FUNDAMENTOS PCR.pptx

7/25/2019 FUNDAMENTOS PCR.pptx

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Fundamentos de la Reaccin enCadena de la Polimerasa (PCR)

Cd Ob S 27 d d 20 !

".C. #rturo "u$o% P&re%


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Replicacin ADN

'l # tiene la ca*acidad de +ormar co*ias de s mismo, conel -n de ue la c&lula mantenga su in+ormacin gen&tica


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Qu es la PCR?

's una t&cnica de biolog a molecular desarrollada en/ 1 *or el r. ary "ullis, la cual nos *ermite obtener

un gran n3mero de co*ias de un +ragmento de # en*articular a *artir de una mol&cula de # molde


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Para que sirve?

ebido a su sim*licidad PCR es unat&cnica *o*ular con una am*lia gamade a*licaciones4

Secuenciacin eteccin de *atgenos in+ecciosos eteccin de mutaciones #n5lisis de e6*resin g&nica #n5lisis de di ersidad gen&tica 'ntre otros.


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Equipo utilizado


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Mezcla de reaccin # molde Primers u oligonucletidos 'n%ima # *olimerasa 8 2O "9 :u;er de reaccin

Co+actores ("gCl 2) d


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ADN molde"ol&cula ue contiene la regin de # ue se aa am*li-car


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r mers uoli onucletidosSon secuencias cortas, de entre !=>0

nucletidos.#ltamente es*ec -cos con la %ona de inter&s.Su +uncin radica en *ro*orcionar a la #*olimerasa un e6tremo >? con un O8 *ree6istente

al ue se @an de a$adir los nucletidosconsecuti os mediante enlace +os+odi&ster.

O8

O8

D P "


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D se o e Pr mers" cu ode $mSe de-ne como a uella en la ue el !0 A de losiniciadores se encuentran en estructura decadena lineal. Se debe considerar


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C#lculo de $emperatura de%usin &$m '


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!? C#C # C #< C#


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$aq Polimerasa'l descubrimiento en /71 de la


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(u)er de reaccin" Cloruro dema nesio

#ct3a como co+actor de la # *olimerasa. Iaconcentracin se debe o*timi%ar.'6ceso de magnesio *roduce una am*li-cacinines*ec -ca de *roductos de PCR.

Jna baKa concentracin disminuye la *roduccindel am*li-cado.


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Para ue la *olimerasa lle e acabo su +uncin necesitadeso6inucletidos en la me%cla de reaccin *arasinteti%ar la nue a @ebra de # . eben adicionarse enuna concentracin *tima.Cantidades mayores de 200 L" *ueden *roducirincor*oraciones errneas

Concentraciones menores de !0 L" se consideraninsu-cientes *ara una s ntesis adecuada.

(u)er de reaccin" dN$Ps


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Ia solucin amortiguadora *ro*orciona el *8y concentracin de sales adecuadas *ara lacorrecta +uncin de la # *olimerasa, estacom*uesto *or


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Pasos PCR

Ia PCR con encional consta de cinco*asos de tem*eratura4

esnaturali%acin #lineamiento 'longacin 'longacin -nal "antenimiento


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Desnaturalizacin

's necesaria una tem*eratura de /! BC*ara la desnaturali%acin de la doblecadena de #


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Alineamiento

Ia tem*eratura baKa a un rango entre!0B=1! BC, con el -n de ue los *rimers@ibriden en la cadena molde

l


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Elon acinSe ele a la tem*eratura a 72 BC *ara el

*timo +uncionamiento de la


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Elon acin *nalIa tem*eratura de e6tensin a 72 BC semantiene *or 1 minutos *ara ue termine lae6tensin de los *roductos incom*letos.

M i i


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MantenimientoSe *rograma un ciclo -nal de ! BC *or

arias @oras, lo ue *ermite conser ar los*roductos de PCR @asta ue se retiren lostubos de reaccin del e ui*o.


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Contar con un # de buena calidad Correcto dise$o de *rimers eterminar *rogramas de PCR


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$ipos de PCR

Con encional4 Se basa en la deteccindel *roducto de am*li-cacin.Ia intensidad de la banda se considera

*ro*orcional a la cantidad del *roductoam*li-cado y su longitud se eri-ca conun marcador de *eso molecular.

$i d PCR


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$ipos de PCR

Cualitati a4 Permite detectar la*resencia o ausencia de un +ragmentode # determinado.

$i d PCR


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$ipos de PCR

"3lti*le4 Se reali%a la am*li-cacin dem5s de un +ragmento de # en unasola reaccin de PCR con dos o m5s

Kuegos de *rimers, se utili%a *ara ladeteccin simult5nea de arios agentes*atgenos, ogms, etc.

$i d PCR


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$ipos de PCR#nidada4 Pro*orciona mayor sensibilidad a la

t&cnica de PCR con encional, al am*li-car lassecuencias de # en dos rondas deam*li-cacin con distintos *ares de iniciadores.Primero se reali%a una PCR con encional con

*rimers e6ternos a la regin ue se deseaam*li-car. Se dise$an *rimers internos *araam*li-car una regin m5s *e ue$a.

$ipos de PCR


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$ipos de PCR

PCR tiem*o real4 la deteccin de co*ias del*roducto de PCR se reali%a al mismo tiem*o uesucede la am*li-cacin. Ios *rimers conMuorocromos *ermiten deteccin de

Muorescencia liberada durante la reaccin *or loue se *uede medir la cantidad de #sinteti%ado en cada momento


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PRCTICA DELABORATORIO

+en


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+en ,-.

Mezcla de reaccin


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Mezcla de reaccin

Reactivo , reaccin:u;er de reaccin E LIPrimer F 0.E LIPrimer R 0.E LI

LINolumen -nal 20 LI

Ampli*cacin de en ri/osomal ,- . 0.1 de /acteria

ro rama e


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ro rama eampli*cacin

Paso $emperatura Ciclosesnaturali%aci

n inicial/! BC 2 min

esnaturali%acin /E BC min>!#lineamiento !! BC min

'longacin 72 BC 2 min# 72 BC 1 min"antenimiento ! BC


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GRACIAS POR SU ATENCIN

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