PENGARUH ALFA-TOKOFEROL TERHADAP EKSPRESI PROTEIN KINASE C

PADA LIGAMEN SPIRALE KOKLEA TIKUS DIABETES

THE INFLUENCE OF ALPHA-TOCOPHEROL ON THE EXPRESSION OF PROTEIN KINASE C

IN THE COCHLEAR SPIRAL LIGAMENT ON DIABETIC RATS

Oraetlabora Immanuel Palandeng,1 Suryani As’ad,2 Karel Pandelaki,3 Ilhamjaya Patellongi4

1Bagian THT-KL, Fakultas Kedokteran, Universitas Sam Ratulangi, Manado. 2Bagian Gizi, Fakultas Kedokteran, Universitas Hasanuddin, Makassar.

3Bagian Penyakit Dalam, Fakultas Kedokteran, Universitas Sam Ratulangi, Manado. 4Bagian Fisiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Hasanuddin, Makassar

Alamat Korespondensi : Oraetlabora I Palandeng Bagian THT-KL Fakultas Kedokteran Universitas Sam Ratulangi Manado 95115 HP: 0811434436 Email: oraetlaborap@yahoo.com

Abstrak

Gangguan pendengaran merupakan salah satu bentuk komplikasi pada penderita diabetes melitus, dan sampai saat ini belum tersedia pengobatan yang khusus ditujukan untuk mengatasi gangguan pendengaran tersebut. Tujuan penelitian ini adalah untuk menguji pengaruh α-tokoferol terhadap perobahan ekspresi protein kinase C (PKC) pada ligamen spirale koklea tikus diabetes. Diharapkan hasil penelitian ini dapat bermanfaat dalam membangun konsep pencegahan / pengobatan gangguan pendengaran pada penderita DM. Dilakukan penelitian eksperimental dengan rancangan randomized post test only control group design, dengan menggunakan 25 ekor tikus Rattus norvegicus strain wistar sebagai hewan coba, yang dibagi menjadi 5 kelompok; 1 kelompok kontrol sehat, satu kelompok kontrol diabetes (di induksi dengan STZ), dan 3 kelompok perlakuan (diabetes + α-tokoferol) dengan dosis α-tokoferol 100, 200 dan 300 mg per kgBB/hari, selama 4 minggu. Hasil analisa statistik, berat badan sampel berdisbusi normal (uji Kolmogorov-Smirnov p = 0,855), antar kelompok mempunyai variansi yang homogen (Levene’s test p = 0,258), tidak terdapat perbedaan bermakna antar kelompok (Oneway Anova p = 0,230). Hasil pengukuran imunohistokimia ekspresi PKC, dengan analisis perbandingan ganda (Tukey HSD) didapatkan perbedaan bermakna (p = 0,000) antar semua kelompok sampel, kecuali antar kelompok P2 (dosis α-tokoferol 200 mg) dan P3 (dosis α-tokoferol 300 mg) didapatkan hasil p = 0,328 (p > 0,05). Disimpulkan bahwa α-tokoferol dapat menurunkan ekspresi PKC sel fibroblas pada ligamen spirale koklea tikus diabetes, semakin tinggi dosis semakin menurun ekspresinya, dengan dosis maksimal 300mg/kgBB/hari. Diharapkan untuk dilakukan penelitian lanjut untuk menguji peran α-tokoferol terhadap pencegahan/pengobatan gangguan pendengaran pada penderita diabetes melitus dan untuk menentukan dosis yang tepat bagi manusia. Kata kunci : α-tokoferol, protein kinase C, gangguan pendengaran. Abstract

Hearing impairment is one of the complication in patients with diabetes mellitus, and so far have not provided specific treatments aimed to overcome this hearing loss. The purepose of this study was to examine the effect of α-tocopherol to chenge the expression of protein kinase C (PKC) to cochlea spirale ligaments on diabetic rats. The result on this study is expected to be useful in establishing concept of prevention / treatment of hearing impairment in patients with diabetes mellitus. Experimental studies with randomized post test only control group design, using 25 rats rattus norvegicus strain wistar as experimental animals, which were divided into 5 groups a control group of healthy, one control group of diabetes (induced by STZ) and 3 treatment group (diabetes + α-tocopherol) with doses of α-tocopherol 100, 200 and 300 mg/kg bw/day for 4 weeks. The results of statistical analysis, the sample weight normal distribution (Kolmogorov-Smirnov test p = 0,855), between groups that have homogeneous variance (Levene's test p = 0.258), there were no significant differences between groups (Oneway Anova p = 0,230). The results of measurements of immunohistochemical expression of PKC, with multiple comparison analysis (Tukey HSD) found significant differences (p = 0.000) between all groups of sample, except between groups P2 (α-tocopherol 200 mg) and P3 (α-tocopherol 300 mg) a result of p = 0,328 (p > 0,05). It was concluded that α-tocopherol can reduce the expression of PKC on fibroblast cells in the cochlear spirale ligament on diabetic rats, the higher dose decreased expression, with a maximum dose of 300 mg / kg body weight/day. Expected to do further research to examine the role of α-tocopherol on the prevention / treatment of hearing loss in patients with diabetes mellitus and to determine the appropriate dose for humans. Keywords : α-tocopherol, protein kinase C, hearing impairment.

PENDAHULUAN

Diabetes melitus (DM) adalah penyakit metabolik, umumnya herediter akibat

kurangnya insulin secara absolut (DM tipe 1) atau relatif (DM tipe 2) dengan gangguan

primer pada metabolisme lemak dan protein, yang secara klinis ditandai hiperglikemia dan

glukosuria (Pandelaki, 2000; ADA, 2011). Di Indonesia, jumlah penyandang DM semakin

tahun semakin menunjukkan peningkatan yang sangat tinggi. Pada tahun 2000, jumlah

penyandang DM di Indonesia sebanyak 8,4 juta jiwa dan diperkirakan akan mencapai angka

12,4 juta jiwa pada tahun 2025. Hal tersebut mengakibatkan Indonesia berada di peringkat

kelima jumlah penyandang DM di dunia setelah India, Cina, USA dan Pakistan (Kusumadewi,

2009; Tandra, 2007).

Berbagai penelitian telah membuktikan bahwa pendengaran menurun merupakan salah

satu bentuk komplikasi kronik pada penderita DM yang masih merupakan masalah karena

angka kejadiannya yang cukup tinggi dan sampai saat ini belum tersedia pengobatan yang

efektif untuk memperbaiki gangguan pendengaran. Bahkan fakta di klinik membuktikan

kurangnya penelitian – penelitian yang khusus ditujukan untuk mencegah atau memperbaiki

gangguan pendengaran.

Beberapa dekade terakhir ini, pemberian α-tokoferol pada penderita DM telah mulai

diteliti. Koya et al (1998) pada penelitiannya dengan pemberian α-tokoferol dalam biakan sel

vaskuler dapat menurunkan produksi diacylglycerol (DAG). Disimpulkan bahwa pemberian

α-tokoferol dapat mencegah aktivasi protein kinase C (PKC) melalui penurunan kadar DAG

dengan cara mengaktifkan enzim DAG kinase yang akan memetabolisme DAG menjadi asam

sosfatidik. Seperti diketahui, peran PKC terhadap terjadinya komplikasi mikroangiopati

berawal dari keadaan hiperglikemia pada penderita DM akan meningkatkan sintesis DAG.

Peningkatan kadar DAG ini akan menyebabkan peningkatan aktifitas PKC. Selanjutnya,

aktivasi PKC menyebabkan peningkatan permeabilitas vaskuler, ekspresi molekul adhesi

seperti VCAM dan ICAM, Na+/H+ antiport dan pH intrasel, proliferasi sel, sintesis kolagen

membrana basalis, sintesis fibronektin, prostanoid – prostanoid vasokonstriktor, hormon –

hormon vasoaktif, AGEs (Advanced Glycosylated End products), endotelin-I, serta hambatan

terhadap ekspresi gen (King & Brownlee, 1996; Koya et al, 1998; Pandelaki, 2000;

Schalkwijk, 2005).

Penelitian ini ditujukan untuk menguji pengaruh α-tokoferol terhadap perubahan

ekspresi PKC sel fibroblas ligamen spirale koklea pada kondisi diabetes (hiperglikemia).

Informasi temuan pada penelitian ini akan menjadi kajian ilmiah, yang diharapkan menjadi

dasar dalam membangun konsep pencegahan / pengobatan gangguan pendengaran pada

penderita DM.

BAHAN DAN METODE

Jenis dan Rancangan Penelitian

Jenis penelitian ini adalah eksperimental laboratories in vivo, dengan rancangan

randomized post test only control group design; untuk mengetahui pengaruh pemberian

α-tokoferol pada unit eksperimen dengan pengukuran variabel hanya dilakukan pada akhir

perlakuan.. Rancangan penelitian memiliki kriteria sebagai berikut : 1) pengambilan sampel

dilakukan secara acak, 2) ada pengulangan, 3) ada kontrol pembanding.

Tempat dan Waktu Penelitian

Pengadaan hewan coba, pemeliharaan, seleksi sampel, pemeriksaan kadar gula darah,

pembuatan model tikus diabetes, pemberian perlakuan, pemeriksaan histopatologi,

pemeriksaan Elisa, serta pemeriksaan Imunohistokimia dilakukan di Laboratorium

Biomolekuler dan Laboratorium Biokimia Universitas Brawijaya Malang. Pemotongan /

pembuatan slide dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi Universitas Airlangga

Surabaya. Penelitian dilakukan selama 10 bulan (Juni 2011 – April 2012), meliputi persiapan

bahan dan alat, perlakuan, pemeriksaan, analisa data dan penyusunan laporan.

Sampel

Sampel penelitian dipilih tikus karena mempunyai kemiripan struktur labirin (telinga

dalam) dengan manusia, dan menggunakan tikus strain populasi yang sama, homogen dalam

jenis kelamin dan umur. Besar sampel ditentukan berdasarkan jumlah ulangan yang dianggap

telah cukup baik (Hanafiah, 2005), dengan rumus sebagai berikut :

(k – 1) (r – 1) ≥ 15

Keterangan : k = jumlah kelompok subyek penelitian (k = 5) r = jumlah pengulangan Perhitungan : (5 – 1) (r – 1) ≥ 15 r ≥ 4 Apabila ditetapkan ulangan tiap kelompok 5 kali, maka besar sampel adalah 5 X 5 = 25

Teknik Pengambilan Sampel Sebelum digunakan sebagai sebagai subyek penelitian, pada hewan coba dilakukan

evaluasi klinis dan dikondisikan dalam lingkungan yang sesuai (selama 14 x 24 jam) untuk

meyakinkan bahwa hewan tersebut tidak berpenyakit atau tidak berpotensi menularkan

penyakit. Sebelum mendapatkan perlakukan penelitian, dilakukan seleksi sampel dengan

kriteria Inklusi : hewan coba berusia 2 bulan, kelamin jantan dan berat badan 125 – 175 gram.

Kriteria Ekslusi : hewan coba dinyatakan oleh dokter hewan konsultan terbukti berpenyakit

baik oleh penyakit menular atau tidak menular atau cedera fisik atau berpotensi menularkan

penyakit dalam kurun waktu evaluasi klinis di dalam kondisi lingkungan yang sesuai (selama

14x24 jam), hewan coba terdeteksi memiliki kelainan bawaan yang dinyatakan oleh dokter

hewan konsultan, hewan coba berperilaku agesif, dalam pengamatan sering menyerang

anggota kelompok lain.

Setelah didapatkan sampel melalui seleksi dengan kriteria inklusi dan ekslusi di atas,

dilakukan pembagian kelompok sampel secara alokasi random sehingga setiap anggota

sampel mempunyai kesempatan yang sama untuk menempati kelompoknya.

Dalam proses pelaksanaan penelitian, diberlakukan kriteria drop out (putus uji)

apabila : 1) Kadar gula darah < 300 mg/dl setelah induksi streptozotocin (STZ) selama 5 hari

berturut – turut, 2) subyek penelitian mengalami sakit atau kematian sehingga tidak bisa

memenuhi prosedur penelitian.

Variabel Penelitian

Variabel bebas; pada suatu penelitian eksperimental, variabel bebas adalah perlakuan,

Pada penelitian ini variabel bebas adalah α-tokoferol 100mg/kgBB/hari, 200mg kgBB/hari

dan 300mg kgBB/hari dengan waktu pemberian 4 minggu.

Variabel tergantung; pada penelitian eksperimen variabel tergantung merupakan

respon obyek penelitian terhadap perlakukan yang diberikan. Pada penelitian ini variabel

tergantung adalah hasil pemeriksaan histopatologi ligamen spirale koklea.

Variabel antara; pada penelitian eksperimental adalah respon obyek penelitian

terhadap perlakuan, yang berlaku sebagai penghubung antara variabel bebas dengan variabel

tergantung. Variabel antara pada penelitian ini adalah ekspresi PKC.

Variabel kendali; merupakan variabel yang dikendalikan oleh peneliti agar subyek

penelitian dalam keadaan homogen. Pengendalian dilakukan dengan memberlakukan syarat

sampel yang digunakan pada penelitian ini. Variabel kendali pada penelitian ini adalah tikus

putih (rattus norvegicus strain wistar), jenis kelamin jantan, berat badan tikus, kandang tikus,

makanan tikus, kadar gula darah (GD) sebelum perlakuan, diagnosis diabetes, cara

pemeliharaan tikus, cara pemberian dan dosis α-tokoferol, serta prosedur penelitian.

Prosedur Perlakuan pada Hewan Coba

Sebanyak 25 ekor tikus yang memenuhi kriteria penelitian dibagi secara random

menjadi 5 kelompok, sebagai berikut : 1) kelompok kontrol sehat (K0), 2) kelompok kontrol

DM tanpa perlakuan (K1), 3) kelompok DM + α-tokoferol 100 mg/kgBB/hari (P1), 4)

kelompok DM + α-tokoferol 200 mg/kgBB/hari (P2), 5) kelompok DM + α-tokoferol 300

mg/kgBB/hari (P3). Kemudian dilakukan pemeriksaan kadar gula darah awal dengan

menggunakan glukometer. Kelompok K1, P1, P2, dan P3 disuntik dengan Streptozotocin

(STZ) 30mg/kgBB/hari secara intraperitoneal. Pada kelompok K0 (kelompok kontrol normal)

tidak diinduksi STZ, hanya disuntikan larutan buffer sitrat saja secara intraperitoneal. Induksi

dilakukan selama 5 hari berturut-turut, kemudian dilakukan pemeriksaan gula darah. Setelah

diperoleh kondisi diabetes (kadar gula darah > 300 mg) dipertahankan / diisolasi selama 2

minggu, kemudian pada kelompok P1, P2, P3 diberi perlakuan masing- masing diberi

α-tokoferol 100mg/kgBB/hari, 200mg/kgBB/hari dan 300mg/kgBB/hari selama 4 minggu.

Pemberian α-tokoferol dilakukan dengan cara ad libitum personde. Pada akhir perlakuan tikus

akan dimatikan dengan inhalasi eter, dilakukan nekropsi jaringan tulang temporal kepala tikus,

kemudian koklea dipisahkan / diambil dari tulang temporal dan direndam dalam larutan

buffer formalin, kemudian dilakukan pemeriksaan histopatologi dan immunohistokimia.

HASIL PENELITIAN

Uji Homogenitas Berat Badan Sampel

Data berat badan sampel (tabel 1) menunjukkan berat badan awal semua kelompok

sampel berdistribusi normal (uji Kolmogorov-Smirnov didapatkan p = 0,855), dan antar

kelompok memiliki variansi yang homogen; Levene’s test p = 0,258. Untuk mengetahui

perbedaan berat badan antar kelompok digunakan analisis variansi satu arah (Oneway Anova)

didapatkan nilai F = 1,536 dan p = 0,230 (p > 0,05). Berdasarkan uji distribusi berat badan

awal penelitian diperoleh hasil bahwa perbedaan berat badan awal antar kelompok tidak

memperlihatkan perbedaan yang bermakna (p > 0,05), sehingga kelompok sampel ini

mempunyai sebaran yang homogen.

Hasil Induksi STZ

Untuk mengetahui pengaruh pemberian STZ terhadap terjadinya Hiperglikemia,

dibandingkan kadar gula sebelum dan sesudah pemberian STZ (tabel 2). Terdapat perbedaan

yang bermakna (p < 0,05) pada kelompok sebelum dan sesudah induksi STZ. Tabel di atas

menunjukkan pengaruh STZ terhadap terjadinya diabetes (GD > 300 mg/dl).

Hasil Pengukuran PKC dengan metode Immunohistokimia

Gambaran ekspresi PKC sel-sel fibroblas ligamen spirale yang didapatkan dengan

metode imunohistokimia pada masing – masing kelompok perlakuan tampak pada gambar 2.

Perbandingan ekspresi PKC masing – masing kelompok dapat dilihat pada tabel 3. Data

pengukuran ekspresi PKC ligamen spirale berdistriusi normal (Uji Kolmogorov didapatkan P

= 0,452), dan antar kelompok memiliki variansi yang homogen (Levene’s test p = 0,354).

Untuk mengetahui perbedaan ekspresi PKC antar kelompok digunakan analisis

variansi satu arah (Oneway Anova) didapatkan nilai F = 550,194 dan p = 0.000 (p < 0.05).

Dengan demikian dapat disimpulkan terdapat perbedaan ekspresi PKC minimal antar

sepasang kelompok.

Untuk mengetahui pasangan kelompok yang berbeda dilakukan analisis perbandingan

ganda (multiple comparison) dengan Tukey HSD. Terdapat perbedaan bermakna p = 0,000

(p < 0,05) antara kelompok kontrol K0 (tikus sehat) dengan kelompok kontrol K1 (Tikus

diabetes tanpa perlakuan). Demikian pula antara kelompok kontrol K1 dengan kelompok

perlakuan P1 (tikus diabetes + α-tokoferol 100mg), P2 (tikus diabetes + α-tokoferol 200mg),

P3 (tikus diabetes + α-tokoferol 300mg). Peningkatan ekspresi sangat nyata terlihat pada

kelompok K1 dibanding kelompok K0. Penurunan ekspresi terlihat pada kelompok perlakuan

(P1, P2, P3) dibanding kelompok K1, dimana terlihat semakin menurun dengan bertambahnya

dosis perlakuan, namun terlihat tidak ada perbedaan bermakna antara kelompok P2 dan P3

dimana didapatkan P = 0,328 (p > 0,05).

PEMBAHASAN

Penelitian ini dilaksanakan untuk menguji pengaruh α-tokoferol terhadap perubahan

molekuler ligamen spirale koklea pada kondisi DM (hiperglikemia). Informasi temuan pada

penelitian ini akan menjadi kajian ilmiah untuk melengkapi penelitian – penelitian

sebelumnya, dan menjelaskan mekanisme peran α-tokoferol ditingkat molekuler ligamen

spirale pada penderita DM. Seperti diketahui berbagai penelitian telah membuktikan bahwa

gangguan pendengaran merupakan salah satu bentuk komplikasi kronik pada penderita DM

yang masih merupakan masalah karena angka kejadiannya cukup tinggi dan sampai saat ini

belum tersedia pengobatan yang efektif untuk memperbaiki gangguan pendengaran. Bahkan

fakta di klinik membuktikan kurangnya penelitian – penelitian yang khusus ditujukan untuk

mencegah atau memperbaiki gangguan pendengaran. Diharapkan dari hasil penelitian ini akan

memberikan pemahaman baru yang dapat menjadi dasar untuk membangun konsep dalam

mencegah / memperbaiki gangguan pendengaran pada penderita DM.

Jenis penelitian adalah eksperimental laboratories in vivo. Penelitian ini menggunakan

rancangan randomized post test only control group design. Dipilih jenis ini karena baik

sampel maupun perlakun lebih terkendali, terukur dan pengaruh perlakuan dapat lebih

dipercaya. Prosedur perlakuan serta pemeriksaan akhir yang berkibat fatal, menjadikan

penelitian ini hanya mungkin dilakukan pada hewan coba. Tikus digunakan sebagai hewan

coba, hal ini dilakukan oleh karena struktur koklea tikus homolog dengan manusia, dan hewan

ini sudah banyak dipakai sebagai model untuk penelitian – penelitian DM (Dhein et al, 2003;

Akbarzadeh et al, 2007; Arora et al, 2009). Selain itu, jika dibanding dengan kera atau kelinci,

tikus lebih banyak dipilih (Sitompul, 2004).

Persiapan hewan coba tujuan utamanya adalah untuk mendapatkan sampel yang

homogen. Tikus Putih (Rattus norvegicus strain wistar) yang memenuhi kriteria penelitian

dikelompokan secara random menjadi 5 kelompok : kontrol sehat, kontrol sakit (diabetes) dan

3 kelompok perlakuan. Data analisis berat badan awal sampel (table 1) berdistribusi normal

berdasarkan uji Kolmogorov-Smirnov didapatkan p = 0,855 (p > 0,05) dan antar kelompok

mempunyai variansi homogen yang didapatkan dari Levene’s test p = 0,258 (p > 0,05; tidak

terdapat perbedaan yang bermakna).

Alfa-tokoferol di samping efeknya sebagai antioksidan, α-tokoferol terbukti dapat

menurunkan aktivitas isozim PKC-α pada berbagai sel (Boscoboinik et al, 1991; Egger et al,

2003; Ricciarelli et al, 1998; Tasinato et al, 1995). Kemampuan α-tokoferol dalam

menurunkan aktivitas PKC pada sel endotel aorta manusia dapat menerangkan efek

pemberian α-tokoferol dalam mencegah disfungsi endotel karena oxidized LDL. Pengaruhnya

terhadapa penurunan laju proliferasi terhadap sel otot polos vaskuler dapat dipakai untuk

menurunkan kejadian penyakit atherosklerrosis dan hipertensi (Boscoboinik et al, 1991;

Clement et al, 1997; Tasinato et al, 1995).

Mekanisme α-tokoferol dalam mempengaruhi aktivitas isozim PKC-α terjadi secara

tidak langsung, yakni dengan menghambat ekspresi diasilgliserol (DAG) yang ada di

permukaan membran atau mengaktifkan enzim protein fosfatase PP2A (Egger et al, 2003;

Hansra et al, 1996; Ricciarelli et al, 1998; Tasinato et al, 1995). DAG bersama-sama dengan

ion kalsium berfungsi dalam mengaktifkan enzim cPKC di permukaan sel, sehingga

penurunan ekspresi DAG menyebabkan penurunan aktivitas PKC. Kemungkinan lain dari

menurunnya aktivitas PKC akibat paparan α-tokoferol adalah terjadinya peningkatan aktivitas

enzim PP2A, dan selanjutnya enzim yang aktif ini menyebabkan defosforilasi isozim PKC-α

(Martin et al, 1998; Nishizuka, 2003; Ricciarelli et al, 1998; Tasinato et al, 1995).

Pada penelitian ini terbukti bahwa aktivitas PKC menurun setelah pemberian terapi

α-tokoferol. Melalui pemulasan imunohistokimia dapat dibuktikan penurunan aktivitas isozim

PKC sebanding dengan dosis yang diberikan, yakni semakin tinggi dosis, ternyata semakin

rendah aktivitasnya (tabel 3). Analisis statistik menunjukkan perbedaan bermakna antara

kelompok K1 (kontrol DM tanpa terapi α-tokoferol) dengan kelompok P1 (DM terapi vitamin

E 100 mg), demikian juga dengan kelompok P2 (DM terapi α-tokoferol 200 mg). Perbedaan

bermakna juga terlihat antara ekspresi PKC kelompok kontrol sehat dengan kelompok terapi

vitamin E 300 mg; menunjukkan bahwa hasil terapi tidak dapat menurunkan aktivitas PKC ke

nilai normal. Hal ini mendukung teori yang disampaikan King and Banskota (1994) bahwa

sekali PKC dan DAG mengalami perubahan, regulasi glukosa darah tidak dapat segera

memulihkan semua manifestasi biokimiawi yang telah terjadi. Sedangkan antara kelompok P2

dengan kelompok P3 (DM terapi α-tokoferol 300 mg) juga terjadi penurunan ekpresi PKC

namun dari analisis statistik menyatakan tidak terdapat perbedaan bermakna. Hal ini dapat

menggambarkan suatu kemungkinan dosis yang dapat memberikan efek optimal untuk

menurunkan aktivitas PKC pada tikus diabetes adalah berkisar antara 200 – 300 mg.

Pemberian α-tokoferol yang menyebabkan penurunan ekpresi PKC sel fibroblas

ligamen spirale koklea tikus diabetes pada penelitian ini, memang belum dapat menyimpulkan

bahwa α-tokoferol dapat mencegah atau mengobati gangguan pendengaran pada penderita

diabetes, namun sudah mengindikasikan suatu kondisi yang lebih baik dibanding tidak diberi

α-tokoferol.

KESIMPULAN DAN SARAN

Alfa-tokoferol dapat menurunkan ekspresi PKC sel fibroblas pada ligamen spirale

koklea tikus diabetes, semakin tinggi dosis semakin menurun ekspresinya, dengan dosis

maksimal 300mg/kgBB/hari. Diharapkan dilakukan penelitian lanjutan yang ditujukan untuk

menguji peran α-tokoferol terhadap pencegahan, perbaikan dan pengobatan gangguan

pendengaran pada penderita DM, dan untuk menentukan dosis yang tepat bagi manusia.

DAFTAR PUSTAKA

ADA (American Diabetes Association). (2011). Standard of medical care in diabetes – 2011. In: Diabetes care, 34(1): 511-561.

Akbarzadeh A., Norouzian D., Mehrabi M.R., Jamshidi Sh., Farhangi A., Verdi A.A. and Mofidian S.M.A. (2007). Induction of Diabetes by Streptozotocin in Rats. Indian Journal of Clinical Biochemistry, 22(2): 60-64.

Arora S., Ojha S.K. and Vohora D. (2009). Characterisation of Streptozotocin Induced Diabetes Mellitus in Swiss Albino Mice. Global Journal of Pharmacology, 3(2) : 81-84.

Boscoboinik D., Szewczyk A., Hensey C. and Azzi A. (1991). Inhibition of cell proliferation by alpha-tocopherol. Role of protein kinase C. J. Biol. Chem, 266: 6188-6194.

Clement S., Tasinato A., Boscoboinik D. and Azzi A. (1997). The effect of alpha-tocopherol on the synthesis, phosphorylation and activity of protein kinase C in smooth muscle cells after phorbol 12-myristate 13-acetate down-regulation. Eur J Biochem, 246: 745-749.

Dhein S., Kabat A., Olbrich A., Rosen P., Schroder P. and Mohr F-W. (2003). Effect of chronic treatment with vitamin E on endothelial dysfunction in a type-1 in vivo diabetes mellitus model and in vitro. J Pharmacology and Experimental Therapeutics Fast Forwar, 305: 144-122.

Egger T., Schuligoi R., Wintersperger A., Amann R., Malle E. and Sattler W. (2003). Vitamin E (α-tocopherol) attenuates cyclo-oxygenase 2 transcription and synthesis in immortalized murine BV-2 microglia. Biochem J, 370: 459-467.

Hanafiah K.A. (2005). Rancangan percobaan : teori dan aplikasi, Edisi 3. Jakarta: PT Raja Grafindo Persada, 9-24.

Hansra G., Bornancin F., Whelan R., Hemmings B.A., and Parker P.J. (1996). 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate-induced Dephosphorylation of Protein Kinase C-α Correlates with the Presence of a Membrane-associated Protein Phosphatase 2A Heterotrimer. J Biol Chem, 271: 32785-32788.

King G.L. and Banskota N.K. (1994). Mechanisms of diabetic microvascular complications. In: Joslin's Diabetes Mellitus (Kahn CR, Weir GC, eds), 13th ed. Philadelphia:Lea & Febiger, 631-47.

King G.L. and Brownlee M. (1996). The cellular and molecular mechanisms of diabetic complications. Endocrinol metab clin North Am ; 25(2): 255-270.

Koya D., Haneda M., Kikkawa R. and King G.L. (1998). D-alpha-tocopherol treatment prevents glomerular dysfunctions in diabetic rats through inhibition of protein kinase C-diacylglycerol pathway. Biofactors, 7: 69-76.

Kusumadewi S. (2009). Aplikasi informatika medis untuk penatalaksanaan diabetes melitus secara terpadu. Dalam: Kumpulan makalah seminar nasional aplikasi teknologi informasi, Yogyakarta, 22-27.

Martin N.F., Boullier A., Fruchart J.C. and Duriez P. (1998). Alpha-tocopherol but not beta-tocopherol inhibits thrombin-induced PKC activation and endothelin secretion in endothelial cells. J Cardiovasc Risk, 5(5-6): 339-345.

Nishizuka Y. (2003). Protein Kinase C Isotypes and Their Specific Functions. Discovery and Prospect of Protein Kinase C Research: Epilogue. J. Biochem, 133: 155-158.

Pandelaki K. (2000). Peran insulin terhadap kejadian dini retinopati diabetik pada diabetes mellitus tidak tergantung insulin (Disertasi). Program Pascasarjana Universitas Airlangga Surabaya.

Ricciarelli R., Tasinato A., Clement S., Ozer N.K., Boscoboinik D. and Azzi A. (1998). α-Tocopherol specifically inactivates cellular protein kinase C α by changing its phosphorilation state. Biochem J, 334: 243-249.

Sitompul B. (2004). Pengaruh pemberian vitamin E terhadap fungsi endotel aorta tikus diabetes (Disertasi). Program studi ilmu kedokteran, Universitas Indonesia.

Schalkwijk C.G. and Stehouwer C.D.A. (2005). Vascular complications in diabetes mellitus: the role of endothelial dysfunction. Clinical Science, 109 : 143-159

Tandra H. (2007). Mengenal Diabetes. Dalam: Panduan lengkap mengenal dan mengatasi diabetes dengan cepat dan mudah. Gramedia Pustaka Utama Jakarta, 1-30.

Tasinato A., Boscoboinik D., Bartoli G.M., Maroni P. and Azzi A. (1995). d-α-Tocopherol inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation occurs at physiological concentration, correlates with protein kinase C inhibition, and is independent of its antioxidant properties. Proc. Nas. Acad. Sci, USA, 92: 12190-12194.

LAMPIRAN

Tabel 1 Data berat badan awal semua kelompok sampel

Kelompok Mean SD Min Maks Oneway Anova

K0 / kontrol normal 151,6 10,7 138 163

F= 1,536 p= 0,230

K1 / kontrol STZ 156,2 18,2 126 172

P1 / STZ + Vit E 100 mg 147,6 8,9 138 158

P2 / STZ + Vit E 200 mg 146,4 5,9 137 151

P3 / STZ + Vit E 300 mg 138,8 10,9 126 150

Tabel 2 Rerata dan simpang baku kadar GD sebelum dan sesudah induksi STZ.

Saat Pemeriksaan Mean (mg/dl) SD Min Maks Anova

Sebelum STZ 90,55 9,80 77 103 F = 3,574 P = 0,000 Sesudah STZ 328,60 14,87 306 352

Tabel 3 Perbandingan ekspresi PKC

Kelompok mean SD Min Maks Oneway Anova

K0 / kontrol normal 2,54 0,42 2,13 3,04

F=632.319 p= 0,000

K1 / kontrol STZ 15,78 0,28 15,15 16,64

P1 / STZ + Vit E 100 mg 10,88 0,49 10,51 11,21

P2 / STZ + Vit E 200 mg 6,95 0,56 6,37 7,66

P3 / STZ + Vit E 300 mg 6,35 0,63 5,67 7,14

Gambar 1: Grafik rerata ekspresi PKC pada semua kelompok sampel

Gambar 2 : Ekspresi PKC pada sel fibroblas ligamen spirale.

Metode Imunohistokimia, pembesaran 400X.

A B

D C

0

5

10

15

20

Sehat DM Vit E 100 Vit E 200 Vit E 300

Keterangan gambar 2 : A. Kelompok kontrol tikus DM B. Kelompok tikus DM Vit E 100 mg C. Kelompok tikus DM terapi Vit E 200 mg D. Kelompok tikus DM terapi Vit E 300 mg Gambar diatas terlihat ekspresi PKC yang ditandai warna coklat pada inti sel, dengan jumlah sel dan densitas kecoklatan yang tinggi pada kelompok kontrol, semakin berkurang dengan meningkatnya dosis perlakuan. Pengukuran ekspresi PKC dikonversikan secara kuantitatif menggunakan program Carl Zeis axiovision rel 4.8.1, dimana diperoleh hasil persentasi area sel – sel fibroblas yang terekspresi.