Microbial BiotechnologyBIO-512 (ATW)

• Plant Growth Promoting Rhizobacteriao Symbiotic PGPR (Rhizobia)o Non-symbiotic PGPR

• Microbial Insecticide (Bt)• Genetic Engineering of Plant• Therapeutic Agent and Vaccin• Molecular Diagnosis• Assignment (8-10 pages)

Plant Growth-Promoting Rhizobacteria(PGPR): Rhizobia

Dr. Aris Tri Wahyudi

Department of Biology FMIPABogor Agricultural University

Biological N2-Fixation

~Approximately 80 % is free N2

~It can not be used by microbes, directly~It must be converted to N2-fixed:

Nitrogen Fixation~Microbe : Symbiotic; Non-Symbiotic~Enzyme: Nitrogenase~Biofertilizer

Biological Nitrogen Fixation

N2(~80 %)

NH3N2 FixationN-CompoundAmino Acid

Cell ActivityTo PlantSymbioticAir

Carbohydrate

Non-Symbiotic

Root Nodule Bacterium : N2 Fixation

Nitrogen Fixation

N2+8H++8e-+16MgATP 2NH3+H2+16 MgADP+16PiNitrogenase

Symbiotic: Bradyrhizobium, Rhizobium, Azorhizobium, etc

Non-symbiotic: Azospirillum, Azotobacter, etc

Symbiotic N2 Fixing Bacteria: (Form Root Nodule)

1. Azorhizobium2. Bradyrhizobium3. RhizobiumAzorhizobium :Form root nodule and stem noduleStem Nodule : Sesbania rostrata

RHIZOBIA

Metabolism and Translocation

Hasil fiksasi N2 yaitu NH3, diekskresikan sel Rhizobium atau Bradyrhizobium masuk ke bintil (nodul)NH3 dlm bintil diproses menjadi :

Temperate Tropikglutamin 11% 9%Asparagin 81% 88% ureideAsam amino 8% 3%

ditranslokasikan ke tanaman bagian atas lewat xylem.

Bakteri bintil akar memperoleh sumber energi (karbohidrat) dari hasil fotosintesis tanaman (fotosintat) dari tanaman bagian atas ke akar lewat phloem.

Sesbania rostrata

RhizobiumTumbuh cepat (3-5 hari) diatas YMA, 2-4 mm diameterMenghasilkan asamDNA : 59-64% G+CMembentuk bintil pada pepolongan subtropisWaktu generasi ~ 4 jam

BradyrhizobiumTumbuh lambat (5-7 hari) di atas YMA,diameter < sama dgn 1 mmMenghasilkan basaDNA : 61-65% G+CMembentuk bintil pada pepolongan tropisWaktu generasi ~ > 8jam

Bradyrhizobium japonicum

Bacterial root nodule of soybean

Gram negativeFix N2 molecular

Slow growingPotential strain : inoculant

Bradyrhizobium japonicum Strains

Fig. Root Nodule Formation of Siratroby Bradyrhizobium japonicum

Fig. Physical map of the complete sequence of Bradyrhizobium japonicum USDA110

Nitrogen (N2) FixationNitrogenase:1. Komponen I : Mo-Fe-protein = dinitrogenase2. Komponen II : Fe-protein = dinitrogenase reduktase

Nitrogenase dikontrol oleh gen nifK. pneumoniae : > 20 gen nif teridentifikasiGen-gen nif H D K

nif H-----sintesis dinitrogenase reduktasenif D, nif K------sintesis dinitrogenase

Nitrogenase sensitif terhadap oksigen (O2)Bakteri aerob : punya mekanisme khusus untuk mem-

pertahankan O2 intraseluler tetap rendahBakteri anaerobik fakultatif :

Fiksasi N2 pada ada O2 atau tanpa O2Bakteri anaerob : tanpa O2

Gen-gen nif pertama kali dipelajari pada K. pneumoniae~dekat dengan E. coli~model yang paling baik

Fe-protein : terdiri dari 2 unit (dimer) disandikan oleh gen nifH 60 kDa

Mo-Fe protein : tdr 4 subunit (tetradimer) : nifDKGen-gen nif terletak pada plasmid (Rhizobium) dan pada

kromosom (Bradyrhizobium)

Penyusunan gen-gen nif sangat bervariasi :R. meliloti : nif HDK berdampinganB. japonicum : nif H terpisah dari nif DK+ 17 kb

nif E, N, S, B terletak diantaranyaK. pneumoniae: nif HDK berdampingan

Ekspresi gen nif dipengaruhi oleh faktor lingkungan:NH3 dan O2 berlebih menghambat aktivitas nitrogenase

Structure of Symbiotic Genes inBradyrhizobium japonicum

nodVW nifDKE N X nifS nifB fixA nifH fixBCX Nod-2

nodYABCSUIJ Orf123 nodZ fixR nifA fixAnodD D1nolA

? 70 kb

Lokus III II I

Cluster I

Cluster II

Biological Nitrogen Fixation : Klebsiella pneunoniae

Klebsiella pneumoniae

Nitrogenase Complex

Nitrogenase reductase is a 60 kDa homodimer with a single 4Fe-4S cluster Very oxygen-sensitive Binds MgATP 4ATP required per pair of electrons transferred Reduction of N2 to 2NH3 + H2 requires 4 pairs of electrons, so 16 ATP are consumed per N2

Two protein components: nitrogenase reductase and nitrogenase

Why should nitrogenase need ATP?

N2 reduction to ammonia is thermodyna-mically favorable However, the activation barrier for breaking the N-N triple bond is enormous 16 ATP provide the needed activation energy

NitrogenaseFunction

Symbiotic Genes in Bradyrhizobium

Gene Species function

nifA B. japonicum transcriptional regulator of B. sp (Parasponia) nif & fix expression

nifH B. japonicum structural gene for dinitro-B. sp (cowpea) genase reductaseB. sp (Parasponia)

nifDK B. japonicum structural genes for dinitro-B. sp (cowpea) genaseB. sp (Parasponia)

nifB B. japonicum Fe MoCo synthesisB. sp (Parasponia)

nifE B. japonicum Fe MoCo synthesisB. sp (Parasponia)

nifN Fe Moco synthesisnifS B. japonicum Maturation of nitrogenasefixA B. japonicum Electron transport to nitrogenasefixBC B. japonicum Electron transport to nitrogenase

B. sp (Parasponia)fixIJ B. japonicum Sequence similarity to family of

two-component regulatoryproteins

fixR B. japonicum Function unknown : sequencesimilarity to dehydrogenases

Symbiotic Genes in Bradyrhizobium(Continued)

Gen Species Function

Hydrogen Uptake (HUP)

Penambatan N2 NH3, selalu dibebaskan H2Gen hup+ (hidrogen uptake) menyandikan :hidrogenase, meningkatkan fiksasi N2 simbiotik

Beberapa Alasan :

1. Oksidasi H2, memungkinkan pengambilan kembali ATP yang digunakan oleh nitrogenase

2. Oksidasi H2 mengurangi resiko penghambatan nitrogenaseoleh H2

3. Penggunaan O2 untuk mengoksidasi H2 dapat melindungi nitrogenase terhadap O2. nitrogenase sensitif thd O2.

Energi KomplekNitrogenase

ATP ADPHidrogenase ATPGeneration

ElectronCarrier

H2 2NH3N2 H+

Rhizobium leguminosarum

Bradyrhizobium japonicum: hup+ and hup-

Nodulation

A. Tahap-tahap pembentukan bintil akar1. Pengenalan thd pasangan yg benar pd tanaman dan pelekatan

bakteri ke rambut akar2. Penyerbuan rambut akar oleh bakteri melalui pembentukan

benang infeksi (infection threat)3. Perjalanan bakteri ke akar utama lewat benang infeksi4. Pembentukan bakteroid dlm sel tanaman5. Pembelahan sel tanaman dan bakteri yg terus menerus, meng-

hasilkan bintil akar dewasa

Akar tanaman pepolongan mengeluarkan bahan organik untukmenarik mikroorganisme di sekitar perakaran (termasuk BBA)Pelekatan BBA dgn akar pepolongan tergantung dari makromolekulpd permukaan rambut akar yg berinteraksi dgn polisakarida BBA

makromolekul : lektinpolisakarida : 2-deoksiglukosa (R. trifolii)

Rambut akar selanjutnya melengkung, lalu bakteri masuk membentuk benang infeksi.

Sel-sel akar yg berdekatan menjadi terinfeksi BBASel yg terinfeksi, terangsang membelah (Sitokinin).

Bakteri dlm sel tanaman membelah, berganda, menggembung mem-bentuk sel yg tdk beraturan dan bercabang : bakteroid

Dikelilingi membran sel tanaman (peribacteroid membrane) fiksasi nitrogen mulai terjadi

Root Nodule Formation

1. Pengenalan thd pasangan dan pelekatan

bakteri ke rambut akar

2. Ekskresi nod faktor yang menyebabkan pelengkungan

rambut-rambut akar

3. Penyerbuan rambut akar oleh bakteri dan pembentukan

benang infeksi (infection threat)

4. Perjalanan bakteri ke akar utama

5. Pembentukan bakteroid dlm sel tanaman

6. Pembelahan sel tanaman dan bakteri yg terus menerus,

menghasilkan bintil akar dewasa

Tanaman Dinodulasi Kec Tumbuh

Pea R. leguminosarum cepatBean R. phaseoli cepatClover R. trifolii cepatAlfalfa R. meliloti cepatSoybean B. japonicum lambatSiratro B. japonicum lambatLupinus B. lupini lambatParasponia B. parasponiae lambat

Nodulation

B. Pembentukan bintil akar : nodulasi1. Sintesis polisakarida

- B-1,2 glukan EPS ------ proses infeksi- Eksopolisakarida (EPS) ----- perkembangan nodul- Lipopolisakarida (LPS) ----- pembentukan nodul

Mempunyai peranan penting utk nodulasiR. meliloti mutan (B-1,2 glukan) dpt membentuk bintil tapi tdk berisi bakteri (pseudonodul)

-Mutan Rhizobium EPS : tidak mampu membentuk nodulMampu membentuk nodul, tapi tdk mampu menambat N2

-Efek mutasi, bergantung pada inang-R. leguminosarum bv. phaseoli (EPS) : bintil normal-R. leguminosarum bv. viciae (EPS) : tdk membentuk bintil-Mutan R. leguminosarum bv. phaseoli (LPS) :mampu membentuk bintil akar, tapi tdk menambat N2

2. Gen-gen untuk nodulasi (nod)-Banyak dipelajari pd R. meliloti, R. leguminosarum bv. trifolii, R. leguminosarum bv. viciae-Pada plasmid pSym : gen-gen nod berada pd fragmen 20 kbTransfer pSym ke spesies lain (resipien), resipien mampu membentuk bintil penambat N2-Transfer pSym ke Agrobacterium menyebabkan nodul abnormal, fix-Plasmid pSym pRL1JI dari R. leguminosarum bv. viciae

-Dua kelompok gen nod :nod ABCIJ : nod umumnod EFGH : penentu spektrum inangnod D : nod regulator = juga penentu inang

Nodulation Genes in Bradyrhizobium

Gene Species function

nodABC B. japonicum Synthesis of essential factorB. sp (Parasponia) for hair curling & cell div.

nodD1 B. japonicum Positive transcriptional re-B. sp (Parasponia) gulation for gene expression

nodD2 B. japonicum Unknown function: mutationB. sp (Parasponia) caused nod-

nodI B. japonicum Unknown function: ATP de-B. sp (Parasponia) pendent transport protein

nodJ B. japonicum Unknown function: Mem-B. sp (Parasponia) brane location

nodK B. sp. (Parasponia) Unknown function

Nadulation Genes in Bradyrhizobium(Continued)

Gene Species Function

nodLMN B. sp (Parasponia) Host range determinationnodSU B. japonicum Unknown functionnodV B. japonicum Host range determinationnodW B. japonicum Transcriptional regulationnodY B. japonicum Unknown function nodZ B. japonicum Genotype specific noduation

Structure of Nodulation GenesR. leguminosarum

Model for Regulation of B. japonicumNodulation Genes

Isoflavon

NodD1 Protein

nodA nodY nodD1

nodD1-box nodY-boxDNA

nodM nodL nodE nodF nodD nodA nodB nodC nodI nodJ

Structure of nod Genes of R. leguminosarumbv. viciae Sym Plasmid pRL1JI

Represi

Aktivasi

3. Regulasi ekspresi gen noda. R. leguminosarum bv. viciae

nod ABCIJ, nod FE, dan nod D ditumbuhkan pada media penumbuhan yang normal ----- hanya nod D yg ditranskripsiJika eksudat akar (pea) ditambahkan pd media, nodFE dan nod ABCIJ aktif terekspresi, berarti eksudat akar tanamaninang dan gen nod D diperlukan untuk mengaktivasi operonnod.

b. Flavonoid merupakan suatu inducerFlavon luteolin, menginduksi ekspresi gen nod R. meliloti7,4-dihidroksi flavon, menginduksi ekspresi gen nod R. meliloti flavon dan flavanon mengaktivasi gen nod R. leguminosarum bv. viciae.

Biotechnological Application

Produksi inokulan untuk Tanaman Legum

Biofertilizer

Bioremediasi: Bioakumulasi Logam Berat

Inokulan pada Tanah Marginal & Netral