UNIVERSIDAD PRIVADA DEL VALLE FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD DPTO: MEDICINA GUIA PRACTICA DE LABORATORIO CARRERA: MEDICINA BIOQUIMICA ICOMPETENCIAS ESPECFICAS A SER EVALUADAS EN LA CLASE PRCTICA DE BIOQUMICA IEVALUACIN DE PRCTICAESTUDIANTESSABER SABER HACER SERNota parcialExamen parcialNOTA FINALRevisin yaplicacin de conocimiento previo (examen) previo) Calidad de trabajo (mapas, casos clnicos, resolucin de cuestionario) Desarrollo de la prctica. (Uso correcto de Material) Puntualidad Disciplina (Uso de vestimenta adecuada) PUNTAJE 0 - 9 0-3 1 1 1 15 15 30\\bck1-tq-ntv\Usuarios ADMINISTRATIVOS$\cbayam\Mis documentos\logo.jpg UNIVERSIDAD DEL VALLE SERVICIOS DE LABORATORIO LABORATORIO DE BIOQUMICA I PRACTICA No 1INTRODUCCIN AL LABORATORIO DE BIOQUMICA -BIOSEGURIDADI.-CONOCIMIENTO TERICO REQUERIDOEl laboratorio de Bioqumica es el complemento a la materia terica de Bioqumica I, e stableciendo una correlacin con los temas impartidos en la teora. El laboratorio de anlisis bioqumico es un ambiente dinmico actual que permite enfre ntar el reto de manejar pruebas ms sensibles, especficas y efectivas en el monitoreo de la salud y la enfe rmedad basados en conocimientos previos de la parte terica de Bioqumica sobre los constituyentes qumi cos de los seres vivos, sus funciones y transformaciones que pueden alterarse y desencadenar en procesos patolgicos. Las pprcticas estn diseadas para que los estudiantes desarrollen un conjunto de hab ilidades que les permitan la aplicacin flexible de las tcnicas manuales mediante la utilizacin de eq uipos y materiales especficos de laboratorio, cumpliendo estrictamente con las normas de biosegurida d y de manejo de residuos biolgicos establecidas en el laboratorio. En adicin, el estudiante debe familiarizarse con las distintas unidades de medicin y factores de conversin utilizados en Bioqumica que le permitan calcular resultados, interpretar valores y resolver casos clnicos. Por otro lado, durante el curso se debe fomentar que el estudiante por s mismo, c onsulte y complemente las clases prcticas, mediante la revisin de la bibliografa de referencia que le impulse a la actualizacin continua de sus conocimientos.Material volumtrico Son aquellos que se utilizan para medir volmenes, son de vidrio o de plstico trans parente que permiten lavisualizacin del lquido que se desea medir, poseen unas marcas grabadas ya sea en forma graduada o de aforos. NOMBRE DESCRIPCIN Y USOS MATRAZ VOLUMTRICO O AFORADOEs un recipiente con forma de pera, fondo plano y un cuello largo y delgado, puede ser de vidrio borosilicatado o polipropileno, dependiendo de su aplicacin Tiene una marca grabada alrededor del cuello que indica un volumen determinado que contiene a una temperatura especfica. La marca de graduacin rodea todo el cuello de vidrio, por lo cual es fcil determinar con precisin cundo el lquido llega hasta la marca. Los matraces se presentan en volmenes que van de 10 ml hasta 2 l. Uso: Se emplea para la preparacin de disoluciones de concentracin conocida y exacta. MATRAZ ERLENMEYER Es un frasco cnico de vidrio de base ancha y cuello estrecho, que puede ser de diversas capacidades. Usos: Se emplea para el calentamiento de sustancias, agitacin de sustancias y preparacin de reactivos de trabajo.PIPETA MANUAL El volumen de la pipeta se determina por diversas graduaciones de enrace y existe desde 0,1 ml a 10 ml. Puede ser de vidrio (reutilizables), o de plstico (de un slo uso). La pipeta se llena por un sistema mecnico denominado pro pipeta que es un instrumento que evita el contacto con la sustancia a medir. Usos: Se emplea para medir y transferir pequeos volmenes de disoluciones con exactitud.NOMBRE DESCRIPCIN Y USOS TUBO DE ENSAYO Consiste en un pequeo tubo de vidrio con una punta abierta (que puede poseer una tapa) y la otra cerrada y redondeada que se construye de cristales resistentes (vidrio borosilicatado) que permite el calentamiento. Usos: Sirve para contener pequeas muestras lquidas, realizar reacciones en pequea escala, conservacin de muestras discretas de reactivos. MICROPIPETA Es un instrumento de laboratorio automtico; los volmenes que puede captar volmenes que pueden variar segn el modelo: los ms habituales, denominados p20, p50 y p100, admiten un mximo de 20, 50 y 100 l respectivamente; utilizan puntas desechables, de plstico y estriles. Existen dos tipos de puntas: las amarillas, para pipetear volmenes pequeos (10 l), y las azules, para pipetear volmenes grandes (80 l). Usos: Sirve para medir pequeos volmenes de lquidos en forma exacta La pipetas automtica es un instrumentos de gran precisin, cuyo perfecto funcionamiento, exactitud y mantenimiento dependen de que se utilice con gran cuidado teniendo en cuenta varios factores: . Ajuste cuidadoso al volumen a toma . Colocar el mbolo al final de su recorrido antes de introducir la punta de la pipeta en la solucin a tomar, evitando as la formacin de burbujas en la solucin. . Tener en cuenta los dos topes del recorrido del mbolo. El primer tope (ofrece ligera resistencia al dedo) indica el volumen exacto a tomar. El segundo tope se emplea para expulsar la totalidad del lquido. Si se carga la pipeta apretando hasta el ltimo tope, se toma ms volumen del medido, producindose un error por exceso. . Devolver con suavidad el mbolo a su origen al cargar la solucin. . No invertir ni inclinar excesivamente la pipeta cuando est cargada con un lquido. . No golpear ni dejar caer la pipeta. . No tocar la punta de la pipeta con los dedos al colocarla, ya que puede contaminar la solucin a medir .Expulsar las puntas utilizadas en los contenedores dispuestos a tal efecto en todas las mesas.PROBETAEst formada por un tubo de vidrio o de plstico transparente de unos centmetros de dimetro, tiene graduacin que indica distintos volmenes. En la parte inferior est cerrada y posee una base que sirve de apoyo, mientras que la superior est abierta y suele tener un pico que permite verter el lquido medido. Puede estar constituido de vidrio o de plstico. Usos: Sirve para medir volmenes de lquidos en forma menos exactaTUBOS DE EPPENDORF Son pequeos viales cnicos, provistos de tapa Usos: Se utilizan para centrifugar a gran velocidad pequeos volmenes o para almacenar cantidades pequeas de soluciones.CUBETAS DE ESPECTROFOTMETRO Son pequeos contenedores con dos caras transparentes que pueden ser de plstico o de vidrio, segn la longitud de onda a la que se quiera medir. Pueden ser tambin de varios volmenes, siendo las ms frecuentes de 1 ml y de 3 ml. Usos: Se utilizan para colocar las soluciones cuya absorcin de luz o color se desea determinar mediante un espectrofotmetroEquiposESPECTROFTMETRO Es un equipo que mide una regin del espectro de la luz absorbido o emitido por una muestra cuya concentracin se desea averiguar porque todas las sustancias pueden absorber energa radiante, ya sea ultravioleta, visible e infrarroja y depende de la estructura de las molculas, siendo caracterstica para cada sustancia qumica. El color de las sustancias se debe a que stas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbida. Los componentes bsicos del instrumento son: una fuente de luz (foco), un selector de la longitud de onda (monocromador), filtros, cubetas (tubos especiales para muestras) y un detector digital. Los principales pasos para el manejo del espectrofotmetro son: . Verificar el voltaje de la corriente de este equipo . Encender y dejar estabilizar el equipo durante 10 minutos como mnimo . Elegir la longitud de onda requerida . Colocar el blanco (agua destilada por lo general) para verificar la absorbancia . Colocar la muestra a ser medida en las cubetas . Elegir el tipo de medicin absorbancia o transmitancia . Leer los valores mostrados en la pantalla y registrar . Desenchufar y cubrirMICROSCOPIO Es un instrumento que est formado bsicamente por una parte mecnica y una parte ptica que es capaz de conseguir aumentos considerablemente mayores de un objeto muy pequeo. Los principales pasos para el manejo del microscopio son: . Retirar el microscopio, tomndolo con una mano por el brazo y con la otra mano por la base, transportar en posicin vertical. Apoyarlo sobre la mesa donde se va a trabajar. . Limpiar suavemente la parte mecnica del microscopio con un pao . Verificar el voltaje antes de conectar a la corriente . Conectar a la corriente y encender . Sentarse en forma adecuada frente al microscopio . Abrir el diafragma del condensador . Subir el condensador ( no tocar el portaobjetos) . Colocar el objetivo de menos aumento o el ms pequeo . Regular la intensidad de luz . Bajar la platina y colocar el preparado en la platina . Centralizar el preparado, hacer coincidir, el tejido con el rayo de luz observando por un costado . Enfocar observando con los ojos cerca de los oculares, usando los mandos de enfoque macro y micromtrico hasta lograr encontrar la imagen . Para cambiar de aumento se hace rotar el revolver . Para sacar la preparacin, girar el revolver y colocar al objetivo de menor aumento y retirar la lmina . Apagar, desconectar de la corriente y guardar. CENTRFUGA DE BAJA VELOCIDAD, DE SOBREMESA O CLNICAS Es una mquina que pone en rotacin una muestra para poder separar sus fases (generalmente una fase slida de una lquida) a travs de la fuerza centrfuga que se genera, permite la separacin de clulas y lquidos de diferente densidadBAO MARIA Es un equipo que mantiene la temperatura constante gracias a un bao de agua que se puede calentar o enfriar segn se requiera. Este equipo consta de un recipiente donde se coloca agua destilada en suficiente cantidad, botn de encendido/apagado un selector de temperatura, un termostato que controla la temperatura del agua y una pantalla digital que indica la temperatura. Para su manejo se procede de la siguiente manera: . Verificar el voltaje de la corriente elctrica . Encender y dejar estabilizar durante 10 minutos como mnimo . Verificar el nivel de agua destilada . Colocar los tubos debidamente formados en una gradilla metlica . Controlar el tiempo de reaccin . Sacar la gradilla con los tubos una vez concluida la reaccin . Apagar y desenchufarII.- OBJETIVOS.-Al finalizar la prctica el alumno ser capaz de:- Reconocer los equipos y materiales utilizados en el laboratorio de bioqumica - Manejar correctamente los equipos y materiales de vidrio utilizados en el labo ratorio de bioqumica considerando las normas de bioseguridad establecidos por el manual de biosegurid ad de laboratorios - Desarrollar una actitud y pensamientos crticos en el trabajo.III.- MATERIAL Y REACTIVOS.-REACTIVOS- EQUIPOS CANTIDAD MATERIALES CANTIDAD Centrfuga 1 Pipetas graduadas y volumtricas 20 Microscopio 6 Vaso de precipitacin 6 Bao Mara 1 Tubos de ensayo 12 Espectrofotmetro 1 Gradilla 6Matraz Erlenmeyer 6Matraz aforado 6Micro pipetas de volumen variable 6PuntillasPro pipetas 10IV.-PROCEDIMIENTO.1. Planificacin de la prctica: La prctica se llevar a cabo en forma individual 2. Desarrollo de la prctica: . Cada alumno reconocer los distintos equipos y materiales de laboratorio . Cada alumno realizar medidas de diferentes volmenes de acuerdo al siguiente proced imiento: o Llenar de agua un vaso de precipitacin o Poner la pro pipeta sobre una pipeta de 5ml. o Pipetear 5 ml de agua con una pipeta de 5 ml, divisiones 1/10 y verter diferen tes volmenes a un tubo de ensayo. o Realizar el mismo procedimiento con pipetas de diferentes volmenesV.- CUESTIONARIO.1. Nombre los tipos de tcnicas Bioqumicas que se emplean en el diagnstico de patolo gas 2. En que unidades se expresa la concentracin de las enzimas en el organismo 3. Convierta 120 mg/dl de glucosa a mol/l, Meq/l y g% 4. Describa la clasificacin de las pipetas 5. Elabore un mapa conceptual de las normas de bioseguridad establecidas para el laboratorio de Bioqumica6. Realice la clasificacin de los siguientes residuos slidosA.- Clase A- rojo ( ) residuos de rganos B.- Clase B- azul ( ) sangre C.- Clase C- negro ( ) radiactivos( ) frascos sin sangre ni fluidos( ) plstico( ) residuos farmacuticos( ) animales contaminados( ) cartones o envolturas( ) hemoderivados( ) residuos qumicos( ) guantes con sangre\\bck1-tq-ntv\Usuarios ADMINISTRATIVOS$\cbayam\Mis documentos\logo.jpg UNIVERSIDAD DEL VALLE SERVICIOS DE LABORATORIO LABORATORIO DE BIOQUMICA I PRACTICA No 2FLEBOTOMA- RECOGIDA DE MUESTRA SANGUNEAI.-CONOCIMIENTO PREVIO REQUERIDOLa sangre es el tejido ms fcilmente biodializable que puede alterarse ante circuns tancias patolgicas y fisiolgicas que modifican tanto los elementos celulares que la integran como las sustancias presentes en el plasma. En el adulto el volumen total de sangre comprende el 8 % de la masa corporal (ra ngo, 7 y 9 %, aprox. 70 a 80 ml/kg de peso), es decir 4 a 5 litros en la mujer no embarazada y 5 a 6 litro s en el varn. El pH de la sangre es de 7.40 y su densidad es de 1.055 g/cm3 La sangre tiene las siguientes funciones: . Transporte de gases: Oxgeno desde los pulmones hacia los tejidos y dixido de carbo no desde los tejidos hacia los pulmones . Transporte de nutrientes desde el tracto digestivo hacia el hgado y otros tejidos , e intercambio de nutrientes entre diversos tejidos. . Transporte de seales hormonales desde las glndulas endocrinas hacia sus rganos blan co . Transporte de sustancias de desecho hacia los rganos de eliminacin (rin, hgado) . Transporte de calor y regulacin de la temperatura . Metabolismo de hormonas y diversas sustancias biolgicas . Regulacin del equilibrio cido bsico . Regulacin del equilibrio hidrosalino . Defensa contra microorganismos El anlisis de sangre es una herramienta de gran utilidad para el diagnstico clnicoporque la sangre est compuesta por diferentes clases de clulas y una parte lquida, llamada plasma; el p lasma contiene varias substancias que estn disueltas en el lquido. La sangre fuera del organismo se coag ula porque sus clulas y protenas se hacen slidas, quedando una parte lquida que se denomina suero que carec e de clulas y de factores de la coagulacin incluyendo la protena fibringeno, pues sta ha sido transfo rmada en fibrina insoluble en el proceso de la coagulacin. La porcin celular de la sangre consta principalmente de glbulos rojos, glbulos blan cos y plaquetas. El suero puede ser analizado en pruebas bioqumicas y serolgicas en cambio la sangr e total obtenida con un anticoagulante sirve para realizar el hemograma y mediante el anlisis de la coagu lacin se mide la capacidad de la sangre para llevar a cabo la coagulacin.Composicin de la sangrePlasma El plasma sanguneo es la porcin lquida de la sangre de color amarillento en la que estn inmersos los elementos formes. Es una solucin acuosa de un 91% y el 8% contiene protenas, aminocidos, glcidos, lpido s, sales, hormonas, enzimas, anticuerpos, urea, gases en disolucin y sustancias inorgnicas ( Na+, K+, CaCl2, C03, H2C03). El plasma se obtiene cuando, inmediatamente despus de extraer la sangre, se le ag rega anticoagulantes como EDTA (Etilendiamino tetra actico) o heparina y se centrifuga.Elementos celulares de la sangre ERITROCITOS Son los ms abundantes en la sangre, tienen una forma de discos redondeados, bicncavos con un dimetro aproximado de 7,5 ul, no presentan ncleo y tienen una vida media de 120 das Contienen la hemoglobina que transporta O2, CO2 e H+ Carecen de ncleoSon destruidos y extrados de la sangre por el bazo, el hgado y la mdula, donde la hemoglobina se desintegra, pero el Fe es reutilizado para formar nueva hemoglobi na LEUCOCITOS Forman parte del sistema inmunolgico, son encargados de destruir los agentes infecciosos. Segn su citoplasma y su ncleo se dividen en: Los granulocitos que tienen un ncleo redondeado, numerosos grnulos en su citoplasma y se forman en las clulas madres de la mdula sea, los granulocitos pueden ser: Neutrfilos, que fagocitan y destruyen bacterias, los eosinfilos, que s e activan en presencia de ciertas infecciones y alergias, los basfilos, que segrega n sustancias como la heparina, que es anticoagulante e histamina que se produce en la inflamacin. Los agranulocitos que no tiene grnulos en el citoplasma y se forman en la mdula sea y en el timo y pueden ser: Linfocitos o monocitos PLAQUETAS Son cuerpos pequeos, ovoideos, sin ncleo, con un dimetro menor que el de los eritrocitos. Los trombocitos o plaquetas que participan en la hemostasia (prevencin y detencin de las hemorragias) porque se adhieren a la superficie interna de la pared de los v asos sanguneos en el lugar de la lesin y ocluyen el defecto de la pared vascularII.- OBJETIVOS.-A la conclusin de la prctica el alumno ser capaz de: - Preparar el material necesario para la obtencin de muestra sangunea por puncin ve nosa y capilar. - Aplicar adecuadamente el procedimiento para la puncin venosa o puncin capilar - Evaluar los cuidados y recomendaciones para realizar una puncin venosa y capila rIII.- MATERIAL Y REACTIVOS.-REACTIVOS- EQUIPOSCANTIDAD MATERIALES CANTIDAD CentrfugaCinta adhesiva 1 MicroscopioGradilla 6Guantes de ltex. 2Agujas y jeringas desechables estriles de volumen entre 5 a 10 ml (Con agujas N 21 G para adultos) 15Lazo de goma o torniquete. 6Recipientes descartadores 6Torunda con alcohol.Torundas secasMicro pipetas 6Tubos de hemlisis 30PuntillasJabn antispticoCola de Zorro 1Papel absorbentePlastilina 1Lancetas 20IV.-PROCEDIMIENTO.-1. Planificacin de la prctica: Los estudiantes de la prctica se organizarn en grupos de 5 personas. 2. Desarrollo de la prctica:. Un estudiante de cada grupo realizar un libro de registro en el que se anotan los datos del paciente (Nmero, nombre completo, edad, sexo, procedencia, tipo de prueba a realizarse) . Cada estudiante realizar la toma de muestra sangunea por puncin capilar o venosa de acuerdo al siguiente procedimiento.3. Toma de muestra de sangre La sangre perifrica constituye el material biolgico de eleccin sobre el cual se rea liza la mayor parte de las investigaciones de laboratorio relacionadas con la qumica clnica. La toma de m uestra de sangre puede ser venosa, capilar y arterial. . La sangre arterial se utiliza para estudiar los parmetros del equilibrio cido-base . . La sangre venosa o capilar se utiliza indiferentemente para determinar todos los analitos. . Los instrumentos que se utilicen para la toma de muestra tienen que ser absoluta mente estriles, qumicamente inertes (para evitar hemlisis), muy eficientes para la penetracin a tra vs de la piel y poco traumticos. . Desinfeccin La zona de la toma de la muestra tiene que estar limpia, desinfectada con sustan cias eficaces.3.1. OBTENCIN DE SANGRE POR PUNCIN CAPILARSITIO DE PUNCIN: Dedo anular en su superficie palmar en el ltimo segmento (Yema del dedo), lbulo de la oreja, superficie plantar media o lateral del taln. . Realizar la antisepsia del lugar elegido . Dejar secar el rea . Puncionar con rapidez y firmeza de tal manera que ingrese toda la punta de . la lanceta.. Descartar la primera gota. . Tomar la sangre que fluye libremente, llenando partes el capilar sellar con plas tilina el otro extremo del capilar . Realizar hemostasia por compresin3.2. OBTENCIN DE SANGRE POR PUNCIN VENOSASITIO DE PUNCIN: Vena ceflica o mediana cubital, femoral, venas del dorso de la ma no o del dorso del pie. El personal deber usar guantes de ltex para realizar operaciones de recoleccin de s angre y para toda manipulacin de sangre, suero, plasma y otros especmenes. . La toma de muestra se efecta preferiblemente de una vena anterior del brazo: en l a mayora, se escoge la vena ceflica o la vena cubital mediana. . Solicitar al paciente que empue la mano para facilitar la aparicin de la vena. . Ligar unos 7 cm arriba de la fosa ante cubital (pliegue del codo) . Pedir al paciente que cierre el puo firmemente varias veces; esto favorece que la s venas que normalmente tienen forma elptica, se vuelvan ms turgentes y redondeadas . Localizar la vena palpando y visualizando cual es la ms apta . Limpiar el sitio de la puncin con torunda de algodn impregnada con alcohol 70% u otro antisptico cutneo, con movimiento circular desde adentro hacia fuera . Con el dedo ndice o el pulgar de la otra mano fijar la vena en un lugar prxima a l a puncin para evitar que esta se mueva . Introducir la aguja con el bisel hacia arriba de 1 a 2 cm hasta ver que fluya la sangre, formando un ngulo de 15 con la piel. . Despus de haber llevado a cabo la venopuncin, aflojar el torniquete y extraer la a guja . Sostener con firmeza una torunda de algodn seco sobre el sitio de extraccin durante algunos minutos . Poner sobre este sitio una tira de cinta adhesiva . Separar la aguja de la jeringa de acuerdo a normas de bioseguridad. La sangre que se encuentra en la jeringa (muestra), colocar en los respectivos t ubos de previamente identificados, los cuales pueden o no tener anticoagulante segn el estudio a real izar (Verter la sangre por las paredes del tubo con suavidad evitando que los glbulos rojos sufran hemlis is) . Los tubos pueden tener o no anticoagulante de acuerdo al tipo de prueba realizar3.3. HEMLISISUna de las causas ms importante para que una muestra de sangre se considere no idn ea est representada por la hemlisis. La hemlisis es la ruptura del glbulo rojo y el pasaje al plasma o suero de hemoglo bina (coloracin de la muestra) y de todas las sustancias contenidas (potasio y enzimas). Las causas ms frecuentes de hemlisis son: . Aguja de calibre pequeo. . Presencia de alcohol sobre la piel. . Excesiva aspiracin (toma de muestra con jeringa). . Excesiva presin en el pasaje de la sangre con la jeringa al tubo de ensayo. . Mezcla muy violenta de la toma de muestra. . Toma de muestra muy dificultosa y prolongada.3.4. SEPARACIN DE SUERO O PLASMA . Recoger una muestra de sangre venosa en un tubo de separacin de suero o un tubo c on tapn rojo de 5 ml . Permitir que la sangre se coagule en el recipiente original tapado hasta que ten ga lugar la coagulacin . Centrifugar la sangre coagulada durante 10 a 20 minutos a 2.500-3.600 rpm . Transferir el suero mediante el empleo de micro pipetas a los tubos de eppendorfpreviamente identificados con los datos del paciente . Las muestras de suero pueden conservarse a 2-8C durante un mximo de una semana. Pa ra conservarlas durante perodos ms prolongados, congele las muestras a -20CProceso de separacin de suero o plasmaV.- CUESTIONARIO.-1. Describa las normas de bioseguridad para el manejo de agujas desechables 2. Describa los cuidados en la toma de muestra sangunea 3. Describa los anticoagulantes ms utilizados en el laboratorio de Bioqumica y su utilidad\\bck1-tq-ntv\Usuarios ADMINISTRATIVOS$\cbayam\Mis documentos\logo.jpg UNIVERSIDAD PRIVADA DEL VALLE SERVICIOS DE LABORATORIO LABORATORIO DE BIOQUIMICA I PRACTICA# 3PROTEINAS PLASMTICAS-SEMINARIO I. CONOCIMIENTO TERICO REQUERIDOLos mtodos utilizados para separar las protenas plasmticas son: La electroforesis, isoelectroenfoque, inmunonefelometria, inmunoensayo turbidimtrico, inmunoensayo enzimtico, inmunodifu sin radial, inmunoelectroforesis, inmunofijacin, radioinmunoensayo La tcnica ms utilizada es la electroforesis de las protenas sricas en la que las par tculas cargadas se separan por su velocidad de migracin diferente. Se utiliza para separar compuesto s con carga neta, como son las protenas. La movilidad electrofortica de una molcula depende directamente d e su carga e inversamente del coeficiente de friccin, que a su vez depende directamente del ta mao de la molcula, de su forma y de la viscosidad del medio. La migracin de las partculas es dependiente de l pH del medio en que se encuentran, ya que su carga neta depende del pH: las protenas son anfolticas en su punto isoelctrico no tienen carga, pero a pH alcalino se cargan negativamente y van hacia el nodo, y a pH cido se carga positivamente e iran hacia el ctodo. La electroforesis consiste en colocar las protenas en un soporte (Geles polimricos , almidn o papel) inmersas en una solucin amortiguadora a un pH determinado dentro de un campo elctr ico, las protenas se desplazan hacia un polo cargado; de acuerdo a la relacin entre el pH del amortigu ador y el pI (Punto isoelctrico) de la molcula; la protena se mover hacia el ctodo, hacia el nodo o perman ecer estacionaria La aplicacin principal de las membranas de acetato de celulosa es para separar la s protenas del suero que las separa en 5 fracciones: En un proteinograma normal: en orden decreciente de movilidad:ALBMINA= 53-62% (1 que migra al nodo) ALFA1 GLOBULINAS = 3 -3,6% ALFA2 GLOBULINA= 10 -10,2% BETA GLOBULINAS= 8-13% GAMMA GLOBULINAS=14-19%Principales protenas plasmticas y su significado clnico .MODIFICACIONES PATOLGICAS PROTENA FUNCIN AUMENTA DISMINUYE Pre albmina . Tiene un peso molecular de 54 kDa y es sintetizada en el hgado . Transporte de la vitamina A . Enfermedad de Hodgkin . Es una protena de fase aguda negativa, que disminuye en la inflamacin y en el cncer . En cirrosis heptica Albmina . Reserva de protenas en la de privacin nutricional . Transporte de cidos grasos de cadena larga y esteroles . Unin y solubilizacin de drogas: (salicilatos, barbitricos, sulfonamidas, penicilina, warfarina) . Regulacin de la presin coloidal (la disminucin de la albmina produce salida de lquido al espacio intersticial y edema).. Fiebre, parasitosis . Disminucin de la sntesis: o malnutricin, ayuno o mala absorcin alimentaria o enfermedad heptica crnica avanzada . Distribucin anormal o dilucin: o Sobre hidratacin o aumento de permeabilidad capilar (septicemia, quemados) . Excrecin anormal o degradacin o sndrome nefrtico o quemados o hemorragia o enteropata con prdidas proteicasALFA GLOBULINAS TIPO I TBG Protena de unin a la tiroxina . Transporte de hormonas tiroideas en sangre . Sndrome nefrtico . En el embarazo a1 Antitripsina . Tiene un peso molecular de 45 kDa y es producida por los leucocitos de pulmn y pncreas . Es inhibidor de la tripsina y de la plasmina. Enfermedad pulmonar aguda (enfisema pulmonar). Reacciones inflamatorias porque es una protena de fase agudaMODIFICACIONES PATOLGICASPROTENA FUNCIN AUMENTA DISMINUYE a1 Glicoprotena cida (Orosomucoide) . Modula la respuesta celular porque est relacionada con matriz extracelular. ------------------. Procesos inflamatorios agudosProtrombina . Tiene un peso molecular 72 kDa, es producida en el hgado . Enfermedades hepticas . Coagulacin intravascular diseminada a1- Lipoprotena HDL . Transporte de lpidos como vitaminas liposolubles y colesterol . Producida en el hgado e intestino. Enfermedades hepticas . Enfermedad de Tangier . HiperlipemiaALFA GLOBULINAS TIPO II a2- Lipoprotena VLDL Transporte de lpidos . Enfermedad heptica grave . Hiperlipidemias a2- Macroglobulina . Es producida en el hgado y tiene un peso molecular de 820 kDa. . Inhibe a las proteasas (tripsina, plasmina) . Artritis mieloma . . . . . Sndrome nefrtico Enfisema Diabetes mellitus Sndrome de Down EmbarazoCeruloplasmina . Transporte de un 90% de Cu++ . Enfermedad de Wilson-------------------Haptoglobina . Se une a la hemoglobina formando un complejo que sirve de reserva de hierro. Este complejo irreversible es captado por las clulas del sistema retculo endotelial, y lo degradan en hierro y aminocidos; as el hierro puede ser reutilizado.. Enfermedad heptica crnica . Eritroblastosis fetal, Anemias hemolticas, . Anemia megaloblastica . Inflamacin aguda y crnica, Neoplasias . Infarto de miocardio . Enfermedad de Hodgkin.MODIFICACIONES PATOLGICASPROTENA FUNCIN AUMENTA DISMINUYE Eritropoyetina . Es la hormona de la eritropoyesis y es producida en el rin . Enfermedades renales y autoinmunes . Anemia BETA GLOBULINAS Transferrina . Transporte de hierro en plasma en forma de in frrico (Fe3+) . Enfermedades hepticas . Nefrosis . Neoplasias malignas . Anemias con deficiencia de hierro.Beta lipoprotena (LDL) . Transporte de colesterol y fosfolpidos.. Desnutricin, ayuno.. Nefrosis . Hiperlipidemias C3-C4 . Componentes del sistema de complemento producidos por el hgado. Enfermedades autoinmunes (lupus eritematoso sistmico, anemia hemoltica autoinmune) ------------------C1 inhibidor de estearasa . Inhibe la actividad de C1.. Edema angioneurtico hereditario ------------------Hemopexina . Transporte especfico del grupo hemo.. Disminuye en las mismas situaciones que la haptoglobina.. Aumenta en las mismas situaciones que la haptoglobina.GAMMAGLOBULINAS La regin gamma contiene las inmunoglobulinas. Se conocen 5 clases: IgG ( 150 kDa) IgA ( 180 kDa ) IgM ( 900 kDa) IgD ( 170 kDa) IgE ( 190 kDa) . Edad avanzada, drogas, leucemia linftica crnica, agammaglobulinemia.. Hipergammaglobulinemia . Enfermedad heptica . Infecciones crnicas . Lupus sistmico . Enfermedad de Waldenstrm, linfoma.Caractersticas electroforticas del suero en las patologas ms comunes Inflamacin aguda El dao tisular se produce en la inflamacin aguda y es caracterizada por la respues ta bioqumica (activacin del complemento) y respuesta celular (movilizacin de fagocitos, increme ntada sntesis de protenas), se presenta fiebre resultado de la liberacin de sustancias toxicas y es timulacin del sistema nervioso central, niveles altos de alfa l y alfa 2 globulinas, de protenas de fas e aguda como la alfa l antitripsina, orosmucoide, haptoglobina, protena c reactiva alfa2 macroglobulina y ceroluplasmina. Inflamacin crnica Est asociada al incremento de protenas de fase crnica; se tiene una ligera elevacin de alfa2, la albmina puede estar ligeramente suprimida con un incremento policlonal de gammaglobulina s esto se observa en desordenes como en las infecciones crnicas (brucelosis, tuberculosis, enfermedad de hodgkin) y en colgenopatas, alergias, cncer y desordenes auto inmunes. Enfermedad heptica Como el hgado es el sitio de sntesis de albmina y globulinas una afeccin de este, lo s niveles bajos de albmina se dan en enfermedades hepatolobulares avanzadas. La hepatitis viral agud a incrementa niveles de Ig G e IgM, la enfermedad crnica del hgado (incluyendo cirrosis) incrementa IgG , IgM e IgA con decrecimiento de albmina y transferrina, la destruccin biliar incrementa niveles d e C4 y beta lipoprotena. Sndrome nefrtico El sndrome nefrtico puede ser causado por diabetes mellitus, enfermedad glomerular y circulatoria se caracteriza por: hipoproteinemia, hipolbuminemia, edema, hiperlipidemia, protein uria; incremento de ciertas protenas de alto peso molecular (macroglobulina, IgM, lipoprotenas) Hipogammaglobulinemia y agammaglobulinemia Las hipogammaglobulinemias se caracterizan por cantidades decrecientes de alguna s o de todas las inmunoglobulinas, la mayora de las deficiencias son hereditarias y se manifiestan en la infancia (enfermedad de Brutons), las deficiencias adquiridas en adultos pueden deberse a enfermedades secundarias (terapia inmunosupresora) Gammapatia monoclonal La gammapatia monoclonal representa desordenes de sntesis de inmunoglobulinas asociada con proliferacin de clones de linfocitos B, la electroforesis muestra un pico homogneo en el rea B, . asociada con decremento de inmunoglobulinas normales Gammapatia policlonal La gammapatia policlonal se caracteriza por incrementos difusos en la regin gamma , de las tres mayores inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgM) Despus de la hipoalbuminemia la gammapatia policlonal es la anormalidad ms comn se observan en: desordenes hepticos crnicos, infecciones crnicas, colagenopatias, metstasis, fbro sis quistica II. - OBJETIVO. - Describir las principales globulinas y sus funciones - Relacionar valores anormales del proteinograma con las patologas ms comunes V. - CUESTIONARIO.1. Resuelva casos clnicos planteados por el docente 2. Realice un mapa conceptual de las protenas plasmticas\\bck1-tq-ntv\Usuarios ADMINISTRATIVOS$\cbayam\Mis documentos\logo.jpg UNIVERSIDAD DEL VALLE SERVICIOS DE LABORATORIO LABORATORIO DE BIOQUMICA I PRACTICA No 4DETERMINACIN DE PROTENAS TOTALES Y ALBMINA EN SUEROI.-CONOCIMIENTO TERICO REQUERIDO.-Las protenas son polmeros lineales constituidos por los aminocidos, que se unen ent re s por medio de enlaces tipo amida denominados enlaces peptdicos. Las protenas pueden ser clasificadas en funcin de aspectos tan diversos como su co mposicin, su disposicin espacial, su funcin biolgica y su localizacin. Las protenas pueden clasificarse en: Hsticas o tisulares, son las protenas de los tejidos. Plasmticas o hemticas, son las protenas de la sangre. Aunque las protenas tisulares son de gran importancia en el organismo, las locali zadas en la sangre por su gran accesibilidad, proporcionan con facilidad informacin importante por lo tanto , son las ms utilizadas en el laboratorio clnico Existen en el suero humano ms de 125 conocidas con mltiples funciones como ser: Tr ansporte, almacenamiento, balance de fluidos (Agua y electrolitos), regulacin del equilibri o cido/base, respuesta de fase aguda en procesos de inflamacin, construccin, reparacin de tejidos, cataltica, hormonal y de coagulacin Las protenas totales estn constituidas por dos fracciones fundamentales la albmina y las globulinas (Que incluye diferentes fracciones protenicas)Albmina Es la protena predominante en el plasma ~50% (40-60%) de la protena total plasmtica . Presenta unaconcentracin de 4-5 g/kg de peso, 35-45 g/L Su concentracin es funcin del estado nutricional, en particular es sensible a defi ciencias de aminocidos. Corresponde al 50% de toda la protena que sintetiza en el hgado Su velocidad de sntesis es de 14-15 g diarios y su vida media es de unos 20 das Es globular compuesta por 585 aminocidos en una sola cadena polipeptdica con 50% d e a-hlice y 15% de estructura , posee 17 puentes disulfuro La albmina ayuda a conservar la distribucin normal de agua ya que produce cerca de 80% del efecto coloido osmtico de las protenas plasmticas totales, debido a su alta concentracin y bajo peso molecular. La albmina interviene en el equilibrio cido-bsico y se encarga tambin del transporte de varias sustancias como son los cidos grasos, bilirrubina, varias hormonas e incluso algunos frmacos (sulfonamidas, penicilina G, aspirina, dicumarol).Globulinas Las globulinas incluyen la fraccin a1-globulina, la fraccin a2-globulina, la fracc in -globulina y la fraccin de .-globulinasII.- OBJETIVOS.-Al finalizar la prctica el alumno ser capaz de: - Determinar la concentracin srica de protenas totales, de albmina y de globulinas - Interpretar los resultados obtenidos en la prctica y relacionarlos con patologasIII.- MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.REACTIVOS- EQUIPOS CANTIDAD MATERIALES CANTIDAD Kit Reactivo Protenas Totales 1 Tubos de ensayo 20 Kit Reactivo de AlbminaGradilla 3 EspectrofotmetroMicro pipetas 3 Agua destilada 1 Marcador de vidrio 2 Bao Mara 1 Pipetas de 5 ml 12Pipetas de 10 ml 6Pro pipetas 5Cola de zorro 5Puntillas 12Jabn antisptico-detergenteMuestra: Suero de un paciente que no debe haber consumido alimentos durante un p erodo de 4 horas previa suspensin de medicamentos que pueden aumentar su concentracin, los cules son: Ester oides anablicos, andrgenos, corticosteroides, hormona del crecimiento, insulina, fenazo piridina y progesterona o de los medicamentos que pueden reducir la concentracin de protenas totales como ser: Ione s de amonio, estrgenos, drogas hepato txicas y anticonceptivos oralesIV.-TCNICA.- (La tcnica puede variar de acuerdo al Kit de Protenas totales y de albm ina disponibles para la prctica)1. Planificacin de la prctica: Los estudiantes de la prctica se organizarn en grupos de 5 personas.2. Desarrollo de la prctica: Cada grupo realizar el siguiente procedimiento. Marcar tres tubos de ensayo para Protenas TotalesBlanco Standard Desconocido Reactivo 3,5 ml 3,5 ml 3,5 ml Suero ***** ***** 50 ul Standard ***** 50 ul ***** Agitar ligeramente e incubar en Bao Mara a 37 C 15 minutos al cabo de los cuales le er en el espectrofotmetro a 530 nm las respectivas absorbancias Los enlaces peptdicos de las protenas reaccionan con el in cprico en medio alcalino para dar un complejo de color violetaTcnica Prot.- Winner . Marcar tres tubos de ensayo para AlbminaBlancoStandard Desconocido Reactivo 2 ml 2 ml 2 ml Suero ***** ***** 20 ul Standard ***** 20 ul ***** Incubar a temperatura ambiente por diez minutos al cabo de los cuales se desarro llar el color, leer en el espectrofotmetro a 630 nm las respectivas absorbancias La albmina reacciona con el bromo cresolsulfon ftalena en presencia de un exceso d e colorante, en medio tamponado a pH 3,8Tcnica Prot.- WinnerV.- RESULTADOS.-1. Expresar en forma ordenada los clculos efectuados durante la prctica mediante l as siguientes relaciones matemticas:Absorbancia del desconocido [Protenas totales] g/dl= ---------------------------------------x [Standard] Absorbancia del StandardAbsorbancia del desconocido [Albmina] g/dl= -------------------------------------- x [Standard] Absorbancia del Standard[Globulinas] g/dl= Protenas Totales - Albmina2. Registrar todos los valores obtenidos al finalizar el procesamiento de la prc ticaVI.- CONCLUSIONES.-1. De acuerdo a los resultados obtenidos, plantear las conclusiones de la prctica de acuerdo al siguiente cuadro referencialPROTENAS TOTALES VALORES DE REFERENCIA: 6,1 -7,9 g/dl Niveles de protenas totales superiores al normal . Hipergammaglobulinemias mono o policlonales . Estados hipovolmicos Niveles de Protenas totales inferiores al normal . Mala absorcin . Kwashiorkor . Marasmo Sntesis proteica disminuida o ineficaz . Hepatopata grave . Agammaglobulinemias Afecciones por aumento de las prdidas de protenas . . . . Sndrome nefrtico Enfermedades gastrointestinales- enteropatas Dermopatas graves- quemaduras, eczemas HemorragiasCatabolismo incrementado de protenas . . . . . Fiebre, Inflamacin Hipertiroidismo Neoplasia Enfermedades crnicas Estados dilucionales- lquidos I.V.ALBMINA VALORES DE REFERENCIA: 3,5 Niveles de Albmina superiores al normal . Deshidratacin . Infusiones I.V. de albmina Niveles de Albmina inferiores al normal . Ingestin adecuada- desnutricin . Absorcin disminuida- sndrome de mala absorcin . Necesidades aumentadas- hipertiroidismo- embarazo . Sntesis deteriorada- hepatopatas, infeccin crnica, analbuminemia hereditaria . Degradacin incrementada- neoplasias, infecciones, traumatismos . Aumento de las prdidas- edema, ascitis, quemaduras, hemorragias, sndrome nefrtico, enteropatas . Estados dilucionales- lquidos I.V. GLOBULINAS VALORES DE REFERENCIA: 1,5 3 g/dl 4,8 g/dlNiveles de protenas totales superiores al normal . Deficiencias inmunolgicas . DeshidratacinVII.- CUESTIONARIO.1. Describa los signos, sntomas y clases de desnutricin 2. Describa qu es el edema y su mecanismo bioqumico 3. Resuelva casos clnicos planteados por el docente\\bck1-tq-ntv\Usuarios ADMINISTRATIVOS$\cbayam\Mis documentos\logo.jpg UNIVERSIDAD DEL VALLE SERVICIOS DE LABORATORIO LABORATORIO DE BIOQUMICA I PRACTICA No 5HEMOGRAMAI.-CONOCIMIENTO TERICO REQUERIDOEl hemograma es una descripcin cuantitativa y cualitativa de las clulas sanguneas. El hemograma es utilizado como un procedimiento de screening de la salud del pac iente, porque permite realizar el diagnstico de ciertas infecciones, evaluar la capacidad del organismo para reaccionar frente a la enfermedad y evaluar la progresin de la enfermedad. La muestra que se utiliza para el hemograma es sangre total, por lo tanto debe m ezclarse con un anticoagulante para evitar la formacin de cogulos o micro cogulos que pueden altera r los elementos formes. El anticoagulante de eleccin es el EDTA (Etilendiamino tetra actico slido o lquido porque no altera la morfologa eritrocitaria y leucocitaria, conserva los elementos formes durante 24 horas y no permite la agregacin plaquetaria.Los parmetros que se consideran son:SERIE ROJA Recuento de Hemates Los glbulos rojos son las clulas sanguneas que contienen en su interior la hemoglobina. Los glbulos rojos son los principales portadores de oxgeno a las clulas y tejidos del cuerpo. Tienen una forma bicncava para adaptarse a una mayor superficie de intercambio de oxgeno por dixido de carbono en los tejidos. Adems su membrana es flexible lo que permite a los glbulos rojos atravesar los ms estrechos capilares. Se utiliza ms para el diagnstico y clasificacin de anemias. Concentracin de Hemoglobina (Hb)Es un pigmento respiratorio, de naturaleza proteica. A travs de la Hb, el hemate realiza su funcin transportadora de 02 desde los pulmones hasta los tejidos. La tasa de Hb junto con el hematocrito se utiliza para controlar anemias o diagnosticar sangrados masivos. Los valores normales de Hb varan segn la edad, sexo y localizacin geogrfica. % Hematocrito(Hto) Es la relacin entre el volumen ocupado por los hemates y el correspondiente a la sangre total, depende fundamentalmente de la concentracin de Hb. Es el espacio ocupado por los hemates en relacin al volumen de sangre total. Velocidad de eritrosedimentacin Consiste en determinar la velocidad con que sedimentan los hemates , al colocar la sangre en una columna durante una unidad de tiempo que depende de la presencia de protenas del plasmandices corpusculares Son valores que se calcular a partir de los datos de hematocrito, concentracin de Hb y nmero de eritrocitos VCM (Volumen Corpuscular medio) Volumen promedio de los eritrocitos en femtolitros (1 fL = 10-15 l).Hto____en %___ *10N de GR/mm3 en millonesPor ej., si el hematocrito es 45 % y hay 500000 de eritrocitos MCV = 450/5 = 90 fL. Rango normal: 80 a 95 fL. HCM (Hb corpuscular media) Cantidad promedio de hemoglobina en cada eritrocito en picogramos (1 pg = 10-12 g)__ Hb_en_g/dl___ *10 N de GR/mm3 en millonesPor ej., si hay 15 g/dl de Hb y 5000000 de eritrocitos por /mL, MCH = 150/5 = 30 pg/eritrocito. Rango normal: 27 a 31 pg. CHCM (concentracin de Hb corpuscular media) Es la concentracin promedio de hemoglobina en gramos por dL de eritrocitos. Hb_en_g/dl___ *100 Hto en %Para el ejemplo antes dado, MCHC = 15/ 0.45 = 33.3 g/dL. Rango normal: 32 a 36 g/dL.SERIE BLANCA Recuento de leucocitos La modificacin de la cantidad de leucocitos puede orientar al diagnstico de enfermedadesinfecciosas, inflamatorias, cncer y leucemias, y otros procesos. Por ello el recuento es muy orientativo en diferentes enfermedades. Recuento diferencial de leucocitos Estudia el porcentaje de cada uno de ellos en un frotis sanguneoSERIE PLAQUETARIA Recuento de plaquetas Sirve para diagnosticar o monitorizar la hemorragia y los trastornos de la coagulacin.II.- OBJETIVOS.-A la conclusin de la prctica el alumno ser capaz de:- Realizar correctamente una puncin venosa y capilar - Realizar todas las pruebas cualitativas y cuantitativos del hemograma - Realizar la lectura e interpretacin del resultado de un hemograma procesado en la prcticaIII.- MATERIAL Y REACTIVOS.-REACTIVOS- EQUIPOS CANTIDAD MATERIALES CANTIDAD CentrfugaCinta adhesiva 1 MicroscopioGradilla 6 Reactivo de tincin GiemsaGuantes de ltex. 2Agujas y jeringas desechables estriles de volumen entre 5 a 10 ml (Con agujas N 21 G para adultos) 15Lazo de goma o torniquete. 6Recipientes descartadores 6Torunda con alcohol.Torundas secas.Tubos de hemlisis con anticoagulante 30Hematocritos no heparinizados 30Pipetas de westergreen 10Portaobjetos 12Soporte de pipetas westergreen 1Pizetas 6Soporte para tincin 1Goteros 6Pro pipetasPlastilina 1Jabn antispticoCola de Zorro 1IV.-PROCEDIMIENTO.-1. Planificacin de la prctica: Los estudiantes de la prctica se organizarn en grupos de 5 personas. 2. Desarrollo de la prctica: Cada grupo realizar el siguiente procedimiento . Obtener 5 ml de muestra de sangre por puncin venosa considerando el procedimiento de la prctica anterior . Vaciar la muestra de sangre en un tubo de hemlisis que contenga 3 gotas de EDTA . Tapar el tubo con un tapn de goma y homogeneizar la muestraRealizacin de extensiones de sangre . Depositar una gota de sangre en el extremo de un portaobjetos a unos 2cm del mis mo . Colocar otro portaobjetos sobre el porta anterior que contiene la gota de sangre , con una inclinacin de 45 inicialmente por la parte anterior de la gota de sangre . Desplazar hacia atrs hasta entrar en contacto con la gota y permitir que por capi laridad la misma se extienda uniformemente .Deslizar el segundo portaobjetos inclinado sobre el primero de manera suave y rpi da . Secar el portaobjetos a temperatura ambiente Tincin hematolgica . Despus del extendido . Poner el portaobjetos sobre un soporte universal . Realizar la fijacin con etanol 1min. . No lavar el portaobjetos . Aadir el colorante diluido a utilizar (Giemsa) gota a gota hasta cubrir toda la e xtensin . Dejar actuar 15 , lavar suavemente con agua destilada . Limpiar la parte inferior y secar Observacin de placas al microscopio . Examinar la muestra con objetivo de 100x y aceite de inmersin. . Las distintas clulas presentarn las siguientes coloraciones: o Hemates color rosado o Grnulos neutrfilos: de rosa a lilasangre3 o Grnulos eosinfilos: de rojo a anaranjado o Grnulos basfilos: azul violceo oscuro o Ncleo linfocitos: violeta oscuro o Ncleo monocitos: prpura azulado . Realizar la Frmula leucocitaria o Determinar el porcentaje de cada tipo de leucocito mediante la observacin direc ta al microscopio del frotis sanguneo teido con el objetivo de inmersin (100X)Determinacin del hematocrito . Llenar un tubo capilar no heparinizado, unas tres cuartas partes de su capacidad con la sangre por capilaridad . Limpiar con papel o gasa el capilar . Tapar el extremo limpio con plastilina . Colocar los capilares en la micro centrfuga considerando el equilibrio de la mism a . Centrifugar guante 5 a unas 12000 rpm . Extraer los capilares . Proceder con la lectura con los lectores de hematocrito o con una regla milimetr ada Determinacin de la Velocidad de eritrosedimentacin globular . Aspirar la muestra de sangre anti coagulada con una pipeta de westergreen con la ayuda de una pro pipeta . Enrazar a 0 . Colocar la pipeta de westergreen apoyando la parte inferior de la misma en el di sco de goma presionando fuertemente para evitar prdida de la muestra . Fijar la parte superior de la pipeta con la pipeta del soporte para pipetas de w estergreen . Anotar la hora. Calcular la alarma de reloj para la 1ra hora . Leer el descenso de hemates que se haya producido en la pipeta anotar . Si el tiempo permite volver a leer transcurrida la 2da hora Recuento de glbulos blancos . Diluir la sangre con unas pipeta especial llamada Thoma que consiste en un tubo capilar graduado en dcimas con marcas de 0,5 en la quinta y 1,0 en la dcima; posee un bulbo que contie ne una perla de vidrio que permite la mezcla de la sangre con un lquido dilutor llamado turk que es una solucin de 1 a 3ml de acido actico glacial, 100ml de agua y 1 ml de azul de metileno que destruy e a los eritrocitos y permite observar los leucocitos. . La pipeta est provista de un tubo de goma con una boquilla que facilita primero a spirar la sangre hasta la marca 0,5, limpiar la punta, aspirar el lquido dilutor hasta la marca 11 y mezclar. . Proceder con la carga de una cmara de Neubauer que consiste en una lmina de vidrio atravesado transversalmente por dos surcos que limitan tres porciones que tiene el retculo d onde se apoya un cubreobjetos, desechar las 2 primeras gotas, aplicar la punta de la pipeta al bo rde de la cmara, dejar salir 1 gota para cubrir toda la extensin de la cmara. Colocar la cmara en la platina del microscopio, observar con el objetivo x10 y co ntar los elementos distribuidos en cuatro cuadrados , obtener un promedio y multiplicar por 10 , qu e permite obtener el total de elementos por mm3 de la dilucin.V.- RESULTADOS.1. Registrar todos los valores obtenidos al finalizar el procesamiento de la prct icaVI.- CONCLUSIONES.1. De acuerdo a los resultados obtenidos, plantear las conclusiones de la prctica de acuerdo al siguiente cuadro referencialVALORES DE REFERENCIA INTERPRETACIN Recuento de Hemates R nacidos: 5,0- 6,5 millones/mm3 Mujeres: 3,5 Hombres: 4.0 millones/mm3 5,0 millones/mm3 5,5Valores disminuidos: Alteraciones en la dieta Anemias de diversa ndole Cncer Enfermedades sistmicas Embarazo Fibrosis de mdula sea HemorragiasValores aumentados: Cardiopatas Enfermedades pulmonares crnicas Estancias en lugares de gran altitud Poliglobulia de diferentes causas Concentracin de Hemoglobina (Hb) Al nacer: 16-23 g/100 ml A los 2 meses: 9-14 g/100 ml A los 10 aos: 12-14 g/100 mlAdultos: Mujeres: 12-14 g/100 ml Hombres: 14-17 g/100 ml Valores disminuidos: Anemias primarias, hemorragias Cncer, embarazo Enfermedades renales Enfermedades autoinmunes Linfomas Problemas de alimentacinValores aumentados: Cardiopatas , Deshidratacin Enfermedades pulmonares crnicas Estancias en lugares de mucha altitud % Hematocrito Recin nacido: 44 a 56% A los 3 meses : 32 a 44 %Al ao de edad: 36 a 41 % Entre 3 - 5 aos: 36 a 43 % Entre 5 - 15 aos: 37 a 45 % Hombre adulto: 40 a 54 % Mujer adulta: 37 a 47 %Un ndice bajo de Hematocrito puede deberse a: Anemias, hemorragias Fallos en la mdula sea (Radiaciones, toxinas, fibrosis, tumores) Embarazo , hipertiroidismo Hemlisis por una transfusin Leucemia , Artritis reumatoideUn ndice alto de Hematocrito puede deberse a: Cardiopatas Deshidratacin Eclampsia (en el embarazo) Enfermedades pulmonares crnicasVALORES DE REFERENCIA INTERPRETACIN Exceso de formacin de hemates Policitemia vera , shock Velocidad de eritro sedimentacin (VSG) 1 hora= 10 mm 2 hora= 20 mmLa VSG se eleva en: Anemia intensa Artritis reumatoide Enfermedades renales Enfermedades autoinmunes (Lupus eritematoso) Enfermedades tiroideas Embarazo Fiebre reumtica Infecciones agudas Macroglobulinemia Polimialgia reumtica Sfilis Tuberculosis VasculitisLa VSG puede aparecer disminuida en: Descenso de protenas en el plasma (por problemas hepticos renales)Disminucin del fibringeno Fallos cardiacos , policitemia ndices corpusculares VCM (Volumen Corpuscular medio) Rango normal: 80 a 95 fL. Determina el volumen medio de los hemates es decir: Normocticos: tamao normal Macrocticos: tamao grande Microcticos: tamao pequeo HCM (Hb corpuscular media) Rango normal: 27 a 31 pg. Expresa el peso medio de Hb en el hemate. CHCM (Concentracin de Hb corpuscular media) Rango normal: 32 a 36 g/dL. Expresa la relacin entre el peso de la Hb y el volumen del hemate. Indica si los hemates son: Normocrmicos: normalmente cargados de Hb Hipocrmicos: poco cargados de Hb Hipercrmicos: muy cargados de Hb Recuento de leucocitos 5000 a 9000/mm3 Leucopenia Fallo de la mdula sea (tumores, fibrosis,intoxicacin) - Enfermedades autoinmunes (Lupus eritematoso diseminado) Enfermedades del hgado o rin Exposicin a radiaciones Leucocitosis Dao de tejidos en quemaduras Enfermedades infecciosas, inflamatorias (por autoinmunidad-reumticas o alergias) Estrs, neoplasias, leucemiaRECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOSVALORES DE REFERENCIA INTERPRETACIN Grupo de leucocitos Valor % Neutrfilos 55 a 70 % Linfocitos 20 a 40 % Monocitos 2 a 8 % Eosinfilos 1 a 4 % Basfilos 0 a 1 % Neutroflia Estrs Infeccin bacteriana Enfermedades inflamatorias crnicas Reumatismo Leucemia Traumatismos Sndrome de CushingLinfocitosis Infecciones virales Leucemias Mononucleosis infecciosa HepatitisMonocitosis Enfermedades inflamatorias crnicas Infecciones virales Tuberculosis Mononucleosis infecciosaMalariaBasoflia Leucemia Policitemia veraEosinoflia Enfermedades alrgicas y autoinmunes Asma bronquial Urticaria Rinitis extrnseca Alergias alimentarias Colagenosis eosinoflica Infecciones y parasitosis Dermatitis atpica Leucemias Anemia perniciosa Enfermedad de Hodgkin Neoplasias Neutropenia Anemia aplsica Enfermedad de Addison Infecciones virales Medicamentos Radio y quimioterapiaLinfopenia Infecciones avanzadas HIV Inmunodeficiencias Leucemias Radioterapia SepsisMonocitopenia CortisonaBasopenia Anafilaxia Estrs HipertiroidismoEosinopenia Corticoides endgenos o exgenos Intoxicacin por alcoholRECUENTO DE PLAQUETAS VALORES DE REFERENCIA INTERPRETACIN 150.000 a 400.000/mm3 Trombocitosis Enfermedades mieloproliferativas Policitemia vera EsplenectomaAnemia con dficit de Fe+2 Artritis reumatoideaTrombocitopenia Alteraciones congnitas por disminucin de la produccin Fibrosis Falla medular Aplasia Radio y quimioterapia Sepsis Sndrome hemoltico-urmico Coagulacin intravascular diseminada Prtesis intravasculares Infecciones virales, bacterianas SangradoVII.- CUESTIONARIO.-1. 2. 3. 4.Describa Describa Describa Resuelvaque son las anemias el tratamiento de las anemias de acuerdo a la clasificacin la frmula leucocitaria en forma relativa y su interpretacin casos clnicos planteados por el docentediagrama de formacin y metabolismo explicado en el prrafo siguiente \\bck1-tq-ntv\Usuarios ADMINISTRATIVOS$\cbayam\Mis documentos\logo.jpg UNIVERSIDAD DEL VALLE SERVICIOS DE LABORATORIO LABORATORIO DE BIOQUMICA I PRACTICA No 6DETERMINACIN DE BILIRRUBINA DIRECTA Y TOTAL EN SUEROI.-CONOCIMIENTO TERICO REQUERIDO.-La bilirrubina se origina por degradacin del grupo hem de la hemoglobina o de otr as hemoproteinas, que a su vez aparece en el plasma como consecuencia de la destruccin de los glbulos rojos e n el sistema retculo endotelial. La hemoglobina, una vez liberada en el interior del eritrocito, se c ombina con las haptoglobinas, protenas plasmticas especficas para su transporte. En una primera etapa y tras su liberacin de la hapt oglobina, se forma, por accin de una oxigenasa, un grupo formilo, con lo que se rompe el anillo tetrapirrl ico del hem, formndose el compuesto denominado biliverdina, que en una etapa posterior y por accin de una r eductasa se transforma en bilirrubina. La bilirrubina es lipoflica por lo tanto es transportada a travs del plasma unida a la albmina y es conjugada a nivel heptico con el cido UDP- glucurnico por la enzima UDP- glucuronil transfera sa aumentando as su solubilidad; despus pasa al intestino donde es desconjugada por la flora bacteria na y forma urobilingenos que puede ser: el estercobilingeno que se oxida y se convierte en estercobilina q ue es eliminada por las heces y en urobilingeno que se reabsorbe al plasma, donde una fraccin vuelve al hga do y recircula en la bilis y la otra se excreta en orina en forma de urobilinas. Desde un punto de vista analtico y clnico, interesa conocer los niveles de bilirru bina total y diferenciar cuantitativamente la "bilirrubina libre" o preheptica que aumenta principalmente en procesos de tipo hemoltico, de la "bilirrubina conjugada" o heptica que est incrementada en la disfu ncin heptica y ms concretamente en fallos de los mecanismos de su eliminacin, a travs del sistema bi liar, cuyo primer paso es introducirse del hepatocito a los canalculos biliares.Metabolismo de la bilirrubinaTIPOS DE BILIRRUBINA Caractersticas principales Bilirrubina no conjugada Bilirrubina conjugada Solubilidad No polar (alcohol) Polar (alcohol y agua) Reaccin con el diazoreactivo Precisa un acelerador Directa Presencia en orina en pacientes ictricos No (est unida a la albmina) Si Afinidad por el tejido cerebral Alta Baja Presencia en ictericias hemolticas Si No Presencia en ictericia obstructiva y hepatocelular Si SiII.- OBJETIVOS.-Al finalizar la prctica el alumno ser capaz de:- Describir la actividad metablica de la bilirrubina - Determinar la concentracin srica de bilirrubina total, directa e indirecta - Interpretar los resultados obtenidos en la prctica y relacionarlos con patologasIII.- MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.-REACTIVOS- EQUIPOS CANTIDAD MATERIALES CANTIDAD Kit reactivo de Bilirrubina 1 Tubos de ensayo 20 EspectrofotmetroGradilla 3 Agua destiladaMicro pipetas 3 Bao Mara 1 Marcador de vidrio 21 Pipetas de 5 ml 12Pipetas de 10 ml 6Pro pipetas 5Cola de zorro 5Puntillas 12Jabn antisptico-detergenteMuestra: Suero de un paciente que no debe haber consumido alimentos durante un p erodo de 8 horas antes de la determinacin, previa suspensin de medicamentos que pueden elevar la bilirrub ina srica como ser: Alopurinol, esteroides, antibiticos, antimalricos, azatioprina, colinrgicos, codena, diurticos, metrotexate, metildopa, morfina, anticonceptivos orales, fenotiazinas, rifampicina, salicilat os, sulfonamidas y la teofilina y la suspensin de medicamentos que pueden disminuir la bilirrubina srica como ser: barb itricos, la cafena y la penicilina.IV.-TCNICA.- (La tcnica puede variar de acuerdo al Kit de Bilirrubina disponible p ara la prctica)1. Planificacin de la prctica: Los estudiantes de la prctica se organizarn en grupos de 5 personas. 2. Desarrollo de la prctica: Cada grupo realizar el siguiente procedimiento . Marcar tres tubos de ensayoBlanco Bil directa Bil total Suero 200 ul 200 ul 200 ul Agua destilada 2,5 ml 2,5 ml ***** Desarrollador ***** ***** 2,5 ml Acido sulfanlico 200 ul ***** ***** Diazoreactivo *****200 ul 200 ul Mezclar de inmediato cada tubo, luego de 5 min. leer en el espectrofotmetro a 530 nm llevando el aparato a 0 con agua destilada La bilirrubina reacciona especficamente con el cido sulfanlico diazotado produciendo un color rojo violceo, en cambio la indirecta requiere un desarrollador (benzoato de cafena). El color desarrollado se puede medir colorimtricamente a 530 nm.Bilirrubina - WinnerV.- RESULTADOS.-1. Expresar en forma ordenada los clculos efectuados durante la prctica mediante l a siguiente relacin matemtica:[Bilirrubina total] mg/l= (Absorbancia del Total- Absorbancia del blanco) * fact or[Bilirrubina directa] mg/l= (Absorbancia del desconocido Total- Absorbancia del blanco) * factor[Bilirrubina indirecta] mg/l=Bil total- Bil directa2. Registrar todos los valores obtenidos al finalizar el procesamiento de la prct icaVI.- CONCLUSIONES.-1. De acuerdo a los resultados obtenidos, plantear las conclusiones de la prctica de acuerdo al siguiente cuadro referencialVALORES DE REFERENCIA Adultos: Bilirrubina directa : 0 a 0,4 mg/dl Bilirrubina total: 0-1 mg/dl Recin nacidos: Hasta las 24 hrs: 6 mg/dl Hasta las 48 hrs:75 g/dl Del 3er al 5to da:12mg/dl Niveles de bilirrubina indirecta superiores al normal Sobreproduccin por trastornos hematolgicos . Hemlisis o eritropoyesis ineficaz . Anemia hemoltica, eritroblastosis fetal . Reabsorcin de grandes hematomas y transfusiones masivas Captacin defectuosa . Sndrome de Gilbert Conjugacin disminuida . Ictericias del recin nacido o Cligler-Najjar I o Cligler-Najjar II . Ictericias familiares no hemolticaso Sndrome de GilbertNiveles de bilirrubina directa superiores al normal Trastornos hereditarios de la excrecin de bilirrubina . Sndrome de Dubin-Johnson . Sndrome de Rotor Colestasis intraheptica . o . . . . Sin obstruccin mecnica Hepatopatas agudas o crnicas Enfermedades virales o autoinmunes Isquemia, txicas por frmacos Hereditarias- enfermedad de Wilson Lesin de conductos biliares intrahepticos, colestasis. Con obstruccin mecnica o Infecciones o Neoplasias hepticas, cirrosis biliarColestasis extraheptica . Enfermedad litisica . Lesiones quirrgicas del rbol biliar, neoplasia de conductos biliares . Carcinoma de pncreas, pancreatitisVII.- CUESTIONARIO.-1. Expliqu porqu la determinacin de bilirrubina es considerada una prueba bioqumica indicadora de la funcin excretora heptica 2. Represente en forma de esquema el metabolismo de bilirrubina y urobilina 3. Describa la clasificacin y causas de las ictericias 4. Describa el procedimiento para disminuir la ictericia en neonatos 5. Resuelva casos clnicos planteados por el docente\\bck1-tq-ntv\Usuarios ADMINISTRATIVOS$\cbayam\Mis documentos\logo.jpg UNIVERSIDAD PRIVADA DEL VALLE SERVICIOS DE LABORATORIO LABORATORIO DE BIOQUMICA I PRACTICA N 7ENZIMAS PARA EL DIAGNSTICO CLNICOI.- CONOCIMIENTO TERICO REQUERIDO.-Las enzimas permiten que las reacciones metablicas procedan con una velocidad may or. La actividad enzimtica vara de acuerdo con la ubicacin celular. Por lo tanto, el pa trn de elevacin enzimtica es til para detectar y diferenciar diversas enfermedades. Adems existen v arias isoenzimas en las que se observa una leve diferencia estructural de la enzima que depende del teji do primario en el cual se sintetiza. Esta diferencia estructural permite separar las enzimas totales en to das sus formas isoezimticas. La determinacin srica de enzimas o de sustratos se basa en que los cambios de los niveles de enzimas plasmticas reflejan los cambios que se dan en un tejido u rgano especfico Las enzimas plasmticas son de dos tipos: . Las enzimas especficas que son propias del plasma por ejemplo las que participan en el proceso de coagulacin . Las enzimas no especficas que no se encuentran en gran cantidad en el plasma porq ue se encuentran en tejidos y rganos especficos y slo son liberadas al plasma cuando exis te un proceso patolgico que puede provocar cambios en la permeabilidad de la membrana celular o incrementar la muerte celular y su liberacin al espacio extracelular. Las enzimas plasmticas no funcionales incluyen a las que existen en las secrecion es exocrinas (amilasa pancretica, lipasa, fosfatasa alcalina, fosfatasa cida) y a las enzimas i ntracelulares verdaderas\\bck1-tq-ntv\Usuarios ADMINISTRATIVOS$\cbayam\Mis documentos\logo.jpg UNIVERSIDAD PRIVADA DEL VALLE SERVICIOS DE LABORATORIO LABORATORIO DE BIOQUMICA I PRACTICA N 8PRUEBAS DE FUNCIONAMIENTO PANCRETICO DETERMINACIN CUANTITATIVA DE AMILASA SRICAI.- CONOCIMIENTO TERICO REQUERIDO.-La alfa amilasa es una metaloenzima que necesita de calcio para romper los enlac es alfa 1-4 glucosdicos de los polisacridos (almidn, glucgeno). Existen dos isoenzimas principales de la amilasa que son: La salival (tipo S) y pancretica (tipo P), detectables en suero como fracciones independientes. La amilasa procedente de lo s rganos donde se sintetiza entra en la circulacin a travs de la sangre que per funde estos rganos; s u vida media en el hombre es de alrededor de diez horas, de aqu la importancia de la deteccin precoz de amilasa en una pancreatitis aguda. En el 35%-55% de los pacientes con pancreatitis aguda la ami lasa se normaliza entre el segundo y tercer da. La isoamilasa pancretica representa del 35% al 50% de la actividad amilasa total y se elimina por va renal de 1,6 a dos veces ms rpido que la salival. La amilasa salival (forma S), no slo re fleja la actividad enzimtica dependiente de la glndula salival, sino la de cualquier origen (tumores de pulmn, ginecolgico). La amilasa filtrada por el glomrulo renal es reabsorbida en un 75% en el tbulo pro ximal. La actividad de amilasa alfa no es especfica para estos tejidos, ya que tambin se encuentra en el epitelio intestinal, trompas de Falopio, mucosa del cuello uterino, endometrio y tejido d el seno durante la lactancia. La principal funcin de la amilasa alfa se debe a la fraccin pancretica, que ayuda a la digestin del almidn, glucgeno y sus productos de descomposicin en el intestino delgado. La alfa amilasa salival hidroliza elalmidn en la cavidad oral, pero su accin termina con rapidez a consecuencia del pH cido del jugo gstrico durante la deglucin. La pancreatitis aguda es una de las principales emergencias mdicas; el alcoholism o y las enfermedades del tracto biliar son las causas predominantes, aunque slo tenemos algunas evidencias conjeturales de cmo se inicia una pancreatitis. Los cambios observados en las enzimas pancreticas como a milasa y lipasa pueden ser de moderados a intensos. La pancreatitis crnica generalmente es la secuela de mltiples brotes de la enfermedad aguda y los resultados de laboratorio normalmente no son muy tiles par a el diagnstico.II.- OBJETIVOS.-Al finalizar la prctica el alumno ser capaz de: e Integrar los conocimientos tericos de la actividad enzimtica en la determinacin d amilasa srica Determinar la concentracin srica de la amilasa Interpretar los resultados obtenidos en la prctica y relacionarlos con patologasIII.- MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.-REACTIVOS- EQUIPOS CANTIDAD MATERIALES CANTIDAD Kit Reactivo Amilasa 1 Tubos de ensayo 10 EspectrofotmetroGradilla 6Agua destilada 1 Micro pipetas volumen variable 6 Bao Mara 1 Marcador de vidrio 2Pipetas de 5 ml 12Pipetas de 10 ml 6Pro pipetas 5Cola de zorro 5Puntillas 12Jabn antisptico-detergenteMuestra: Suero de un paciente que no debe haber consumido alimentos durante un p erodo de 6 horas previa suspensin de los siguientes medicamentos: Asparaginasa, corticoesteroides, azatio prina, colinrgicos, cido etacrnico, codena, mercaptopurina, morfina, anticonceptivos orales, rifampicina, d iurticos tiacdicosIV.-TCNICA.- (La tcnica puede variar de acuerdo al Kit de Amilasa disponible para la prctica)1. Planificacin de la prctica: Los estudiantes de la prctica se organizarn en grupos de 5 personas. 2. Desarrollo de la prctica: Cada grupo realizar el siguiente procedimiento . Marcar dos tubos de ensayoConocido Desconocido Sustrato1 ml 1 ml Suero ***** 20 ul Incubar a 37C en Bao Mara 7,5 minutos exactamente Reactivo de yodo 1 ml 1ml Mezclar por agitacin , retirar los tubos del bao y agregar Agua destilada 8 ml 8 ml Leer a 640 llevando el aparato a 0 con agua destilada En esta prueba la amilasa descompone especficamente el almidn (sustrato ,pero separa la hidrlisis con reactivo de Yodo, que da un color violeta con el almidn remanenteTcnica Amilo kit- WinnerV.- RESULTADOS.-1. Expresar en forma ordenada los clculos efectuados durante la prctica mediante l a siguiente relacin matemtica:Absorbancia del Conocido- Absorbancia del desconocido [Amilasa] UA/dl= --------------------------------------------------------------------- *1000 Absorbancia del Conocido2. Registrar todos los valores obtenidos al finalizar el procesamiento de la muestraVI.- CONCLUSIONES.-1. De acuerdo a los resultados obtenidos, plantear las conclusiones de la prctica de acuerdo al siguiente cuadro referencialVALORES DE REFERENCIA Normal: Menor a 120 Unidades Amilolticas/dl Niveles de amilasa superiores al normal Enfermedades pancreticas . Pancreatitis aguda de cualquier origen . Pancreatitis crnica Complicaciones de la pancreatitis . Fstulas, pseudoquistes absceso, ascitis . Cncer de pncreas . Traumatismos pancreticos Niveles de Amilasa inferiores al normal Destruccin extensa del pncreas . Pancreatitis fulminante . Fibrosis qustica avanzada Lesin heptica grave . Hepatitis . Toxemia del embarazo . IntoxicacinEnfermedades salivales . Parotiditis . Radiacin . Litiasis, traumatismos Enfermedades gastrointestinales . Apendicitis aguda . lcera duodenal . Obstruccin intestinal Enfermedades hepticas y biliares . Hepatitis virales, cirrosis Enfermedades ginecolgicas . Rotura del embarazo ectpico . Cncer de ovario Otros . Insuficiencia renal . Alcoholismo, traumatismos cerebrales . Quemaduras, shock traumticoVII.- CUESTIONARIO.-1. Esquematice un algoritmo del diagnstico de pancreatitis aguda2. Resuelva casos clnicos planteados por el docente\\bck1-tq-ntv\Usuarios ADMINISTRATIVOS$\cbayam\Mis documentos\logo.jpg UNIVERSIDAD PRIVADA DEL VALLE SERVICIOS DE LABORATORIO LABORATORIO DE BIOQUMICA I PRACTICA N 9DETERMINACIN DE LIPASA SRICAI.- CONOCIMIENTO TERICO REQUERIDO.-La lipasa es una enzima tipo hidrolasa producida por el pncreas que opera en form a optima en el lumen del intestino delgado, donde bajo condiciones de pH ligeramente cido y en presencia d e bilis hidroliza los triglicridos que se encuentran en forma micelar en las posiciones 1 y 3, generand o los monoglicridos y cidos grasos libres que luego son absorbidos por la mucosa intestinal. Se observa actividad de lipasa tambin en mucosa intestinal, estmago, leucocitos y tejido adiposo. Sin embargo, slo la lipasa pancretica tiene significado clnico; su principal funcin consiste en hidrolizar los triglicrid os de la dieta que han sido emulsificados por cidos biliares y ayudan as a la absorcin de grasas en el intestin o delgado.II.- OBJETIVOS.-Al finalizar la prctica el alumno ser capaz de: e Integrar los conocimientos tericos de la actividad enzimtica en la determinacin d lipasa srica Determinar la concentracin srica de lipasa Interpretar los resultados obtenidos en la prctica y relacionarlos con patologasIII.- MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.REACTIVOS- EQUIPOS CANTIDAD MATERIALESCANTIDAD Kit Reactivo Lipasa 1 Tubos de ensayo 20 EspectrofotmetroGradilla 3 Agua destilada 1 Micro pipetas 3 Bao Mara 1 Marcador de vidrio 2Pipetas de 5 ml 12Pipetas de 10 ml 6Pro pipetas 5Cola de zorro 5Puntillas 12Jabn antisptico-detergenteMuestra: Suero de un paciente que no debe haber consumido alimentos durante un p erodo de 8 horas previa suspensin de los siguientes medicamentos: Colinrgicos, la codena, la indometacina, la meperidina y la morfina.IV.-TCNICA.- (La tcnica puede variar de acuerdo al Kit de Lipasa disponible para l a prctica)1. Planificacin de la prctica: Los estudiantes de la prctica se organizarn en grupos de 5 personas. 2. Desarrollo de la prctica: Cada grupo realizar el siguiente procedimiento . Marcar dos tubos de ensayoBlanco Desconocido Reactivo de trabajo(lipasa reconstituida 3 ml 3 ml Suero100 ul Mezclar inmediatamente, leer la absorbancia (A1) llevar otra vez al bao y leer la absorbancia a los 5 min.(A2) La lipasa srica hidroliza una emulsin de aceite de olivaTcnica Lipasa-OrgenicsV.- RESULTADOS.-1. Expresar en forma ordenada los clculos efectuados durante la prctica mediante l a siguiente relacin matemtica:Absorbancia corregida/5min [Lipasa] UI/l= ------------------------------------ * 1953 Absorbancia inicial del blancoAbsorbancia corregida/5min = Absorbancia desconocido- Absorbancia del Blanco2. Registrar todos los valores obtenidos al finalizar el procesamiento de la prct icaVI.- CONCLUSIONES.-1. De acuerdo a los resultados obtenidos, plantear las conclusiones de la prctica de acuerdo al siguiente cuadro referencialVALORES DE REFERENCIA Adultos: 10-150 UI/l Niveles de lipasa srica superiores al normal . . . . . Pancreatitis aguda, clculos pancreticos Pancreatitis crnica Obstruccin del intestino delgado Insuficiencia renal aguda y crnica Trasplante de rgano( rin, hgado, corazn). Alcoholismo y cetoacidosis diabtica Niveles de lipasa srica normales . ParotiditisVII.- CUESTIONARIO.-1. Esquematice el comportamiento de la lipasa y amilasa en la pancreatitis aguda 2. Resuelva casos clnicos planteados por el docente\\bck1-tq-ntv\Usuarios ADMINISTRATIVOS$\cbayam\Mis documentos\logo.jpg UNIVERSIDAD PRIVADA DEL VALLE SERVICIOS DE LABORATORIO LABORATORIO DE BIOQUMICA I PRACTICA N 10PRUEBAS DE FUNCIONAMIENTO HEPTICO TRANSAMINASAS SRICASI.- CONOCIMIENTO TERICO REQUERIDO.-Las transaminasas GOT y GPT son enzimas ampliamente difundidas en el organismo. La GOT se encuentra en el citoplasma y en las mitocondrias en cambio la GPT se e ncuentra en el citoplasma La GOT que se denomina glutmico oxalactico transaminasa o AST (Aspartato aminotran sferasa) cataliza la siguiente reaccin reversibleLa GPT que se denomina glutmico pirvico transaminasa o ALT (Alanina amiotransferas a) cataliza la siguiente reaccin reversibleEn el hgado se encuentran los niveles ms altos de ALT, mientras que la AST se encu entra presente en el corazn, msculo esqueltico e hgado en cantidades similares. La actividad en el suero de tanto la AST como la ALT aumenta rpidamente durante el comienzo de la ictericia viral y perman ece elevada por 1 a 2 semanas. En las hepatitis txicas tambin se elevan la ALT y la AST. En los paciente s con hepatitis crnica activa tambin se observan aumentos en la AST y ALT.La necrosis heptica aguda se acompaa por incrementos significativos en las activid ades tanto la ALT y la AST. El aumento en la actividad de la ALT es generalmente mayor que el increment o en la actividad de la AST. En la cirrosis del hgado las actividades de las transaminasas sricas generalm ente no se elevan por encima de 300 U/L, sin importar la causa de la enfermedad cirrtica. En el diagnstico de la enfermedad del hgado, la medicin de los niveles sricos de ASA T y ALAT es valiosa. Esto es importante cuando se establece el diagnstico puesto que la ALAT y la ASAT estn presentes en otros tejidos adems del hgado y la actividad srica de estas enzimas puede reflejar una enfermedad orgnica en tejidos distintos al hgado. Las actividades sricas de la ALT y la AST se elevan en el infarto del miocardio, infarto renal, distrofia muscular progresiva y otro gran nmero de enfe rmedades que solamente afectan al hgado de una manera secundaria, como la enfermedad de Gaucher, la enfe rmedad de NiemannPick, la mononucleosis infecciosa, la leucemia mieloctica, la cetoacidosis diabtic a y el hipertiroidismoII.- OBJETIVOS.-Al finalizar la prctica el alumno ser capaz de: - Integrar los conocimientos tericos de la actividad enzimtica en la determinacin d e transaminasas sricas - Determinar la concentracin srica de transaminasas - Interpretar los resultados obtenidos en la prctica y relacionarlos con patologasIII.- MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.-REACTIVOS- EQUIPOS CANTIDAD MATERIALES CANTIDAD Kit Reactivo de GOT 1 Tubos de ensayo 20 Kit Reactivo de GPTGradilla 3 EspectrofotmetroMicro pipetas 3 Agua destilada 1 Marcador de vidrio 2 Bao Mara 1 Pipetas de 5 ml 12Pipetas de 10 ml 6Pro pipetas 5Cola de zorro 5Puntillas 12Jabn antisptico-detergenteMuestra: Suero de un paciente que no debe haber consumido alimentos durante un p erodo de 4 horas previa suspensin de medicamentos que pueden aumentar su concentracin, los cules son: Paracetamol, alopurinol, ampicilina, azatioprina, carbamacepina, cefalosporinas, clorpropamida, clofibrato, cloxacilina, codena, indometacina, isoniacida, metrotexate, cido nalidixico, nitro furantoina, fenitona, procainamida, propanolol.IV.-TCNICA.- (La tcnica puede variar de acuerdo al Kit de Transaminasas disponible para la prctica)1. Planificacin de la prctica: Los estudiantes de la prctica se organizarn en grupos de 5 personas. 2. Desarrollo de la prctica: Cada grupo realizar el siguiente procedimiento . Marcar tres tubos de ensayoBlanco GOTGPT Sustrato 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml Suero ***** 100 ul 100 ul Agua destilada 100 ul ***** ***** Dejar 30 minutos a temperatura ambiente para que se produzca la reaccin 2,4 Dinitrofenol hidracina 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml Diluyente para enzimas 5ml 5ml 5ml Leer en el espectrofotmetro a 505 nm llevando el aparato a cero con agua destilada El piruvato (el oxalacetato es inestable y se convierte a piruvato) reacciona co n el 2, 4 dinitrofenol hidracina produciendo en medio alcalino un compuesto coloreadoTcnica Transaminasas 200 - WinnerV.- RESULTADOS.-1. Registrar todos los valores obtenidos al finalizar el procesamiento de la prct ica 2. Determinar la concentracin de GOT y GPT llevando las lecturas a una curva de c alibracin previamente construida con estndares de concentracin conocida para tener los resultados en U/LVI.- CONCLUSIONES.-1. De acuerdo a los resultados obtenidos, plantear las conclusiones de la prctica de acuerdo al siguiente cuadro referencialVALORES DE REFERENCIA: GOT 5 35 U/l GPT 5- 50 U/lNiveles de GOT superiores al normal Hepatopatas . Necrosis activa de las clulas parenquimatosas . Hepatitis vrica aguda . Congestin insuficiencia cardiaca, cirrosis, obstruccin biliar, cncer metasttico, isquemia heptica . Eclampsia Enfermedades msculo esquelticas . Traumatismos . Mioglobinurias . Infarto agudo de miocardio Otras . . . . . . . Pancreatitis aguda Infarto pulmonar Infarto cerebral Quemaduras Agotamiento por calor intoxicacin por plomo Anemia hemolticaNiveles de GOT inferiores al normal . . . . . Azoemia Estados de dficit de piridoxal fosfato Cetoacidosis diabtica Embarazo Enfermedades renalesNiveles de GPT superiores al normal Hepatopatas . Necrosis activa de las clulas parenquimatosas . Hepatitis vrica aguda . Congestin insuficiencia cardiaca, cirrosis, obstruccin biliar, cncer metasttico, isquemia heptica . Pre eclampsia grave Enfermedades msculo esquelticas. . . .Traumatismos Mioglobinurias Obesidad Leucemia linfoblstica agudaNiveles de GPT inferiores al normal . Infecciones urinarias . Neoplasias . Estados de dficit de piridoxal fosfatoVII.- CUESTIONARIO.-1. Describa la funcin y la utilidad de la .- Glutamil transferasa y de la 5`nucle otidada en el diagnstico de patologas 2. Resuelva casos clnicos planteados por el docente\\bck1-tq-ntv\Usuarios ADMINISTRATIVOS$\cbayam\Mis documentos\logo.jpg UNIVERSIDAD PRIVADA DEL VALLE SERVICIOS DE LABORATORIO LABORATORIO DE BIOQUMICA I PRACTICA N 11DETERMINACIN CUANTITATIVA DE FOSFATASA ALCALINA- FAL SRICAI.- CONOCIMIENTO TERICO REQUERIDO.-La enzima ha sido identificada en la mayora de los tejidos corporales y se locali za generalmente en las membranas celulares. La actividad ms alta de la fosfatasa alcalina se observa en el hgado, los huesos, el intestino, el rin y la placenta, y se han identificado por lo menos 11 isoformas d iferentes de la fosfatasa alcalina en el suero. La medicin de la fosfatasa alcalina srica es til para diferenciar la enfermedad hep atobiliar de la enfermedad osteognica. La actividad de la fosfatasa alcalina aumenta mucho (10 veces) como r esultado de una sntesis localizada en la membrana despus de una obstruccin extrahepatobiliar tal como la c olestasis o los clculos biliares. La obstruccin biliar intraheptica tambin se ve acompaada por una elevacin d e la actividad de la fosfatasa alcalina srica, pero el grado de incremento es mucho menor (2 a 3 veces ). La enfermedad heptica que produce necrosis de las clulas del parnquima no eleva la fosfatasa alca lina srica a menos que la enfermedad heptica est asociada con dao a los canalculos o con estasis biliar . Tambin se incrementa la actividad de la fosfatasa alcalina srica durante la pubertad debido al crecimiento acelerado de los huesos y durante el tercer trimestre del embarazo debido a la liberacin de la fosfatasa alcalina por la placenta.II.- OBJETIVOS.-Al finalizar la prctica el alumno ser capaz de: - Integrar los conocimientos tericos de la actividad enzimtica en la determinacin d e fosfatasa alcalinasrica - Determinar la concentracin srica de fosfatasa alcalina - Interpretar los resultados obtenidos en la prctica y relacionarlos con patologasIII.- MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.-REACTIVOS- EQUIPOS CANTIDAD MATERIALES CANTIDAD Kit Reactivo FAL 1 Tubos de hemlisis 20 EspectrofotmetroGradilla 6 Agua destilada 1 Micro pipetas volumen variable 6 Bao Mara 1 Marcador de vidrio 2Pipetas de 5 ml 12Pipetas de 10 ml 6Pro pipetas 5Cola de zorro 5Puntillas 12Jabn antisptico-detergenteMuestra: Suero de un paciente que no debe haber consumido alimentos durante un p erodo de 8 horas previa suspensin de los siguientes medicamentos: Metildopa, propanolol, alopurinol, anti depresivos tricclicos, clorpromacina, anticonceptivos orales, analgsicos, antiinflamatoriosIV.-TCNICA.- (La tcnica puede variar de acuerdo al Kit de Fosfatasa alcalina dispo nible para la prctica)1. Planificacin de la prctica: Los estudiantes de la prctica se organizarn en grupos de 5 personas.2. Desarrollo de la prctica: Cada grupo realizar el siguiente procedimiento . Marcar tres tubos de ensayoBlanco Standard Desconocido Sustrato 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml Suero *****50 ul Standard ***** 50 ul ***** Incubar 10 min. a 37 C Reactivo de color 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml Leer el color desarrollado a una longitud de onda de 520 nm llevando el aparato a 0 con agua destilada La FAL desdobla el fenilfosfato de sodio en medio alcalino tamponado con aminometil propanol AMP liberando fenol que se determina por reaccin con 4 amino antipirina yferri cianuro como agente oxidante.Tcnica Fosfatasa Alcalina Optimizada- WinnerV.- RESULTADOS.-1. Expresar en forma ordenada los clculos efectuados durante la prctica mediante l a siguiente relacin matemtica:Absorbancia del desconocido [Fosfatasa alcalina] UI/l= ----------------------------------- * [Standard] Absorbancia del Standard2. Registrar todos los valores obtenidos al finalizar el procesamiento de la prct icaVI.- CONCLUSIONES.-1. De acuerdo a los resultados obtenidos, plantear las conclusiones de la prctica de acuerdo al siguiente cuadro referencialVALORES DE REFERENCIA Adultos: 68-240 UI/l Nios: 100-400 UI/l Niveles de FAL superiores al normal Origen seo . . . . . . . . Cnceres seos osteoblsticos Enfermedad de Paget Hiperparatiroidismo Osteognesis imperfecta Fractura en recuperacin Enfermedad de Hodkin Osteomalacia RaquitismoHepatopatas . . . . . Obstruccin biliar Clculos biliares Carcinoma biliar Ndulos hepticos Tumor metastsicoNiveles de FAL inferiores al normal . Desnutricin-anemia . Deficiencia de protena . Acondroplasia . Hipotiroidismo . Cretinismo . Escorbuto . Dficit de Zn y de Mg . Mujeres posmenopusicas(Osteoporosis) . Consumo de Frmacos (Corticoides, hipolipemiantes). Infiltracin heptica . Hepatitis vrica, txica, alcohlica Fisiolgicamente . En el perodo de crecimiento en los nios . En el primer trimestre del embarazoVII.- CUESTIONARIO.-1. Describa que son las isoenzimas 2. Describa las reacciones bioqumicas en las que participa la fosfatasa cida y su utilidad en el diagnstico de patologas 3. Describa las pruebas bioqumicas que se recomiendan en forma paralela a la determinacin de fosfatasa alcalina en problemas seos 4. Resuelva casos clnicos planteados por el docente\\bck1-tq-ntv\Usuarios ADMINISTRATIVOS$\cbayam\Mis documentos\logo.jpg UNIVERSIDAD DEL VALLE SERVICIOS DE LABORATORIO LABORATORIO DE BIOQUMICA I PRACTICA No 12METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS GLICEMIAI.-CONOCIMIENTO TERICO REQUERIDO.-La glucosa es el hidrato de carbono esencial para la vida, que se forma por la f otosntesis que hacen los vegetales y luego se transforma en almidn en los cereales y hortalizas, o en fruc tosa en las frutas y miel. La principal funcin bioqumica de la glucosa es la de proporcionar energa para los p rocesos de la vida. El sistema para regular los niveles de glucosa sangunea funciona para lograr dos fin es. El primero es para almacenar glucosa en exceso en relacin a las necesidades corporales inmediatas en un reservorio compacto (glucgeno) y el segundo es para movilizar la glucosa almacenada de maner a que mantenga el nivel de glucosa sangunea. La regulacin de la glucosa sangunea es esencial para man tener al cerebro, cuya fuente energtica primaria es la glucosa, abastecido por una cantidad constan te de la misma. La funcin de la insulina es desviar la glucosa extracelular a los sitios de almacena miento intracelular en la forma de macromolculas (como el glucgeno, lpidos y protenas). Es as que la glucosa es almac enada en tiempos de abundancia para los momentos de necesidad. En respuesta a la baja glucosa en sangre, como en perodos de ayuno, una serie de agentes hiperglucemiantes acta en las vas metablicas intermediarias para formar glucosa a p artir de las macromolculas almacenadas. De esta forma las protenas y el glucgeno son metabolizad os para formar glucosa-6-fosfato (gluconeognesis), la cual es hidrolizada a glucosa en el hgado y liberada a la sangre para mantener los niveles de glucosa sangunea. Los agentes hiperglucemiantes ms importantes son el glucagn, la epinefrina, el cor tisol, la tiroxina, la hormona de crecimiento y ciertas hormonas intestinales.El comportamiento de cada uno de estos agentes es diferente en la regulacin de la glucosa sangunea; mientras que la insulina favorece el metabolismo anablico (sntesis de macromolculas ), estas hormonas, en parte, inducen el metabolismo catablico para romper grandes molculas. Las reservas glucdicas del organismo oscilan entre 1200-2400 Kcal. y se localizan principalmente en el tejido muscular (79%) y en el tejido heptico (14%) bajo forma de glucgeno, pero tambin en las clulas sanguneas (7%) en forma de glucosaMECANISMOS DE REGULACIN DE LA GLICEMIA Disminucin de glicemia Aumento de glicemia Sntesis de glucgeno heptico y muscular Entrada de glucosa a las clulas Eliminacin de glucosa por el rin Absorcin intestinal de glucosa Paso de glucosa del hgado a la sangre Glucogenlisis GluconeognesisLa determinacin de glucosa es til para el diagnstico y control de diabetes mellitus e hipoglicemiaII.- OBJETIVOS.-Al finalizar la prctica el alumno ser capaz de: - Analizar el metabolismo de carbohidratos para comprender las alteraciones de l os carbohidratos en el organismo - Determinar la concentracin srica de glucosa - Interpretar los resultados obtenidos en la prctica y relacionarlos con patologasIII.- MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.-REACTIVOS- EQUIPOS CANTIDAD MATERIALES CANTIDAD Kit Reactivo de Glicemia 1 Tubos de ensayo 20 EspectrofotmetroGradilla 3 Agua destilada 1 Micro pipetas 3 Bao Mara 1 Marcador de vidrio 2Pipetas de 5 ml 12Pro pipetas 5Cola de zorro 5Puntillas 12Jabn antisptico-detergenteMuestra: Suero de un paciente que no debe haber consumido alimentos durante un p erodo de 8 horas antes de la determinacin, previa suspensin de medicamentos que pueden elevar la glicemia srica como ser: Corticoides, estrgenos, alcohol, fenitona, tiacidas, propanolol.IV.-TCNICA.- (La tcnica puede variar de acuerdo al Kit de Glicemia disponible para la prctica)1. Planificacin de la prctica: Los estudiantes de la prctica se organizarn en grupos de 5 personas. 2. Desarrollo de la prctica: Cada grupo realizar el siguiente procedimiento . Marcar tres tubos de ensayoBlanco Standard desconocido Reactivo de color 2ml 2ml 2mlStandard ***** 20 ul ***** Suero del paciente ***** ***** 20ul Agitar ligeramente e incubar en Bao Mara a 37 C durante 10 minutos al cabo de los c uales se lee en el espectrofotmetro a 505 nm las respectivas absorbanciasTcnica Glicemia enzimtica- WinnerV.- RESULTADOS.-. Determinar la concentracin de glucosa srica mediante la siguiente relacin matemtica:Absorbancia del desconocido [Glucosa] mg/dl= ---------------------------------------x [Standard] Absorbancia del Standard. Registrar e interpretar todos los valores obtenidos durante la prcticaVI.- CONCLUSIONES.-. De acuerdo al resultado obtenido a que conclusiones podramos arribar, explique, el porqu VALORES DE REFERENCIA: 70 a 110mg/dl Niveles de glicemia superiores al normal Diabetes mellitus . . . . Hemocromatosis Sndrome de cushing Acromegalia GigantismoAumento de adrenalina circulante Niveles de glicemia inferiores al normal Alteraciones pancreticas . Tumor . Hiperplasia clulas de los islotes del pncreas Tumores extra pancreticos . Carcinoma gstrico o de la glndula suprarrenal Hepatopatas . Hepatitis, cirrosis. Inyeccin de adrenalina . Estrs- emociones quemaduras, shock, anestesia . Encefalopata de wernick . Lesiones en el sistema nerviosos central- convulsionesEndocrinopatas . Insuficiencia hipofisaria . Enfermedad de Addison . Hipotiroidismo Anomalas peditricas . . . . Prematuridad Lactante de madre diabtica Hipoglicemia cetsica Hipoglicemia espontnea del lactanteEnzimopatas . Enfermedad de Von Gierke . Galactosemia . Intolerancia a la fructosa Defectos del metabolismo de cidos grasos . . . . Dficit de carnitina Defectos de Acil Co A deshidrogenada Desnutricin AlcoholismoVII.- CUESTIONARIO.1. Resuelva casos clnicos planteados por el docente 2. Realice un mapa conceptual de las vas metablicas de la glucosa\\bck1-tq-ntv\Usuarios ADMINISTRATIVOS$\cbayam\Mis documentos\logo.jpg UNIVERSIDAD DEL VALLE SERVICIOS DE LABORATORIO LABORATORIO DE BIOQUMICA I PRACTICA No 13HEMOGLOBINA GLUCOSILADA HbA1c-SEMINARIO I.- CONOCIMIENTO TERICO REQUERIDOLa diabetes Mellitus (DM) es una de las condiciones metablicas con mayor prevalen cia en el mundo y causa importante de morbilidad y de mortalidad, por lo cual, es fundamental investigar mtodos ms sensibles que permitan su diagnstico, pronstico y tratamiento, con el fin de prevenir el surgimi ento de secuelas tales como las angiopatas, nefropatas, retinopatas y complicaciones cardiovasculares. La hemoglobina de los seres humanos est compuesta por tres variedades principales de hemoglobina llamadas: hemoglobina A, hemoglobina A2 y hemoglobina F. La hemoglob ina A es la ms abundante porque representa el 97%. Dentro de esta misma fraccin hay varios grupo s, tambin conocidos como fracciones menores (HbA1a, HbA1b y HbA1c), las cuales se diferencian entre s de acuerdo con la velocidad de movimiento durante el proceso de electroforesis. La hemoglobina glicosilada, conocida tambin, como Hb rpida, es una fraccin de la HbA correspondiente a la entidad molecular N-(1-desoxifructosil) hemoglobina, or iginada por la reaccin entre la glucosa y el grupo amino N-terminal de la cadena de la he moglobina. Su fraccin de sustancia o de masa en sangre, respecto a la hemoglobina, es directamente propor cional a la concentracin de la glucosa y a la duracin de la exposicin de la hemoglobina a la glucosa. La HbA1c es la ms abundante de los componentes menores de la hemoglobina en los e ritrocitos humanos que se forma por unin de la glucosa a la cadena beta de la hemoglobina. Puesto que los glbulos rojos tienen una vida de 120 das, es posible saber de esta forma como han estado sus concentraciones de glucosa durante los ltimos tres meses. La HbA1c revela el control a largo plazo de su glucosa en los ltimos tres meses. Los valores de HbA1cempiezan a reflejar cambios importantes en la dieta y terapia aproximadamente de 3 a 4 semanas despus del cambio. La hemoglobina glicosilada es el tanto por ciento de hemoglobina que se encuentr a unido a la glucosa, alrededor del 5% en condiciones normales. Un valor mayor al 6,5% es diagnstico de diabetes. Cuando se utiliza este valor para el control del paciente diabtico, un resultado mayor a 7% indica que hay que realizar una vigilancia ms estricta de los niveles de glu cosa del paciente, ya que de no ser as podra desarrollar complicaciones como ceguera, fallo renal o neuropata.Valores de referencia:GLUCEMIAS MEDIAS PORCENTAJE DE HbA1c RIESGO DE COMPLICACIONES 60 4 %Riesgo bajo (se considera normal hasta 6,5%) 90 5 % 120 6 % 150 7 % Riesgo moderado (control aceptable hasta 7,5%) 180 8 %Riesgo aumentado210 9 %Se considera mal control a partir de 9,5% 240 10 % Riesgo alto 270 11 %Riesgo critico 300 12 % 330 13 % 360 14 %Al finalizar la prctica el alumno ser capaz de: - Entender la importancia del control de la diabetes a travs de la hemoglobina gl ucosilada\\bck1-tq-ntv\Usuarios ADMINISTRATIVOS$\cbayam\Mis documentos\logo.jpg UNIVERSIDAD DEL VALLE SERVICIOS DE LABORATORIO LABORATORIO DE BIOQUMICA I PRACTICA No 14DETERMINACIN DE FRUCTOSA- SEMINARIO I.- CONOCIMIENTO TERICO REQUERIDOLa glucosa presente en el plasma humano reacciona con diversas protenas formando glucoprotenas estables siendo la principal de ellas la albmina. Esta reacci