Actividad inmunomoduladora del extracto de metanol de la cabeza

Ars Pharmaceutica, 45:3; 281-291, 2004

281ACTIVIDAD INMUNOMODULADORA DEL EXTRACTO DE METANOL DE LA CABEZA FLORAL...

Actividad inmunomoduladora del extractode metanol de la cabeza floral de Sphaeranthus

indicus LinnImmunomodulatory activity of methanol extract of flower-heads of

Sphaeranthus indicus Linn

BAFNA AR, AND MISHRA SH.*

Pharmacy Department, Faculty of Technology and Engineering,The M.S.University of Baroda,Vadodara-390002,Gujarat, India

*Dirección para correspondencia: Dr.S.H.Mishra, Pharmacy department, Faculty of Technology and Engineering,The M.S.University of Baroda, Vadodara-390002. Gujarat, India.

Correo electrónico:[email protected]

RESUMEN

El extracto de metanol y sus fracciones de éter de petróleo, cloroformo y metanol sobrante de las cabezas floralesde Sphaeranthus indicus Linn demostraron su eficacia al aumentar la actividad fagocítica, el título de anticuerposde la hemaglutinación y la hipersensibilidad de tipo retardado, mientras que sólo la fracción de metanol restanteresultó activa en la normalización de los niveles de leucocitos totales en el caso de la mielosupresión inducida porciclofosfamida en ratones. Por tanto, el presente estudio revela que el fármaco augura buenos resultados como agenteinmunomodulador, al actuar como estimulante de la inmunidad celular y humoral y de la función fagocítica.PALABRAS CLAVE: Sphaeranthus indicus. Actividad inmunomoduladora. Hemaglutinación. Mielosupresión.

ABSTRACT

Methanol extract, its petroleum ether, chloroform and remaining methanol fractions, of flower heads of Sphaeranthusindicus Linn. were found effective in increasing phagocytic activity, haemagglutination antibody titer and delayed typehypersensitivity, whereas only remaining methanol fraction was found active in normalizing total WBC levels in caseof cyclophosphamide induced myelosuppression in mice. Present study, therefore, reveals that the drug holds promiseas immunomodulatory agent, which acts by stimulating both humoral as well as cellular immunity and phagocyticfunction.KEY WORDS: Sphaeranthus indicus. Immunomodulatory activity. Haemagglutination. Myelosuppression.

INTRODUCTION

Herbal drugs are known to possess immuno-modulatory properties and generally act by sti-mulating both specific and non-specific immuni-ty1. Many plants used in traditional medicine arereported to have immunomodulating activities.Some of these stimulate both humoral and cellmediated immunity while others activate onlythe cellular components of the immune system,i.e. phagocytic function without affecting the

INTRODUCCIÓN

Los fármacos herbales son conocidos por suspropiedades inmunomoduladoras y por estimu-lar de forma generalizada la inmunidad específi-ca y no específica1. Muchas de las plantas utili-zadas en la medicina tradicional han demostradoposeer actividades inmunomoduladoras. Algunasde estas plantas estimulan tanto la inmunidadcelular como la inmunidad humoral, mientras queotras sólo activan los componentes celulares del

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BAFNA AR, MISHRA SH.

humoral or cell mediated immunity. Leaf extractof Picrorrhiza kurroa stimulated the humoralresponse and the phagocytic function of the re-ticuloendothelial system. Some of these plantsalso suppress both humoral and cell mediatedimmunity 2,3.

About 34 plants are identified as rasayanasin Indian Ayurvedic system of medicine havingvarious pharmacological properties such as im-munostimulant, tonic, neurostimulant, antiageing,antibacterial, antiviral, antirheumatic, anticancer,adaptogenic, antistress etc.4. An entire section ofmateria medica of Ayurveda is devoted to drugsentitled as ‘Rasayana’ used for enhancement ofbody resistance5. Many plants with potentialimmunomodulatory activity are reported, someof these have already been undertaken for eva-luation of their activities in animals, and also tosome extent in humans. Some glaring exampleswith promising activity are Asparagus racemo-sus, Azadirachta indica, Curcuma longa, Oci-mum sanctum, Panax ginseng, Picrorrhiza ku-rroa, Tinospora cordifolia, Withania somniferaetc. A lot more are still to be explored and offerscope for further investigation4.

Sphaeranthus indicus Linn. (Compositae) is aherb found mostly in southern part of India usedas bitter stomachic, stimulant, alterative, pecto-ral and demulcent, and externally emollient.Distilled water prepared like rose water from theherb is recommended by local physicians forbilious affections and for dispersions of variouskinds of tumours. Flowers (flower heads) arehighly esteemed as alteratives, depuratives, re-frigerants and tonics, useful as blood purifiers inskin diseases. The drug is also useful in urethraldischarges and in jaundice6. The present investi-gation was aimed to study the immunomodula-tory activity of methanol extract of flower headsof S.indicus and its different fractions using re-ported methods in order to justify the traditionalclaims endowed upon the drug as rasayana.

MATERIALS AND METHODS

Animals: Swiss albino mice of either sex,weighing 20-25 gms, household in standard con-ditions of temperature, humidity and light wereused. They were fed with standard rodent dietand water ad libitum.

sistema inmunitario, es decir, la función fagocí-tica sin afectar a la inmunidad celular o humo-ral. El extracto de hoja de Picrorhiza kurroa actúacomo estimulante de la respuesta humoral y dela función fagocítica del sistema reticuloendote-lial. Algunas de estas plantas también actúan comosupresores de la inmunidad celular y humoral 2,3.

Aproximadamente unas 34 plantas se identi-fican como rasayanas en el sistema de medicinaAyurvedic de la India y presentan diversas pro-piedades farmacológicas inmunoestimulantes,tónicas, neuroestimulantes, anti-envejecimiento,antibacterianas, antivirales, antireumáticas, anti-cancerígenas, adaptogénicas, antiestrés, etc.4 Lamateria médica ayurvédica dedica una seccióncompleta a los fármacos utilizados para mejorarla resistencia corporal titulada ‘Rasayana’. Seidentificaron diversas plantas con actividad in-munomoduladora potencial, entre las que se en-contraban algunas con las que ya se había em-prendido la evaluación de sus actividades enanimales y, en cierta medida, en humanos. Aspa-ragus racemosus, Azadirachta indica, Curcumalonga, Ocimum sanctum, Panax ginseng, Picro-rrhiza kurroa, Tinospora cordifolia, Withaniasomnifera etc. son algunos ejemplos evidentesde plantas con una actividad prometedora. Aúnquedan por investigar muchas más, lo que am-plía las posibilidades para futuras investigacio-nes4.

Sphaeranthus indicus Linn. (Compositae) esuna hierba que se encuentra principalmente en elsur de la India que posee propiedades antiulce-rosas, estomacales, estimulantes, curativas, pec-torales, demulcentes y emolientes de forma ex-terna. Los médicos locales recomiendan el aguadestilada preparada como el agua de rosas pro-cedente de la hierba para las afecciones biliaresy la diseminación de varios tipos de tumores.Las flores (la cabeza floral) son muy apreciadaspor sus propiedades curativas, depurativas, fe-brífugas y tónicas, muy útiles como purificado-ras de la sangre en patologías dérmicas. El fár-maco es también muy útil para combatir la ictericiay las secreciones uretrales. La presente investi-gación se realizó con el propósito de estudiar laactividad inmunomoduladora del extracto demetanol de las cabezas florales de S.indicus ysus distintas fracciones mediante los métodosestablecidos para justificar las indicaciones tradi-cionales legadas por el fármaco como rasayana.


283IMMUNOMODULATORY ACTIVITY OF METHANOL EXTRACT OF FLOWER-HEADS OF...

Plant material and extract preparation: Freshflower heads of S.indicus were collected fromthe outfield of city, and were authenticated inBotany Department of M.S.University, Baroda.Maceration of air-dried, powdered flower headsof S.indicus afforded 6.65% methanol extract (w/w). Methanol extract so obtained was then frac-tionated by maceration into different polaritysolvents like petroleum ether, benzene, chloro-form and methanol. All respective fractions wereconcentrated under vacuum and used for phyto-chemical and pharmacological screening. Methanolextract gave positive tests for alkaloids, pheno-lics, steroids, terpenoids and carbohydrates. Pe-troleum ether, benzene and chloroform fractionsgave positive tests for terpenoids and steroidswhereas methanol fraction gave positive tests foralkaloids, phenolics and carbohydrates on phyto-chemical screening7.

Test samples: Weighed quantities of testextracts were suspended in 1% sodium carboxymethylcellulose to prepare suitable dosage form.The control animals were given an equivalentvolume of sodium carboxy methylcellulose ve-hicle. Cyclophosphamide was used as a standardimmunosuppressant.

Carbon ink suspension: Pelican AG, Germany,ink was diluted eight times with saline and usedfor carbon clearance test in a dose of 10µl/gmbody weight of mice.

Sheep red blood cells (SRBCs) were washedwith three times in normal saline and adjusted toa concentration 20% for immunization and 1%for challenge as Antigen.

METHODS

Phagocytic activity

Phagocytic index was determined as per themethod reported by Gonda et al.8 Mice weredivided into 11 groups, of six animals each. Thecontrol group received 1.0 % sodium carboxymethylcellulose solution only as vehicle; whileanimals of the treatment groups were given testextracts (100 and 200 mg/kg, p.o.) in 1.0 % sodiumcarboxy methyl cellulose daily for 5 days. Car-bon ink suspension was injected via tail vein toeach mouse after 48 hours of 5 days treatment.Blood samples were drawn from orbital vein at

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales: Ratones albinos suizos de ambossexos, con un peso de entre 20 y 25 g., mante-nidos en condiciones estándar de temperatura,humedad y luz. Fueron alimentados con una die-ta estándar de roedor y agua ad libitum.

Material de la planta y preparación delextracto: Se recogieron cabezas florales frescasde S.indicus procedentes de los jardines de laciudad y se autenticaron en el Departamento debotánica de la M.S.University, Baroda. La ma-ceración de las cabezas florales disecadas al airede S.indicus proporcionó un 6,65% de extractode metanol (w/w). El extracto de metanol obte-nido de este modo se fraccionó por maceraciónen disolventes de distintas polaridades como eléter de petróleo, el benceno, el cloroformo y elmetanol. Todas sus respectivas fracciones seconcentraron al vacío y se utilizaron para el cri-bado farmacológico y fitoquímico. El extractode metanol resultó positivo en las pruebas dealcaloides, felónicos, esteroides, terpenoides ycarbohidratos. Las fracciones de cloroformo,benceno y éter de petróleo resultaron positivasen las pruebas de terpenoides y esteroides, mien-tras que la fracción de metanol resultó positivaen las pruebas de alcaloides, felónicos y carbo-hidratos en el cribado fitoquímico7.

Muestras de prueba: Las cantidades pesa-das de los extractos de prueba se suspendieronen un 1% de carboximetilcelulosa de sodio parapreparar las formas de dosificación adecuadas.A los animales controlados se les proporcionóun volumen equivalente de carboximetilcelulosade sodio como vehículo. La ciclofosfamida seutilizó como inmunosupresor estándar.

Suspensión de tinta de carbón: Se diluyó tintaPelican AG, Germany ocho veces con soluciónsalina y se utilizó para la prueba de depuracióndel carbón en una dosis de 10µl/gm de pesocorporal de los ratones.

Los eritrocitos de cordero se lavaron tres vecesen solución salina normal y se ajustaron a unaconcentración del 20% para la inmunización ydel 1% para la prueba como antígeno.

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0 and 15min. Blood (25-µl) was mixed with 0.1% sodium carbonate (2 ml) and subjected fordetermination optical densities at 660 nm.

The phagocytic index K, was calculated byusing following equation:

K= (In OD1-In OD2) / (t2-t1)where OD1 and OD2 are the optical densities

at times t1 and t2, respectively.

Cyclophosphamide induced Myelosuppression

Cyclophosphamide induced myelosuppressionwas studied according to the method describedby Manjarekar et al.9 Animals were divided into12 groups of six animals each. The control groupand cyclophosphamide group received 1.0 %sodium carboxy methylcellulose solution only asvehicle daily for 13 days while animals in treat-ment groups were given the test extracts (100and 200 mg/kg, p.o.) in 1.0 % sodium carboxymethyl cellulose daily for 13 days. On days 11,12, 13 all the animals except in the control groupwere injected with cyclophosphamide (30mg/kg,i.p.) 1 hour after administration of the extracts.Blood samples were collected on day 14 and totalwhite blood cell (WBC) count was determined.

Humoral antibody (HA) titre and delayed typehypersensitivity (DTH) response:

The method described by Puri et al.10 wasadopted. Animals were divided into 11 groupsof six animals each. The control group received1.0 % sodium carboxy methylcellulose solutiononly as vehicle; while animals in the treatmentgroups were given the test extracts (100 and 200mg/kg, p.o.) in 1.0 % sodium carboxy methylcellulose daily for 7 days. The animals wereimmunized by injecting 0.1 ml of 20% of freshsheep red blood cells suspension intraperitonea-lly on 0 day. Blood samples were collected inmicro centrifuge tubes from individual animalby retro-orbital plexus on 7th day to obtain serum.Antibody levels were determined by haemagglu-tination technique. Briefly, equal volumes ofindividual serum samples of each group werepooled. Two fold dilutions of pooled serum sam-ples were made in 25 µl volumes of normal sa-line in microtitration plate and to it added 25 µlof 1% suspension of sheep red blood cells in

MÉTODOS

Actividad fagocítica

El índice fagocítico se determinó mediante elmétodo establecido por Gonda et al.8 Los rato-nes se dividieron en 11 grupos con seis animalescada uno. El grupo de control sólo recibió un1,0% de solución de carboximetilcelulosa de sodiocomo vehículo, mientras que a los animales delos grupos de tratamiento se les administraronlos extractos de prueba (100 y 200 mg/kg, víaoral) en un 1,0% de caborximetilcelulosa de sodiodiariamente durante 5 días. A cada ratón se leinyectó la suspensión de tinta de carbón a travésde la vena de la cola 48 horas después del tra-tamiento de 5 días. Se extrajeron muestras desangre de la vena orbital a los 0 y 15 minutos.La sangre (25-µl) se mezcló con un 0,1% decarbonato sódico (2 ml) y se sometió a la deter-minación de densidades ópticas a 660 nm.

El índice fagocítico (K) se calculó mediantela siguiente ecuación:

K= (In OD1-In OD2) / (t2-t1)donde OD1 y OD2 son las densidades ópticas

en los momentos t1 and t

2, respectivamente.

Mielosupresión inducida por ciclofosfamida

La mielosupresión inducida por ciclofosfami-da se estudió de acuerdo con el método descritopor Manjarekar et al.9 Los animales se dividie-ron en 12 grupos de seis animales cada uno. Elgrupo de control y el grupo de la ciclofosfamidarecibieron un 1,0% de solución de carboximetil-celulosa de sodio sólo como vehículo diariamen-te durante 13 días, mientras que a los animalesde los grupos de tratamiento se les administra-ron los extractos de prueba (100 y 200 mg/kg,vía oral) en un 1,0% de caborximetilcelulosa desodio diariamente durante 13 días. Los días 11,12 y 13, a todos los animales excepto a los delgrupo de control se les inyectó ciclofosfamida(30 mg/kg, intraperitoneal) 1 hora después de laadministración de los extractos. Las muestras desangre se extrajeron el día 14 y se determinó elrecuento de leucocitos totales.



saline. After mixing, the plates were incubatedat room temperature for 1 hr. and examined forhaemagglutination under microscope. The reci-procal of the highest dilution of the test serumgiving agglutination was taken as the antibodytitre.

On 7th day, the thickness of the right hindfootpad was measured using digital vernier cali-per. The mice were then challenged by injectionof 20µl of 1% SRBCs in right hind footpad. Footthickness was again measured after 24 hrs ofthis challenge. The difference between the preand post challenge foot thickness express in mmwas taken as a measure of delayed type hyper-sensitivity (DTH).

Statistical analysis

Data are expressed as the mean ± S.E.M. andstatistical analysis was carried out employingStudent’s t-test.

RESULTS

Carbon clearance test

Methanol extract of S.indicus and its fractio-ns in different solvents possess macrophage sti-mulatory activity as evidenced by increased pha-gocytic index in carbon clearance test. Thephagocytic activity of reticuloendothelial is ge-nerally measured by the rate of removal of car-bon particles from blood stream. The phagocyticindex for control group was found to be 0.094 ±0.0065 whereas all test extracts of S.indicus in-creased it significantly. The maximum effect wasfound in case of methanol extract and its petro-leum ether and remaining methanol fractions(P<0.001) (Table 1).

Título de anticuerpos humorales y la respuestade la hipersensibilidad de tipo retardado (DTH):

Se adoptó el método descrito por Puri et al.10

Los animales se dividieron en 11 grupos de seisanimales cada uno. El grupo de control recibióun 1,0% de solución de carboximetilcelulosa desodio sólo como vehículo, mientras que a losanimales de los grupos de tratamiento se lesadministraron los extractos de prueba (100 y 200mg/kg, vía oral) en un 1,0% de caborximetilce-lulosa de sodio diariamente durante 7 días. Eldía 0, los animales fueron inmunizados median-te la inyección intraperitoneal de 0,1 ml de sus-pensión fresca de eritrocitos de cordero al 20%.Las muestras de sangre se extrajeron en tubosmicrocentrífugos a cada animal de forma indivi-dual del plexo retroorbital el día 7 para la obten-ción de suero. Los niveles de anticuerpos sedeterminaron mediante la técnica de hemagluti-nación. En síntesis, se obtuvo el mismo volumende suero de las muestras individuales de cadagrupo. Las diluciones de factor dos de las mues-tras de suero mezclado se realizaron en volúme-nes de 25 µl de solución salina normal en placasde microtítulo y a las que se añadieron 25 µl desuspensión de eritrocitos de cordero en soluciónsalina al 1%.

Una vez realizada la mezcla, las placas seincubaron a temperatura ambiente durante 1 horay se examinaron bajo el microscopio en buscade hemaglutinación. Se tomó como título deanticuerpos la muestra recíproca de la diluciónmás alta de los sueros de prueba que resultópositiva en aglutinación. El día 7, se midió elgrosor de la pata trasera derecha mediante elcalibrador digital Vernier. A continuación, seinyectó a los ratones 20µl de eritrocitos de cor-dero al 1% en la pata trasera derecha. Se midióde nuevo el grosor de la pata pasadas 24 horas.La diferencia entre el grosor de la pata antes ydespués de la inyección expresada en mm se tomócomo medida de hipersensibilidad de tipo retar-dado (DTH).

Análisis estadístico

Los datos se expresaron como la media ± delanálisis S.E.M. y el análisis estadístico se reali-zó con el empleo de pruebas t de estudiantes.

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RESULTADOS

Prueba de depuración del carbón

El extracto de metanol de S.indicus y sus frac-ciones en distintos disolventes poseen actividadestimuladora macrófaga como demostró el au-mento del índice fagocítico en la prueba de de-puración del carbón. La actividad fagocítica delsistema reticuloendotelial generalmente se mi-dió en relación con la velocidad de eliminaciónde las partículas de carbón del flujo sanguíneo.El índice fagocítico del grupo de control fue de0,094 ± 0,0065, mientras que en todos los ex-tractos de prueba de S.indicus aumentó de formasignificativa. El máximo efecto se encontró enel caso del extracto de metanol y la fracción deéter de petróleo y la fracción de metanol sobran-te (P<0,001) (Tabla 1).

TABLE I: Effect of methanol extract and its different Fractions on HA titre, DTH response,phagocytic index and cyclophosphamide induced myelosuppression.

TABLA I: Efecto del extracto de metanol y sus distintas fracciones cromatográficas sobre el título de anticueroshumorales, la respuesta DTH, el índice fagocítico y la mielosupresión inducida por ciclofosfamida.

Los valores se expresan como la media ± del análisis S.E.M. n=6; a = p<0,05, b = p<0,001, d = N.S. (No significativo).Todos los grupos de tratamiento se compararon con el grupo de control para el título de anticuerpos humorales, la respuesta DTH y elíndice fagocítico, y se compararon con el grupo de la ciclofosfamida en el caso de la mielosupresión inducida por la ciclofosfamida.

Values are expressed as mean ± S.E.M. n=6; a = p<0,05, b = p<0,001, d = N.S. (Non Significant).All treated groups are compared with control for HA titre, DTH response and phagocytic index, whereas with cyclophosphamide groupin case of cyclophosphamide induced myelosuppression.

Tratamiento Treatment

Dosis Dose

mg/kg

Título de anticuerpos humorales

Media ± análisis S.E.M. HA titre

Mean ± S.E.M.

Respuesta DTH (mm) Media edema de la pata ±

análisis S.E.M. DTH response (mm)

Mean paw edema ± S.E.M.

Índice fagocítico Media ± análisis S.E.M.

Phagocytic index Mean ± S.E.M.

Recuento de leucocitos totales Media ± análisis S.E.M.

Total WBC count Mean ± S.E.M.

Control - 64,00 ± 14,311 0,313 ± 0,038 0,0943±0,006 5800±99,16

Ciclofosfamida Cyclophosphamide

30 - - - 2142±248,1

100 682,7±107,9 c 0,590 ± 0,054 c 0,150±0,008c 4191±214,6 c Extracto de metanol Methanol extract 200 405,3±69,46 c 0,576 ± 0,084 c 0,126±0,005 c 4300±1544 c

100 256,0±57,24 c 0,470 ± 0,050 c 0,151±0,005 c 3483±222,4b Fracción de éter de petróleo Petroleum ether fraction

200 298,7±71,39 c 0,510 ± 0,037 c 0,167±0,004 c 3625±197,8 c

100 170,7±75,12 d 0,275 ± 0,033N.S. 0,125±0,002 c 2650±172,7d Fracción de benceno Benzene fraction 200 138,7±25,69 a 0,246 ± 0,062

N.S. 0,123±0,005 c 3058±157,3a 100 277,3±76,92 a 0,521 ± 0,022 c 0,123±0,003 c 2868±101,4 a Fracción de cloroformo

Chloroform fraction 200 160,0±32,00 a 0,332 ± 0,059 N.S. 0,139±0,005 c 3100±96,61 a

100 341,3±78,67 c 0,670 ± 0,050 c 0,165±0,004 c 5275±453,1 c Fracción de metanol Methanol fraction 200 426,7±53,97 c 0,810 ± 0,037 c 0,162±0,004 c 6083±568,9 c



Cyclophosphamide induced myelosuppression

Administration of cyclophosphamide has sig-nificantly lowered the levels of total WBC (2142± 248.08) as compared to control group (5800 ±99.16) in blood. Methanol extract and remainingmethanol fraction were found potent in protec-ting cyclophosphamide-induced myelosuppressionas evidenced by increasing the levels of totalWBC count significantly (p< 0.001). Petroleumether and chloroform fraction also raised WBClevels but could not reach up to the normal va-lues. Remaining methanol fraction of methanolextract was the only fraction that increased thetotal WBC count up to the normal values in adose dependent manner (5275 ± 453.1 and 6083± 568.9 at 100 and 200 mg/kg respectively).

Humoral antibody (HA) titre and delayed typehypersensitivity (DTH) response

Humoral response to SRBCs was checked byhaemagglutination antibody titre. The humoralantibody titre value in control was found to be64.00 ± 14.31. Administration of methanol ex-tract and its fractions produced increase in hu-moral antibody titre as evident by haemaggluti-nation at that dilution. Statistically significantlevels were obtained with methanol extract andits petroleum ether, chloroform and remainingmethanol fraction at both the dose level. Thedose dependent increase was established only withpetroleum ether (256 ± 57.24 and 298.7 ± 71.39)and methanol fraction (341.3 ± 78.67 and 426.7± 53.97). Methanol extract (682.7 ± 107.9 and405.3 ± 69.46) and chloroform fraction (277.3 ±76.92 and 160 ± 32) showed decrease in levelsat higher dose.

DTH response was checked by increased foo-tpad thickness using digital vernier calipers.Administration of methanol extract and its frac-tions produced increase in thickness of footpadof mice as a measure of DTH response. Statisti-cally significant (p<0.001) increase in DTH res-ponse in dose dependent manner by remainingmethanol fraction (0.670 ± 0.050 and 0.810 ±0.037) and petroleum ether fraction (0.470 ± 0.050and 0.510 ± 0.037) obtained. Benzene fractionslightly reduced the DTH response by reducingthickness of footpad compared to control group.Methanol extract and chloroform fraction also

Mielosupresión inducida por ciclofosfamida

La administración de ciclofosfamida provocóel descenso significativo de los niveles de leuco-citos totales en sangre (2142 ± 248,08) en com-paración con el grupo de control (5800 ± 99,16).El extracto de metanol y la fracción de metanolsobrante resultaron ser unos potentes protectoresde la mielosupresión inducida por ciclofosfami-da como evidenció el aumento significativo delos niveles del recuento de leucocitos totales (p<0,001). Las fracciones de éter de petróleo y clo-roformo también aumentaron los niveles de leu-cocitos pero no pudieron alcanzar los valoresnormales. La fracción de metanol sobrante delextracto de metanol fue la única fracción queaumentó el recuento de leucocitos totales hastavalores normales de una forma dosis-dependien-te (5275 ± 453,1 y 6083 ± 568,9 para 100 y 200mg/kg respectivamente).

Título de anticuerpos humorales y la respuestade la hipersensibilidad de tipo retardado (DTH)

La respuesta humoral ante los eritrocitos decordero se comprobó mediante el título de anti-cuerpos de la hemaglutinación. El valor del títu-lo de anticuerpos humorales del grupo de con-trol fue 64,00 ± 14,31. La administración delextracto de metanol y sus fracciones produjo unaumento del título de anticuerpos humorales comoevidenció la hemaglutinación en esta dilución.Se obtuvieron niveles estadísticamente signifi-cativos con el extracto de metanol y sus fraccio-nes de éter de petróleo, cloroformo y metanolsobrante en ambas dosis. El aumento dosis-de-pendiente sólo se estableció con la fracción deéter de petróleo (256 ± 57,24 y 298,7 ± 71,39)y la fracción de metanol (341,3 ± 78,67 y 426,7± 53,97). El extracto de metanol (682,7 ± 107,9y 405,3 ± 69,46) y la fracción de cloroformo(277,3 ± 76,92 y 160 ± 32) mostraron un des-censo de los niveles a dosis más altas.

La respuesta DTH se comprobó por el au-mento del grosor de la pata mediante el calibra-dor digital Vernier. La administración del ex-tracto de metanol y sus fracciones produjo unaumento del grosor de la pata de los ratones,hecho que se tomó como medida de la respuestaDTH. Se obtuvo un aumento estadísticamentesignificativo (p<0,001) de la respuesta DTH en

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la forma dosis-dependiente con la fracción demetanol sobrante (0,670 ± 0,050 y 0,810 ± 0,037)y la fracción de éter de petróleo (0,470 ± 0,050y 0,510 ± 0,037). La fracción de benceno redujolevemente la respuesta DTH al reducir el grosorde la pata en comparación con el grupo de con-trol. El extracto de metanol y la fracción de clo-roformo también mostraron un aumento de larespuesta DTH en comparación con el grupo decontrol.

DISCUSIÓN

Se estudió la actividad inmunomoduladora deS.indicus mediante la evaluación de su efecto enel título de anticuerpos, la respuesta DTH, lafunción fagocítica y la mielosupresión inducidapor ciclofosfamida en ratones. La administracióndel extracto de metanol y sus fracciones mostróactividad inmunoestimuladora. Se obtuvo unaestimulación significativa con respecto a estosparámetros con el extracto de metanol, la frac-ción de éter de petróleo y la fracción de metanolsobrante, mientras que las fracciones de cloro-formo y benceno mostraron cambios poco signi-ficativos. El aumento en el índice de depuracióndel carbón reflejó la mejora de la función fago-cítica de macrófagos mononucleares y de la in-munidad no específica. La fagocitosis de losmacrófagos es importante frente a los parásitosde menor tamaño y su efectividad mejora nota-blemente gracias a la opsonización de los pará-sitos mediante los anticuerpos y el complementoC3b que es el encargado de una depuración másrápida de los parásitos de la sangre11. La produc-ción de anticuerpos frente a los eritrocitos decordero (SRBC, antígeno T-dependiente) requie-re la cooperación de los macrófagos y los linfo-citos B12. Los resultados obtenidos durante lapresente investigación mostraron un aumento enla producción de anticuerpos en respuesta a loseritrocitos de cordero.

La respuesta DTH es específica del antígenoy causa eritema e inducción en el lugar de lainyección del antígeno en animales inmuniza-dos. La histología de la hipersensibilidad retar-dada (DTH) puede variar según la especie, perouna característica general es la llegada de célu-las del sistema inmune al lugar donde se realizala inyección, macrófagos y basófilos en el casode los ratones en los que la inducción resulta

showed increased DTH response compared tocontrol group.

DISCUSSION

Immunomodulatory activity of S.indicus wasexplored, by evaluating its effect on antibodytitre, DTH response, phagocytic function andcyclophosphamide induced myelosuppression inmice. Administration of methanol extract and itsfractions showed immunostimulating activity.Significant stimulation with respect to these pa-rameters was obtained with methanol extract, itspetroleum ether and remaining methanol frac-tion while benzene, chloroform fractions showedinsignificant changes. The increase in carbonclearance index reflects the enhancement of pha-gocytic function of mononuclear macrophage andnon- specific immunity. Phagocytosis by macro-phages is important against the smaller parasitesand its effectiveness is markedly enhanced byopsonisation of parasite with antibodies and com-plement C3b leading to more rapid clearance ofparasite from blood11. The antibody productionto T-dependent antigen SRBCs requires the co-operation of T and B-lymphocytes and macro-phages12. Results obtained during present inves-tigation showed increased antibody productionin response to SRBCs.

DTH is antigen specific and causes erythemaand induction at the site of antigen infection inimmunized animals. The histology of DTH canbe different for different species, but the generalcharacteristics are an influx of immune cells atthe site of injection, macrophages and Basophilsin mice and induction becomes apparent within24-72 hours. T-cells are required to initiate thereaction13, 14.

Increase in the DTH response indicates thatdrug has a stimulatory effect on lymphocytes andnecessary cell types required for the expressionreaction. DTH response, which is direct co-rela-te of cell-mediated immunity, was significantlyincreased as compared to untreated control15.

Statistically significant rise in HA titre, DTHresponse and phagocytic activity of petroleumether and remaining methanol fraction suggestthat active principles of flower heads which areresponsible for stimulation of antibody respon-se, cell mediated response and phagocytic func-tion can be extracted with both polar and non



evidente a las 24-72 horas. Las células T sonnecesarias para iniciar la reacción13, 14.

El aumento de la respuesta DTH indica queel fármaco produce un efecto estimulador sobrelos linfocitos y los tipos de células necesariaspara la expresión de la reacción. La respuestaDTH, que es el correlato directo de la inmunidadcelular, aumentó significativamente en compara-ción con el grupo de control no tratado 15.

El aumento estadísticamente significativo deltítulo de anticuerpos humorales, la respuesta DTHy la actividad fagocítica de la fracción de éter depetróleo y la fracción de metanol sobrante sugi-rió que los principios activos de las cabezas flo-rales, responsables de la estimulación de la res-puesta de anticuerpos, la respuesta celular y lafunción fagocítica, se pueden extraer con disol-ventes polares y no polares.

En el caso de la mielosupresión inducida porciclofosfamida, la fracción de metanol sobrantedel extracto de metanol consiguió devolver elnivel de leucocitos a su nivel normal, mientrasque el resto de fracciones no dieron resultado, loque sugirió que los componentes polares son losresponsables de la protección frente a la mielo-supresión por ciclofosfamida. El efecto protec-tor de la fracción de metanol sobrante del ex-tracto de metanol frente a la mielosupresióninducida por ciclofosfamida es comparable a losefectos obtenidos con Asparagus racemosus16 yW. somnifera 17.

Ciertos fitoconstituyentes de la planta ya sehan aislado; tres nuevos eudesmanólidos juntocon dos sesquiterpeniodes, criptomeridiol y 4-epi-criptomeridiol 18, tres nuevas hidroxilactonasestrechamente relacionadas se han aislado delextracto de cloroformo de las cabezas florales deS.indicus 19. Aislamiento de los alcaloides de lasflores 20 y aislamiento de 7-hidroxi-3’, 4’.5, 6-tetrametoxiflavona 7-O-β-D-(1→4)-diglucósido:También se identificó un nuevo glicósido de fla-vonol en el pecíolo de S.indicus 21. Un principioantimicrobiano aislado del extracto de éter depetróleo se identificó como lactona sesquiterpé-nica bicíclica 22. Un glicósido sesquiterpénicoaislado del extracto de metanol de S.indicus fueel responsable del aumento de la producción deanticuerpos23.

Las lactonas sesquiterpénicas son importan-tes fitoconstituyentes de probada eficacia convariadas actividades farmacológicas como, porejemplo, actividades antibacterianas (especialmente

polar solvents.In the case of cyclophosphamide induced

myelosuppression, remaining methanol fractionof methanol extract was able to bring back thelevels of WBC to the normal while other fractio-ns were ineffective suggesting that polar compo-nents responsible for protection against cyclo-phosphamide myelosuppression. The protectiveeffect of remaining methanol fraction of metha-nol extract against myelosuppression induced bycyclophosphamide is comparable with those ob-tained for Asparagus racemosus16 and W. somni-fera 17.

A few phytoconstituents from the plant havealready been isolated; three new eudesmanolidesalong with two sesquiterpenoids, cryptomeridioland 4-epicryptomeridiol 18, three closely relatednew hydroxy lactone have been isolated fromchloroform extract of flower heads S.indicus 19.Isolation of alkaloids from flowers 20 and isola-tion of 7-hydroxy-3’, 4’.5, 6-tetramethoxy-fla-vone 7-O-β-D-(1→4)-diglucoside: a new flavo-ne glycoside from the stem of S.indicus 21 alsoreported. An antimicrobial principle isolated frompetrol ether extract was identified as bicyclicsesquiterpene lactone 22. One Sesquiterpene glyco-side isolated from methanol extract of S.indicuswas responsible for increased antibody produc-tion 23.

Sesquiterpene lactones are proven as impor-tant phytoconstituents with different pharmaco-logical activities such as antibacterial (especia-lly against gram positive bacteria), antifungal andanthelmentic activity. Some act as anti-parasiticagent- artemisinin an antimalarial of proven effi-cacy in humans24. Recently three new Sesquiter-pene glycosides isolated from Dendrobium nobi-le were reported for their immunomodulatorypotential25. During the present study Sesquiter-pene lactones were found in non-polar fractionswhile remaining methanol fraction was devoidof these constituents. The activity of petroleumether, benzene and chloroform fractions maytherefore be attributed to the presence of suchnon-polar type of compounds. However, protec-tion against cyclophosphamide myelosuppressionwas observed by only remaining methanol frac-tion, suggests the content of constituents otherthan sesquiterpenoids which were also responsi-ble for increased humoral and cellular response.

The present investigation therefore reveals thatflower heads of S.indicus certainly possess im-

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frente a la bacteria Gram positiva), antifungalesy antihelmínticas. Algunas lactonas, como elartesunato, actúan como agentes antiparasitarios,con una probada eficacia antimalaria en huma-nos. Recientemente, se ha demostrado el poten-cial inmunomodulador en tres nuevos glicósidossesquiterpénicos aislados de Dendrobium nobile.Durante el presente estudio las lactonas sesqui-terpénicas se encontraron en las fracciones nopolares, mientras que la fracción de metanolsobrante carecía de estos constituyentes. Por tanto,es posible atribuir la actividad de las fraccionesde éter de petróleo, benceno y cloroformo a lapresencia de este tipo de compuestos no polares.

Sin embargo, la protección frente a la mie-losupresión por ciclofosfamida se observó sóloen la fracción de metanol sobrante, lo que sugie-re un contenido de constituyentes distintos delos sesquiterpenoides, que son los responsablesdel aumento de la respuesta celular y humoral.Por tanto, la presente investigación revela quelas cabeza florales de S.indicus posee con certe-za propiedades inmunomoduladoras. El mecanismoexacto de actuación, sin embargo, sólo se pudodesarrollar después de la caracterización detalla-da de la parte activa de las distintas fracciones.Se han tenido en cuenta los estudios en esta lí-nea y se continuarán teniendo en cuenta en futu-ras investigaciones.

AGRADECIMIENTOS

A.R.Bafna desea dar las gracias a CSIR, NewDelhi, India por su ayuda financiera (SRF) parael desarrollo de este trabajo.

munomodulatory properties. The exact mecha-nism of action, however, could only be unfoldedafter detailed characterization of active moietiesfrom different fractions. Studies on these lineshave already been taken up and shall follow inour future communications.

ACKNOWLEDGEMENT

A.R.Bafna wishes to thank to The CSIR, NewDelhi, India for providing financial assistance(SRF) for carrying out this work.

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Actividad inmunomoduladora del extracto de metanol de la cabeza