad progres y en los 6 meses siguientes su hgado fue agrandndose y se hizo doloroso a la palpacin. Las pruebas de funcin heptica eran anmalas. La concentracin de transaminasa glutmico oxlica (TGO) era de 1.200 UI/L, y la de bilirrubina total era 77 mol/l ( normal de 2-19 mol/l ). Se le diagnostic hepatitis . 1. Por qu aument la actividad de la TGO del suero? _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 2. Qu vitamina es una de las coenzimas de la TGO? _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ BIBLIOGRAFA: Kathleen Morrison Treseler. Laboratorio clnico y pruebas de diagnstico. Editorial Manual Moderno. Rex Montgomery. Bioqumica Casos y texto. Quinta edicin. Mosby Year Book. Wolfe Publishing. Bioqumica de Harper. Editorial Manual Moderno.

45 PRACTICA NO 11 DETERMINACIN DE ENZIMAS: AMILASA OBJETIVOS: y Identificar a esta enzima como una de las principales utilizadas para el diagnstico clnico. y Conocer su importancia en la evaluacin de la pancreatitis aguda. FUNDAMENTO: La alfa amilasa incubada en presencia de solucin amortiguadora de almidn, cataliza la hidrlisis del mismo y su actividad es medida fotomtricamente despus de la adicin de yodo. INTRODUCCIN : Las amilasas son enzimas que catalizan la hidrlisis de los polisacridos. Las pruebas de amilasa en suero y en la orina son mediciones cuantitativas de la cantidad de la enzima que se encuentra en la sangre o en la orina .Esta prueba es de suma importancia en la evaluacin de la pancreatitis aguda. La amilasa que se encuentra en la sangre es producida principalmente por las glndulas salivales y el pncreas. Las lesiones en las clulas glandulares ( como en la pancreatitis aguda) liberan grandes cantidades de amilasa . La enzima penetra rpidamente en la sangre y aumenta sus valores sricos. Los valores de amilasa en orina tambin aumentan rpidamente, a menudo dentro de varias horas posteriores al aumento en el suero. El incremento en la orina se presenta frecuentemente cuando los valores sricos comienzan a disminuir. MATERIAL EMPLEADO: y y y y y Tubos de ensayo Espectrofotmetro Muestra ( suero) Reactivos ( tcnica de Bioxon) Pipetas

METODO: 1.- Marcar Dos tubos de ensayo con las letras C ( control ) y M ( muestra ) respectivamente y enseguida pipetear: Substrato ( React. No. 1 ) ml. Amortiguador ( React. No. 2 ) CONTROL 0.5 ml. 0.5 ml. MUESTRA 0.5 0.5 ml.

2.- Incubar los tubos a 37 C aproximadamente durante 2 minutos y despus agregar:

46

Suero

CONTROL -

MUESTRA 0.02 ml. (

3.- Mezclar rpidamente e incubar a 37 C durante 7 minutos y 30 segundos cronometrados). Enseguida agregar: Reactivo de color Agua destilada CONTROL 1 ml. 8 ml. MUESTRA 1 ml. 8 ml.

4.- Agitar y determinar las absorbancias del control ( C ) y de la muestra ( M ) a 660 nm, ajustando el cero con agua destilada. El color es estable durante 2 horas.

CALCULOS: Ac = Absorbancia del control Am = Absorbancia de la muestra Ac Am __________ X 800 = U.A/ 100 ml. Ac Definicin de unidad: Una unidad Amiloltica o Caraway (UA) es la cantidad de enzima contenida en 100 ml. de muestra que puede hidrolizar 10 mg. de almidn en 30 minutos ,en las condiciones de la reaccin. Valores de referencia: Suero de 60 a 160 U.A./100 ml. ACTIVIDADES: 1. Las concentraciones de amilasa se encuentran aumentadas en: _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ ____________________________ 2. Las concentraciones de amilasa disminuyen en :

47 _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ ____________________________

BIBLIOGRAFA: Kathleen Morrison Treseler. Laboratorio Clnico y pruebas de diagnstico. Editorial Manual Moderno

48 PRACTICA NO 12 DETERMINACION DE ENZIMAS: FOSFATASA ALCALINA GENERALIDADES: La fosfatasa alcalina es una enzima, originada principalmente en el hueso, hgado y placenta, con alguna actividad en el rin e intestino. Se denomina alcalina porque funciona mejor a valores de pH de 9. Esta prueba enzimtica se utiliza como un marcador de tumores y como un ndice de enfermedad del hgado y hueso cuando se correlaciona con otros datos clnicos. En enfermedad sea, la enzima aumenta en proporcin a la produccin de nuevas clulas, como resultado de la actividad osteoblstica y del depsito de calcio en los huesos. En enfermedad heptica, la concentracin sangunea se incrementa cuando se impide la excrecin de esta enzima por alguna obstruccin de las vas biliares. TECNICA: 1.-Precalentar el reactivo de trabajo a 37C durante unos minutos 2.-Pipetear en una cubeta: Reactivo de trabajo Muestra 1.0 mL 20 uL

3.-Mezclar e insertarla en un portacubetas a 37C 4.-Anotar la absorbancia inicial y poner simultneamente el cronmetro en marcha. Efectuar nuevas lecturas cada minuto durante 3 minutos. 5.-Comprobar que las diferencias entre absorbancias sean sensiblemente iguales. Calcular el incremento de absorbancia por minuto promedio. CALCULOS : Considerando que el coeficiente de absorcin molar del 4-nitrofenol a 405 nm es 18.450, se deducen los siguientes factores para calcular la concentracin cataltica : Diferencia incremento por minuto X 2764 = U/L VALORES NORMALES: Adultos 26-117 U/L ACTIVIDADES A REALIZAR: 1. En que patologa se eleva en relacin con la elevacin de bilirrubinas y AST? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 2. En qu patologas hay aumentos notorios?

49 __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 3. En qu enfermedades seas hay aumentos importantes? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 4. En qu otras enfermedades se puede encontrar alteracin de sta enzima? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ Caso clnico: Colangitis Femenina de 58 aos de edad, la cual presenta desde hace 1 mes discreta ictericia, sin sintomatologa agregada, anoche inicia con dolor agudo e hipersensibilidad en hipocondrio derecho, fiebre y escalosfros, menciona tambin presencia de coluria. Los anlisis clnicos reportan: BH leucocitosis con predominio de polimorfonucleares, aumento de la fosfatasa alcalina y de las bilirrubinas. A qu se debe el aumento de la fosfatasa alcalina? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ A qu se debe el aumento de la. bilirrubinas? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

50 PRACTICA No. 13 DETERMINCACION DE ENZIMAS: FOSFATASA ACIDA GENERALIDADES: Las fosfatasas cidas son enzimas distribuidas ampliamente en los tejidos, incluyendo hueso, hgado, bazo, rin, eritrocitos y plaquetas. No obstante, su mayor importancia se encuentra en la prstata donde la actividad de la fosfatasa cida es 100 veces superior que en otros tejidos. Por esta razn, la prueba de las concentraciones de fosfatasa cida se usa para diagnosticar cncer metastsico de la prstata y seguir la eficacia del tratamiento. Se sabe que hay cifras elevadas de fosfatasa cida en pacientes con cncer de prstata que ha sufrido metstasis ms all de la cpsula a otras partes del organismo, principalmente hueso. Se considera que una vez que el carcinoma se ha extendido, la prstata empieza a liberar fosfatasa cida originando un aumento en la sangre. El procedimiento de la fraccin prosttica mide, especficamente , la concentracin de fosfatasa cida prosttica secretada por las clulas de la prstata, en contraste con la medicin de actividad enzimtica total, la cual es una medicin indirecta. La fosfatasa cida tambin se halla en concentraciones elevadas en el lquido seminal. Se pueden emplear pruebas para esta enzima en la investigacin de estupro. FUNDAMENTO: La fosfatasa cida cataliza en medio cido la hidrlisis del naftil fosfato. El -naftol producido reacciona con una sal de diazono formando un cromgeno. La actividad cataltica se determina a partir de la velocidad de formacin de dicho cromgeno medido a 405 nm. El tartrato se utiliza como inhibidor especfico de la denominada fraccin prosttica. La fosfatasa cida en suero es muy inestable. Si la determinacin no se efecta de inmediato, se debe acidificar la muestra aadiendo l gota del reactivo C por cada ml., de suero. En estas condiciones la fosfatasa es estable 6 das a 28C. PROCEDIMIENTO: 1.- Precalentar el reactivo de trabajo a 37C durante unos minutos. 2.- Pipetear en una cubeta: Reactivo de trabajo Muestra 1.0 ml 0.1 ml

3.- Mezclar e insertarla en el portacubetas termostatizado a 37C. Poner el cronmetro en marcha. 4.- A los 5 minutos, anotar la absorbancia inicial y efectuar nuevas lecturas cada minuto durante 3 minutos. 5.- Comprobar que las diferencias entre las absorbancias sean sensiblemente iguales. Calcular el incremento de absorbancia por minuto promedio.

51

CALCULOS: Utilizar los siguientes factores para calcular la concentracin cataltica: Absorb/min. x 844 = U/L Absorb/min. X 14061 = nkat/L FAC prosttica = FAC total FAC no prosttica VALORES NORMALES: FAC total: hasta 10 U/L = 167 nkat/L FAC prosttica: hasta 3.5 U/L = 58 nkat/L Nota: Estos titulos se dan nicamente a titulo orientativo, es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios intervalos de normalidad. RESULTADOS:___________________________________ ACTIVIDADES A REALIZAR: 1. Qu indica una cifra significativamente alta de esta enzima? _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 2. En la patologa mencionada, despus de que tratamientos, disminuyen las concentraciones de la fosfatasa cida? _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 3. En qu otras enfermedades se presenta moderadamente elevada sta enzima? _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ BIBLIOGRAFA: Montgomery R. Bioqumica: Casos y texto. Quinta edicin. Editorial Mosby Year Book Wolfe publishing. Kathleen Morrison Treseler. Laboratorio clnico y pruebas de diagnstico. Editorial Manual Moderno

52 PRACTICA NO 14 EXAMEN GENERAL DE ORINA INTRODUCCION: El examen general de orina es un examen fsico, qimico y microscpico de la misma, es una herramienta de diagnostico muy importante que permite detectar muchos trastornos o padecimientos en el paciente. Cabe mencionar que no se deben de tomar decisiones diagnosticas o teraputicas basndose en un solo resultado, sino tener en cuenta todos los hallazgos mdicos. Adems factores como el uso de algunos frmacos, ingesta de algunos alimentos, etc, pueden afectar los resultados de algunas pruebas. MATERIAL Y EQUIPO: Probeta Refractmetro Tubo de ensaye de 13x100 mm Tiras reactivas Portaobjetos Cubreobjetos de 22x22 Microscopio TECNICA Volumen: En una probeta medir el volumen de la muestra reportndolo en mililitros. Densidad: Procedimiento con tira reactiva (Tiempo de lectura 45 segundos). Sumergir la tira reactiva en una muestra de orina y comparar con la escala cromtica la variacin en el cambio de color. Esta prueba se basa en el cambio aparente de pKa de ciertos polielectrolitos pretratados en relacin con la concentracin inica. En presencia de un indicador los colores varan desde un verde-azul oscuro en orinas de baja concentracin, hasta un verde amarillo en muestras de alta concentracin inica. Este mtodo permite la determinacin de la gravedad especifica (densidad) de la orina entre 1.000 a 1.030. En general existe una correlacin que no rebasa las 0.005 unidades de los valores obtenidos con el mtodo del ndice de refraccin. En orinas con un pH 6.5, se puede mejorar la exactitud aadiendo 0.005 al valor obtenido. Si la lectura es instrumental el ajuste es automtico. Procedimiento tcnico con el refractmetro: Limpiar y secar la superficie de la tapa y el prisma del refractmetro, depositar una gota de orina y cerrar la tapa, dirigir el instrumento hacia la fuente de luz y leer la escala de densidad en el lmite luz - oscuridad. La escala permite lecturas de hasta 1.035, de modo que las muestras con valores superiores deben ser diluidas.

53 COLOR, OLOR Y ASPECTO: Se hace una inspeccin ocular de la muestra de orina anotando las observaciones correspondientes. Examen microscpico de la Orina o En un tubo de ensaye de 13 x 100 mm medir una muestra de orina previamente mezclada y centrifugar a 3000 r.p.m. durante 10 minutos. o Decantar el sobrenadante en otro tubo. o Poner aproximadamente una gota de sedimento resuspendido sobre un portaobjetos y colocar un cubre-objetos, evitando la formacin de burbujas. La cantidad de sedimento no debe ser excesiva que flote en cubreobjetos. o La observacin debe hacerse lo ms pronto posible para evitar que se seque y se altere su contenido. o Hacer la observacin microscpica a bajo y alto aumento, cuidando de variar continuamente el foco y de seguir en forma sistemtica los cuatro lados del cubre. Los elementos ms comunes a investigar son: o Leucocitos por la tira reactiva. (tiempo de lectura 2 minutos) Los leucocitos granulocticos contienen esterasas que catalizan la hidrlisis del derivado ster cido aminopirrol, liberando 3-hidroxi-5-fenil pirrol; este ltimo compuesto de pirrol, reacciona con una sal de diazonio. El color de reaccin negativa es crema y violeta para las positivas. Leucocitos por observacin microscpica: Por las interferencias que pueden darse con la tira reactiva, se recomienda hacer la identificacin microscpica de leucocitos en seco fuerte contando el nmero de ellos en 10 campos representativos. Bacterias, levaduras, cristales y cilindros; se cuentan en forma apreciativa y se reportan desde escasos hasta abundantes. Clulas epiteliales escamosas; slo se informan si son numerosas. Eritrocitos; de estar presentes, se informan desde escasos hasta abundantes. ACTIVADADES POR REALIZAR??