«IQ>MJL

Filogenetik Molekuler Bakteri Rhizosphere dari Tumbuhan

ObatAgeratum conytoides Berdasarkan Amplified Ribosomal

DNA Restriction Analyses (ARDRA)

Disampaikan pada Seminar dan Bazaar Program Penelitian dan Pengabdian

Kepada Masyarakat 2012

A N Y F I T R I A N I

PRODI BIOLOGI F A K U L T A S P E N D I D I K A N M A T E T I K A DAN I L M U P E N G E T A H U A N A L A M

U N I V E R S I T A S P E N D I D I K A N I N D O N E S I A

20 12

« «

Filogenetik molekuler bakteri rhizosphere dari tumbuhan obat Ageratum conyzoides

berdasarkan Amplified Ribosomal DNA Restriction Analyses ( A R D R A )

Telah dilakukan penelitian tentang filogeni molekuler berdasarkan Amplified Ribosomal DNA Restriction Analyses ( A R D R A ) pada bakteri endofit dari tumbuhan obat Ageratum conyzoides L . Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mempelajari (1) pola restriksi Hha\ a tauMspl dari 16S rDNA hasil amplifikasi in vitro pada plasmid rekombinan dan (2) filogeni molekuler dari bakteri endofit. Metode yang dilakukan adalah isolasi D N A kromosom, amplifikasi in vitro 16S rDNA, kloning 16S r D N A pada vektor, verifikasi sisipan dengan metode Polymerase Chain Reaction ( P C R ) , restriksi amplikon 16S rDNA dengan Hha\ atauMsp\, dan konstruksi filogenetik dengan program M V S P 3.2. Efisiensi transformasi 16S r D N A pada vektor sekitar 1.56 x 102 sampai 3.53 x 102. Pola restriksi menunjukkan keragaman genetik bakteri endofit. Analisis filogenetik menunjukkan bakteri endofit memiliki empat kelompok besar. Filogenetik menunjukkan keragaman genetik bakteri endofit pada A. conyzoides.

Kata kunci : A. conyzoides, A R D R A , endofit, filogenetik

Pendahuluan

Ageratum conyzoides merupakan sal ah satu tumbuhan obat yang banyak digunakan masyarakat

Asia Pasifik sebagai obat luka, antisakit, bahkan antitumor. Khasiat sebagai tumbuhan obat tidak

lepas dari peran bakteri endofit yang hidup di dalam jaringan tumbuhan tersebut. Interaksi

bakteri endofit dengan inangnya sangat mempengaruhi satu dengan lainnya (Neilan et al. 2002).

Karakterisasi morfologi dan biokimia bakteri endofit sudah dilakukan, sebagian besar tergolong

bakteri Gram negatif, koloni dapat berbentuk bulat, bergerigi, bahkan tak beraturan. Beberapa

bakteri endofit mempunyai kemampuan katalitik seperti kitinase, protease, dan amylase (Fitriani

2010). Kemampuan katalitik tidak lepas dari adanya keragaman genetik pada komunitas

endorizisfer. Tujuan dari penelitian ini adalah (1) mempelajari pola restriksi fragmen D N A dari

16S rDNA, (2) mempelajari filogenetik molekuler berdasarkan pola restriksi fragmen DNA.

Any Fitriani

Prodi Biologi, Fakultas P M I P A , Universitas Pendidikan Indonesia

Dr. Setiabudhi 229 Bandung 40154

Email : anyfitriani@yahoo.com

Abstrak

1

Bahan dan Metode

A. Pengambilan Contoh Akar A. conyzoides

Akar A. conyzoides dikoleksi dengan memotong pangkal akar (tanpa menyentuh

permukaan akar). Semua akar dan tanah yang menempel diambil dari tumbuhan dan

dimasukkan ke dalam kantung plastik dan selama perjalanan contoh akar disimpan di

dalam kotak berisi es.

B. Isolasi DNA kromosom

Isolasi D N A kromosom dilakukan berdasarkan Fermentas (Ukraina).

C . Amplifikasi 16S rDNA

Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi 16S-rDNA adalah primer 63f dan 1387r

(Marchesi etal. 1998). Kondisi reaksi yang digunakan adalah sebagai berikut, D N A hasil

isolasi sebanyak 1 • ! dengan konsentrasi 50 ng/ml, 0,5 • ! dNTPs 20 mM, masing-

masing primer 1 D l (5 pmol/ml), 0,5 • ! 10X buffer polymerase, 1 • ! D N A polymerase 2

U/ l ( N E B , U S A ) , 20 Dl ddH20. Campuran bahan-bahan tersebut diinkubasi pada mesin

P C R dengan kondisi, yaitu awal denaturasi 94 °C selama 5 menit, denaturasi 94 °C

selama 30 detik, penempelan primer 50 °C selama 30 detik, pemanjangan 72 °C selama 1

menit, P C R akhir selama 5 menit. P C R dilakukan sebanyak 30 siklus.

D. Kloning Amplikon pada Vektor

Produk P C R diklon ke dalam vector cloning p G E M - T Easy dan ditransformasi ke dalam

sel E. coli DH5D yang sudah kompeten (Sambrook dan Russel 2001). Transforman yang

mengandung plasmid rekombinan diseleksi menggunakan antibiotika ampisilin dan

ditapis menggunakan X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolil-D-D-galaktopiranosida) sebagai

substrat yang ditambahkan pada media Luria Bertani agar ( L A ) sebagai media seleksi.

E . Digesti Amplikon Menggunakan Enzim Restriksi

Koloni transforman putih diambil untuk digores pada cawan agar L A yang ditambah

ampisilin (100 mg/ml) dan X-gal (40 mg/ml) sebagai replica untuk analisis selanjutnya.

Secara acak diambil 10 transforman untuk isolasi plasmid rekombinan yang mengandung

gen 16 S rRNA. Isolasi plasmid dilakukan dengan kit (Biobasic). Plasmid rekombinan

2

yang diperoleh diamplifikasi ulang menggunakan primer 63F dan 1387R. Produk P C R

yang diperoleh didigesti dengan enzimMspl dan Hha\.

F . Elektroforesis

Elektroforesis dilakukan pada matriks gel agarosa dengan konsentrasi 1%. K e dalam

larutan D N A ditambahkan larutan pewarna (loading dye) sebanyak 2 Dl , lalu dicampur

rata. Sebanyak 5 • ! campuran tersebut dimasukkan ke dalam sumur elektroforesis.

Kondisi elektroforesis yang digunakan yaitu, beda potensial 75 volt, buffer elektroforesis

I X T A E (40 mM Tris-Acetate, 1 mM E D T A ) dan waktu elektroforesis 45 menit.

G . Visualisasi DNA

Gel agarose direndam di dalam larutan etidium bromide selama 5-10 menit. Setelah itu

larutan diganti dengan air destilata dan dibiarkan selama 10 menit. Selanjutnya gel

agarosa diletakkan pada U V transiluminator dan didokumentasikan dengan kamera

Polaroid.

H. Konstruksi Pohon Filogenetik

Pola pita yang dihasilkan dari hasil digesti enzim restriksi diubah ke dalam nilai 1 dan 0

berdasarkan ada tidaknya pita D N A yang muncul pada ukuran panjang D N A tertentu.

Data ini diolah menggunakan program M V S P , versi 3.2 untuk mengkonstruksi pohon

filogenetika.

Hasil dan Diskusi

D N A kromosom yang berhasil diisolasi diamplifikasi dengan metode PCR. Amplikon

yang diperoleh dilarikan dengan elektroforesis (Gambar 1).

3

Gambar 1. Hasil elektroforegram D N A bakteri endofit akar A. conyzoides. 1) Kontrol positif; 2&3) Bakteri endofit ternaungi; 4) Kontrol negatif; 5&6) Bakteri endofit terbuka

Kloning 16S r D N A pada vektor menghasilkan banyak klon yang memiliki plasmid

rekombinan. Plasmid rekombinan diamplifikasi dengan primer 67f dan 1387r dan amplikon

direstriksi dengan Hha\ a tauMspl . Hasil restriksi memperlihatkan pola-pola fragmen yang

beragam (Gambar 2 dan 3).

(a) (b)

M EFB1 E F B E EF63 EFB4 EFB5 EFB6 EFB7 EFBS EFB3 EF612 E F B l l EFB12 EFB13 EFB14 EFB15 EFB16 EFE17 EFB1S EFB1; EFB20 1517 1300 '.11 J

900 800

600 500

400

300 300

200

100

( c l ) (c2)

Gambar 2. Pola restriksi fragmen D N A hasil restriksi dengan Hha\ a tauMspl dari 16SrDNA bakteri endofit A. conyzoides pada kondisi terbuka. (a) Pola restriksi Hhal, (b) Pola restriksi Mspl; (c) Diagram pola restriksi (1) Hha\,{2)Msp\

(a) (b)

5

IVI EFN1 EFN2 EFN3 EFN4 EFN5 EFN6 EFN7 EFNS EFN9 EFN10 F F N 1 1 F F N 1 J L I 11 XL

F F P J 1 1 EFN14 F F N 1 S L I M l J

F F N 1 F t r r i i o F F N 1 7 F F N 1 S t r i i i c FFN1C t r i i i i / 121,'

.22'.

3 : : E : C

700

i l l

-::

300

:::

100

(cl) (c2) Gambar 3. Pola restriksi fragmen D N A hasil restriksi dengan Hha\ atau Mv/?1 dari

16SrDNA bakteri endofit A. conyzoides pada kondisi ternaung. (a) Pola restriksi Hhal, (b) Pola restriksi Mspl; (c) Diagram pola restriksi (1) Hha\,(2)Msp\

Pola restriksi menunjukkan keragaman 16S r D N A yang berbeda, hal ini menunjukkan

keragaman spesies. Bakteri endofit A. conyzoides pada habitat ternaung lebih beragam dari pada

terbuka. Hal ini disebabkan oleh perbedaan kondisi abiotik terutama intensitas cahaya matahari.

Intensitas cahaya matahari berkaitan dengan kandungan air tanah dan kelembaban tanah. Kadar

air akan mempengaruhi jumlah air yang dapat dimanfaatkan oleh tumbuhan dan jumlah air yang

masuk akan mempengaruhi kelulushidupan bakteri endofit yang hidup di dalam jaringan akar

(Verstraete etal. 2010).

Konstruksi filogenetik menunjukkan pengelompokkan klon yang diperoleh (Gambar 4).

Bakteri endofit mengelompok menjadi empat kelompok besar, diantaranya ada satu kelompok

yang hanya terdiri atas klon-klon yang serupa. Sementara tiga kelompok lainnya mempunyai

klon-klon yang relative berbeda. Berdasarkan analisis filogenetik ada tujuh filotipe yang

anggotanya mirip satu dengan lainnya, yaitu E F N 9 dan 10, E F N 19 dan 20, E F N 17 dan 18 yang

berasal dari habitan ternaung. Yang lainnya adalah E F B 4 dan 5, E F B 6,8 dan 9, E F N 2 dan 10,

E F B 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 dan 20.

6

UPGMA

i —r~

Nei A Lis Coefficient

Gambar 4. Filogenetik molekuler berdasarkan 16S rDNA dari bakteri endofit pada Ageratum conyzoides

Kesimpulan

Pola restriksi dengan Hha\ atau Msp\ menunjukkan pola yang berbeda kecuali pada

endorizosfer terbuka ada 10 filotipe yang berada pada satu kelompok yang sama. Filogenetik

menunjukkan pengelompokkan klon yang memiliki karakteristik yang berbeda pada bakteri

endofit.

Daftar Pustaka

Fitriani A. 2010. Diversity of endophyte bacteria from medicinal plant Ageratum conyzoides L . Paper presented on 6 t h Asia-Pacific Biotechnology Congress and 49 t h Annual Convention of the Phillipine Society for Microbiology, Inc. Manila, May, 11-14 2011.

Moffit M C , Neilan B E . 2003. Evolutionary affiliations within the superfamily of ketasyntahses 7

reflect complex pathway associations. J Mol E v o l 56: 446-456. Marchesi JR. 1998. Design and evaluation of useful bacterium-specific P C R primers that amplify

genes coding for bacterial 16S rRNA. Appl Environ Microbiol 64: 795-799.

Verstraete B , Van Elst D , Steyn H , Van W y k B , Lemaire B , Smets E , Dessein S. 2011. Endophytic bacteria in toxic South African Plants : identification, phylogeny, and possible involvement in gousieste. Plos One 26:6(4): el9265.

8

Isolasi dan Filogeni Molekuler berdasarkan Gen 16S rRNA dari Strain Flit Simbion Rizosfer pada Tumbuhan Obat Ageratum conyzoides L . (Bandotan)

Any Fitriani * ) , Any Aryani

Program studi Biologi, F P M I P A Universitas Pendidikan Indonesia J1. Dr. setiabudhi 229 Bandung 40154

*) anvfitriani(g>yahoo.com

A B S T R A K

Telah dilakukan penelitian tentang filogeni molekuler berdasarkan 16S r D N A pada bakteri ektorizosfer dan endofit dari tumbuhan obat Ageratum conyzoides L . Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mempelajari (1) pola restriksi Hha\ atau Msp\ dari 16S r D N A hasil amplifikasi in vitro pada plasmid rekombinan dan (2) filogeni molekuler dari bakteri ektorizosfer dan endofit. Metode yang dilakukan adalah isolasi D N A kromosom, amplifikasi in vitro 16S rDNA, kloning 16S r D N A pada vektor, verifikasi sisipan dengan metode Polymerase Chain Reaction ( P C R ) , restriksi amplikon 16S r D N A dengan Hha\ atau Msp\, dan konstruksi filogenetik dengan program M V S P 3.2. Efisiensi transformasi 16S rDNA pada vektor sekitar 1.56 x 102 sampai 4.82 x 102. Pola restriksi menunjukkan keragaman genetik, Analisis filogenetik menunjukkan bakteri ektorizosfer memiliki 4 kelompok besar. Filogenetik menunjukkan keragaman genetic bakteri ektorizosfer pada A conyzoides.

Kata kunci : A. conyzoides, pola restriksi, filogenetik

Isolasi dan Filogeni Molekuler berdasarkan Gen 16S rRNA dari Strain Elit Simbion Rizosfer pada Tumbuhan Obat Ageratum conyzoides L . (Bandotan)

Any Fitriani *) , Any Aryani

Program studi Biologi, F P M I P A Universitas Pendidikan Indonesia J l . Dr. setiabudhi 229 Bandung 40154

*) anyfitrianiftf)vahoo.eom

A B S T R A K

Telah dilakukan penelitian tentang filogeni molekuler berdasarkan 16S r D N A pada bakteri ektorizosfer dan endofit dari tumbuhan obat Ageratum conyzoides L . Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mempelajari (1) pola restriksi Hha\ atau Mspl dari 16S rDNA hasil amplifikasi in vitro pada plasmid rekombinan dan (2) filogeni molekuler dari bakteri ektorizosfer dan endofit. Metode yang dilakukan adalah isolasi D N A kromosom, amplifikasi in vitro 16S rDNA, kloning 16S r D N A pada vektor, verifikasi sisipan dengan metode Polymerase Chain Reaction ( P C R ) , restriksi amplikon 16S rDNA dengan Hha\ atau Msp\, dan konstruksi filogenetik dengan program M V S P 3.2. Efisiensi transformasi 16S rDNA pada vektor sekitar 1.56 x 102 sampai 4.82 x 102. Pola restriksi menunjukkan keragaman genetik, Analisis filogenetik menunjukkan bakteri ektorizosfer memiliki 4 kelompok besar. Filogenetik menunjukkan keragaman genetic bakteri ektorizosfer pada A. conyzoides.

Kata kunci : A. conyzoides, pola restriksi, filogenetik

Isolasi dan Filogeni Molekuler berdasarkan Gen 16S rRNA dari Strain Elit Simbion Rizosfer pada Tumbuhan Obat Ageratum conyzoides L . (Bandotan)

Any Fitriani *) , Any Aryani

Program studi Biologi, F P M I P A Universitas Pendidikan Indonesia J L Dr. setiabudhi 229 Bandung 40154

*) anyfitriani^yahoo.eom

A B S T R A K

Telah dilakukan penelitian tentang filogeni molekuler berdasarkan 16S r D N A pada bakteri ektorizosfer dan endofit dari tumbuhan obat Ageratum conyzoides L . Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mempelajari (1) pola restriksi Hha\ atau Mspl dari 16S rDNA hasil amplifikasi in vitro pada plasmid rekombinan dan (2) filogeni molekuler dari bakteri ektorizosfer dan endofit. Metode yang dilakukan adalah isolasi D N A kromosom, amplifikasi in vitro 16S rDNA, kloning 16S rDNA pada vektor, verifikasi sisipan dengan metode Polymerase Chain Reaction ( P C R ) , restriksi amplikon 16S r D N A dengan Hha\ atau Mspl, dan konstruksi filogenetik dengan program M V S P 3.2. Efisiensi transformasi 16S rDNA pada vektor sekitar 1.56 x 102 sampai 4.82 x 102. Pola restriksi menunjukkan keragaman genetik, Analisis filogenetik menunjukkan bakteri ektorizosfer memiliki 4 kelompok besar. Filogenetik menunjukkan keragaman genetic bakteri ektorizosfer pada A. conyzoides.

Kata kunci : A. conyzoides, pola restriksi, filogenetik