Manual de practicas de bioquimica metabolica

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

MANUAL DE PRÁCTICAS

BIOQUIMICA

FUENTE: http://quimicoupagu.blogspot.com/1


Practica no. 1SOLUBILIDAD DE CARBOHIDRATOS

FUNDAMENTO:Loa carbohidratos son en general mas solubles en agua y solventes inorganicos y menos solubles o insolubles en solventes inorganicos.

REACTIVOS:-Agua destilada-HCl 5%-NaOH 5%-Etanol-Cloroformo-Carbohidratos Glucosa

FructosaXilosa

TECNICA:Colocar aproximadamente 15 mg de cada uno de los carbohidratos en tubos etiquetados y examine su solubilidad en agua, alcali diluido, acido diluido, etanol y cloroformo añadiendo 2ml de solvente.

RESULTADOS:

OBSERVACIONES:

CONCLUSIONES:

IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS

1.- PRUEA DE BIAL PARA PENTOSAS.

FUNDAMENTO:Cuando se calienta pentosas con HCl concentrado se forma furfural que se condensa con orcinol (3,5-dihidroxitolueno), en presencia de iones ferricos para dar un complejo coloreado.

GENERALIDADES:-Explique que es un monosacárido, oligosacarido y un polisacarido.-Clasificacion de los monosacáridos en base al numero de atomos de carbono que poseen



_Escriba las formulas de una triosa, una terrosa, una pentosa y una hexosa.

REACTIVOS:1.- Reactivo de Bial. Disolver 1.5 g de orcinol en 500 ml. De HCl concentrado. Agregar a esta solucion 20 gotas de FeCl3. Guardar en frasco ambar.2.- Solucion de carbohidratos:

Glucosa: 1g/100mlXilosa: 1g/100ml

TECNICA:1.- Rotular los tubos de ensaye de 15 x 150 con el nombre del carbohidrato a probar y el nombre de la prueba (Bial).2.- Pipetear 1ml de la muestra (sol. de carbohidrato) al tubo de ensaye correspondiente, y 2.5 ml de reactivo de Bial. 3.- Colocar en baño de agua hirviente hasta la aparicion de color, y sacar inmediatamente.

RESULTADOS:

OBSERVACIONES:

PRUEBA DE SELIWANOFF

FUNMDAMENTO:Las cetosas se deshidratan mas rapidamente que las aldosas dando derivados de furfural que se condensan con resorcinol para formar un compuesto coloreado, por lo tanto debe evitarse un calentamiento prolongado que ocasionaria la deshidratación de las aldosas.

GENERALIDADES:-Explique que es una aldosa y una cetosa-Escriba la formula de Fisher y de Haworth de una aldosa y una cetosa con nombres.

REACTIVOS:1.- Reactivop de Seliwanoff. Disolver 0.7 g de resorcinol en 100 ml de HCl concentrado. Agregar agitando 100 ml de agua destilada. Guardar en frasco ambar.2.- Solucion de fructosa y glucosa 1g/100ml cada uno.

TECNICA:1.- Rotular los tubos de endsaye con el nombre del carbohidrato y el nombre de la prueba (Seliwanoff).



2.- Pipetear 2 ml del reactivo de Seliwanoff a cada tubo y añadir 2 gotas del carbohidrato al tubo de ensaye correspondiente. Calentar en un baño de agua hirviente hasta la aparicion de color.

RESULTADOS:

OBSERVACIONES:

PRUEBA DE YODO

FUNDAMENTO:El yodo forma complejos coloreados de absorción con los polisacaridos.

GENERALIDADES:-Enlace glucosidico , como se forma, estructura quimica de uno.-Describa la estructura quimica de sacarosa, almidon, y glucogeno.

REACTIVOS:1.- Solucion de yodo (mezclar 2 g de KI y 1 g de yodo , disolver esta mezcla en agua destilada, completar a 100 ml).2.- Solucion de

almidon 1g/100ml sacarosa 1g/100ml

glucosa 1g/100ml

TECNICA:Colocar en una capsula de porcelana 3 gpotas de solucionn problema y 3 gotas de yodo, observe los colores.

RESULTADOS:

OBSERVACIONES:

Practica no. 2.IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS II.

REACCIÓN DE TOLLENS.

FUNDAMENTO: LA PRUEBA DE T0LLENS ES UNA REACCIÓN CARACTERÍSTICA PARA AZUCARES REDUCTORES DANDONOS COMPUESTOS COLOREADOS (NEGROS) CUANDOSE TRATE DE ELLOS.



REACTIVOS: GLUCOSA 2% ARABÍNOSA 2% MALT-OSA 2% SACAROSA 2% ALMIDON.

REACTIVO DE TOLLENS:MEZCLAR 10 mL DE HC1 CONCENTRADO CON 2 Ml DE FLOROGLUCÍNOL AL 2% Y LLEVAR CON AGUA DESTILADA HASTA 18 ml.

TÉCNICA:1.- COLOCAR EN EL TUBO DE ENSAYO CORRESPONDIENTE 0.5MLDE LAS SOLUCIONES A PROBAR (GLUCOSA, ARABINOSA, MALTOSA, SACAROSA, ALMIDON2.- AGREGAR 1 ML DE REACTIVO DE TQLLENS Y MEZCLAR.3.- CALENTAR EN UN BAÑO DE AGUA HIRVIENTE POR 3 A 4MIN.4.- UN COLOR OSCURO ES UNA PRUEBA POSITIVA.

RESULTADOS:

OBSERVACIONES:

CONCLUSIONES:

FUNDAMENTO: LA REACCIÓN DE FEHLING ESTA BASADA EN LA ACCIÓN REDUCTORA QUE TIENEN LOS AZUCARES SOBRE LOS IONES CÚPRICOS EN MEDIO ALCALINO

REACTIVOS: GLUCOSA 2% ARABINOSA2% MALTOSA 2% SACAROSA 2% FRUCTOSA 2°/o ALMIDÓN 2% AGUA DESTILADA.

REACTIVO DE FEHLING:SOLUCIÓN A: PESAR 34.65 g DE SULFATO DE COBREY DISOLVER EN 300 ml DE AGUA DESTILADA, LLEVAR A 500 ml CON AGUA Y CONSERVAR EN FRASCO CON TAPÓN DE HULE.



SOLUCIÓN B.- PESAR 125 g DÉ KOH Y 173 g DE TARTRATO DE SODÍO Y POTASIO, Y LLEVAR CON AGUA DESTILADA A 500 ML, CONSERVAR EN FRASCO REVESTIDO DE PARAFINA Y CON TAPÓN DE HULE.

TÉCNICA:PREPARACIÓN DEL TESTIGO:1.- COLOCAR EN UN TUBO DE ENSAYE 2 ml DE AGUA DESTILADA2.- AGREGAR 0.5 ml DE FEHLING A Y 0.5 ml DE FEHLING B Y MEZCLAR.3.- CALENTAR EN BAÑO MARÍA A EBULLICIÓN DURANTE 5 MIN.4.- NO DEBE PRODUCIRSE UN PRECIPITADO ROJO LADRILLO

PREPARACIÓN DE LOS PROBLEMAS:1.- COLOCAR EN EL TUBO CORRESPONDIENTE 1ml DE LAS SOLUCIONES A PROBAR (GLUCOSA, ARABINOSA, MALTOSA, SACAROSA, FRUCTOSA Y ALMIDÓN)2.- AGREGAR 0.5 ml DE FEHLING A Y 0.5 ML DE FEHLING B Y MEZCLAR3.- CALENTAR EN BAÑO MARÍA EN EBULLICIÓN DURANTE 5 MIN.4.- UN PRECIPITADO ROJO LADRILLO SERA UNA PRUEBA POSITIVA.

RESULTADO:

OBSERVACIONES:

CONCLUSIONES:

REACCION DE LA ANTRONA.

FUNDAMENTO: LOS ACIDOS CONCENTRADOS ORIGINAN UNA DESIDRATACION DE LOS MONOSACARIDOS PARA RENDIR FURFURALES QUE SON DERIVADOS ALDEHIDICOS DEL FURANO, POR EJEMPLO: LA D- GLUCOSA CON ACIDO CLORHIDRICO CONCENTRADO (HCl) PRODUCE 5 HIDROXI METIL FURFURAL.

ESTOS PRODUCTOS SE COMBINAN LUEGO CON ANTRONA PARA DAR UN COMPLEJO COLOREADO.



REACTIVOS:1.- SOLUCION DE ANTRONA 2 GR/LT EN HCl CONCENTRADO.2.- SOLUCION DE GLUCOSA 1 GR/100 ML3.- FRUCTOSA 1 GR/1OO ML.

TECNICA:1.- APROXIMADAMENTE A 2 ML DE ANTRONA AGREGUE 5 GOTAS DE LA SOLUCION PROBLEMA, MEZCLAR FUERTEMENTE Y OBSERVAR EL CAMBIO DE COLOR.

RESULTADO:

OBSERVACIONES:

CONCLUSIONES:

PRACTICA NO. 3.REACCIÓN DE BENEDICT PARA AZUCARES REDUCTORES

Fundamento:Esta prueba se basa en la reacción de reducción del cobre de Benedict. La glucosa y otras sustancias reductoras reducen los iones cúpricos a iones cuprosos y forman un oxido cuproso rojo. El color azul de Cu++ es negativo para sustancias reductoras.

Generalidades:Escriba las fórmulas de la glucosa, la sacarosa y un segmento del almidón (en forma de alfa amilasa).

Reacción de Fehling.

Consiste en: 1 ml de la solución problema (Hidrolizado) + 0.5 ml de Fehling A +0.5 ml de Fehling B



Calentar 5 minutos en baño de agua hirviente

Reactivos:

1. Reactivo de Benedict2. solución de almidón 2%3. solución de sacarosa 2%4. Solución de glucosa a diferentes concentraciones indentificadas como:

Glucosa 1, 2,3 y 4.

Técnica:

Pipetee 0.5ml de la solución problema en un tubo de ensayo de 15 x 150 y agregue 1 ml de reactivo de Benedict, mezclar y colocar en un baño de agua hirviendo por 3 min.Auxíliese de la tabla siguiente para determinar la cantidad aproximada de glucosa presente en las soluciones de glucosa 1, 2,3 y 4.

color Concentración aprox. de glucosa (g/100ml)

Azul 0 g/100ml (Negativa)

Azul verdoso 0.3 g/100ml

Verde oliva 1.0 g/100 ml

Azul café 1.5 g/100 ml

Rojo ladrillo 2.0 g/100 ml o más

Hidrólisis de la Sacarosa

5 ml de sacarosa 2% +6 gotas de HCl concentrado

Mezclar y calentar 5 minutos en agua hirviente EnfriarAgregar 15 gotas de NaOH 5% para neutralizar Efectuar una prueba de Fehling al hidrolizado

Reacción de Fehling

1 ml de la solución problema (Hidrolizado)



+ 0.5 ml de Fehling A +0.5 ml de Fehling BCalentar 5 minutos en baño de agua hirviente Resultados y Observaciones:

Conclusiones:

PRACTICA NO. 4FERMENTACIÓN DE LA GLUCOSA POR LEVADURAS

(Sacharomyces cereviceae)

FUNDAMENTO: La glucosa es un carbohidrato fermentable por las levaduras.

REACTIVOS: Solución de glucosa (1 g en 100 ml) Reactivo de benedict. Levadura de panadero seca activa.

TÉCNICA:1.- En un vaso de precipitado de 25 ml. Pipetee 10 ml de la solución de glucosa y añada 0.3 g (la punta de una espátula) de levadura. Mezcle perfectamente hasta que la mezcla sea homogénea. Incube a 37 grados.

Realice una prueba de Benedict a esa mezcla a los 30 min., y a la hora y media de incubación. 2.- Para verificar que la solución de glucosa es un azúcar reductor, realice una prueba de Benedict a la solución de glucosa. 3.- Para verificar que la levadura no contiene la presencia de ningún azúcar reductor realice un blanco de la siguiente manera: Mezcle 0.3 g (la punta de una espátula) de levadura con 10 ml. De agua destilada. Efectúe una prueba de Benedict tomando 0.5 mi de esta solución de levadura.

Nota: La prueba de Benedict se efectúa de la sig. Manera:Pipetear 0.5 ml. de la solución problema en un tubo de 15 X 150Añadir 1 ml. de Reactivo de Benedict.Calentar en baño de agua hirviente durante 3 min.

INTERPRETACION:

1. Muestra no fermentada: reacción de Benedict positiva (rojo ladrillo)



2. Muestra fermentada: reacción de Benedict negativa (azul).

RESULTADOS Y OBSERVACIONES:

CONCLUSIONES:

PRACTICA NO. 5.DETERMINACIÒN DE GLUCOSA DEL SUERO POR EL METODO DE LA

GLUCOSA OXIDASA.

ANTECEDENTES:

La determinación de la glucosa en fluidos biológicos asido bien documentadas. La prueba de glucosa pude ser diagnostica mente significativa en diabetes e hipoglucemia.

FUNDAMENTO:

La glucosa es oxidad por la glucosa oxidasa a ácido gluconico hiperoxido de hidrogeno en presencia de peroxidasa reacciona con el hidroxibenzoato y 4-aminoantipirina (PAP) para producir un cromógeno de Quinoneimina rojo con un máximo de absorbancia a 505 nm.

GLUCOSA OXIDASA

B-D-Glucosa + o2 + H2O Ácido D-gluconico +H2 O 2

PeroxidasaH2O2 + Hidroxibenzoato + 4-Aminoantipirina Cromógeno Quinoneimina Rojo +H 2º

La concentración de glucosa es directamente proporcionar a la absorbancia del cromógeno de Quinoneimina a 505 nm.

MATERIAL:

1 tubo de ensaye de 13/100 1pipeta de 20 microlitros 1 pipeta de 5ml.

REACTIVOS:

Reactivo de color:Una solución conteniendo después de reconstitución 0.5125 mml. / L de



4-antipirina, 10mmol /L de p- hidrixibenzoato, > 20 000 U/L de glucosa oxidasa, >1000 U/L peroxidasa (Rábano Picante), buffer y preservativo.

Estándar de glucosa

Una solución acuosa conteniendo 90 ml/dL la glucosa y perceptivos

PRECAUCIONES:No pipetee los reactivos con la boca y evite el contacto con la piel y ojos.

RECOLECIÒN Y PREPARACIÒN DE LA MUESTRA:

La muestra de elección de be ser plasma preparado de la sangre colecta con anticoagulante fluorado. Otro plasmas y sueros pueden usarse si separados del paquete globular y ensayados rápidamente.El plasma fluorado para análisis de glucosa e estable a 2-8 º C por 5 días.

PROCEDIMIENTOS:

1.-prepare el reactivo de trabajo de glucosa2.-en tubos separados pipetee 20 microlitros del estándar o del suero a ensayar3.-añada 2 ml. De reactivo y mezcla.4.- incube por 10 minutos a 37ºC, y determine la absorbancia del estándar (A s) y de cada cero (A) a 505 nm. Contra blanco de reactivo.

CALCULOS Y RESULTADOS

La glucosa se expresa en mg/dL o mmol/Litros Glucosa mg/Dl= A X concentración del estándar ºA s

A= absorbancia del problema As = absorbancia del estándarESTANDAR = 90mg. /dL ( ) X ( 9 0 ) =

( ) VALORES ESPERADOS

70-105mg. / dL

Estos valores son sugeridos. Se recomienda que cada laboratorio establezca el rango para el área en que esta localizado.



OBSERVACIONES:

RESULTADOS:

Absorbancia estándar de la glucosa:

A= 0.310B= 0.315

Abs. Problema X 90 = mg/dlAbs. Estándar

.323 X 90 = 83 mg/dl

.312

RESULTADOS:

CONCLUCIÒN:

PRACTICA NO. 6.

CURVA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA.

FUNDAMENTO:

CURVA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA.

Son pruebas que miden la capacidad para metabolizar la glucosa. Las personas que padecen de diabetes mellitus tienen altos niveles de glucosa en la sangre y las pruebas de tolerancia a la glucosa son una de las herramientas para diagnosticarla. Este examen también se realiza para diagnosticar diabetes mellitus en estudios investigativos que involucren a los diabéticos y en casos en los que se sospeche la presencia de esta enfermedad, a pesar de haber realizado un examen en ayunas de glucosa en sangre, con resultados normales, así como para el diagnóstico de hiperinsulinismo (elevación de los niveles de insulina).

Los métodos más utilizados más comúnmente para evaluar la tolerancia a una sobrecarga de glucosa pueden ser:

1. Pruebas de tolerancia utilizando una dosis única oral de glucosa.2. Pruebas de tolerancia con una dosis intravenosa de glucosa.



La prueba más común de tolerancia a la glucosa es la oral. Después de una noche de ayuno, el paciente ingiere una solución que contiene una cantidad conocida de glucosa. Se toma una muestra de sangre basal, antes de que el paciente ingiera la solución de glucosa y de nuevo cada 30 minutos después hasta por 2 ó 3 horas, según la solicitud del médico, para la determinación de glicemia. Además, el paciente no puede comer durante el examen y se recomienda informar al médico acerca del uso de medicamentos que pueden afectar los resultados del examen.

Con frecuencia se solicita la medición de los niveles de insulina (hormona producida por el páncreas que permite introducir la glucosa desde la sangre hasta la cada una de las células del cuerpo).

Cuando se suministra la glucosa por boca, la absorción desde el tracto gastrointestinal hacia la sangre continúa durante un lapso variable, que depende de la cantidad de glucosa suministrada. La máxima absorción de glucosa se estima en 0,8 g/kg de peso por hora. La tolerancia a la glucosa suministrada por vía oral, mide el balance entre la velocidad de pasaje de la glucosa al fluido extracelular y su separación por la asimilación celular y la excreción urinaria, si la hubiere. Por tanto, la prueba puede influirse no sólo por aquellos factores vinculados con la utilización de la glucosa, sino también por los que influyen en su absorción. Las pruebas intravenosas de tolerancia a la glucosa son poco comunes. Para realizar este tipo de prueba, al paciente se le inyecta por vía venosa una cantidad conocida de glucosa durante tres minutos, previa la medición de los niveles de insulina en la sangre en el minuto uno y en el tres.

INTERPRETACIÓN En condiciones normales la sangre en ayunas debe tener un nivel de glucosa inferior a 100 mg/dl. Los valores sanguíneos normales son: Ayunas: 60 a 100 mg/dl 1 hora: menos de 200 mg/dl 2 horas: menos de 140 mg/dl.

Entre 140 y 199 se considera que existe intolerancia a la glucosa y es un grupo que tiene mayor riesgo de desarrollar diabetes.

Los niveles por encima de 200 mg/dl indican un diagnóstico de diabetes.



Los criterios utilizados para definir la condición de anormalidad de una curva de tolerancia ,se basan en el nivel o pico elevado alcanzado por la concentración sanguínea y la falta de retorno al nivel normal, 2 horas después de la ingestión de glucosa, siendo este último el más importante.

Un valor hipoglucémico (bajo de glicemia) de 3 a 5 horas después de la ingestión de la glucosa se observó en ciertos pacientes cuya curva de tolerancia era de tipo diabético, interpretándose un hiperinsulinismo, típico del estado diabético.

DIBUJOS:

CALCULOS Y RESULTADOS:

CONCLUSIONES:

PRACTICA NO. 7.DETERMINACIÒN DE GLUCOSA SERIADA.

ANTECEDENTES:La determinación de la glucosa en fluidos biológicos asido bien documentadas. La prueba de glucosa pude ser diagnostica mente significativa en diabetes e hipoglucemia.

MATERIAL: 4 tubo de ensaye de 13/100 1pipeta de 20 microlitros 1 pipeta de 5ml.

REACTIVOS:Reactivo de color:Una solución conteniendo después de reconstitución 0.5125 mml. / L de 4-antipirina, 10mmol /L de p- hidrixibenzoato, > 20 000 U/L de glucosa oxidasa, >1000 U/L peroxidasa (Rábano Picante), buffer y preservativo.Estándar de glucosaUna solución acuosa conteniendo 90 ml/dL la glucosa y perceptivos

PROCEDIMIENTOS:1.-prepare el reactivo de trabajo de glucosa2.-en tubos separados pipetee 20 microlitros del estándar o del suero a ensayar3.-añada 2 ml. De reactivo y mezcla.4.- incube por 10 minutos a 37ºC, y determine la absorbancia del estándar (A s) y de cada cero (A) a 505 nm. Contra blanco de reactivo.

CALCULOS Y RESULTADOS



La glucosa se expresa en mg/dL o mmol/Litros Glucosa mg/Dl= A X concentración del estándar ºA s

A= absorbancia del problema As = absorbancia del estándarESTANDAR = 90mg. /dL ( ) X ( 9 0 ) =

( ) VALORES ESPERADOS 70-105mg. / dL


CONCLUCIÒN:

PRACTICA NO.8.Determinación de proteínas totales.

Historia del Método

La reacción de color de las moléculas de proteínas con iones cúpricos, es conocida como la reacción de color de Biuret, y es conocida desde 1878, desde las publicaciones de Riegler en 1914 se han hecho varios intentos para estabilizar los iones cúpricos en ractivos alcalino. Kingsley modificó el procedimiento en 1939 y en 1942 para incluir el uso de sodio como agente complejo. Este procedimiento fue modificado más tarde por Weichselbaum y Gornall. El presente método está basado en estas modificaciones.

Principio ++ ÁlcaliProteína + Cu complejo de color

La proteína en suero forma un complejo coloreado violeta cuando reacciona con iones cúpricos en solución alcalina, la intensidad del color violeta es proporcional a la cantidad de proteína presente cuando se compara contra una solución de concentración conocida de proteína.

Reactivo

Hidróxido de sodio 600 mM; sulfato de cobre 12mM. Tartrato de sodio potasio 32 Mm; Yoduro de potasio 30Mm; ingredientes no reactivos.

El reactivo esta listo para su uso El reactivo se guarda a temperatura ambiente



El reactivo debe ser una solución azul pálido. La presencia de turbidez o de un precipitado negro indica deterioro del reactivo y no debe ser usado.

Material

Reactivo de proteína total Pipetas automatizadas Cronómetro Tubos de ensaye Espectrofotómetro

Procedimiento (Manual)

Etiquetar los tubos para blanco, estándar, paciente, etc. Pipetee 1.0 ml del reactivo de trabajo a cada tubo. Añadir 20 Ul de la muestra a los tubos respectivos, mezclar por

inversión, Incubar 5 minutos a temperatura ambiente. Ajustar el espectrofotómetro a cero con el blanco a 540 nm. Leer y anotar las absorbancias de todos los tubos.

Calibración

Use estándar acuoso de proteína (8g/dL) o suero calibrador. Se debe calibrar de acuerdo a las instrucciones de calibración del instrumento. Si el resultado de los controles se encuentra en el rango, la prueba debe ser recalibrada.

Cálculos

Abs = Absorbancia

Abs (Paciente)-------------------- * concentración del estándar = concentración de proteína g/dl.Abs (Estándar) g/dL

Valores esperados

6.2 – 8.5 g/dlSe recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.




CONCLUCIÒN:

PRACTICA NO. 9.PROTEINAS TOTALES Y ALBUMINA

OBJETIVOCuantificación de las proteínas totales y albúmina en el suero. FUNDAMENTO

Proteina:La proteína presente en la muestra reacciona con los iones cobre (II) en medio alcalino, originando un complejo coloreado que se cuantifica por espectrofotometría.

Albumina:La determinación colorimetrica de albumina humana en suero se realiza en un medio amortiguado, lo cual permite su union por puentes de hidrogeno a colorantes o indicadores como el verde de bromocresol, tiene la propiedad de enlazarse específicamente con la albúmina produciendo un cambio de color de intensidad proporcional a su concentración.

GENERALIDADES

Las proteínas séricas están separadas aproximadamente en albúminas y globulinas; en otras palabras, la proteína total = albúmina + globulina. La albúmina es la proteína de mayor concentración en el suero que sirve para trasportar muchas moléculas pequeñas, pero también juega un papel decisivo en el mantenimiento de la presión oncótica de la sangre, es decir, impedir que el líquido se filtre a los tejidos.

Las globulinas se dividen a grandes rasgos en globulinas alfa-1, alfa-2, beta y gammaglobulinas, las cuales se pueden separar y cuantificar en el laboratorio mediante la electroforesis y la densitometría.

La fracción alfa-1 incluye la alfa-1 antitripsina (ver Alpha-1 antitripsina ) y la globulina fijadora de tiroxina (ver T3, T4, RT3U ). La fracción alfa-2 contiene la haptoglobina, ceruloplasmina, HDL y alfa-2 macroglobulina.

En general, los niveles de proteínas alfa-1 y alfa-2 aumentan en presencia de inflamación. La fracción beta incluye la transferrina (ver hierro sérico ), el plasminógeno (ver análisis del factor VIII ) y las beta lipoproteínas (ver LDL). La fracción gamma incluye los diferentes tipos de anticuerpos (inmunoglobulinas M, G y A).

Valores Normales


http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003480.htm












Proteína total: 6,4 a 8,3 g/dl Albumina: 3-5 gr / 100ml

METODOLOGIA:

BIURETVERDE DE BROMOCRESOL

REACTIVOS

Verde de bromocresol (BCG) 0.15 g/L. Buffer pH 4.56- 4.76; Surfactante, ingredientes no reactivos y estabilizadores.

Reactivo de proteinas (biuret) Patron para proteinas totales. Patron para albumina. El reactivo esta listo para usarse El reactivo es estable a la fecha de caducidad, guardado a temperatura

ambiente. El reactivo debe ser una solución verde-amarilla, clara. Si presentan

turbidez o precipitado el reactivo es insatisfactorio y debe ser descartado.

PRECAUCIONES:Los reactivos causan irritacion. Evite el contacto con piel, ojos y ropa. En caso de contacto, lavese con abundante agua.

CONSERVACIÓNAlmacenados a temperatura ambiente, los reactivos son estables hasta su fecha de caducidad.

INSTRUMENTOSUse un espectrofotometro o fotocolorimetro calibrado a 540 y 630nm y un baño capaz de mantener la temperatura a 37ºC.

MUESTRASuero unicamente

MATERIAL

Pipetas automatizadas Tubos de ensayo Cronometró Espectrofotómetro para leer a 630 nm

PROCEDIMIENTOProteínas:

1.- Pipetear en tubos de ensaye:



BLANCO ESTANDAR MUESTRAReactivo de proteinas

Suero

patron

2.5ml 2.5ml

0.05ml

2.5ml

0.05ml

2.- Agitar bien y dejar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente.

3.- Leer la absorbancia (A) del Patrón y de la muestras frente al Blanco a 540 nm. El color es estable durante al menos 2 horas.

Albúmina

Etiquete los tubos para blanco, control, estándar, paciente, etc. Pipetee 1.0 mL del reactivo de trabajo en cada tubo. Añada 10µL de la muestra a los tubos respectivos y mezclar. Incube por un minuto. Ajuste el espectrofotómetro a cero con el blanco a 630 nm. Lea y anote las absorbancia de todos los tubos.

BLANCO ESTANDAR MUESTRAReactivo de albumina

Suero patron

Suero problema

2.5ml 2.5ml

0.01ml

2.5ml

0.01ml

OBSERVACIONES Y RESULTADOS:

CONCLUCIÒN:

Cuestionario.

1.- ¿Cuál es la proteína plasmática más abundante?

2.- ¿donde es sintetizada la albúmina?

3.- ¿Cuántas cadenas polipetida y cuantos aminoacidos constituyen la albúmina?

4.- ¿funciones de la albúmina?



5.- ¿Qué se produce cuando la concentración de albúmina disminuye en sangre de manera importante disminuyendo la presión osmótica con la consecuente extravasación del H2O?

6.- ¿Qué entiende por hipoalbuminemia?

7.- ¿diga 2 patologías que produzcan hipoalbuminemia?

8.- ¿Qué entiende por hiperalbuminemia?

9.- ¿diga un estado patológico en el que se presenta hiperalbuminemia?

PRACTICA NO. 10.TRIGLICERIDOS GPO (LIQUIDO)

PRINCIPIO:

Trigliceridos lipasa glicerol + acidos grasos

Glicerol + ATP GK gliceroL-1-fosfato + ADP

GliceroL-1-fosfato + O2 GPO DAP + H2O2

H2O2 + 4-AA + 4-clorofenol POD quinoneimina + HCl + 2 H2O

Los trigliceridos en suero son hidrolizados a glicerol y ácidos grasos libres por acción de la lipasa. En presencia de ATP y glicerol cinasa (GK) el glicerol se convierte a glicerol-1-fosfato. El glicerol-1-fosfato es despues oxidado por la enzima glicerol-fosfato oxidasa (GPO) para obtener peroxido de hidrogeno. La condensacion del peroxido con 4-clorofenol y 4-aminofenazona en presencia de peroxidasa (POD) produce una quinineimina de color rojo seco el cual se absorbe a o cerca de 500 nm. La intensidad del complejo coloreado formado es directamente proporcional a la cantidad de trigliceridos en la muestra.

REACTIVOS:

Buffer de Good (pH 7.3-7.5) 50 mM, 4-clorofenol, ATP 0.5 mM, sal de magnesio 12 mM, 4-aminofenazona 0.3 mM, glicerol cinasa (microbial) > 250 U/L, glicerol-fosfato oxidasa (microbial) > 200,000 U/L, surfactantes, estabilizadores y preservativos, incluido azida de sodio (0.1 %).

MATERIAL: Reactivo de trigliceridos GPO Pipetas automatizadas



Tubos de ensayo Cronometro Bloque termico Espectrofotometro capaz de leer a 500 nm Estandar o calibrador de trigliceridos

PROCEDIMIENTO MANUAL:

1. Identificar los tubos: blanco, estandar control, etc.2. Pipetear 1 mL de reactivo en cada tubo. 3. Agregar 10 uL de suero a sus respectivos tubos. Mezclar suavemente.4. Incubar todos los tubos por 5 minutos.5. Ajustar el espectrofotometro a 0 con el blanco (500-520 nm)6. Leer y anotar absorbancias. El color final es estable por 60 minutos.

VALORES ESPERADOS:

44-148 mg/dL. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.

CALCULOS:

NOTA.- Los trigliceridos se expresan en mg/dL o mmol/Lmg/dL= Abs. (desconocido)/ Abs. (estandar) x concentracion std trigliceridos mg/dL.Para convertir el valor a mmol/L, se debe multiplicar el resultado por 0.0113.


CONCLUCIÒN:

PRACTICA NO. 11.COLESTEROL

PRINCIPIO. col. esterasaÉsteres de colesterol. colesterol + ac. Grasos Col. oxidasaColesterol + H2O colesterol 3-one + H2O2

H2O2 + 4-AAP + fenol POD quinoneimina + 4H2O



La intensidad de color rojo es directamente proporcional al colesterol total en la muestra cuando se lee a 500 nm.

REACTIVOS 4-AAP. 3 mM: colesterol estearasa - 150 u/l ; colesterol oxidasa 150U/l: fenol 15 mM; buffer fosfato pH 6.8; estabilizadores no reactivos y preservativos.El reactivo esta listo para usarse.No se debe utilizarse si esta turbio.

INTERFERENCIAAlgunas drogas y sustancia pueden afectar la determinación de colesterol.

Material Reactivo de colesterol Pipetas automatizadas Tubo de ensayo Cronometro Bloque térmico Espectrofotómetro capaz de leer a 500 nm.

PROCEDIMIENTO (MANUAL)1. identificar los tubos: blanco, estándar. Control, etc.2. pipetear 1 ml de reactivo en cada tubo. Precalentar a 37°C por lo menos por

5 min.3. agregar 10 UL de suero a sus respectivos tubos.4. incubar los tubos por 5 min.5. ajustar el espectrofotómetro a 500 nm.6. leer y anotar la absorbancia.

VALORES OBSERVADOSColesterol deseable 200 mg/dlColesterol alto 240mg/dlSe recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.

CALCULOSABS= ABSORVANCIA

Mg / dl = abs. (Desconocido) * Concentración de colesterol mg/ dl Abs. (Estándar)




CONCLUCIÒN:


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Manual de practicas de bioquimica metabolica