ACTIVACION VOLTAJE - DEPENDIENTE DE IKACh POR EL AGONISTA

MUSCARINA EN CARDIOMIOCITOS

Ricardo A. Navarro-Polanco1, Eloy G. Moreno Galindo1, Rodrigo Zamora Cardenas1,

Berenice Ocón Moran2

1 University Center for Biomedical Research, Universidad de Colima, Colima, México. 2Superior School of Medicine of University of Colima, México

Resumen

Objetivos: Evaluar en miocitos cardiacos la dependencia de voltaje del agonista muscarina

para activar a IKACh y determinar el efecto que tienen sobre la relajación de esta corriente.

Métodos: Con la técnica de fijación de voltaje en configuración de célula completa y el

programa pClamp10 (Axon Intruments), se registraron corrientes macroscópicas de

cardiomiocitos (aurícula izquierda) felinos realizando curvas concentración respuesta (C-R)

de muscarina a tres diferentes voltajes: -100, -30 y +50mV. Resultados: Los resultados

preliminares muestran que muscarina activo IKACh con mayor potencia a -100 mV (EC50 =

0.12 µM ± 0.02) que a +50 mV (EC50 = 0.79 µM ± 0.03). La medición a    -30mV resultó

con una potencia intermedia (EC50 = 0.24 µM ± 0.04) a la de los otros voltajes de prueba .

Conclusion: Estos resultados apoyan la hipótesis de la dependencia de voltaje específica de

ligando de los receptores M2, y a que la relajación de IKACh es consecuencia de dicha

dependencia de voltaje.

Palabras clave: Muscarina, Receptores M2, dependencia de voltaje.

INTRODUCCION

La función del corazón es generar la presión que se necesita para mantener

circulando la sangre en el organismo. Para esto, depende de la contracción rítmica y

coordinada de los millones de células (cardiomiocitos. La coordinación de estas células está

establecida por cuatro propiedades celulares: excitabilidad, automatismo, conducción y

contractilidad.

El potencial de acción es considerado como un cambio temporal del potencial

membranal, el cual es originado por cambios de permeabilidad en la membrana. Cuando

aumenta la permeabilidad de la membrana para un ion, éste se desplaza a favor del

gradiente electroquímico en una magnitud que depende de la diferencia entre el potencial

membranal y el potencial de equilibrio del ion, conocida como fuerza de empuje o, en

inglés, driving force. El movimiento o flujo de iones genera 2 corriente eléctrica (corrientes

iónicas). La entrada de cationes o salida de aniones producen despolarización de la

membrana, generando corrientes negativas o entrantes (deflexiones hacia abajo); por otro

lado, la salida de cationes o la entrada de aniones producen hiperpolarización, que se

traducen en corrientes positivas o salientes (deflexiones hacia arriba) (Mascher, 1997). El

potencial de acción no es similar en todos los tejidos cardiacos, pues presenta diferencias en

su amplitud, velocidad de cambio durante la despolarización (dV/dt) y en el valor del

potencial durante la meseta. Farmacológica y funcionalmente, se han reportado cinco

diferentes subtipos de receptores muscarínicos, distribuidos en tejidos y órganos

específicos. Estos subtipos fueron clasificados como M1, M2, M3, M4 y M5. En un gran

número de estudios se ha constatado que el subtipo de receptor muscarínico que predomina

ampliamente en el tejido cardiaco de varias especies animales, incluyendo a los humanos,

es el M2 (A. y Tuček S., 2002). Adicionalmente, cabe destacar que el único subtipo de

receptor muscarínico involucrado funcionalmente en la regulación de la frecuencia cardiaca

es también el M2 (Stengel y cols. 2000; Wess, 2004).Los canales IKACh pertenecen al grupo

de canales de K+ rectificadores entrantes (Kir) acoplados a proteínas G, perteneciendo a la

subfamilia Kir3.0. Se puede decir que estos canales representan una de las clases más

primitiva de canales iónicos, pues carecen de un dominio sensible al voltaje, y se pueden

encontrar en diversos organismos, desde unas simples bacterias hasta mamíferos superiores

(Hille, 2001). La estructura elemental de los canales Kirestá constituída por 2 regiones

transmembranales, una región formadora de poro (H5) y los extremos amino y carboxilo,

que se encuentran ambos en el lado citoplasmático (Fig.3B). Los canales Kir se ensamblan

en tetrámeros, de tal forma que el canal KACh está compuesto por subunidades Kir 3.1 y

Kir 3.4 en una estequiometría 2:2 (Kurachi y ishii, 2004). Como 5 su nombre lo indica, los

canales Kir se distinguen por conducir más fácilmente las corrientes entrantes que las

corrientes salientes (Fig.3A). El mecanismo de rectificación entrante de los canales Kir se

explica por un rápido bloqueo, dependiente de voltaje, por el Mg2+ y las poliaminas

intracelulares (Ruppersberg, 2000).

Se utilizaron gatos adultos (sexo indistinto), a los cuales se les administró una

dosis de heparina (1000 U/kg, i.p) 30 min antes de la aplicación de la anestesia,

pentobarbital sódico (50 mg/kg, i.p.). Una vez anestesiado, se extrajo el corazón mediante

una toracotomía bilateral y posteriormente se colocó en solución Tyrode previamente

burbujeada con gas carbógeno (95% O2 y 5% CO2). Una vez extraído el corazón, los

miocitos se aislaron mediante el método de separación enzimática descrito inicialmente por

Isenbergy Klöcner (1982) y modificado por Moreno-Galindo y cols. (2011). Los registros

electrofisiológicos se realizaron a temperatura ambiente (23-25° C) al usar el sistema de

perfusión rápida para las curvas concentración-respuesta (C-R), ya 36.5±0.5°C al utilizar la

perfusión convencional para el protocolo de pulsos cuadrados de voltaje. Los electrodos de

registro se elaboraron a partir de capilares de vidrio (WPI Inc., USA), y mediante la

utilización de un estirador P-97 (Sutter Instruments, USA). Previo a la utilización de éstos

con los miocitos, los electrodos fueron sometidos a un proceso de pulido final con la

utilización de una microforja MF-83 (Narishige, Japón). Para las curvas C-R, la sustancia a

utilizar (agonista) se aplico a través de un sistema de perfusión rápida, mientras que para la

aplicación del protocolo de pulsos cuadrados de voltaje se empleó la perfusión

convencional. Los electrodos se colocaron en un sujetador (“holder”) que permite la

succión y que se conectaba a un preamplificador que, a su vez, era la entrada hacia un

amplificador Axopatch 200B (Axon Instruments, USA). La generación de pulsos de

respuesta de adquisición y el procesamiento de datos se realizaron utilizando un sistema de

trabajo conformado por una computadora, un convertidor A/D/A Digidata 1322A y el

programa pClamp10 (ambos de Axon Instruments).

ESTADO DEL ARTE

Los receptores acoplados a proteínas G (RAPG) representan uno de los principales

sistemas de detección y/o recepción de señales extracelulares con más éxito evolutivo.

También son denominados receptores heptahélicos de siete dominios transmembranales, y

éstos se encuentran conectados mediante tres asas intracelulares y tres extracelulares. Los

RAPG son una de las familias más grandes e importantes de las proteínas membranales,

pues están implicados en un sinfín de procesos de transducción de señales celulares. Estos

receptores se encuentran en los genomas de prácticamente todos los seres vivos (Kroezey

cols., 2003).En los humanos ya se han identificado más de 800 genes (3 % de su genoma)

que se sabe que codifican para estos receptores (Holinstat y cols., 2006).

Los RAPG son responsables de mediar un gran número de respuestas fisiológicas

ante diferentes estímulos como hormonas, neurotransmisores, luz, olores y sabores

(Lagerström y Schiöth, 2008). Estas respuestas son originadas gracias a su interacción con

sustancias (ligandos o agonistas) de variada estructura molecular (Kroeze y cols.,

2003).Así, dentro de las funciones importantes de estos receptores se encuentran: la

regulación de la secreción de glándulas endócrinas y exócrinas, la exocitosis, quimiotaxis,

el control de la presión sanguínea y la función plaquetaria, además de procesos de

regeneración tisular, embriogénesis, angiogénesis, y control del crecimiento celular normal

o aberrante (Marinissen y Gutkind, 2001; Jacoby y cols., 2006).

Los RAPG han recibido su nombre debido a su interacción con las proteínas G

localizadas en el lado interno de la membrana citoplasmática. Tras la unión del ligando

activador, el receptor sufre cambios conformacionales en las subunidades de la proteína G,

provocando que dicha proteína se disocie en las subunidades Gα y Gβγ. El receptor

activado, provoca la salida del GDP de la subunidad Gα, con lo que entra el GTP,

promoviendo de este modo la disociación de la subunidad Gαde la Gβγ. En este momento

es cuando ambas subunidades, Gα y Gβγ, pueden acceder a sus efectores iniciando distintas

vías de señalización, siendo finalizadas cuando la subunidad Gα hidroliza el GTP y así se

reestructura el trímero inactivo (Hoz-Jiménez, 2008).

Sensibilidad al voltaje de los receptores acoplados a proteínas G

Como se sabe, la interacción de los RAPG con sus ligandos constituye el principal

mecanismo de control sobre sus vías de señalización acopladas, sin embargo, estudios de

los últimos 25 años han venido a demostrar que el voltaje membranal de las células es

capaz de modular a varios de estos receptores (Marty y Tan, 1989; Ito y cols., 1992;

Mahaut-Smith y cols., 1999; Perroy y cols., 2002; Dekel y cols., 2005). Así por ejemplo,

expresando heterólogamente receptores M2 en ovocitos de rana Xenopus se mostró que

tienen mayor afinidad, es decir, mayor fuerza de interacción por ACh en la

hiperpolarización, y menor afinidad en la despolarización (Ben-Chaim y cols., 2003). 7

En los primeros trabajos no quedaba claro si la sensibilidad al voltaje residía en el

propio receptor o en cualquier otro elemento de la vía de señalización. La evidencia más

sólida sobre la capacidad inherente que poseen los RAPG para detectar cambios en el

voltaje membranal fue confirmada de manera directa al registrarse corrientes asociadas con

movimientos de cargas en el receptor M2, expresado en ovocitos de Xenopus (Ben-Chaim y

cols., 2006; Navarro Navarro-Polanco y cols., 2011), semejantes a las que se han reportado

en los canales iónicos sensibles a voltaje (gating currents). Estas corrientes aportan

información importante de la generación de cambios conformacionales, ya que reflejan la

reorientación de las cargas dentro del receptor en respuesta a cambios en el voltaje.

También, se aportaron evidencias fuertes para los receptores muscarínicos M1 (Ben-Chaim

y cols., 2003 y 2006), los purinérgicos P2Y1 (Martinez-Pinna y cols. 2005), los

glutamaérgicos (Ohana y cols., 2006) y, recientemente, los adrenérgicos α2A (Rinne y

cols., 2013). De esta manera, el hecho que el voltaje modifique la actividad de los RAPG,

sugiere una capacidad adicional para modular finamente la señalización celular en los

tejidos excitables como el sistema nervioso y los músculos esquelético y cardiaco.

Importantemente, como mecanismo para explicar la dependencia de voltaje, Ben-

Chaim y cols. (2006) propusieron que: 1) estos receptores pueden adoptar dos estados de

afinidad hacia sus ligandos, uno de alta afinidad cuando se acoplan a su proteína G y otro

de baja afinidad cuando están libres, 2) los movimientos de carga producidos por el cambio

en el voltaje generan cambios conformacionales en la región del receptor que se acopla con

su proteína G, de manera tal que la hiperpolarización favorece dicho acoplamiento y

conduce al receptor a un estado de alta afinidad, mientras que la despolarización favorece

un estado de baja afinidad debido a un menor acoplamiento con su proteína G.

Dependencia de voltaje de los receptores muscarínicos M2 cardiacos

Más recientemente, ya en estudios realizados en miocitos cardiacos felinos, se ha

mostrado que el voltaje membranal modifica la potencia con la que ACh activa a IKACh

(Fig. 1), observación congruente con el cambio en la afinidad con la que ACh se une a los

receptores M2 (Ben-Chaim y cols., 2003). Además, se observó que otro agonista

muscarínico, la pilocarpina, también manifiesta dependencia de voltaje para activar a

IKACh, sólo que de una manera opuesta a la de ACh, mayor potencia en los voltajes más

positivos que a los más negativos (Fig. 1), como resultado de una mayor eficacia pero

también de una mayor afinidad durante la despolarización (Navarro-Polanco y cols., 2011).

También, los resultados con ACh y pilocarpina fueron reproducidos en miocitos cardiacos

de conejo (Moreno-Galindo, 2008). Así pues, estas evidencias debilitan ampliamente la

propuesta de que la despolarización favorece un estado de baja afinidad debido a una

reducción en la interacción entre los receptores M2 y sus proteínas G (Ben-Chaim y cols.,

2006; Parnas y Parnas, 2007), ya que se esperaría que la afinidad disminuyera con la

despolarización sin importar el agonista muscarínico en cuestión. Opuesto a esta hipótesis,

y en congruencia con los resultados anteriores obtenidos en cardiomiocitos, un estudio

reciente muestra que los receptores adrenérgicos α2A manifiestan una sensibilidad al

voltaje en donde la afinidad y/o la eficacia son

dependientes de agonista e independientes del

acoplamiento del receptor con la proteína G

(Rinne y cols., 2013).

Fig. 1 Efectos dependientes de voltaje opuestos de la ACh y pilocarpina (Pilo) sobre la activación de IKACh en miocitos cardiacos. A, registros de corrientes a un voltaje de +50 mV (trazos superiores) y -100 mV (trazos inferiores). La línea punteada indica el nivel cero de corriente. B, curvas C-R para la activación de IKACh por ACh y pilocarpina a los potenciales

de -100 y +50 mV. Las líneas continuas representan el ajuste de los datos con una ecuación de Hill. La concentración efectiva al 50% (EC50) para ACh fue de 45 ± 10 nM a -100 mV y de 176 ± 39 nM a +50 mV, mientras que para pilocarpina fue de 12 ± 3 μM a -100 mV y de 4 ± 1 μM a +50 mV. (Modificada de Navarro-Polanco y cols., 2011).

DESARROLLO CAPITULAR EN SECCIONES

Sistema de perfusión rápida

Para la aplicación de los agonistas sobre los miocitos se utilizó un sistema de perfusión

rápida (SF-77B, Warner Instruments, USA) consistente de multi-pipetas capilares de 3

salidas, conectadas a las múltiples soluciones contenidas en cada una de las jeringas

empleadas. En la cámara de registro, se aplicaba perfusión convencional de solución

extracelular sobre las células a una velocidad aprox. de 1 mL/min. Una vez que se tenía la

célula adherida al electrodo o micropipeta (configuración cell attached), se activaba el

sistema de perfusión rápida sobre dicha célula y posteriormente se establecía la

configuración de célula completa (whole cell), fijando un potencial de mantenimiento de –

100 ó +50 mV (aleatoriamente) y perfundiendo las soluciones de agonistas. Los tiempos de

aplicación y lavado de las sustancias sobre las células se controlaron mediante el propio

programa pClamp (Axon Instruments).

Protocolo experimental para las curvas concentración-respuesta (C-R) secuenciales

Se realizaron curvas C-R a dos voltajes de prueba, -100 y +50 mV, para el agonista a

evaluar, muscarina. Para lo cual, se aplicaron concentraciones crecientes de agonista sólo

durante el tiempo necesario para obtener el estado estable de la corriente activada, IKACh,

continuando con un lavado hasta recuperar el nivel de corriente basal antes de aplicar la

siguiente concentración de agonista. Los tiempos de perfusión dependieron de la

concentración de agonista (5-14 s), mientras que los tiempos de lavado oscilaron entre 15-

40 s, según la concentración de agonista.

Una vez aplicadas las concentraciones de agonista a cierto voltaje, se permitió a la célula un

reposo de 1-2 min a un voltaje de -40 mV. Durante este lapso de tiempo, se verificó la

condición de la célula y posteriormente se repitió el mismo procedimiento en el otro voltaje

de prueba. Se cuantificó la amplitud de la corriente (medida al pico) activada por los

agonistas muscarínicos (IKACh) y se normalizó con respecto a la respuesta de IKACh

provocada por una concentración máxima de agonista, que servía como la referencia de qué

tanto proporcionalmente se activaba la vía de señalización por el agonista. Todo esto, con el

propósito de homogenizar las respuestas y poder hacer comparaciones entre las distintas

células, entre los voltajes de prueba y entre los agonistas a ensayar.

Ajustes de las curvas concentración-respuesta

En las curvas C-R, se graficó la magnitud de la corriente activada (IKACh), expresada en

fracción, con respecto a la concentración de agonista muscarínico utilizado, y se ajustó en

base a la ecuación de Hill: y = Emax• Xn/ [(EC50)n+ Xn]

Donde:

y = Amplitud fraccional de IKACh.

Emax= Efecto máximo alcanzado.

X = Concentración de agonista.

EC50 = Concentración que produce el 50% de la respuesta máxima.

n= Número o coeficiente de Hill.

Protocolo experimental de pulsos cuadrados de voltaje

Adicionalmente, para cada agonista se realizaron registros electrofisiológicos de corrientes

macroscópicas utilizando un protocolo de pulsos cuadrados de voltaje durante la activación

de la corriente (IKACh) en estado estable. Se aplicaron dos concentraciones del agonista,

200 nM y 10 μM. El protocolo de pulsos cuadrados de voltaje consistió en aplicar, a partir

de un potencial de mantenimiento de -40 mV, pre-pulsos de 2 s de duración desde +50 mV

hasta -130 mV con decrementos de 20 mV, seguidas por el pulso de prueba a -130 mV

(Figs. 9 y 10, inserto arriba).

Una vez ensayada una concentración de agonista (generalmente la menor), y posterior a su

lavado, se verificaba la condición de la célula y, en caso de ser buena, se procedía a repetir

el mismo protocolo de pulsos, pero ahora con la otra concentración de prueba. La corriente

activada, IKACh, se obtuvo por la sustracción digital de la corriente registrada en presencia

del agonista, menos la corriente registrada en condiciones control, aplicando en ambas el

mencionado protocolo de pulsos de voltaje.

Condiciones control de los registros electrofisiológicos

Las condiciones control para el registro de las corrientes macroscópicas en los miocitos se

realizaron siempre en la presencia de bloqueadores de otras corrientes que existen en los

miocitos auriculares de gato. Se usaron: el E-4031 (3 μM), bloqueador de la corriente

rectificadora tardía rápida (IKr); el chromanol 293B (50 μM), bloqueador de la corriente

rectificadora tardía lenta (IKs) (Sanguinetti y cols., 1991; Bosch y cols., 1998; Sun y cols.,

2000). También, esta misma concentración de chromanol 293B, 50 μM, es capaz de

bloquear un 60-70% a la corriente de K+ transitoria (Ito) (Bosch y cols., 1998; Sun y cols.,

2000). El cobalto (2 mM) en la solución externa y el BAPTA (5 mM) en la solución interna

se utilizaron para bloquear la corriente de Ca2+ tipo L y las corrientes activadas por Ca2+,

respectivamente.

Análisis estadístico de los datos

Los resultados obtenidos se presentan como los valores promedio ± el error

estándar de la media. Para las curvas C-R, los datos obtenidos en cada célula se ajustaron

de manera individual con la ecuación de Hill. Se utilizó la prueba t de Student pareada para

evaluar las diferencias estadísticas. Un valor de probabilidad de menos del 0.05 (p<0.05)

fue considerado estadísticamente significativo.

RESULTADOS

Determinación de las concentraciones de referencia de la agonista muscarina para la

activación de IKACh en miocitos cardiacos

Primero, se procedió a determinar la concentración de muscarina que activa al máximo la

vía de señalización de IKACh, es decir, la concentración que serviría de referencia para

conocer el nivel de activación que generan las concentraciones submáximas y así poder

hacer comparaciones entre los voltajes de prueba y entre las distintas células. Con este fin,

se realizaron registros electrofisiológicos a los dos voltajes de mantenimiento (-100 y +50

mV), aplicando concentraciones crecientes en un orden de magnitud para y permitiendo

lavados entre cada concentración. Para confirmar el nivel de activación de la vía, al final se

aplicó el agonista fisiológico, ACh, a una concentración (10 μM) que la activa al máximo

(Ben-Chaim y cols., 2003; Navarro-Polanco y cols., 2011 y 2013).

Respecto a la respuesta producida por ACh 10 μM, se observó que muscarina 1 μM produjo

respuestas apenas submáximas de 0.80 ± 0.11 y de 0.70 ± 0.15 a -100 mV y +50 mV,

respectivamente. Las otras concentraciones de muscarina, 10, 100 y 1000 μM activaron a

IKACh prácticamente a un mismo nivel a ambos voltajes (Fig.2). Así pues, se observó que

con muscarina sí se alcanzó el nivel de respuesta que activa una concentración máxima del

agonista fisiológico ACh, y hasta lo rebasó en un 12-30%.

Fig. 2. Activación de IKACh por el agonista muscarina en miocitos auriculares de

gato. Registros representativos de las corrientes (IKACh) activadas por 1, 10, 100 y 1000

μM de muscarina y por ACh 10 μM, a un voltaje de mantenimiento de -100 mV (A) y de

+50 mV (B). Las barras horizontales sobre las corrientes indican la duración de la

aplicación del agonista y la línea punteada señala el nivel de corriente cero. IKACh

activada por las distintas concentraciones de muscarina a -100 mV (C) y +50 mV (D),

normalizadas respecto a la respuesta obtenida con ACh 10 μM. n = 4.

Dependencia de voltaje del agonistas muscarina en la activación de IKACh

A continuación, con objeto de conocer si la vía de señalización de la corriente cardiaca

IKACh manifiesta o no dependencia de voltaje cuando es activada por muscarina, se

realizaron curvas concentración-respuesta (C-R) a partir de los registros de las corrientes

generadas a los dos voltajes de comparación, -100 y +50 mV. 22

Con muscarina, se encontró que la activación de IKACh fue dependiente del potencial de

membrana de los cardiomiocitos. Por ejemplo, los registros de la Fig. 3A muestran que,

cuando el voltaje se mantiene a -100 mV, las concentraciones 0.03, 0.3 y 3 μM produjeron

respuestas respectivas de 0.11, 0.71 y 0.93, normalizadas al efecto de la concentración

saturante de 30 μM; mientras que dichas respuestas a +50 mV fueron significativamente

menores: 0.06, 0.39 y 0.83, respectivamente. En resumen, los resultados arrojaron una

potencia significativamente mayor (~5 veces) a -100 mV, con una concentración efectiva al

50 % (EC50) de 114 ± 23 nM, que a +50 mV (EC50 = 588 ± 144 nM) (Fig. 3B).

Fig. 3. Dependencia de voltaje de muscarina para la activación de IKACh con curvas

C-R en miocitos cardiacos. A, Registros de IKACh a un voltaje de mantenimiento de +50

mV (trazos superiores) y -100 mV (trazos inferiores). Las barras horizontales sobre las

corrientes indican la duración de la aplicación del agonista y la línea punteada señala el

nivel de corriente cero. B, Curvas C-R de muscarina para la activación de IKACh a un

potencial de mantenimiento de -100 mV (■) y a +50mV (○). Los datos se normalizaron

respecto de la corriente activada por la concentración saturante de 30 μM de muscarina,

registrada en esa misma célula a ambos voltajes, y se graficaron en función de la

concentración de muscarina. Las líneas continuas representan el ajuste de los datos a la

ecuación de Hill. Los valores de Emax, EC50 y del coeficiente de Hill fueron 0.96 ± 0.04,

114 ± 23 nM y 1.03 ± 0.16, respectivamente (-100 mV), y de 1.05 ± 0.04, 588 ± 114 nM y

0.73 ± 0.08, respectivamente (+50 mV). n = 4 miocitos en ambos voltajes.

DISCUSION Y PROPUESTAS

Al activar la vía de señalización de IKACh en miocitos cardiacos, las evidencias

más importantes de este trabajo son: 1) el agonista muscarina se comporto como agonista

total y con potencia (nM) similar a la del agonista fisiológico ACh; 2) las curvas C-R,

manifestaron efectos dependientes de voltaje, 3) utilizando el protocolo de pulsos

cuadrados de voltaje, se observó una dependencia de voltaje similar a la obtenida con las

curvas C-R: mayor activación al hiperpolarizar (muscarina).

En el sistema de señalización celular aquí utilizado, activación de IKACh en miocitos

auriculares felinos, y bajo nuestras condiciones experimentales, se encontró que muscarina

se comporta como agonista total, dado que es capaz de generar la máxima respuesta, la

cual se comprobó con la aplicación de una concentración saturante del agonista endógeno,

ACh 10 μM (Ben-Chaim y cols., 2003; Moreno-Galindo, 2008; Navarro-Polanco y cols.,

2011 y 2013). El agonismo y la potencia fueron congruentes con lo observado en estudios

funcionales de disminución de la frecuencia y contractilidad cardiacas en cobayo (Clague y

cols., 1985; De Amici y cols., 2000).

En cuanto a la dependencia de voltaje, muscarina activó a IKACh de manera

semejante a como lo hace ACh (Moreno-Galindo y cols., 2011), tanto en la potencia, la

cual osciló en el rango nanomolar; así como en el sentido y magnitud del cambio de la

potencia ocasionado por el voltaje, la cual fue ~5 veces menor a -100 mV que a +50 mV.

Hasta el momento, sólo agonistas estructuralmente muy semejantes a ACh (con un

grupo sustituído),como carbacol y metacolina, habían tenido una dependencia de voltaje

similar a ACh (Salazar-Fajardo, en preparación); mientras que con agonistas con un poco

de mayor diferencia estructural a la ACh (con dos o más grupos sustituídos), como colina,

pilocarpina, tetrametil amonio y betanecol, se ha observado una dependencia de voltaje

diferente a la de ella (Moreno-Galindo, 2008; Navarro-Polanco y cols., 2011 y 2013). Así,

puede decirse que el resultado con muscarina fue inicialmente algo sorpresivo porque

estructuralmente se asemeja a ACh y a pilocarpina, lo cual quiere decir que se necesitaría el

apoyo de estudios de interacción ligando-receptor (docking), sobre todo ahora que

recientemente se hizo la descripción cristalográfica de los receptores M2 (Haga y cols.,

2012)

Con respecto al fenómeno de la relajación de IKACh, utilizando concentraciones

donde la dependencia de voltaje se manifiesta con muscarina 200 nM, la despolarización

generó la disminución gradual de IKACh, y la hiperpolarización ocasionó el aumento

paulatino de esta corriente. Todo lo cual es precisamente lo que se observó en las curvas C-

R: muscarina activó mayor corriente en los voltajes negativos (-100 mV) que a los positivos

(+50 mV. Así, se puede decir que la muscarina manifestó el comportamiento típico de la

relajación (Noma y Trautwein, 1978). Con las concentraciones altas, donde la gran mayoría

de canales están activados y la dependencia de voltaje tiende a saturarse, la dependencia de

voltaje de la relajación igualmente tendió a desaparecer. Estos resultados, donde la

relajación de IKACh es dependiente de voltaje, de concentración y de ligando, son

congruentes con lo reportado con ACh y pilocarpina (Moreno-Galindo y cols., 2011). De

esta manera, encontramos una estrecha relación entre la dependencia de voltaje y el

fenómeno de la relajación de IKACh que manifestó el agonista evaluado.

REFERENCIAS

Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. and Walter, P. Signaling through

Gprotein-linked cell-surface receptors. En: Molecular biology of the cell. (4th ed.).

USA: Garland Science, 2002, p. 852-853.

Ben-Chaim, Y., Chanda, B., Dascal, N., Bezanilla, F., Parnas, I. and Parnas, H. (2006).

Movement of „gating charge‟ is coupled to ligand binding in a G-protein-coupled

receptor. Nature 444 (7115): 106-109

Ben-Chaim, Y., Tour, O., Dascal, N., Parnas, I. and Parnas, H. (2003). The M2 muscarinic

G-protein-coupled receptor is voltage-sensitive. J. Biol. Chem. 278: 22482-22491.

Bosch, R.F., Gaspo, R., Busch, A.E., Lang, H.J., Li, G.R. and Nattel, S. (1998). Effects of

the chromanol 293B, a selective blocker of the slow, component of the delayed

rectifier K+ current, on repolarization in human and guinea pig ventricular

myocytes. Cardiovasc. Res. 38: 441-450.

Breitweiser, G. and Szabo, G. (1985). Uncoupling of cardiac muscarinic and β-adrenergic

receptors from ion channels by a guanine nucleotide analog. Nature 317: 538-540.

Clague, R. U., Eglen, R. M., Strachan, A. C. and Whiting, R. L. (1985). Action of agonists

and antagonists at muscarinic receptors present on ileum and atria in vitro.Br. J.

Pharmacol. 86: 163-170.

De Amici, M., CleliaDallanoce C., De Micheli, C., Angeli, P., Marucci, G., Cantalamessa,

F. and Sparapassi L., 2000. Pharmacological profile of enantiomerically pure

chiral muscarinic agonists Desoxymuscarines. Life Sciences. 67 (2000) 317–326.

Dekel, N. (2005). Is the metabotropic GABAB G-protein-coupled receptor voltage

sensitive? Rev. Neurosci.16: S16

Dekel, N., Priest, M.F., Parnas, H., Parnas, I. and Bezanilla, F. (2012). Depolarization

induces a conformational change in the binding site region of the M2 muscarinic

receptor. PNAS 109: 285-290.

Haga K.,Kruse A.C., Asada H., Yurugi-Kobayashi T., Shiroishi M., Zhang C., Weis W.I.,

Okada T., Kobilka B.K., Haga T. and Kobayashi T. (2012). Structure of the human

M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist. Nature. 482, 547–

551

Hibino, H., Inanobe, A., Furutani, K., Murakami, S., Findlay, I. and Kurachi, Y. (2010).

Inwardly rectifying K+ channels: their structure, function, and physiological roles.

Physiol. Rev. 90: 291-366.

Hille, B. Ion channels of excitable membranes. (2001). USA: Sinauer Associates, 3th. ed.

Holinstat, M.,Oldham, W.M. and Hamm, H.E. (2006). G-protein-coupled receptors:

evolving views on physiological signalling: symposium on G-protein-coupled

receptors: evolving concepts and new techniques. EMBO Rep; 7(9): 866–869.

Hoz- Jiménez, C. G., Papel de PKCδ en la estimulación de ERK5 por GPCRs acoplados a

proteínas Gq y su repercusión en hipertrofia cardiaca (2008). Tesis Doctoral.

Madrid: Departamento de Biología Molecular, Universidad Autónoma de Madrid.

Isenberg, G. and Klöckner, U. (1982). Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by

pre-incubation in a KB-medium.Plügers Arch. 395: 6-18.

Ishii, M., Inanobe, A., Fujita, S., Makino, Y., Hosoya, Y. and Kurachi, Y. (2001). Ca2+

elevation evoked by membrane depolarization regulates G-protein cycle via RGS

proteins in the heart. Circ. Res. 89: 1045-1050.

Itoh, T., Seki, N., Suzuki, S., Ito, S., Kajikuri, J. and Kuriyama, H. (1992). Membrane

hyperpolarization inhibits agonist induced synthesis of inositol 1,4,5-triphosphate

in rabbit mesenteric artery. J. Physiol. 451: 307-328.

Jacoby E., Bouhelal R., Gerspacher M. and Seuwen K. (2006). The 7 TM G-protein-

coupled receptor target family. ChemMedChem 1(8):761-782.

Krejči, A. and Tuček, S. (2002). Quantitation of mRNAs for M1 to M5 subtypes of

muscarinic receptors in rat heart and brain cortex. Mol. Pharmacol. 61: 1267-

1272.

Kroeze, W.K., Sheffler, D.J. and Roth, B.L. (2003).G-protein-coupled receptors at a glance.

J. of cell Sci. 116: 4867-4869.

Kurachi Y, Ishii M. (2004). Cell signal control of the G protein-gated potassium channel

and its subcellular localization. J Physiol. 554(Pt 2):285-94

Lagerström M.C. and Schiöth H.B. (2008). Structural diversity of G protein-coupled

receptors and significance for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery 7,

339-357

Löffelholz, K. and Papano, A.J. (1985). The parasympathetic neuroefector junction of the

heart.Pharmacol. Rev. 37: 1-24.

Mahaut-Smith, M. P., Hussain, J. F. and Mason, M. J. (1999). Depolarization-evoked Ca2+

release in a non-excitable cell, the rat megakaryocyte. J. Physiol. 515: 385-390

Marinissen M.J. and Gutkind J.S. (2001) G-protein-coupled receptors and signaling

networks: emerging paradigms. Trends Pharmacol Sci 22 (7): 368-376.

Martinez-Pinna, J., Gurung, I.S., Vial, C., Leon, C., Gachet, C., Evans, R.J. and Mahaut-

Smith, M.P. (2005). Direct voltage control of signaling via P2Y1 and other

Galphaq-coupled receptors. J. Biol. Chem. 280: 1490-1498.

Marty, A. and Tan, Y. P. (1989). The initiation of calcium release following muscarínico

stimulation in rat lacrimal glands. J. Physiol. 419: 663-678

Mascher, D. Propiedades funcionales de los tejidos cardiacos. En: Fisiología; células,

órganos y sistemas. (1ª ed.). Editado por ediciones científicas universitarias.

México. Compiladores: Muñoz-Martínez, E. J. y Garcia X., 1997, p. 37-63

Moreno-Galindo, E. G. Caracterización de la interacción voltaje-dependiente de agonistas

muscarínicos sobre el receptor muscarínico M2 de corazón. Tesis Doctoral.

Colima: Universidad de Colima, 2008.

Moreno-Galindo, E. G., Sánchez-Chapula, J. A., Sachse F.B., Rodríguez-Paredes J.A.,

Tristani-Firouzi M. and Navarro-Polanco R.A., (2011). Relaxation gating of the

acetylcholine-activated inward rectifier K+ current is mediated by intrinsic voltage

sensitivity of the muscarinic receptor. J. Physiol 589.7: 1755–1767.

Navarro-Polanco, R. A., Moreno-Galindo, E. G.,Ferrer-Villada T., Arias M., Rigby J.R.,

Sánchez-Chapula J.A. and Tristani-Firouzi M., (2011). Conformational changes in

the M2 muscarinic receptor induced by membrane voltage and agonist binding. J.

Physiol 589.7: 1741–1753.

Navarro-Polanco, R.A., Aréchiga-Figueroa, I.A., Salazar-Fajardo, P.D., Benavides-Haro,

D.E., Rodríguez-Elias, J.C., Sachse, F.B., Tristani-Firouzi, M., Sánchez-Chapula,

J.A. and MorenoGalindo, E.G. (2013). Voltage sensitivity of M2 muscarinic

receptors underlies the delayed rectifier-like activation of ACh-gated K+ current

(IKACh) by choline in feline atrial myocytes. J. Physiol. Aceptado y publicado

previo a su impresión: 07 Mayo 2013. Doi:10.1113/jphysiol.2013.255166.

Nichols, C. G. and Lopatin, A. N. (1997). Inward rectifier potassium channels. Annu. Rev.

Physiol. 59: 171-191.

Noma, A. and Trautwein, W. (1978). Relaxation of the ACh-induced potassium current in

the rabbit sinoatrial node cell. Pflügers Arch. 377: 193-200.

Ohana, L., Barchad, O., Parnas, I. and Parnas, H. (2006). The metabotropic glutamate

Gprotein-coupled receptors mGluR3 and mGluR1a are voltage-sensitive. J. Biol.

Chem. 281: 24024-24215.

Parnas, H. and Parnas, I. (2007). The chemical synapse goes electric: Ca2+-and

voltagesensitive GPCRs control neurotransmitter release. Trends Neurosci. 30: 54-

61.

Perroy, J., Richard, S., Nargeot, J., Bockaert, J. and Fagni, L. (2002). Permissive effect of

voltage on mGlu 7 receptor subtype signaling in neurons. J. Biol. Chem. 277:

1223-1228.

Pfaffinger, P.J., Martin, J.M., Hunter, D.D., Nathanson, N.M. and Hille, B. (1985). GTP-

binding proteins couple cardiac muscarinic receptors to a K+ channel. Nature 317:

536-538.

Rinne, A., Birk, A. and Bünemann, M. (2013). Voltage regulates adrenergic receptor

function. PNAS 110: 1536-1541.

Ruppersberg, J. P. (2000). Intracellular regulation of inward rectifier K+ channels. Plügers

Arch. (Eur. J. Physiol.) 441: 1-11.

Salazar-Fajardo, P. D. Papel de la sensibilidad al voltaje del receptor muscarínico M2 en la

modulación de la rectificación de IKACh en miocitos cardiacos. Tesis Doctoral.

Colima: Universidad de Colima, en preparación.

Sanguinetti, M.C. and Jurkiewicz, N.K. (1991). Delayed rectifier outward K+ current is

composed of two currents in guine pig atrial cells. Am. J. Physiol. 260: H393-399.

Stengel, P.W., Gomeza, J., Wess, J. and Cohen, M.L. (2000). M2 and M4 receptor

knockout mice: muscarinic receptor function in cardiac and smooth muscle in

vitro. J. Pharmacol. Exp. Ther. 292: 877-885.

Sun, Z. Q., Thomas, G.P. and Antzelevitch, C. (2000). Chromanol 293B inhibits slowly

activating delayed rectifier and transient outward currents in canine left ventricular

myocytes. J. Cardiovasc Electrophysiol. 12: 472-478.

Wess, J. (1996). Molecular biology of muscarinic acetylcholine receptors. Crit. Rev.

Neurobiol. 10: 69-99.

Wess, J. (2004). Muscarinic acetylcholine receptor knockout mice: novel phenotypes and

clinical implications. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44: 423-450.

Yamada, M., Inanobe, A. and Kurachi, Y. (1998). G protein regulation of potassium ion

channels. Pharmacol rev, 50, 723-760.