Guia de Practicas Bioquimica I-2009

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

FACULTAD DE INGENIERIA INDUSTRIAL Y DE SISTEMAS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

Ing. GUILLERMO ALEXANDER CHUMBE GUTIERREZ

Lima, 2009

GUIA DE PRÁCTICA DE LABORTORIO

BIOQUIMICA I

INDICE

INDICE............................................................................................................................................................ 2

REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA................................................................................3

PRÁCTICA Nº 1 SOLUCIONES.....................................................................................................................8

PRÁCTICA Nº 2 PROPIEDADES FISICO QUÍMICAS DEL AGUA..............................................................11

PRÁCTICA Nº 3 DETERMINACIÓN DEL PH Y ACIDEZ..............................................................................14

PRÁCTICA Nº 4 RECONOCIMIENTO DE PROTEINAS..............................................................................19

PRÁCTICA Nº 5 PROPIEDADES FÍSICAS DE LAS PROTEINAS...............................................................22

PRÁCTICA Nº 6 RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS....................................................................25

PRÁCTICA Nº 7 RECONOCIMIENTO E HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN........................................................29

PRÁCTICA Nº 8 RECONOCIMIENTO DE LÍPIDOS.....................................................................................31

PRÁCTICA Nº 9 ANÁLISIS CUANTITATIVO DE ENZIMAS.........................................................................34

PRÁCTICA Nº 10 EXTRACCIÓN DE ADN...................................................................................................39

PRÁCTICA Nº 11 LAS RUTAS METABÓLICAS...........................................................................................41

BIBLIOGRAFÍA............................................................................................................................................. 49

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREALFACULTAD DE INGENIERÍA INDUSTRIAL Y DE SISTEMAS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIALGUÍA DE PRÁCTICAS – BIOQUÍMICA I

REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

El trabajo en el Laboratorio requiere la observación de una serie de

normas de seguridad que eviten posibles accidentes debido a

desconocimiento de lo que se está haciendo o a una posible negligencia

de los alumnos y alumnas que estén en un momento dado, trabajando en

el Laboratorio.

I. REGLAS PARA EL ALUMNO

1. Cada grupo de prácticas se responsabilizará de su zona de trabajo y de su material.

2. Es conveniente la utilización de guardapolvo (bata o mandil) blanco, largo, ya que

evita que posibles derrames de sustancias químicas lleguen a la piel; también se

recomiéndale uso de zapatos cerrados y protector respiratorio.

3. Se recomienda usar un gorro blanco mientras se permanezca en el laboratorio.

4. Si tienes el pelo largo, es conveniente que lo lleves recogido.

5. Se recuerda que en el laboratorio está terminantemente prohibido fumar, tomar

bebidas y comer.

6. Sólo permanecerán en el laboratorio siempre y cuando estén dentro de sus horarios

estipulados y con el consentimiento explícito del profesor.

7. El material que se rompa o deteriore estando en poder los alumnos, deberá ser

repuesto por otro de las mismas características a mas tardar al final del semestre

II. SEGURIDAD Y PROTECCIÓN

1. Antes de utilizar un compuesto, asegurarse bien de que es el que se necesita, fijarse

bien el rótulo.

2. No coger ningún producto químico, sin autorización de tu profesor.

3. No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados

sin consultar con el profesor.

4. Es muy importante que cuando los productos químicos de desecho se viertan en la

pila de desagüe, aunque estén debidamente neutralizados, debe dejarse que circule

por la misma, abundante agua.

5. No tocar con las manos y menos con la boca, los productos químicos.

6. No pipetear con la boca. Utilizar la bomba manual, una jeringuilla según que se

disponga en el Centro.

7. Los ácidos requieren un cuidado especial. Cuando queramos

diluirlos, nunca echaremos agua sobre ellos; siempre al contrario,

es decir, ácido sobre agua.Ing. Guillermo Chumbe Gutiérrez

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8. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc) no deben estar cerca de fuentes

de calor. Si hay que calentar tubos con estos productos, se hará al baño María, nunca

directamente a la llama.

9. Si se vierte sobre ti cualquier ácido o producto corrosivo, lávate inmediatamente con

mucha agua y avisa al profesor.

10. Al preparar cualquier disolución se colocará en un frasco limpio y rotulado

convenientemente.

11. Cuidado con los bordes y puntas cortantes de los tubos u objetos de vidrio. Si durante

clases se quiebra algún objeto de vidrio se debe desechar de inmediato. Previamente

comunicar al profesor (a) responsable.

12. El vidrio caliente no se diferencia a simple vista del vidrio frío. Para evitar

quemaduras, dejarlo enfriar antes de tocarlo.

13. Si tienes que calentar a la llama el contenido de un tubo de ensayo, observa

cuidadosamente estas dos normas:

La boca del tubo de ensayo no apunte a ningún compañero. Puede hervir el

líquido y salir disparado, por lo que podrías ocasionar un accidente.

Como ves en el dibujo, calienta por el lateral del tubo de ensayo, nunca por el

fondo; agita suavemente.

14. Cuando se determinen masas de productos químicos con balanza, se colocará papel

de filtro sobre los platos de la misma y si es necesario porque el producto a pesar

fuera corrosivo, se utilizará un vidrio de reloj; asegúrese de tarar previamente el papel

o la luna de reloj.

15. Se debe evitar cualquier perturbación que conduzca a un error, como vibraciones

debidas a golpes, aparatos en funcionamiento, soplar sobre los platos de la balanza,

etc.

III. SUSTANCIAS QUE DEBEN USARSE CON PRECAUCIÓN

Todas las que se utilizan en las operaciones y reacciones en el laboratorio son

potencialmente peligrosas por los que, para evitar accidentes, deberán trabajarse con

cautela y normar el comportamiento en el laboratorio por las exigencias de la

seguridad personal y del grupo que se encuentre realizando una práctica.

Ing. Guillermo Chumbe GutiérrezPágina 4 de 49



Numerosas sustancias orgánicas e inorgánicas son corrosivas o se absorben

fácilmente por la piel, produciendo intoxicaciones o dermatitis, por lo que se ha de

evitar su contacto directo; si este ocurriera, deberá lavarse inmediatamente con

abundante agua la parte afectada.

IV. RECOMENDACIONES PARA EL MANEJO DE ALGUNAS SUSTANCIAS

ESPECÍFICAS.

Ácido Fluorhídrico (HF):

Causa quemaduras de acción retardada en la piel, en contacto con las uñas causa

fuertes dolores, y sólo si se atiende a tiempo se puede evitar la destrucción de los

tejidos incluso el óseo.

Ácido Nítrico (HNO3):

Este ácido daña permanentemente los ojos en unos cuantos segundos y es

sumamente corrosivo en contacto con la piel, produciendo quemaduras, mancha las

manos de amarillo por acción sobre las proteínas.

Ácido Sulfúrico (H2SO4), Fosfórico (H3PO4) y Clorhídrico (HCl)

Las soluciones concentradas de estos ácidos lesionan rápidamente la piel y los tejidos

internos. Sus quemaduras tardan en sanar y pueden dejar cicatrices. Los accidentes

más frecuentes se producen por salpicaduras y quemaduras al pipetearlos

directamente con la boca.

V. ¿QUÉ HACER EN CASO DE ACCIDENTE?

En caso de accidente en el laboratorio, hay que comunicarlo inmediatamente al

docente.

Salpicaduras por ácidos y álcalis:

Lavarse inmediatamente y con abundante agua la parte afectada. Si la quemadura

fuera en lo ojos, después de lavado, acudir al servicio medico.

Si la salpicadura fuera extensa, llevar al lesionado al chorro de la regadera

inmediatamente y acudir después al servicio medico.

Quemaduras por objetos, líquidos o vapores calientes:

Aplicar pomada para quemaduras o pasta dental en la parte afectada. Es caso

necesario, proteger la piel con gasa y acudir al servicio medico.




VI. BUENAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO (BPL / GLP)

Las Buenas Prácticas de Laboratorio o Good Laboratory Practices (BPL / GLP), es un

conjunto de reglas, procedimientos operacionales y prácticas establecidas y promulgadas

por determinados organismos como The Organization for Economic Cooperation and

Development (OCDE), o la Food and Drug Administration (FDA) que se consideran de

obligado cumplimiento para asegurar la calidad e integridad de los datos producidos en

determinados tipos de investigaciones o estudios.

Esto surge debido a que en los años 1969 y 1975 las agencias reguladoras se enfrentaron

con grandes discrepancias en los datos dirigidas a ellas, obtenidas en distintos

laboratorios.

Había caso de laboratorios que no trabajaban bajo protocolos y la información solo estaba

en forma oral, en general los informes eran incompletos y no contaban con documentos

de procedimiento estandarizado.

Es necesario realizar un mejor trabajo, tanto en el manejo y desarrollo de estudio de

informes como en reportes de los laboratorios.

Las BPL abarcan todos los eslabones de un estudio de investigación y para ello se

necesita que previamente se haya establecido un “Plan de Garantía de la Calidad”. Para

verificar que el plan se cumple a lo largo de todo el estudio se precisa de un “sistema

planificado de actividades”, cuyo diseño o finalidad es asegurar que el Plan de Garantía

cumpla.

Las Normas BPL constituyen una filosofía de trabajo, son un sistema de organización de

todo lo que de alguna forma interviene en la realización de un estudio o procedimiento

encaminado a la investigación de todo producto químico o biológico que pueda tener

impacto sobre la especie humana. Las normas inciden en como debe trabajar a lo largo

de todo el estudio, desde el diseño hasta el archivo.

¡BIENVENIDOS!




PRÁCTICA Nº 1 SOLUCIONES

I. OBJETIVOS :- Identificar la existencia de soluciones en los sistemas biológicos.

- Explicar los cálculos y procedimientos para preparar soluciones porcentuales, molares y

normales, así como las diferentes diluciones de éstas.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO:Una solución es una mezcla homogénea de por lo menos dos componentes: una fase

dispersa, que es el Soluto, y una dispersora que constituye el solvente (disolvente) y que,

generalmente, se encuentra en mayor proporción. Las soluciones más utilizadas en

bioquímica son las que tienen agua como solvente.

La concentración es la magnitud física que expresa la cantidad de un elemento o un

compuesto por unidad de volumen. En el SI se emplean las unidades mol·m-3. Cada

sustancia tiene una solubilidad que es la cantidad máxima de soluto que puede disolverse

en una disolución, y depende de condiciones como la temperatura, presión, y otras

substancias disueltas o en suspensión.

Para expresar cuantitativamente la proporción entre un soluto y el disolvente en una

disolución se emplean distintas unidades: molaridad, normalidad, molalidad, formalidad,

porcentaje en peso, porcentaje en volumen, fracción molar, partes por millón, partes por

billón, partes por trillón, etc. También se puede expresar cualitativamente empleando

términos como diluido, para bajas concentraciones, o concentrado, para altas.

La dilución consiste en preparar una solución menos concentrada. Las diluciones se

expresan usualmente como una razón matemática, como 1:10, lo cual significa una

unidad de solución original diluida a un volumen final de 10, lo que es igual a un volumen

de solución original con nueve volúmenes de solvente (siendo el volumen final = 10.




Si bien la densidad no es una forma de expresar la concentración, ésta es proporcional a

la concentración (en las mismas condiciones de temperatura y presión). Por esto en

ocasiones se expresa la densidad de la solución a condiciones normales en lugar de

indicar la concentración; pero se usa más prácticamente y con soluciones utilizadas muy

ampliamente. También hay tablas de conversión de densidad a concentración para estas

soluciones; aunque el uso de la densidad para indicar la concentración es una práctica

que está cayendo en desuso.

La molaridad (M); expresa la concentración, como las moles de soluto en un litro de

solución. Se expresa como:

M = (moles de soluto)/(Litro de solución)

La normalidad (N); es el número de pesos equivalentes de soluto contenidos en un litro

de solución. Éstos indican la cantidad exacta de un reactivo que reacciona completamente

con una cantidad de otro. Al darse la concentración en Normalidad debe especificarse la

reacción, ya que el número de equivalencia depende de ésta. Por lo tanto, la normalidad

de una solución depende de la reacción para la cual está indicada y puede variar de una

reacción a otra.

N = (número de pesos equivalentes)/(Litro de solución)

.

III. MATERIALES Y REACTIVOS:

III.1 Equipos, Utensilios y Material de vidrio Balanza analítica Espátula Fiola 100 ml Vaso precipitación 100 ml Luna de reloj

III.2 Insumos Hidróxido de sodio. Alcohol. Glucosa.

IV. METODOLOGÍA:

Preparar soluciones normales, molares y porcentuales, así como identificar el soluto y

solvente en cada una de las soluciones, para su posterior uso en las diferentes pruebas

bioquímicas.


http://es.wikipedia.org/wiki/Presi%C3%B3n

http://es.wikipedia.org/wiki/Temperatura

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Proporcional&action=edit

http://es.wikipedia.org/wiki/Densidad_(f%C3%ADsica)



V. DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA

Preparar 100 ml de una solución de glucosa al 5%.

Preparar 50 ml de Hidróxido de sodio al 0.1 N.

A partir de una solución de alcohol al 96º, obtener 100 ml de alcohol al 20%.

Para realizar lo anterior primero deben de realizar los cálculos correspondientes, luego

pesar los solutos a disolver y mezclar vigorosamente.

VI. RESULTADOS Y DISCUSIONES

6.1. ¿Qué es una solución?

6.2. ¿Cuántas clases de concentraciones de Normalidad existen?, describa cada una de

ellas.

6.3. ¿Qué se entiende por los siguientes términos: mol, formalidad, molalidad?

6.4. ¿Qué significan: v/v, p/v, p/p y ppm?

6.5. ¿Qué es una solución isotónica?

6.6. ¿Qué es una solución osmolar?

6.7. ¿Qué se entiende por dilución y dilución seriada de las soluciones?




PRÁCTICA Nº 2 PROPIEDADES FISICO QUÍMICAS DEL AGUA

I. OBJETIVO

Comprender la relación existente entre las propiedades físicas y químicas del agua con

las fuerzas de interacción intermolecular.

Observar el comportamiento de dos grasas distintas en diferentes medios acuosos para

identificar las propiedades fisicoquímicas del agua.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

Cuando un compuesto soluble en agua es colocado en ésta, desaparece rápidamente en

el líquido. Por el contrario, si no es soluble, entonces permanece donde se le coloca. Si

posee una solubilidad intermedia, entonces se puede dispersar sobre la superficie del

agua hasta que se vuelve invisiblemente delgada.

Lo que determina el comportamiento de un compuesto en una solución son las complejas

interacciones de tipo eléctrico en las superficies de las moléculas.

Por ejemplo, la solubilidad de un compuesto químico en agua depende de la magnitud de

las interacciones de unión entre sus moléculas y las del agua. El grado de solubilidad

resulta de una competencia entre los enlaces que mantienen a cada molécula unida y las

oportunidades alternas de unirse con la otra sustancia.

Los compuestos orgánicos varían grandemente en su solubilidad en agua. La vida en la

Tierra no existiría sin esta variabilidad. Los compuestos orgánicos insolubles tienen

grupos componentes de átomos que forman pocas uniones (ninguna en algunos casos)

con moléculas de agua.

Se dice que tales grupos son hidrofóbicos, al igual que la molécula que tenga tales

grupos. Este término es confuso ya que implica una repulsión entre la molécula (o el

grupo) y el agua. El efecto no surge de la repulsión sino del hecho de que la unión es tan

débil que la cohesión del agua mantiene afuera al compuesto hidrofóbico.

Sin embargo, muchas moléculas orgánicas son parcialmente solubles en agua debido a

que por lo menos algunos de sus grupos atómicos se unen al agua. Mientras más de

estos grupos tenga el compuesto, será más soluble.




III. MATERIALES Y REACTIVOS

Equipos – materiales Reactivos Balanza Piceta Placas petri Espátula Manguera de hule Matraces volumétricos Mechero Pipetas

Micropipeta Vasos de precipitado de 50 ml Vaso de precipitado de 100 ml

Acetona. Ácido clorhídrico concentrado. Aceite de oliva. (ácido oleico). Agua destilada. Bicarbonato de sodio. Hidróxido de amonio. Hidróxido de sodio. Petrolato líquido. (Mezcla de

hidrocarburos del petróleo). Sudán III.

IV. METODOLOGIA

El alumno tendrá que aplicar el método experimental para el desarrollo de esta práctica

así como el método analítico para obtener los resultados citados.

V. DESCRIPCION DE LA PRACTICA

Antes de la práctica se debe preparar las siguientes soluciones:

Preparación de soluciones:1.- Prepare 100 ml de bicarbonato de sodio 20 % en agua. 2.- Prepare 25 ml de hidróxido de sodio 0.1 N en agua. 3.- Prepare 25 ml de ácido clorhídrico 0.1 N en agua. 4.- Prepare 25 ml de hidroxido de amonio 0.1 N en agua.

Comportamiento del aceite mineral. Vierta en una placa petri como se describe a continuación:1.- Vierta 10 ml de agua2.- Vierta 10 ml de solución de HCl .3.- Vierta 10 ml de solución de NaOH A cada placa agregue una gota de aceite mineral con una pipeta. Observe. Añada unas gotas más y observe. Mantenga las muestras en observación durante 30 minutos.

Comportamiento del ácido oleico (aceite de oliva). 1.- Vierta 10 ml de agua2.- Vierta 10 ml de solución de HCl .3.- Vierta 10 ml de solución de NaOH 4.- Vierta 10 ml de solución de hidroxido de amonio A cada placa agregue una gota de aceite de oliva coloreado con SUDAN III con una pipeta Pasteur. Observe.Añada unas gotas más y observe. Mantenga las muestras en observación durante 30 minutos.




Lave y caliente al rojo la punta de un clip o pinza, posteriormente colocarlo en una placa

con agua adicionar una pequeña gota de ácido oleico. Observe.

Coloque una segunda gota sobre la superficie. Observe.

Nota: para la eliminación de las sustancias, neutralizar los residuos ácidos con

bicarbonato de sodio, y los residuos alcalinos con bicarbonato de sodio.

VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Revise las estructuras químicas de los compuestos utilizados en el experimento.

Identifique las propiedades físicas y químicas de los grupos funcionales de los

compuestos utilizados.

Explique las variaciones en términos de las fuerzas que actúan entre el aceite de oliva, el

aceite mineral y las diferentes soluciones.




PRÁCTICA Nº 3 DETERMINACIÓN DEL PH Y ACIDEZ

(En productos Lácteos, Zumos de fruta y Harinas)

I. OBJETIVO

Dar a conocer algunos ensayos de las técnicas potenciométricas y acidimétricas

aplicadas al control de calidad de los alimentos.

Ser capaces de realizar el análisis de acidez de un alimento.

Ser capaces de obtener los valores de pH y acidez de un alimento.

II. FUNDAMENTO TEORICO

En 1909 Sorensen propuso expresar la concentración del ión hidrógeno como sus

logaritmos decimales con signo cambiado (o como el logaritmo decimal de su inversa) y

llamó a esta expresión “exponente de hidrógeno, designándolo con el símbolo pH.

pH = -log [ H+ ] = log 1 / [ H+ ] y [ H+ ] = 10-pH

De manera análoga se define:

pOH = - log [OH- ] = log 1/ [OH- ]

A temperatura ambiente (25°C)

pH + pOH = 14

Si la solución tiene reacción neutra, [H+] = [OH- ] y pH = pOH = 7

Si la solución tiene reacción ácida, [H+] > 1.10-7, por lo tanto pH < 7 < pOH.

Si la solución tiene reacción básica, [H+] < 1.10-7 < [OH- ] y pH > 7 > pOH.

Neutralización; toda vez que se reúnen soluciones de un ácido y de un hidróxido ocurre

una modificación química y la reacción (pH) de la solución resultante es diferente a la de

cada una de las soluciones iniciales. Tal modificación se llama neutralización. La

sustancia producto de la reacción química, aparte del agua, se llama sal.

ácido + hidróxido → sal + agua

HCl + NaOH → NaCl + H20

Se denomina hidrólisis el proceso por el cual una sal al disolverse en agua regenera el

ácido (o la base) de la cual proviene, dando origen a una solución cuya reacción es

alcalina (o ácida) según los casos.




La Titulación; es un operación analítica en la cual se determina o mide la concentración

desconocida de una solución de soluto y solventes conocidos, sobre la base del volumen

consumido de una solución de soluto (reactivo), solvente y concentración conocidos. Esta

última solución se llama solución valorada del respectivo reactivo.

Experimentalmente, este punto se determina con el punto final de la titulación que se

manifiesta por el cambio de color del indicador. El indicador es una sustancia que tiene

distinto color según el pH. En las titulaciones de este tipo se pretende llegar a un punto de

equivalencia que corresponda a la formación de una sal estequiométricamente definida

muchas veces como sal neutra.

Una sal estequiométricamente neutra puede tener una reacción realmente neutra (pH =

7,00) o también ácida pH < 7,00 o básica pH > 7,00.

Es por lo tanto necesario elegir correctamente el indicador adecuado a cada caso, pues el

empleo de un indicador inapropiado puede conducir a un punto de viraje que no coincide

con el punto de equivalencia que interesa observar.

Se dan a continuación los datos correspondientes a tres indicadores muy conocidos:

- Azul de bromotimol color amarillo a pH <6,00 y color azul a pH > 7,60

- Rojo de metilo color rojo a pH < 4,40 y color amarillo a pH > 6,20

- Fenolftaleína incolora a pH < 8,00 y color rosado a pH > 9,6

Indicador universal

Una mezcla de varios indicadores, por ejemplo: los citados anteriormente y el azul de

timol (anaranjado a pH 2,00 y azul a pH 9,00), permite la medición de una gama de pH de

límites relativamente amplias.

Una solución de: Azul de timol 0,025 g/l; Rojo de metilo 0,0625 g/l; Azul de bromotilol 0,25

g/l; Fenolftaleína 0,5 g/l; permite medir el pH por observación de los siguientes colores:


pH Color pH Color

10 Violeta 9 Azul índigo8 Azul verdoso 7 Verde6 amarillo 5 anaranjado4 rojo



Papel de tornasol

Es un papel impregnado con tintura de tornasol que se tiñe agregando una cantidad

ínfima de un ácido (papel de tornasol rojo) o de un álcali (papel de tornasol azul). Si una

gota de la solución analizada puesta sobre el papel azul lo tiñe de rojo, la reacción de la

solución es ácida. Si una gota de la solución analizada puesta sobre el papel rojo lo tiñe

de azul, la solución es básica. Si ninguno de los dos papeles cambia de color bajo la

influencia de la solución analizada, ésta se considera neutra.

Papel indicador de pH

Es un papel que va variando de color según el pH. Existen escalas de colores para

comparar.

Prácticamente todos las alimentos (harinas, lácteos, frutas y sus zumos) contienen ácidos

orgánicos que pueden detectarse por el sabor y en consecuencia los productos de zumo

de frutas conservan un carácter ácido. Puesto que es sabido que la química fundamental

de los tejidos vivos implica la formación de mezclas complejas de ácidos orgánicos.

En la mayoría de las frutas, no obstante, existe un ácido dominante mientras que otros

componentes se encuentran en cantidades secundarias o en cantidades traza.

Normalmente es suficiente determinar la acidez titulable, o acidez libre, calculada en el

ácido predominante. Una alícuota de la bebida, liberada del dióxido de carbono por

ebullición o agitación vigorosa, se titula con hidróxido sódico valorado a pH 8,1 usando

potenciómetro o utilizado fenolftaleina para detectar el punto final.

1 ml de NaOH 0,1 N representa: 0,10 mili equivalente de ácido

El valor de la titulación no indica si los ácidos presentes son fuertes o débiles. En muchos

casos, el conocimiento de la actividad del Ion hidrógeno resulta más útil que la acidez

titulable.

Durante el almacenamiento y deterioro de los alimentos, ocurren cambios por acción

enzimática y desarrollo de bacterias. Estos cambios dependen de manera importante de

la concentración del Ion hidrógeno más que de la acidez titulable presente.

III. MATERIALES Y REACTIVOS3.1 Muestra

Leche fresca Harina de trigo Zumo de fruta




3.2 Material de vidrio Bureta graduada y / o Pipeta graduada Erlenmeyer 250 ml Vasos de precipitación 250 ml Embudo Papel filtro Papel indicador de pH. Potenciómetro o Phmetro

3.3 Reactivos Solución de Fenolftaleína al 1% Solución de Hidróxido de Sodio al 0.1 N Agua destilada

IV. METODOLOGIA

Preparar soluciones acido, básicas para su posterior utilización, así como identificar el

porcentaje de acidez y pH de principales grupos alimenticios.

V. DESCRIPCION DE LA PRÁCTICA

Experiencia N° 1: Determinación del pH.

Se determinarán los pH de soluciones problemas.Colocar sobe una placa de vidrio pedacitos de papel pH. Mojar una varilla de vidrio en la primera solución problema y tocar con la varilla un trozo de papel pH . Observar.

Experiencia N° 2: Ph de harina (AOCO official meted 943.02, 1995)

Suspéndase 10 g de harina en 100 ml de agua destilada, a 25 ºC. Espérese durante 30 minutos, agitando de vez en cuando. Déjese en reposo otros 10 minutos más; decántese el líquido sobrenadante y

determínese en él el pH, a 25 ºC, empleando potenciómetro calibrado.

Acidez titulable de harina

Agitar 10 g de harina en 100 ml de agua libre de CO2 en un erlenmeyer de 300 ml de capacidad, durante 1 hora a intervalos de 10 minutos.

Filtrar la suspensión hasta obtener un volumen de filtrado que sobrepase los 50 ml Se toman los 50 ml de filtrado y se colocan en un frasco de erlenmeyer de 125 ml de

capacidad. Se titula con NaOH 0.1 N en presencia de 1 ml de solución de fenolftaleína al 1 % hasta

que se produzca el cambio de coloración, el cual deberá persistir por espacio de 30 segundos.

La acidez del extracto acuoso se calcula como ácido sulfúrico. (1 ml de NaOH 0.1N = 0.0049 g de H2SO4)

Experiencia N° 3: Acidez titulable de leche




Mídase o pésese una cantidad adecuada de muestra (unos 20 g); deposítese en una cápsula adecuada y dilúyase con dos veces su volumen de agua exenta de CO2.

Añádase 2 ml de una disolución de fenolftaleína y titúlese con NaOH 0.1 N hasta un color rosa persistente.

Exprésese la acidez en términos de porcentaje de ácido láctico. (1 ml de NaOH 0.1N = 0.0090 g de ácido láctico)

Experiencia N° 4: Acidez titulable de zumo de frutas

Transfiérase con una pipeta, 10 g de la muestra de fruta triturada o 25 ml de la “disolución de preparada” de jalea, conservas o fruta, y llevar a 250 ml con agua destilada.

Agregar 0.3 ml ó 2 gotas de una disolución de fenolftaleína al 1%. Titúlese con hidróxido de sodio 0.1N hasta que aparezca una tonalidad rosa que persista

por 30 segundos. Exprésese la acidez en términos del ácido predominante según la fruta a analizar.


% de acidez = G* N* meq del ácido*100g muestra

Donde:G : gasto de la solución de NaOH.N : Normalidad de la solución de NaOH.Meq. del ácido: mili equivalente del ácido en que se expresa la acidez (ácido predominante).g muestra: Peso de la muestra a analizar

- ¿Qué medio favorece al crecimiento de microorganismos: ácido o alcalino? , ¿Qué clase de microorganismos se reproducen en dicho medio?

- ¿Qué diferencia existe entre el pH y la Acidez?- Existe alguna correlación entre el pH de los alimentos y la cantidad de carbohidratos,

lípidos, proteínas en el mismo. Explicar- Según los valores obtenidos en clase, realiza una comparación con los valores reales.




PRÁCTICA Nº 4 RECONOCIMIENTO DE PROTEINAS

I. OBJETIVO

Identificar a través de pruebas bioquímicas las proteínas existentes en soluciones

problemas

II. FUNDAMENTO TEORICO

Coagulación de Proteínas; Las proteínas, debido al gran tamaño de sus moléculas,

forman con el agua soluciones coloidales. Estas soluciones pueden precipitar con

formación de coágulos al ser calentadas a temperaturas superiores a los 70º C o al ser

tratadas con soluciones salinas, ácidos, alcohol, etc.

La coagulación de las proteínas es un proceso irreversible y se debe a su

desnaturalización por los agentes indicados, que al actuar sobre la proteína la desordenan

por la destrucción de su estructura terciaria y cuaternaria

Reacción Xantoproteica: Es debida a la formación

de un compuesto aromático nitrado de color amarillo,

cuando las proteínas son tratadas con ácido nítrico

concentrado. La prueba da resultado positivo en

aquellas proteínas con aminoácidos portadores de

grupos bencénicos, especialmente en presencia de

tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza

c

on un álcali vira a un color anaranjado oscuro.

Reacción de Biuret: La producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos,

ya que se debe a la presencia del enlace peptídico (- CO- NH -)que se destruye al

liberarse los aminoácidos.

Cuando una proteína se pone en contacto con un álcali concentrado, se forma una

sustancia compleja denominada Biuret, de fórmula:

Que en contacto con una solución de sulfato cúprico diluida, da

una coloración violeta característica.

Reacción de los aminoácidos azufrados: Se pone de manifiesto por la formación de un

precipitado negruzco de sulfuro de plomo. Se basa esta reacción en la separación




mediante un álcali, del azufre de los aminoácidos, el cual al reaccionar con una solución

de acetato de plomo, forma el sulfuro de plomo. III. MATERIALES Y REACTIVOS

3.1 Muestra Clara de huevo

3.2 Material de vidrio Tubos de ensayo

Gradilla

Varillas de vidrio

Mechero

Vasos de precipitados

Pipetas

Vaqueta

3.4 Reactivos Acido nitrico concentrado

Hidroxido de sodio a 40 %

Hidroxido de sodio al 20 %

Sulfato cuprico al 1 %

Acetato de plomo al 5 %

IV. METODOLOGIA

El alumno tendrá que aplicar el método experimental para el desarrollo de esta practica


V. DESCRIPCION DE LA PRÁCTICA

V.1. REACCIÓN XANTOPROTEICA:

1. Poner en el tubo de ensayo de 2 a 3 cc. de solución problema (clara de huevo).

2. Añadir 1 cc. de HNO3 concentrado.

3. Calentar al baño maría a 100: C..

4. Enfriar en agua fría

5. Añadir gota a gota una disolución de sosa al 40%.

V.2. REACCIÓN DE BIURET:

1. Tomar un tubo de ensayo y poner unos 3 cc. de albúmina de huevo.

2. Añadir 2cc. de solución de hidróxido sódico al 20%.

3. A continuación 4 ó 5 gotas de solución de sulfato cúprico diluida al 1%. Debe

aparecer una coloración violeta-rosácea característica.




V.3. REACCIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS AZUFRADOS

1. Poner en el tubo de ensayo de 2 a 3 cc. de albúmina de huevo (clara de huevo).

2. Añadir 2 cc. de solución de hidróxido sódico al 20%.

3. Añadir 10 gotas de solución de acetato de plomo al 5%.

4. Calentar el tubo hasta ebullición.

5. Si se forma un precipitado de color negruzco nos indica que se ha formado sulfuro

de plomo, utilizándose el azufre de los aminoácidos, lo que nos sirve para

identificar proteínas que tienen en su composición aminoácidos con azufre.


Describir lo encontrado en la experiencia realizada.

VI.1. ¿Cómo se manifiesta la desnaturalización de la clara de huevo?

VI.2. ¿Cuál de los tres agentes utilizados tiene mayor poder de desnaturalización?

VI.3. ¿Cómo podríamos saber que una sustancia desconocida es una proteína?

VI.4. ¿Qué coloración da la reacción del Biuret?

VI.5. ¿Una proteína coagulada podría dar la reacción del Biuret?

VI.6. Si se realiza la reacción del Biuret sobre un aminoácido como la Glicina ¿es positiva

o negativa? ¿Por qué?




PRÁCTICA Nº 5 PROPIEDADES FÍSICAS DE LAS PROTEINAS

I. OBJETIVO

- Estudiar la propiedad amortiguadora del pH de las proteínas (Ej. Proteínas

plasmáticas, proteínas de la clara de huevo, proteínas de la leche, etc.)

- Estudiar la precipitación de proteínas por sales neutras

- Estudiar la precipitación de proteínas por solventes orgánicos.


En las cadenas polipeptídicas de las proteínas los grupos amino y carboxilo de los

aminoácidos, salvo los terminales, se encuentran constituyendo los enlaces peptídicos.

De este modo los grupos que pueden cargarse eléctricamente y actuar como ácidos

débiles, confiriéndoles a las proteínas la capacidad de actuar como amortiguadores; son:

(a) Carboxilos libres de los aminoácidos di carboxílicos, cuyos pKa fluctúan alrededor de 4

(b) Épsilon amino de la lisina, guanidino de la arginina, fenol de la tirosina, sulfhídrico de

la cisteína, cuyos pKa son superiores a 9.

(c) Imidazol de la histidina cuyo pKa en las proteínas es de 5,6 a 7.

Las sales neutras en altas concentraciones disminuye la solubilidad de las proteínas, lo

cual se debe probablemente a una deshidratación de las moléculas proteicas.

El solvente, en estos casos, se organiza alrededor de los iones de la sal, de modo que

éste disminuye alrededor de las moléculas de proteínas, las que se asocian en una fase

sólida.

La fuerza iónica a la cual precipitan las proteínas es característica para cada una de ellas,

a iguales condiciones de pH y temperatura. Esta propiedad permite separar mezclas de

proteínas.

El agua tiene una constante dieléctrica relativamente alta (80.36 a 20°C), por lo cual en

solución acuosa disminuye la interacción entre las moléculas proteicas (debido a sus

grupos cargados), mientras que aumenta la interacción entre las proteínas y el agua. Esto

favorece la solubilidad de las proteínas. Los solvente orgánicos tales como el Etanol,

metanol y acetona tienen constantes dieléctricas bajas (25; 32,4 y 19,6 respectivamente a

20°C), de modo que al agregarlos a una solución acuosa de proteínas baja la constante

dieléctrica del medio, y además disminuye la concentración efectiva (actividad) del agua;

lo que favorece la interacción de los iones proteicos entre sí y por lo tanto su precipitación.





3.1 Muestra Clara de huevo

Leche

Solución de caseína

3.2 Material de vidrio Baño María

Termómetro

Tubos de Ensayo

Pinza de madera

Vasos de precipitación 250 ml

Embudo

Papel filtro

3.3 Reactivos Indicador rojo de metilo

HCl 10 m mol /L

NaCl 0,15 M

Etanol

Acetona

Solución saturada de sulfato de sodio (*)

(*) Pese 23 g de sulfato de sodio anhidro. Disolver en 70 ml de agua destilada a

50°C. Completar a 100 ml con agua, cuidando que la temperatura no baje de

37°C. Guardar a esa temperatura para evitar su precipitación.

IV. METODOLOGÍA

Se utilizará la experimentación directa, acompañada de la observación y la deducción.


5.1 Propiedad amortiguadora de pH

Tome 1 ml de la clara de huevo en un tubo de ensayo y desproteinizar de la

siguiente manera: Calentar el tubo con la muestra en un baño de ebullición

durante 1 a 2 minutos, luego filtrar o centrifugar. Luego complete el volumen del

filtrado a 2 ml con agua destilada.

Tome 1 ml de la clara de huevo en otro tubo de ensayo y agregue 1 ml de agua

destilada.




Agregue a cada tubo 1 o 2 gotas del indicador rojo de metilo y titule con HCl 10

mmol/L. Anote sus resultados y compare.

5.2 Precipitación por sales neutras

Tome 2 ml de caseína en un vaso precipitado. Agregue 30 ml de la solución

saturada de sulfato de sodio.

Espere de 10 a 15 minutos para que la precipitación sea completa. Filtre o

centrifugue. 5.3 Precipitación por solventes orgánicas

Tome 2 tubos de prueba y agregue a cada uno 1 ml de solución de caseína.

Agregue 3 ml de acetona, dejando un tubo a temperatura ambiente y el otro en

refrigeración por 30 minutos. Anotar sus observaciones.

Diluir 1:4 cada muestra con solución de cloruro de sodio 0,15M, tenerlas a

temperatura ambiente unos minutos. Anotar sus observaciones.

Repetir el experimento utilizando como solvente el Etanol.


Describir lo encontrado en la experiencia realizada y responder brevemente las siguientes

preguntas.

1. ¿Qué son las proteínas, cómo se clasifican?

2. ¿Qué es punto isoeléctrico?

3. Diferencie entre hidrólisis, desnaturalización y precipitación

4. ¿Qué es pKa?

5. ¿Qué es una constante dieléctrica?

6. ¿Qué tipo de proteínas son las albúminas?

7. ¿Qué características tienen las globulinas?




PRÁCTICA Nº 6 RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS

I. OBJETIVO

- Reconocimiento cualitativo de algunos glúcidos o carbohidratos.

- Observar la hidrólisis del enlace de un disacárido.


Los carbohidratos también llamados hidratos de carbono o glúcidos, son compuestos de

amplia distribución en la naturaleza, la mayoría son de origen vegetal formados durante el

proceso de la fotosíntesis. Los hidratos de carbono son sustancias orgánicas que

contienen grupos aldehídos o cetónicos potenciales (que en su estado libre poseen un

intenso poder reductor) y numerosos grupos alcohólicos secundarios y primarios. A causa

de la similitud de sus estructuras y reacciones, resulta difícil identificarlos y determinarlos.

Son primordiales en la alimentación ya que al ser oxigenados en las células liberan

energía para las funciones de los organismos; son también importantes en la industria

como es el caso de la elaboración del papel a partir de la celulosa. Se clasifican en:

a. Monosacárido: azucares simples no hidrolizables como la triosa o pentosas.

b. Oligosacàrido: (disacáridos) sacarosa, maltosa, lactosa.

c. Polisacáridos: almidón, glucógeno, celulosa, quitina.

Los Azúcares presentes en una muestra de azúcar comercial o de algún producto

azucarado se determinan cuantitativamente por métodos físicos (ópticos) o por métodos

químicos. Los ensayos que se llevan a cabo con los hidratos de carbono son de tres tipos:

a. Estudio de las propiedades ópticas y de las formas de los cristales aislados de las

soluciones en que se encuentran, o estudio de los cristales de ciertos derivados.

b. Estudio de la fermentación por acción de levaduras, hongos o bacterias.

c. Estudio de los colores característicos y de los precipitados que se forman cuando se los

trata con: Yodo, fenoles o aminas aromáticas, soluciones alcalinas o débilmente acidas de

iones metálicos pesados (Cu, Bi, Hg, Fe), etc.


3.1 Muestra Glucosa al 5 %

Lactosa al 5%

Tomate

Muestras problema

Fructuosa 5 %




3.2 Material de vidrio Cocina eléctrica

Mechero

Tubos de Ensayo

Gradillas

Probeta de 50 ml

Pinza de madera

Vasos precipitado de 100- 50 ml

Pipeta

Gotero

3.3 Reactivos Azul de metileno.

Amoniaco al 30%

Nitrato de plata

NaOH 10%

Reactivo de fehling A y fehling B

Lugol

IV. METODOLOGÍA



5.1 Determinación de Azúcares Reductores (método de Fehling)

Los monosacáridos y la mayoría de los disacáridos poseen poder reductor, que deben al

grupo carbonilo que tienen en su molécula. Este carácter reductor puede ponerse de

manifiesto por medio de una reacción redox llevada a cabo entre ellos y el sulfato de

Cobre (II). Las soluciones de esta sal tienen color azul. Tras la reacción con el glúcido

reductor se forma óxido de Cobre (I) de color rojo. De este modo, el cambio de color

indica que se ha producido la citada reacción y que, por lo tanto, el glúcido presente es

reductor.

El método puede ser volumétrico o gravimétrico. El método gravimétrico se conoce como

la propuesta de Munson y Walker y el método volumétrico como la propuesta de Eynon-

Lane.

El método gravimétrico corresponde a la cantidad de cobre reducido en presencia de

azúcares reductores; el peso en miligramos de Cu2O corresponde a los miligramos de

azúcares analizados, por medio de las tablas de Munson y Walker que aparecen en el

AOAC. (Hay que tener en cuenta las diluciones para reportar la concentración final)




1. Mezclar en un tubo de ensayo:

Fehling A (CuSO4) 2 ml

Fehling B (Tartrato/NaOH) 2 ml

2. Agitar y calentar a ebullición (aproximadamente 1 min).

3. Añadir 1 ml de la disolución de azúcares y hervir durante un minuto. Si se reduce el

cobre se forma un precipitado de Cu2O de color rojizo.

La reacción será positiva si la muestra se vuelve de color rojo y será negativa si

queda azul o cambia a un tono azul-verdoso.

Observar y anotar los resultados de las distintas muestras de glúcidos.

5.2 Identificación de Monosacáridos – reacción del azul de metileno

1. Colocar 1ml de glucosa o fructuosa en un tubo de ensayo.

2. Agregar 1 ml de NaOH al 10 %

3. Añadir 2 o 3 gotas de azul de metileno y calentar

¿Qué ocurre con el color azul?

¿Qué agente es el responsable del cambio? ¿Por qué?

5.3 Prueba del espejo de plata

1. Añadir en un tubo de ensayo:

- AgNO3 1% 1 ml

- NH3 30% 1 ml

- Disolución de azúcar 1 ml

2. Mezclar bien y se calentar durante 2 minutos.

3. Sacar y dejar reposar.

Si el ensayo es positivo la plata metálica, que precipita, se va depositando en la pared del

tubo formando un espejo (“espejo de plata”).

5.4 Determinación de Polisacáridos

Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el I2 y el polisacárido. El color de

ese complejo depende del polisacárido presente. El almidón es un polisacárido vegetal

formado por dos componentes: la amilosa y la amilopectina. La primera se colorea de azul

en presencia de yodo debido no a una reacción química sino a la adsorción o fijación de

yodo en la superficie de la molécula de amilosa, lo cual sólo ocurre en frío. Como reactivo

se usa una solución denominada lugol que contiene yodo y yoduro potásico. Como los

polisacáridos no tienen poder reductor, la reacción de Fehling da negativa.




Almidón: amilosa: azul y amilopectina: rojo-violáceo (si están presentes los dos

componentes predomina el azul).

Glucógeno: rojo-violáceo.

Dextrinas: rojo-violáceo

1. Colocar en un tubo de ensayo 3ml de la solución de almidón.

2. Añadir 3 gotas de la solución de lugol.

3. Observar y anotar los resultados.

4. Calentar suavemente, sin que llegue a hervir, hasta que pierda el color.

5. Enfriar el tubo de ensayo al grifo y observar cómo, a los 2-3 minutos, reaparece el color

azul.



preguntas.

1. ¿Que son los azúcares reductores y enuncie cinco de ellos?

2. Defina y grafique la estructura de la sacarosa, celulosa, hemicelulosa, almidón.

3. Describa los principales usos de los carbohidratos en la Agroindustria.

4. De una breve descripción de los siguientes productos: miel de caña, miel de abejas y

panela.




PRÁCTICA Nº 7 RECONOCIMIENTO E HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN

I. OBJETIVO

Que el alumno reconozca un polisacárido y su hidrólisis.


Es un polisacárido de reserva vegetales. Para reconocerlo se utiliza la solución de Lugol.

(yodo y yoduro potasico en medio acido). Al añadir tal solución el almidón adquiere una

coloración oscura, azul-violeta. Esta coloración no es debida a ninguna reacción química

sino a que el lugol se adsorbe a la superficie del almidón, de forma que si lo calentamos

se separan y la coloración desaparece.

El almidón cuando se hidroliza libera amilasa y amilo pectina, si la hidrólisis prosigue se

van liberando oligosacardos de glucosa y finalmente glucosas.


3.1 Muestra Papa

Solución de almidón


Cuentagotas

Pipeta

Luna de reloj

Porta y cubre objetos

Microscopio

Vaso de precipitado

Tripo con rejilla

Mechero de ron

Vasos de precipitado de 100 – 250 ml

Cuchillo

3.3 Reactivos Lugol

NaOH al 20%

IV. METODOLOGÍA

El alumno tendrá que aplicar el método experimental para el desarrollo de esta practica






5.1 Hidrólisis del almidón

1. Coloca en un tubo de ensayo 2 ml. De solución de almidón, y añadir 2 o 3 gotas

de lugol.

2. Observar y anotar la coloración.

5.2 Hidrólisis del almidón de papa

1. Colorar el líquido del raspado de la papa en un portaobjetos, añadir un poco de

lugol y observar en un microscopio la forma de los granos de almidón.

2. Se puede hacer una observación antes de la aplicación del lugol.

3. Colocar en un tubo de ensayo 2ml de aceite y 2ml de NaOH al 20%..

4. Agitar enérgicamente y colocar el tubo al baño María de 20 a 30 minutos.

5. Pasado este tiempo, se pueden observar en el tubo 3 fases: una inferior clara

que contiene la solución de sosa sobrante junto con la glicerina formada, otra

intermedia semisólida que es el jabón formado y una superior lipídica de aceite

inalterado.



preguntas.




PRÁCTICA Nº 8 RECONOCIMIENTO DE LÍPIDOS

I. OBJETIVO

Identificar a través de pruebas bioquímicas los lípidos en las muestras problema.

Brindar al alumno los reconocimientos básicos para desarrollar análisis en grasas y aceites.


SAPONIFICACIÓN:

Las grasas reaccionan en caliente con el hidróxido sódico o potásico descomponiéndose

en los dos elementos que las integran: glicerina y ácidos grasos. Éstos se combinan con

los iones sodio o potasio del hidróxido para dar jabones, que son en consecuencia las

sales sódicas o potásicas de los ácidos grasos. En los seres vivos, la hidrólisis de los

triglicéridos se realiza mediante la acción de enzimas específicos (lipasas) que dan lugar

a la formación de ácidos grasos y glicerina.

TINCIÓN:

Los lípidos se colorean selectivamente de rojo -anaranjado con el colorante Sudán III.

SOLUBILIDAD:

Los lípidos son insolubles en agua. Cuando se agitan fuertemente en ella se dividen en

pequeñísimas gotas formando una emulsión de aspecto lechoso, que es transitoria, pues

desaparece en reposo por reagrupación de las gotitas de grasa en una capa que, por su

menor densidad, se sitúa sobre el agua. Por el contrario, las grasas son solubles en

disolventes orgánicos, como el éter, cloroformo, acetona, benceno, etc.


3.1 Muestra Tinta china roja

Aceite de oliva.


Gradilla

Varillas de vidrio

Mechero

Cocina eléctrica

Rejilla de asbesto por cocina

Vasos de precipitado de 150 – 250 ml

Pipetas




3.3 Reactivos Solución de NaOH al 20%

Solución de Sudán III

Eter, cloroformo o acetona

IV. METODOLOGÍA




5.1 Saponificación

1. Colocar en un tubo de ensayo 2ml de aceite y 2ml de NaOH al 20%.

2. Agitar enérgicamente y colocar el tubo al baño María de 20 a 30 minutos.

3. Pasado este tiempo, se pueden observar en el tubo 3 fases: una inferior clara

que contiene la solución de sosa sobrante junto con la glicerina formada, otra

intermedia semisólida que es el jabón formado y una superior lipídica de aceite

inalterado.

5.2 Tinción

1. Disponer en una gradilla 2 tubos de ensayo colocando en ambos 2ml de aceite.

2. Añadir a uno de los tubos 4-5 gotas de solución alcohólica de Sudán III.

3. Al otro tubo añadir 4-5 gotas de tinta roja.

4. Agitar ambos tubos y dejar reposar.

5. Observar los resultados: en el tubo con Sudán III todo el aceite tiene que

aparecer teñido, mientras que en el tubo con tinta, ésta se irá al fondo y el aceite

no estará teñido.

5.3 Solubilidad

1. Poner 2ml de aceite en dos tubos de ensayo.

2. Añadir a uno de ellos 2ml de agua y al otro 2ml de éter u otro disolvente

orgánico,

3. Agitar fuertemente ambos tubos y dejar reposar.

4. Observar los resultados: Se verá cómo el aceite se ha disuelto en el éter y, en

cambio no lo hace en el agua y el aceite subirá debido a su menor densidad.






preguntas.

1. ¿Qué son los jabones?

2. ¿Cómo se pueden obtener los jabones?

3. ¿Por qué en la saponificación la glicerina aparece en la fase acuosa?

4. ¿Qué enzima logra en el aparato digestivo la hidrólisis de las grasas?

5. Indica lo que ocurre con la mezcla aceite-Sudán III y aceite-tinta y explica a qué se

debe la diferencia entre ambos resultados.

6. ¿Qué ocurre con la emulsión de agua en aceite transcurridos unos minutos de reposo?

¿Y con la de los otros compuestos empleados y aceite?¿A qué se deben las diferencias

observadas entre ambas emulsiones?




PRÁCTICA Nº 9 ANÁLISIS CUANTITATIVO DE ENZIMAS

I. OBJETIVO

Determinar la presencia de enzimas en productos de origen animal o vegetal mediante reacciones químicas específicas.

Identificar la acción de la catalasa, peroxidasa y tirosidasa.


Las enzimas cumplen las dos leyes comunes a todos los catalizadores: la primera es que

durante la reacción no se alteran, y la segunda es que no desplazan la constante de

equilibrio para que se obtenga más producto, sino que simplemente favorecen que la

misma cantidad de producto se obtenga en menos tiempo.

Las enzimas, a diferencia de los catalizadores no biológicos, presentan una gran

especificidad, actúan a temperatura ambiente y consiguen un aumento de la velocidad de

reacción de un millón a un trillón de veces.

En toda reacción química se produce una transformación de unas sustancias iniciales,

denominadas reactivos o sustratos (S), en unas sustancias finales o productos (P). Esta

transformación no se verifica directamente, ya que es necesario un paso intermedio en el

cual el reactivo se active, de forma que sus enlaces se debiliten y se favorezca su ruptura.

Este paso intermedio recibe el nombre de complejo activado y requiere un aporte de

energía, generalmente en forma de calor, que se conoce como energía de activación.

Las enzimas, una vez que han realizado la transformación del sustrato o sustratos en

productos, se liberan rápidamente de ellos para permitir el acceso a otros sustratos.

Algunas enzimas no son activas hasta que sobre ellas actúan otras enzimas o iones.

Estas enzimas se denominan zimógenos o proenzimas. Por ejemplo, el pepsinógeno, que

el HCl transforma en pepsina.

En la cadena polipeptídica de una enzima se pueden distinguir tres tipos de aminoácidos:

• Aminoácidos estructurales, sin función dinámica.

• Aminoácidos de fijación, encargados de establecer enlaces débiles con el sustrato.

Constituyen el centro de fijación de la enzima.




• Aminoácidos catalizadores, que se unen al sustrato mediante enlaces covalentes, de

forma que en dicho sustrato se debilita la estructura molecular favoreciendo su ruptura.

Constituyen el centro catalítico de la enzima.

Las enzimas alostéricas suelen estar constituidas por varias subunidades o protómeros.

Cada protómero posee dos centros: un centro regulador y otro centro catalítico o activo. Al

unirse a este centro una molécula, el activador, modulador o ligando, la conformación del

protómero varía, haciendo funcional al centro catalítico. De esta forma, la enzima

alostérica pasa de un estado inhibido (T) a un estado catalítico o activo (R). La variación

en la conformación de un protómero se transmite a los otros protómeros asociados

haciéndolos activos, efecto que se denomina transmisión alostérica.

La Catalasa

Es una enzima que se encuentra en las células de los tejidos animales y vegetales. La

función de esta enzima en los tejidos es necesaria por que durante al metabolismo

celular, se forma una molécula toxica que es el peroxido de hidrógeno, H2O2 (agua

oxigenada).

La existencia de catalasa en los tejidos animales, se aprovecha para utilizar el agua

oxigenada como desinfectante cuando se echa sobre una herida. Como muchas de las

bacterias patógenas son anaerobias (no puede vivir con oxigeno), mueren con el

desprendimiento de oxigeno que se produce cuando la catalasa de los tejidos actúa sobre

el agua oxigenada.

La Peroxidasa

Es una enzima que cataliza la oxidación de ciertos compuestos dadores de hidrógeno,

como fenoles (guayacol, pirogalol) y aminas aromáticas (o-fenilendiamina) por medio de

peróxidos. El sustrato oxidable más usado es el guayacol, que es oxidado a un complejo

coloreado de tetraguayacol en presencia de peroxidasa.

Las enzimas peroxidasas (POXs) están ampliamente distribuidas en animales, plantas y

microorganismos. Éstas presentan múltiples formas isoenzimáticas que difieren tanto en

la secuencia de sus aminoácidos como en sus propiedades químicas. La POXs esta

involucrada en procesos fisiológicos relevantes de las plantas superiores tales como

lignificación, catabolismo de auxinas, resistencia a patógenos, como así también en

diversos mecanismos de respuesta a situaciones de estrés.

La demostración citoquímica de esta enzima se basa en la acción oxidante de la

peroxidasa sobre el sustrato bencidina en presencia de peróxido de hidrógeno,

formándose un color café oscuro en el sitio de la actividad de la enzima. La reacción




positiva se visualiza por la formación de gránulos café oscuro en el citoplasma de los

tejidos a analizar.

La Tirosinasa

La enzima responsable del pardeamiento enzimático recibe el nombre de

polifenoloxidasa, fenolasa o tirosinasa, en este último caso especialmente cuando se hace

referencia a animales, ya que en ellos la tirosina es el principal sustrato. También se ha

utilizado el término cresolasa, aplicado a la enzima de vegetales. La polifenoloxidasa tiene

dos actividades enzimáticas, una hidroxilando monofenoles (“cresolasa”) y otra oxidando

difenoles a quinonas (“catecolasa”). Dependiendo de la fuente, la actividad “cresolasa” es

mayor o menor, incluso inexistente en algunos casos. En cambio, todas las enzimas

tienen actividad “catecolasa”. La característica estructural más importante de estas

enzimas es la presencia en su centro activo de dos átomos de cobre, unidos cada uno de

ellos a tres histidinas, que se han conservado a lo largo de la evolución en todas las

enzimas de este tipo, desde las bacterias al hombre. En su entorno se sitúan una serie de

aminoácidos hidrofóbicos, con anillos aromáticos, que también son importantes en su

actividad, para la unión de los sustratos. Los sustratos de la reacción pueden ser

monofenoles o difenoles. La tirosina es el sustrato principal de la polifenoloxidasa en los

crustáceos, y también se encuentra presente en vegetales como la lechuga o en los

champiñones. En los vegetales, el sustrato más extendido es probablemente el ácido

clorogénico, en el que el grupo fenólico se encuentra unido a un resto de azúcar, que se

encuentra, entre otros, en manzanas, peras, melocotones, ciruelas, uvas, paltas y papas.

Las polifenoloxidasas son también en muchos casos capaces de oxidar aminas

aromáticas para formar o-aminofenoles


3.1 Muestra Papa cruda.

Trocitos de tomate

Jugo de limón

Zanahoria

Carne cruda

Rábano


Gradilla

Varillas de vidrio

Mechero

Cocina eléctrica

Rejilla de asbesto por cocina




Vasos de precipitado de 150 – 250 ml (12 unidades)

Pipetas

Rallador

Cronómetro

Embudo

Papel de filtro alimentario (para infusiones filtrantes)

Gasa

Mortero

3.3 Reactivos Peróxido de hidrógeno (Agua Oxigenada)

IV. METODOLOGÍA



5.1 Reconocimiento de la Cataasa

1. Formar una pila de tubo según la muestra de tejidos vegetales con las que

cuente.

2. Colocar las muestras de tejidos en cada tubo

3. Añadir 5 ml de agua oxigenada al mismo tiempo

4. Cronometrar el tiempo de reacción de cada muestra

5. Ir observando la mayor o menor actividad, según el tejido con el que se realice

la experiencia

6. Identificar al más reactivo

7. Realizar esquemas de las observaciones.

5.2 Desnaturalización de la Catalaza

Mediante esta experiencia vamos a ver una propiedad fundamental de proteínas,

que es la desnaturalización. Ya que la catalasa químicamente es una proteína,

podemos desnaturalizarla al someterla a altas temperaturas. Al perder la

estructura terciaria, perderá también la función y como consecuencia su función

catalítica, por lo que no podrá descomponer el agua oxigenada y no se observara

ningún tipo de reacción cuando hagamos la experiencia anterior con muestras de

tejidos hervidos.




5.3 Determinación de la Peroxidasa

5.3.1 Prueba de la Bencidina:

1. Añadir a un ml de extracto acuoso filtrado de rábano 5 gotas de solución

alcohólica de bencidina.

2. Agregar dos gotas de peroxido de hidrógeno al 0.5% y agitar suavemente.

3. Anotar los resultados.

5.3.2 Prueba del Pirogalol:

1. Utilizando un rallador rallar la papa fresca sobre un mortero limpio.

2. Tomar una pequeña cantidad de la papa rallada sin exprimir y colocarla en un

tubo de ensayo.

3. Añadir un ml. de pirogalol al 1% y 2 gotas de peróxido de hidrógeno al 2%.

4. Observar la aparición de un precipitado. Anotar los resultados.

5.4 Determinación de la Tirosinasa

1. Rallar una papa fresca y exprimirla a través de una gasa doble e

inmediatamente filtrar el extracto en un embudo.

2. Vaciar a un tubo de ensayo un ml. del extracto y añadir 3 gotas de solución de

tirosina.

3. Agitar el contenido del tubo y luego colocarlo en baño de agua caliente a 40ºC.

4. Cada dos minutos agitar el tubo de ensayo para que el líquido tenga mejor

contacto con el oxigeno del aire.

5. Observar y anotar los cambios de coloración de la mezcla reaccionante.






PRÁCTICA Nº 10 EXTRACCIÓN DE ADN

I. OBJETIVO

Realizar una extracción casera de la presencia de ADN en vegetales.


La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones

salinos son atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolución y

posterior extracción de la célula. Se empieza por lisar (romper) las células mediante un

detergente, vaciándose su contenido molecular en una disolución tampón en la que se

disuelve el ADN. En ese momento, el tampón contiene ADN y todo un surtido de restos

moleculares: ARN, carbohidratos, proteínas y otras sustancias en menor proporción. Las

proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrán fraccionado en cadenas más

pequeñas y separadas de él por acción del detergente. Sólo queda, por tanto, extraer el

ADN de esa mezcla de tampón y detergente, para lo cual se utiliza alcohol isoamílico,

probablemente el único reactivo de esta práctica que no suele haber en una cocina.


3.1 Muestra Hielo triturado

Cebolla

Ajos

Tomate

Leche


Gradilla

Varillas de vidrio

Batidor

Nevera

Colador o Centrífuga

Vasos de precipitado de 150 – 250 ml (12 unidades)

Pipetas

Rallador

3.3 Reactivos Agua (destilada o mineral)

Sal de mesa

Bicarbonato sódico

Detergente líquido o champú




Alcohol isoamílico a 0ºC.

IV. METODOLOGÍA




1. Preparar el tampón con los siguientes ingredientes y mantener en la nevera o en un

baño de hielo triturado: 120 ml de agua, si es posible destilada y si no mineral. No usar

agua del grifo. 1,5 g de sal de mesa, preferiblemente pura. 5 g de bicarbonato sódico. 5 ml

de detergente líquido o champú.

2. Elegir la muestra que va a proporcionar el ADN entre los vegetales que pueda haber

(cebolla, ajo, tomates, etc.) y cortarla en cuadraditos.

3. Triturar la muestra con un poco de agua en la batidora accionando las cuchillas a

impulsos de 10 segundos. Así se romperán muchas células y otras quedarán expuestas a

la acción del detergente.

4. Mezclar en un recipiente limpio 5 ml del triturado celular con 10 ml del tampón frío y

agitar vigorosamente durante al menos 2 minutos. Separar después los restos vegetales

más grandes del caldo molecular haciéndolo pasar por un colador lo más fino posible. Lo

ideal es centrifugar a baja velocidad 5 minutos y después pipetear el sobrenadante.

5. Retirar 5 ml del caldo molecular a un tubo de ensayo y añadir con pipeta 10 ml de

alcohol isoamílico enfriado a 0ºC. Se debe dejar escurrir lentamente el alcohol por la cara

interna del recipiente, teniendo éste inclinado. El alcohol quedará flotando sobre el

tampón.

6. Se introduce la punta de una varilla estrecha hasta justo debajo de la separación entre

el alcohol y el tampón. Remover la varilla hacia delante y hacia atrás y poco a poco se

irán enrollando los fragmentos de mayor tamaño de ADN. Pasado un minuto retirar la

varilla atravesando la capa de alcohol con lo cual el ADN quedará adherido a su estremo

con el aspecto de un copo de algodón mojado.






PRÁCTICA Nº 11 LAS RUTAS METABÓLICAS

I. OBJETIVO

Reconocer la degradación de la glucosa, dando por consiguiente el proceso de la glucólisis y respiración (ciclo de Krebs).


La degradación de la glucosa es realizada por el proceso de glucólisis en el citoplasma

por la acción del ADP obteniendo acido Pirúvico, De acuerdo a las circunstancias puede

realizarse dos procesos:

1.- Sin oxigeno obtenemos el proceso de fermentación con la obtención de etanol

o acido lactico.

2.- Con oxigeno pasando al ciclo de Krebs obteniendo diferentes sustancia, la cual

se realiza en las mitocondrias.

LA GLUCÓLISIS:

Comienza con una molécula de glucosa. En este proceso, primero se invierte energía por

transferencia de un grupo fosfato desde una molécula de ATP, una por cada paso, a la

molécula de azúcar. La molécula de 6 carbonos luego se escinde y, de allí en adelante, la

secuencia produce energía. En cierto momento se reduce una molécula de NAD+ a

NADH e H+ almacenándose parte de la energía producida por la oxidación del

gliceraldehído fosfato. En los pasos finales las moléculas de ADP toman energía del

sistema, fosforilándose a ATP.




Glucosa+2ATP+4ADP+2Pi+2NAD => 2Ácido pirúvico+2ADP+4ATP+2NADH+2H+2H2O

De esta forma, una molécula de glucosa se convierte en dos moléculas de ácido pirúvico.

La ganancia neta, la energía recuperada, es dos moléculas de ATP y dos moléculas de

NADH por molécula de glucosa. Las dos moléculas de ácido pirúvico contienen todavía

una gran parte de la energía que se encontraba almacenada en la molécula de glucosa

original. La serie de reacciones que constituyen la glucólisis se lleva a cabo virtualmente

en todas las células vivas, desde las células procarióticas hasta las células eucarióticas

de nuestros propios cuerpos.

LAS VIAS AEROBICAS - RESPIRACIÓN:

En el curso de la respiración, las moléculas de tres carbonos de ácido pirúvico producido

por la glucólisis son degradadas a grupos acetilo de dos carbonos, que luego entran al

ciclo de Krebs. En una serie de reacciones en el ciclo de Krebs, el grupo acetilo de dos

carbonos es oxidado completamente a dióxido de carbono. En el curso de la oxidación de

cada grupo acetilo se reducen cuatro aceptores de electrones (tres NAD+ y un FAD) y se

forma otra molécula de ATP.

EL CICLO DE KREBS

En el ciclo de Krebs.

Los carbonos

donados por el

grupo acetilo se

oxidan a dióxido de

carbono y los

electrones pasan a

los transportadores

de electrones. Lo

mismo que en la

glucólisis, en cada

paso interviene una

enzima específica.

La coenzima A es el

nexo entre la

oxidación del ácido

pirúvico y el ciclo de

Krebs. A modo de

resumen: en el ciclo

de Krebs se




producen una molécula de ATP, tres moléculas de NADH y una molécula de FADH2 que

representan la producción de energía de este ciclo. Se necesitan dos vueltas del ciclo

para completar la oxidación de una molécula de glucosa. Así, el rendimiento energético

total del ciclo de Krebs para una molécula de glucosa es dos moléculas de ATP, seis

moléculas de NADH y dos moléculas de FADH. La etapa final de la respiración es el

transporte terminal de electrones, que involucra a una cadena de transportadores de

electrones y enzimas embutidas en la membrana interna de la mitocondria. A lo largo de

esta serie de transportadores de electrones, los electrones de alta energía transportados

por el NADH de la glucólisis y por el NADH y el FADH2 del ciclo de Krebs van "cuesta

abajo" hasta el oxígeno. En tres puntos de su pasaje a lo largo de toda la cadena de

transporte de electrones, se desprenden grandes cantidades de energía libre que

impulsan el bombeo de protones (iones H+) hacia el exterior de la matriz mitocondrial.

Esto crea un gradiente electroquímico a través de la membrana interna de la mitocondria.

Cuando los protones pasan a través del complejo de ATP sintetasa, a medida que

vuelven a fluir a favor del gradiente electroquímico al interior de la matriz, la energía

liberada se utiliza para formar moléculas de ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico.

Este mecanismo, en virtud del cual se lleva a cabo la fosforilación oxidativa, se conoce

como acoplamiento quimiosmótico.

En esta representación de la cadena respiratoria, las moléculas que se indican: flavina

mononucleótido (FMN), coenzima Q (CoQ) y los citocromos b, c, a y a3, son los

principales transportadores de electrones de la cadena. Al menos otras nueve moléculas

transportadoras funcionan como intermediarias además de las que se muestran aquí. Los

electrones transportados por la NADH entran en la cadena cuando son transferidos a la

FMN, que entonces se reduce (azul). Casi instantáneamente, el FMN cede los electrones

al CoQ. El FMN vuelve así a su forma oxidada (naranja), listo para recibir otro par de

electrones, y la CoQ se reduce. CoQ entonces pasa los electrones al siguiente aceptor, y

vuelve a su forma oxidada. El proceso se repite en sentido descendente. Los electrones,

al pasar por la cadena respiratoria, van saltando a niveles energéticos sucesivamente

inferiores. Los electrones que son transportados por el FADH2 se encuentran en un nivel

energético ligeramente inferior que los del NADH. En consecuencia, entran en la cadena

de transporte más abajo, a la altura de la CoQ. Los electrones finalmente son aceptados

por el oxígeno, que se combina con protones (iones hidrógeno) en solución, y forman

agua.

Los electrones que son transportados por el FADH2 se encuentran en un nivel energético

ligeramente inferior que los del NADH. En consecuencia, entran en la cadena de

transporte más abajo, a la altura de la CoQ. Los electrones finalmente son aceptados por

el oxígeno, que se combina con protones (iones hidrógeno) en solución, para formar

agua.




LAS VÍAS ANAEROBIAS: En ausencia de oxígeno, el ácido pirúvico puede seguir una de

varias vías llamadas anaeróbicas. Veremos brevemente dos de las vías anaeróbicas más

interesantes. El ácido pirúvico puede convertirse en etanol (alcohol etílico) o en uno de

varios ácidos orgánicos diferentes, de los cuales el ácido láctico es el más común.

En el primer paso de la glucólisis se desprende dióxido de carbono. En el segundo, se

oxida el NADH y se reduce el acetaldehído. La mayor parte de la energía química de la

glucosa permanece en el alcohol, que es el producto final de la secuencia. Sin embargo,

regenerando NAD+, estos pasos permiten que la glucólisis continúe, con su pequeño,

pero en algunos casos vitalmente necesario, rendimiento de ATP.

Pasos por los cuales el ácido pirúvico, formado en la glucólisis, se convierte

anaeróbicamente en etanol.

El ácido láctico se forma a partir del ácido pirúvico, por acción de una variedad de

microorganismos y también por algunas células animales cuando el O2 es escaso o está

ausente.

Reacción enzimática que produce ácido láctico anaeróbicamente a partir de ácido pirúvico

en las células musculares.

En el curso de esta reacción, el NADH se oxida y el ácido pirúvico se reduce. Las

moléculas de NAD+ producidas en esta reacción se reciclan en la secuencia glucolítica.




Sin este reciclado, la glucólisis no puede seguir adelante. La acumulación de ácido láctico

da como resultado dolor y fatiga muscular.

OTRAS VÍAS CATABÓLICAS Y ANABÓLICAS:

La mayoría

de los

organismos

no se

alimentan

directamente

de glucosa.

Otros

alimentos

son

degradados

y convertidos

a moléculas

que pueden

entrar en

esta vía

central.Dado

que muchas

de estas

sustancias,

como las

proteínas y

los lípidos,

pueden

degradarse y

entrar en la

vía central,

se puede

suponer que

es posible el proceso inverso, o sea, que los distintos intermediarios de la glucólisis y del

ciclo de Krebs pueden servir como precursores para la biosíntesis. Y así es. Sin embargo,

las vías biosintéticas, aunque son semejantes a las catabólicas, se diferencian de ellas.

Hay enzimas diferentes que controlan los pasos y hay varios pasos críticos del

anabolismo que difieren de los de los procesos catabólicos.

Para que ocurran las reacciones de las vías catabólica y anabólica debe haber un

suministro constante de moléculas orgánicas que puedan ser degradadas para producir




energía y deben estar presentes moléculas que serán los ladrillos de construcción. Sin el

suministro de estas moléculas, las vías metabólicas dejan de funcionar y la vida del

organismo finaliza. Las células heterótrofas (incluyendo a las células heterótrofas de los

vegetales, tales como las células de las raíces) dependen de fuentes externas,

específicamente de células autótrofas, para obtener las moléculas orgánicas que son

esenciales para la vida. Las células autótrofas, por el contrario, son capaces de sintetizar

monosacáridos a partir de moléculas inorgánicas simples y de una fuente externa de

energía. Luego, estos monosacáridos se utilizan no sólo para suministrar energía, sino

también como sillares de construcción para la variedad de moléculas orgánicas que se

sintetizan en las vías anabólicas. Las células autótrofas más importantes, sin lugar a

dudas, son las células fotosintéticas de las algas y las plantas que capturan la energía de

la luz solar y la utilizan para sintetizar las moléculas de monosacáridos de las cuales

depende la vida en este planeta.


3.1 Muestra Azúcar o Uvas borgoña / Italia

Hígado de res.

Vela

Aceite común

3.2 Material de vidrio Matraz

Tapon de jebe con dos agujeros.

Vasos precipitados 150 – 250 ml (12)

pHmetro

Bureta

Varilla

Matraz aforado de 50 ml

pipeta graduada de 5,0 ml

pipeta graduada de 1,0 ml

Tubo de ensayo (12)

Gradilla

Termómetros

3.3 Reactivos Agua destilada

Hidroxido de sodio

Levadura

Azul de metileno

Buffer Fosfato

Enzimas




IV. METODOLOGÍA



5.1 Práctica 1

1. Realizar un macerado del hígado con ayuda del mortero, con una adecuada

cantidad de agua destilada.

2. Separar el extracto.

3. Sobre el extracto se coloca 10 ml. de buffer fosfato y 5 ml. de cloruro de sodio al

10%.

4. Se coloca 6 ml. De extracto en tubos de ensayo.

5. Se añade 2 ml. De una solución de azul de metileno. Mantenga un tubo a 37ºC

y otro a temperatura ambiente.

6. Luego observe el cambio de color del indicador y vuelva a incubar. Repetir dos

veces. Repetir el experimento dando condiciones de anaerobiosis parcial con el

aceite y anaerobiosis total con la vela.

5.2 Práctica 2

1. Armar los instrumentos como el diseño:

Preparación de un fermento sin aire. Preparación de un fermento con aire

2.

Aplicar en cada envase un caldo de cultivo conformado por:

Azúcar 200 g.

Agua 500 ml.

Levadura 50 gr.

3. Controlar los parámetros de pH, temperatura, acidez.

4. Por espacio de 6 días




5. Apreciar los resultados y analizar llenando la siguiente tabla:

Dia/ fechaHoras de

monitoreopH Acidez Tº % azúcar

Apariencia

del caldoObservaciones

Inicial: Hora:

24

24

12

12

12

12

12

12

8

8

8

8

8

8

8

8

8

8

8

8

8

8

8

8

.


Describir lo encontrado en la experiencia realizada y contestar las siguientes preguntas:




1. ¿Por qué el ácido pirúvico se convierte en ácido láctico sólo para volver a convertirse

en ácido pirúvico?

2. ¿Cómo extraen energía de las grasas o de las proteínas?

.




BIBLIOGRAFÍA

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Físicas y Naturales. Colección Julio Carrizosa Valenzuela no2. Santafé de Bogotá D.C.

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Publicado por AOAC International, 16th edición, volumen 1 y 2, U.S.A.

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http://www.ellaboratorio.8k.com/practicas.htm . Revisado el 02 de mayo del 2006.

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Federico Villarreal. FIIS. EPIA. 2008

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Federico Villarreal. FIIS. EPIA. 2008


Documents

Guia de Practicas Bioquimica I-2009