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Chapter 7: Summary – Resumen – Samenvatting
Summary
Asthma is a condition that affects the small airways (bronchioles) that are
responsible for carrying air into and out of the lungs. During asthma, the
bronchioles are inflamed and narrowed (Fig. 7.1) due to an excess of mucus
causing clinical symptoms in the patient such as, coughing, wheezing, shortness of
breath, and a tightness of the chest. Although the specific underlying causes of
asthma are still incompletely defined, it has been shown that various genetic
factors can predispose an individual to allergic asthma. Besides genetic factors,
environmental factors, including dust mites, fungi, second-hand smoke,
cockroaches, pets (cats and dogs), air pollution, foods, respiratory infections, and
exercise can initiate an asthma attack, and they are called allergic triggers or
allergens.
The immune system is a complex environment, possessing a variety of elements
able to recognize and attack invading microorganisms. In allergic diseases, the
immune system is subverted by foreign substances, such as the allergens
mentioned above. In allergic asthma, the allergen reaches the airways by
inhalation where it can be ingested by specific cells (antigen-presenting cells;
APCs) that subsequently degrade it into small pieces (peptides), which can then be
exposed on the cell surface and presented to the immune system (Fig. 7.2A). The
immune response is initiated by lymphocytes (Fig. 7.2A), a white blood cell or
leukocyte that is recruited to the airways where it releases proteins called
cytokines. Cytokines act as messengers that deliver signals to a specific receptor
located on the surface of target cells (adjacent cells or distant cells) inducing
intracellular signals that result in specific biological responses including migration,
proliferation, or survival. There is a wide range of cytokines and their receptors,
and they have been grouped according to structural features in three main families:
Chemokine family: these induce migration of cells toward the source of the
chemokine.
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Chapter 7: Summary – Resumen – Samenvatting
Hematopoietin family: it includes growth factors and many Interleukins (IL),
which are cytokines of leukocyte origin and can act on leukocytes.
Tumor necrosis factor (TNF) family: it includes trimeric proteins that are either
attached to the cells or secreted.
During allergic asthma, the main cytokines that play a role in the inflammatory
response are IL-4, IL-5, and IL-13. IL-4 induces the production of immunoglobulin
E (IgE), a specific type of antibody that is generated by exposure to allergens. IgE
can bind receptors on the surface of eosinophils and mast cells (immune effector
cells) (Fig. 7.2A) causing the release of toxic products as well as a variety of
inflammatory mediators including histamine and leukotrienes. These substances
cause contraction of the smooth muscle cells of bronchioles as well as attraction
and accumulation of eosinophils and neutrophils (Fig. 7.2A). IL-13 has been
associated with mucus hyper-secretion in the lung; and IL-5 is capable of inducing
recruitment of eosinophils to the lung as well as maintaining eosinophil survival by
binding specifically to its receptor (Fig. 7.2B).
The eosinophil is a specific type of white blood cell characterized by having a bi-
lobed nucleus and different types of granules, which store various toxic proteins
(Fig. 7.2B). The high content of positively-charged proteins make this cell capable
of binding eosin, a negatively-charged dye of orange-pink color, and for that
reason, the orange cells in a hematoxylin-eosin staining receive the name of
eosinophils. Eosinophils are produced in the bone marrow under the influence of
several cytokines. IL-5 is critical for the production of eosinophils, and as
mentioned above, it is also involved in maintaining their survival and inducing the
release of mature cells into the circulation. The number of eosinophils in healthy
donors is low (1-3% of the white blood cell population) with an estimated half-life of
18 hours in peripheral blood. During parasitic infections, the number of eosinophils
increases, which is essential for remission of the disease since these cells are
responsible of releasing their toxic granule proteins to kill parasites. However, in
absence of parasites, inappropriate release of these granule products are toxic to
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Chapter 7: Summary – Resumen – Samenvatting
tissues causing inflammation and damage, as happens in allergic asthma. In
asthmatic patients, the number of eosinophils in sputum directly correlates with the
severity of the disease, and this parameter has been utilized to measure airway
inflammation together with the measurement of toxic eosinophil proteins in serum
and urine.
In this thesis, we have focused on understanding the mechanisms by which IL-5
induces survival of eosinophils. In Chapter 2 and 3, we have studied the
intracellular signals generated upon binding of IL-5 to its receptor. The IL-5
receptor (IL-5R) is expressed on the cell surface of eosinophils, and it is composed
of an α-chain that specifically binds IL-5 and a β-chain, which is shared with the
receptors for IL-3 and granulocyte–macrophage colony-stimulating factor (GM-
CSF). In the absence of IL-5, there are intracellular changes which eventually
leading to cell death after one to two days. Our results have revealed novel
mechanisms regulating IL-5-dependent survival, which could specifically be
targeted to inhibit eosinophil function therapeutically (Fig 7.2B).
In Chapter 4, we have investigated the effects of a novel IL-5R antagonist peptide
that specifically blocks both IL-5-mediated signaling as well as eosinophil functions
including migration and cell adhesion. This peptide could be considered as a
candidate for the development of novel asthma therapies. In chapter 5, we have
analyzed the use of protein transduction technology, a novel approach to deliver
large biologically active molecules (DNA, peptides, proteins, drugs) into living cells,
which could be utilized to inhibit intracellular signaling in eosinophils, and in that
way eosinophil function.
Currently, oral steroids are the most effective anti-inflammatory drugs available,
and are considered an essential treatment for moderate and severe asthmatics.
However, they only alleviate the symptoms temporally and their continued use
could cause severe side effects. Our work contributes to understanding eosinophil
biology and thus the development of safe antagonists that specifically target IL-5
and eosinophil function. An eosinophil-targeted approach may be useful for the
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Chapter 7: Summary – Resumen – Samenvatting
development of molecules that could be utilized as alternative therapies in the
treatment of asthma and other eosinophil-associated diseases.
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Chapter 7: Summary – Resumen – Samenvatting
Figure 1: Comparison between healthy small airways (bronchioles) and their narrowing due to mucus accumulation and the inflammatory response during asthma Figure 2 A) Representation of cell types involved in the inflammatory responses during asthma. B) The eosinophil is a white blood cell or leukocyte, characterized by having a nucleus with two lobules and many intracellular granules, which store a variety of proteins. On its membrane, it expresses the IL-5R, which is composed of one α-chain and one β-chain. IL-5, a cytokine produced by lymphocytes, binds to the α-chain of the receptor, which consequently becomes activated (1). Activation of IL-5R leads to the generation of specific signals inside the cell, which can be changed if there is not binding of cytokine. These signals determine the response of the cell (2). In presence of IL-5, eosinophils can survive whereas absence of IL-5 induces eosinophil death (3).
B
Antigen-presenting cell
MC
Mast cell
Lymphocyte
Eosinophil Neutrophil
A
α β
Eosinophil membrane
Eosinophil granules
Eosinophil nucleus
Eosinophil membrane
IL-5 receptor
Intracellular signals
Death
IL-5
Outside the cell
Inside the cell
1
2
Eosinophil responses
3
Survival
+ IL-5 - IL-5
α βα β
Eosinophil membrane
Eosinophil granules
Eosinophil nucleus
Eosinophil membrane
IL-5 receptor
Intracellular signals
Death
IL-5
Outside the cell
Inside the cell
1
2
Eosinophil responses
3
Survival
+ IL-5 - IL-5
B
Antigen-presenting cell
MCMC
Mast cell
Lymphocyte
Eosinophil Neutrophil
A
α β
Eosinophil membrane
Eosinophil granules
Eosinophil nucleus
Eosinophil membrane
IL-5 receptor
Intracellular signals
Death
IL-5
Outside the cell
Inside the cell
1
2
Eosinophil responses
3
Survival
+ IL-5 - IL-5
α βα β
Eosinophil membrane
Eosinophil granules
Eosinophil nucleus
Eosinophil membrane
IL-5 receptor
Intracellular signals
Death
IL-5
Outside the cell
Inside the cell
1
2
Eosinophil responses
3
Survival
+ IL-5 - IL-5
Normal airway
Asthma airway
Normal airway
Asthma airway
Normal airway
Asthma airway
Normal airway
Asthma airway
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Chapter 7: Summary – Resumen – Samenvatting
Resumen
El asma es una condición que afecta las vías aéreas pequeñas (bronquiolos), las
cuales están encargadas de la entrada y salida de aire a los pulmones. En el
asma, los broquiolos se encuentran inflamados y con disminución de la luz debido
al exceso de moco (Fig. 7.1) que ocasiona al paciente síntomas clínicos tales
como tos, dificultad para respirar y una sensación de congestión en el pecho.
Aunque las causas del asma no están bien determinadas, se ha demostrado que
factores genéticos pueden predisponer, pero los genes involucrados están aun en
proceso de investigación. Además, factores ambientales tales como el polvo de
ácaros, los hongos, el humo de fumadores, las cucarachas, las mascotas (perros y
gatos), la polución, los alimentos, las infecciones respiratorias y el ejercicio,
pueden inducir un ataque de asma y por lo tanto, han sido denominados
disparadores alérgicos o alergenos.
El sistema inmune posee una variedad de elementos capaces de reconocer y
atacar una sustancia extraña, tales como los alergenos mencionados
anteriormente. El alergeno llega a las vías respiratorias por inhalación y allí puede
ser ingerido por células (células presentadoras de antígeno) que lo destruyen en
partes pequeñas (péptidos), que son expuestas en la superficie de la célula para
presentarlo al sistema inmune (Fig. 7.2A). La respuesta inmune es iniciada por
linfocitos (Fig. 7.2A), una clase de células blancas o leucocitos, que son atraídos
hacia las vías aéreas, en donde secretan pequeñas proteínas llamadas citocinas.
Las citocinas funcionan como mensajeros que llevan señales a receptores
específicos localizados sobre la superficie de las células (adjacentes o distantes) e
inducen señales intracelulares que generan respuestas biológicas específicas
como la migración, la proliferación o la supervivencia celular. Existe una gran
variedad de citocinas, que al igual que sus receptores, han sido agrupadas en tres
familias de acuerdo a sus caracteristicas estructurales:
Familia de las quimiocinas: estas citocinas pueden inducir migración de las
células hacia el orígen de la quimiocina.
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Chapter 7: Summary – Resumen – Samenvatting
Familia de las hematopoyetinas: esta familia incluye factores de
crecimiento y las interleucinas (IL), las cuales son citocinas producidas por
leucocitos y que actúan sobre los leucocitos.
Familia del Factor de necrosis tumoral (TNF): esta familia incluye
proteínas triméricas que están ancladas a la célula o secretadas al medio.
En el asma, las citocinas claves en la respuesta inflamatoria son: IL-4, IL-5 y IL-13.
La IL-4 induce la producción de inmunoglobulina E (IgE), que es un tipo de
anticuerpo específico generado por exposición a alergenos. IgE puede unirse a
receptores sobre la superficie de eosinófilos y mastocitos, (Fig 7.2A) ocasionando
su degranulación y la liberación de productos tóxicos derivados de los gránulos
que contienen las células, al igual que varios mediadores de inflamación como la
histamina y los leucotrienos. Estas sustancias causan contracción de las células
musculares de los bronquiolos y acumulación de eosinófilos y neutrófilos (Fig
7.2A). La IL-13 se ha asociado con la excesiva producción de moco; y la IL-5 es
capáz de atraer eosinófilos hacia el pulmón y mantener su supervivencia cuando
se une específicamente a su receptor.
El eosinófilo es un tipo específico de célula blanca caracterizado por tener un
núcleo bilobulado y diferentes clases de gránulos, los cuales almacenan proteínas
tóxicas (Fig. 7.2B). El alto contenido de proteínas cargadas positivamente hacen
que ésta célula sea capaz de unirse a la eosina, una coloración cargada
negativamente y de color naranja-rosado, razón por la cual, las células naranja en
una coloración de hematoxilina-eosina reciben el nombre de eosinófilos. Los
eosinófilos son producidos en la médula ósea bajo la influencia de varias citocinas.
IL-5 juega un papel crítico en la producción de eosinófilos, y como se mencionó
anteriormente, está también encargada de su supervivencia y de inducir la salida
de células maduras a la circulación. El número de eosinófilos en personas sanas
es bajo (1-3% de la población de células blancas) con una vida media de unas 18
horas en sangre periférica. En infecciones parasitarias, el número de eosinófilos
aumenta, lo cual es esencial para la remisión de la enfermedad dado que estas
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Chapter 7: Summary – Resumen – Samenvatting
células son responsables de liberar los productos tóxicos de sus gránulos para
matar los parásitos. Sin embargo, cuando no hay parásitos, hay una secreción
inapropiada de estos productos que son tóxicos para los tejidos causando
inflamación y daño tisular, como sucede en el asma alérgica. En los pacientes
asmáticos el número de eosinófilos en esputo se correlaciona directamente con la
severidad de la enfermedad, y este parámetro ha sido utilizado para medir
inflamación de las vías aéreas, al igual que la medición de proteínas granulares
del eosinófilo en suero y orina.
Esta tésis está especialmente enfocada a entender los mecanismos por los cuales
la IL-5 induce la supervivencia de los eosinófilos. En los capitulos 2 y 3, se han
estudiado las señales intracelulares generadas por la unión de la IL-5 a su
receptor. El receptor de IL-5 (IL-5R) está expresado sobre la superficie de los
eosinófilos, y está compuesto por una cadena α que se une específicamente a la
IL-5 y una cadena β, la cual es también utilizada por los receptores de otras
citocinas: la IL-3 y el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrofagos
(GM-CSF). En ausencia de IL-5 se producen cambios en la señales intracelulares
que causan muerte celular. Nuestros resultados muestran nuevos mecanismos
que regulan la supervivencia dependiente de IL-5, los cuales pueden ser utilizados
para inhibir el funcionamiento de los eosinófilos. (Fig. 7.2B).
En el capítulo 4 investigamos los efectos de un péptido que funciona como
antagonista del IL-5R. Este péptido se une específicamente a la cadena α del
receptor e inhibe las señales inducidas por la IL-5 al igual que funciones de los
eosinófilos tales como migración y adhesión. Este péptido puede ser considerado
como un candidato en el desarrollo de nuevas terapias contra el asma. En el
capítulo 5 analizamos el uso de la transducción de proteínas, una tecnología que
ha sido descrita recientemente y que consiste en depositar moléculas
biológicamente activas (ADN, péptidos, proteinas, drogas) dentro de células vivas.
Esta técnica podría ser utilizada para inhibir señales intracelulares en los
eosinófilos y así, inhibir su función.
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Chapter 7: Summary – Resumen – Samenvatting
Actualmente, los esteroides orales son las drogas anti-inflamatorias más efectivas
que están disponibles y son consideradas esenciales en el tratamiento del asma
moderada y severa. Sin embargo, estos medicamentos solo alivian los síntomas
temporalmente y su continuo uso puede causar efectos colaterales. Nuestro
trabajo contribuye al desarrollo de antagonistas seguros específicamente dirigidos
para bloquear la IL-5 y la función de los eosinófilos, lo cual puede ser utilizado en
el desarrollo de terapias alternativas para el tratamiento no solo del asma sino
también de otras enfermedades asociadas con eosinófilos.
Samevatting
Het begrijpen van de moleculaire mechanismen die de eosinofielen productie en
functie reguleren is essentieel voor de ontwikkeling van moleculen die mogelijk
kunnen worden ingezet in de behandeling van astma en andere eosinofiel-
geassocieerde ziektes. We hebben de mechanismen waarin IL-5 de celoverleving
van eosinofielen reguleert onderzocht, en hebben kritische mediatoren
geindentificeerd en een nieuw mechanismen gevonden die gebruikt kunnen
worden als therapeutische targets om eosinofiel functie te blokkeren. We hebben
ook het effect van een nieuw IL-5R antagonist peptide bestudeerd en vonden dat
het specifiek de IL-5 signaaltransductie routes blokkeert en eosinofiel functies,
waaronder chemotaxis en celadhesie, remt. Verder hebben we ook het gebruik van
eiwittransductie domeinen (PTD) geanalyseerd om eiwitten af te geven die de
eosinofiel intracellulaire signalen en daarmee eosinofiel functie kunnen blokkeren.
Dit werk draagt bij aan de ontwikkeling van veilige antagonisten die specifiek IL-5
en eosinofiel functie treffen. Alternatieve therapieën zijn nodig voor de behandeling
van astmatische reacties omdat het continue gebruik van orale steroïden serieuze
bijwerkingen kunnen hebben.
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Chapter 7: Summary – Resumen – Samenvatting
Figura 1: Comparación entre vías aéreas normales (bronquiolos) y su angostamiento debido a la acumulación de moco y la respuesta inflamatoria en el asma. Figura 2 A)Representación de los tipos de células involucradas en la respuesta inflamatoria en el asma. B) El eosinófilo es una célula blanca o leucocito caracterizado por tener un núcleo con dos lóbulos y muchos gránulos intracelulares que almacenan diversas proteínas. En su membrana se encuentra el receptor para IL-5 (IL-5R), el cual está compuesto por una cadena α y una cadena β. IL-5, una citocina producida por linfocitos, se une a la cadena α del receptor e induce su activación (1) La activación de IL-5R genera señales específicas dentro de la célula, la cuales pueden cambiar si la citocina no se une a su receptor. Estas señales determinan las respuesta de la célula (2). En presencia de IL-5, los eosinófilos pueden sobrevivir mientras que la ausencia de IL-5 induce muerte de los eosinófilos (3).
B
Célula presentadora deantígeno
MC
Mastocito
Linfocito
Eosinófilo Neutrófilo
A
α β
Membrana celular
Gránulos del Eosinófilo
Núcleo del Eosinófilo
Membranadel
Eosinófilo
Receptor de IL-5
Señales intracelulares
Muerte
IL-5
Exterior de la célula
Interior de lacélula
1
2
Respuestas del Eosinófilo
3
Supervivencia
+ IL-5 - IL-5
α βα β
Membrana celular
Gránulos del Eosinófilo
Núcleo del Eosinófilo
Membranadel
Eosinófilo
Receptor de IL-5
Señales intracelulares
Muerte
IL-5
Exterior de la célula
Interior de lacélula
1
2
Respuestas del Eosinófilo
3
Supervivencia
+ IL-5 - IL-5
B
Célula presentadora deantígeno
MC
Mastocito
Linfocito
Eosinófilo Neutrófilo
A
Célula presentadora deantígeno
MC
Mastocito
Linfocito
Eosinófilo Neutrófilo
A
α β
Membrana celular
Gránulos del Eosinófilo
Núcleo del Eosinófilo
Membranadel
Eosinófilo
Receptor de IL-5
Señales intracelulares
Muerte
IL-5
Exterior de la célula
Interior de lacélula
1
2
Respuestas del Eosinófilo
3
Supervivencia
+ IL-5 - IL-5
α βα β
Membrana celular
Gránulos del Eosinófilo
Núcleo del Eosinófilo
Membranadel
Eosinófilo
Receptor de IL-5
Señales intracelulares
Muerte
IL-5
Exterior de la célula
Interior de lacélula
1
2
Respuestas del Eosinófilo
3
Supervivencia
+ IL-5 - IL-5
Vía aéreanormal
Vía aéreaen el asma
Vía aéreanormal
Vía aéreaen el asma
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