Microbiología General

Seminario Nro. 1Esterilización y Bioseguridad

Algunos conceptos básicos...Esterilización: eliminación o muerte de todostodos los microorganismos que contiene un objeto o sustancia.

Bactericida: Agentes que destruyen y matan a las bacterias

Bacteriostático: Agentes que inhiben el crecimiento de las bacterias

Desinfectante: agente que elimina la carga microbiana total en superficies inanimadas tales como mesadas de trabajo.

Antiséptico: agente que controla y reduce la presencia de microorganismos potencialmente patógenos sobre piel y/o mucosas

Esterilización

Criterio de muerte para un microorganismo

Perdida irreversibleirreversible de su capacidad de reproducción

Cinética de Muerte de un MOLa muerte de microorganismos como consecuencia de un tratamiento a altas temperaturas sigue una cinética exponencialcinética exponencial.

dNdt

= - K´N

Nº ufc

tiempo

Cinética de Muerte de un MO

Se define el valor D como el tiempo necesario para que el número de supervivientes caiga al 10% del valor inicial (o, lo que es lo mismo, para que el logaritmo del número de supervivientes se reduzca en una unidad).

El tiempo (D) varía para cada temperatura (de ahí el subíndice t) de forma que a mayores temperaturas el valor de D es menor, es diferente para distintos microorganismos, distintos entornos y diferentes condiciones fisiológicas.

VALOR D : Tiempo de reducción decimal

VALOR D : Tiempo de reducción decimal

Efecto de la Temperatura lo

g nº

m.o

. vi

able

s

tiempo

60 ºC

100

10

170 ºC

50 ºC ¿ A que temperatura es menor el valor de D?

D es un parámetro de la sensibilidad de un Microorganismo determinado al efecto de la temperatura

log

nº M

O

viab

les

tiempo

B

100

10

1 C

A ¿Cuál es el MO más sensible al tratamiento?

Si aumentamos la temperatura de tratamiento, el valor de D disminuye de forma logarítmica. De manera análoga a como el valor D indicaba el tiempo necesario para lograr que el número de supervivientes se redujera al 10% de la población inicial, el valor z indica el incremento en la temperatura (medida en número de grados) necesario para que el valor D se reduzca a la décima parte del inicial.

VALOR Z

donde ∆T es el incremento de temperatura, y DT1 y DT2 los valores de D a las dos temperaturas estudiadas.

Efecto de la Temperatura sobre características de los alimentos

Efecto de la carga inicial (No)

012345678

0 20 40 60 80

Tiempo (min)

log

Nº s

obre

vivi

ente

s

Esterilización en Microbiología de Alimentos

Desde el punto de vista de la salud alimentaria, se suele requerir un tratamiento 12D de los productos susceptibles de ser portadores de gérmenes patógenos (o que puedan dar lugar a intoxicaciones). Este tratamiento reduce en 12 órdenes de magnitud el número de supervivientes o bien, visto de otra forma, reduce en un factor de 10-12 la probabilidad de supervivencia de un microorganismo dado. Si consideramos que un solo microorganismo contaminaba una unidad (una lata, por ejemplo) del alimento inicial, después de un tratamiento 12D la probabilidad de encontrar una lata contaminada se reduce hasta 10-12.

D121 = 0.20 minNo = 3.5 x 10 5 ufc/lataTiempo de tratamiento a 121°C = 2 minNF = ¿?

Clostridium botulinum

3.5 x 10 15 ufc/ lata

6

5

4

3

2

1

0

5

4

3

6 2

11 2 3 4 5 6 7

Log 10

Tiempo (min)

AB

Rec

uent

o de

via

bles

Prob

abili

dad

de

sobr

eviv

ient

es

Log 10

0

Valor D=1 minuto105

12

10

8

6

4

2

01 2 3 4 5 6 7

Log 10

Tiempo (min)

Rec

uent

o de

via

bles

Prob

abili

dad

de

sobr

eviv

ient

es

Log 10

10

8

6

12 4

2

0

MO B

D=0.5 min a 121 ºC

MO A

D=1 min a 121 ºC

Ejercicios– Si se ha determinado que para esporas de Clostridium botulinum

suspendidas en buffer fosfato el D121 = 0.204 min, ¿Cuánto tiempo llevaría reducir una población de 1012 esporas de C. botulinum en buffer fosfato a 1 espora a 121°C?

– Para el mismo sistema se sabe que el valor Z= 10ºC. ¿Cuánto tiempo llevaría reducir una población de 1012 esporas de C. botulinum en buffer fosfato a 1 espora a 111°C?

– La leche cruda a la entrada de la planta de procesamiento tiene una carga bacteriana de 4x105ufc/ml. La leche se va a procesar a 79ºC por 21 segundos. Si el valor D promedio para la población bacteriana a 65ºC es de 21 segundos y el valor Z es de 7ºC, cuántos microorganismos quedarán luego del tratamiento a 79ºC?¿Cuánto tiempo se requeriría para lograr el mismo grado de letalidad a 65ºC?¿Cuánto tiempo llevaría reducir la concentración a 1ufc/100ml con un tratamiento a 65ºC?

Agentes Físicos

•CALOR

•RADIACIONES

•FILTRACIÓN

Calor• Calor húmedo

• Calor seco Ambos pueden ser utilizados en procesos

de esterilización

Calor húmedoPROCESOS

• Esterilización: Vapor saturado a presiones mayores que la

atmosférica Tindalización (fraccionada por vapor)

• Pasteurización• UHT

MECANISMOS DE ACCIÓN

• Desnaturalización de proteínas• Destrucción de ácidos nucleicos

Pasteurización

•LHT (low temperature holding)

30 minutos a 62.8ºC

•HTST (high temperature short time)

15 segundos a 71.6ºC

•Solo destruye patógenos (Coxiella burnetti, Mycobacterium

tuberculosis, etc.) y reduce flora de deterioro.

NO ES UN PROCESO DE ESTERILIZACIÓN

•Usos: leche, lácteos, jugos de fruta

Louis Pasteur

UHT (Ultra high temperature)

• 140ºC-150ºC durante pocos segundos• Proceso continuo

• Necesita envasado aséptico• Si es un proceso de esterilización

Tindalización

•100 ºC 30 min, 3 días sucesivos

•Proceso discontinuo con períodos de incubación intercalados

•Usos: esterilización de productos de baja resistencia

térmica, cuando no existe otra opción

John Tyndall

Vapor saturado a presiones mayores que la atmosférica

• Condiciones: Vapor saturado a temperaturas mayores de 100ºC

(PRECAUCIÓN: eliminación total del aire)

• Equipo: Autoclave

• Alcance: Se puede conseguir esterilización

• Usos: Esterilización de materiales y productos termoestables ( salvo productos oleosos y polvos). Descontaminación de desechos biológicos.

Autoclave

Condiciones : • 121ºC durante 15 minutos, con cargas iniciales bajas • 121ºC durante 30 minutos, con cargas iniciales altas

Indicadores: • Físicos: Temperatura y/o presión• Químicos• Indicador biológico: Geobacillus stearotermophilus

(D 121ºC=1.5 minutos)Tamaño del inóculo: 104 esporas

Autoclave

Perfil de temperatura de un proceso de esterilización por calor húmedo

Tem

pera

tura

ºC

100

110

120

15

Tiempo (min.)

Etapa de calentamiento

Etapa de mantenimiento

Etapa de enfriamiento

1 2 3

Calor Seco

•Mecanismo de acción: Procesos de oxidación

•Controles de proceso de esterilización

Indicadores físicos y químicos

Indicador biológico esporas de Bacillus subtilis var. niger (D 160ºC = 0.3 a 1.8 min, Z=20ºC, tamaño del inóculo: 105 esporas)

Calor SecoAire caliente:

Equipo:Hornos eléctricosAlcance: Se consigue esterilización (170ºC, 60 minutos o 160ºC,

120 minutos)Usos:

a) Esterilización de:

• Materiales resistentes al calor• Sustancias no miscibles en agua (inyectables oleosos, siliconas,

vaselina líquida) • Polvos

b) Despirogenizacion (250ºC 45 minutos o 180ºC 4hs, o 650 1 min)

• Incineración: Destrucción de material contaminado

Flameado :Desinfección

Resistencia a calor

PrionesEndosporas bacterianasMycobacteriaVirus sin envoltura lipídicaHongosBacteriasVirus con envoltura lipídica

RESISTENCIA

+

_

La esterilización por filtración se logra por el paso de un líquido o un gas a través de un material capaz de retener los microorganismos presentes. La esterilización por filtración se emplea para materiales sensibles al calor, tales como ciertos medios de cultivo, azúcares, soluciones de antibióticos y otros medicamentos, etc.

Esterilización por filtración

Filtros de profundidad:Estos filtros están elaborados por un material fibroso (papel, asbesto o fibra de vidrio) dispuesto al azar, de manera que dentro de la estructura del filtro se crean vías tortuosas donde pueden quedar retenidos la mayoría de los contaminantes presentes.

Filtros de superficie:Son filtros elaborados generalmente de acetato de celulosa o nitrato de celulosa y contienen poros de tamaño uniforme. Este tipo de filtro tiene como ventaja que, al conocer exactamente el tamaño de poro que presentan, se pueden seleccionar filtros capaces de retener la totalidad de los microorganismos presentes en una solución. Sin embargo, se saturan rápidamente y la velocidad de filtración a través de ellos es lenta. La mayor parte de los filtros de membrana se pueden esterilizar en autoclave y luego se manipulan asépticamente al ensamblar el equipo.

FILTRACIÓN DE AIRE

•Filtros HEPA (HHigh EEfficiency PParticulate AAir)•Remoción de hasta el 99.97% de partículas mayores de 0.3 micrones de diámetro

•Se usan en cabinas o habitaciones de flujo laminarflujo laminar

CONTROL •Retención Mínima de un 99.97% de partículas generadas mediante ensayo DOP(di-octil-nftalato) en caliente con un diámetro de 0.3 micrones.

SE USAN PARA Lograr ambientes con número de partículas controlado: FLUJOS LAMINARES AREAS DE TRABAJO

Cabinas de Flujo Laminar Vertical

Entrada de aire

Salida de aire

Protege la muestra, el

operador y el medio ambiente

Actividad antimicrobiana

Alta energía

Baja energía

Dos tipos: Radiaciones ionizantes Radiaciones no ionizantes

Esterilización por radiaciones

Radiaciones Ionizantes

Características:• Alta energía, baja longitud de

onda• Gran poder de penetración• Ionizan átomos y moléculas• No requieren altas temperaturasTipos:• Rayos gamma (60Co o 137Cs)• Rayos catódicos (electrones

acelerados)• Partículas beta

Mecanismos de acción:• Formación de radicales libres• Daño al ADN, ARN

Resistencia:PrionesDeinococcus radioduransEnterococcus faecium Esporas bacterianasVirusHongos Bacterias (en gral)

D (kGy) m.o.3 Bacillus pumilus1.2 Staphylococcus spp.

Desventajas:Equipo especial, personal entrenadoNo todos los materiales resisten el tratamientoReacciones no deseadas en alimentos

Radiaciones no IonizantesCaracterísticas:• Baja energía, sin poder ionizante• Sin poder penetranteSin poder penetrante• Máxima eficiencia biocida a 260nm

Mecanismos de acción:• Sitio blanco ADN• Formación de dímeros de timina

Usos:• Desinfección de superficies• Desinfección de aire y agua

NO SE UTILIZAN PARA ESTERILIZAR SINO PARA:

Luz ultravioletaLa radiación ultravioleta producida artificialmente en el espectro de 250 nm ha sido utilizada por su actividad germicida esterilizante por más de 30 años. La acción de los rayos ultravioleta se debe a la producción de ozono que logra la asepsia, ya que este gas conserva su acción inhibidora hasta una dilución de 1 x 40.000. Los aminoácidos aromáticos de las proteínas y las bases puricas y primidinicas, en particular la timina del DNA, son los principales compuesto blancos afectados por la acción bactericida de la acción ultravioleta. Evitando la replicación de las tiras del DNA o causando recombinaciones que terminan en mutaciones mortales.

Dímeros de timina

ESTERILIZACIÓN POR RADIACION UV

Procesos de esterilizaciónUsosCondicionesAgente

Material filtrable0.22 micras de poro

Filtración

Material termosensibleResistente al tratamiento

25KGy45KGy

Radiaciones ionizantes

Material termoestableNo penetrable por vapor

160ºC 2 horas180ºC 1 hora

Calor seco

Material termoestablePenetrable por vapor

121ºC 15 min.(o equivalente)

Calor húmedo

Control de Esterilización

• Controles del proceso Indicadores: Físicos Químicos Biológicos

• Post-proceso: TEST DE TEST DE ESTERILIDAD !!!ESTERILIDAD !!!

Indicador físico Ej: Temperatura, presión

Indicador químico Cambio de color

Controles del proceso

Indicador biológico Microorganismo resistente

AntisépticosAlcoholesIodoÓrgano-MercurialesColorantes

Desinfectantes y/o Esterilizantes Cloro y Compuestos clorados

AldehídosOxido de EtilenoCompuestos Fenólicos

Agentes químicos de esterilización y control del

crecimiento

•Lesionan la membrana celular de los microorganismos y desnaturalizan proteínas. Desorganizan la estructura fosfolipídica de la membrana. •No destruyen esporas y tienen una acción germicida lenta. •Los alcoholes de cadena corta tienen un efecto nocivo mayor que los de cadena larga. Se utilizan en concentraciones del 50 al 70%. •Los más utilizados son el etanol e isopropílico.

•Es un agente oxidante que modifica grupos funcionales de proteínas y ácidos nucleicos. Inactiva proteínas y enzimas por oxidación de los grupos -SH a S-S, pudiendo atacar también grupos amino, indoles, etc. •Se utiliza como desinfectante de la piel (tintura de iodo: yodo molecular 2% y yoduro de sodio 2% en alcohol), aunque es irritante. •Es efectivo contra esporas en una concentración de 1600 ppm de iodo libre

Iodo

Alcoholes

•Es un antiséptico débil, con capacidad oxidante y formadora de radicales libres. •Actualmente, el peróxido de hidrógeno gaseoso se está utilizando como desinfectante de superficies o decontaminante de gabinetes biológicos debido a que no posee las propiedades tóxicas y cancerigenas del óxido de etileno y formaldehído.

•Estos tipos de compuestos se combinan con los grupos -SH de las proteínas, inactivando enzimas. •Dentro de los mercuriales orgánicos se encuentran el metafen y el mertiolate.

Órgano-Mercuriales

Peróxido de Hidrógeno

Los derivados del trifenilmetano (violeta de genciana, verde de malaquita y verde brillante) bloquean la conversión del ácido UDP-acetilmurámico en UDP-acetilmuramil-péptido.

Colorantes

R = HSO4- Verde Brillante

R = Cl- Verde de Malaquita Violeta de Genciana

El cloro, los hipocloritos y las cloraminas son desinfectantes que actúan sobre proteínas y ácidos nucleicos de los microorganismos. Oxidan grupos -SH, y atacan grupos aminos, indoles y al hidroxifenol de la tirosina. El producto clorado más utilizado en desinfección es el hipoclorito de sodio (agua lavandina), que es activo sobre todas las bacterias, incluyendo esporasincluyendo esporas, y además es efectivo en un amplio rango de temperaturas. La actividad bactericida del hipoclorito de sodio se debe al ácido hipocloroso (HClO) y al Cl2 que se forman cuando el hipoclorito es diluido en agua.

El hipoclorito de sodio se comercializa en soluciones concentradas (50-100 g/l de Cloro activo) y Generalmente, se utilizan soluciones con una concentración del 0.1-0.5% de Cloro activo. Su actividad está influida por la presencia de materia orgánica

Cloro y sus derivados

Aldehídos

•Son agentes alquilantes que actúan sobre proteínas, lo que provoca modificación irreversible de enzimas e inhibición de la actividad enzimática.•Se utilizan como desinfectantes y esterilizantes. Destruyen esporas. •El glutaraldehído es el único esterilizante efectivo en frío. •El formaldehído como gas se utiliza para descontaminar edificios, ambientes, etc. •El formaldehído gaseoso se obtiene por calentamiento del paraformaldehído tiene la desventaja de ser muy irritante y perder actividad en ambientes refrigerados.

Glutaraldehido Paraformaldehido Formaldehido

•Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógenos lábiles como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc. •Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la industria farmacéutica. Sirve para esterilizar material termosensibles como el descartable y plástico, equipos electrónicos, bombas cardiorrespiratorias, etc. Es muy peligroso

Oxido de Etileno

Compuestos Fenólicos•Son desinfectantes que provocan lesiones en la membrana citoplasmática porque desordenan la disposición de las proteínas y fosfolípidos. •El fenol no es usado a menudo como desinfectante por su olor desagradable, por ser muy irritante y por el resido que queda luego de tratar las superficies. •Los derivados del fenol más utilizados son el hexaclorofeno (compuesto difenílico) y los cresoles (alquil fenoles). Estos son muy efectivos a bajas concentraciones contra formas vegetativas de bacterias. No son efectivos contra esporas.

Coeficiente del fenol

BIOSEGURIDAD

Bioseguridad•Contención primariaContención primaria:: protección del personal y del medio ambiente inmediato del laboratorio de la exposición a agentes infecciosos.

•Contención secundaria:Contención secundaria: Protección del medio ambiente externo al laboratorio de la exposición a materiales infecciosos

•Equipos de Seguridad (Barreras PrimariasBarreras Primarias). Los equipos de seguridad incluyen gabinetes de seguridad biológica (BSCs), recipientes cerrados, y otros controles de ingeniería destinados a eliminar o minimizar las exposiciones a materiales biológicos peligrosos.

•Diseño y Construcción de Instalaciones (Barreras Barreras SecundariasSecundarias)

•Riesgo BiológicoRiesgo Biológico: Es la probabilidad de sufrir cualquier tipo de infección, alergia, o toxicidad por una exposición no controlada a agentes biológicos.

Niveles de BioseguridadBioseguridad

Agentes de RiesgoBioseguridad

Se entiende por agente de riesgo biológico cualquier microorganismo -incluyendo de los genéticamente modificados- cultivo celular, animal o planta o producto de estos, capaz de producir cualquier tipo de infección, alergia o toxicidad en humanos, animales u otros seres vivos.

Agentes de Riesgo - Grupo IBioseguridad

Sin riesgo o bajo riesgo individual y comunitario. Agentes bien identificados que se sabe que no producen enfermedad en humanos sanos y existe un potencial mínimo de peligro para el personal del laboratorio y el ambiente.

Bacillus subtillisNaegleria gruberivirus de la hepatitis canina infecciosa

Agentes de Riesgo - Grupo IIBioseguridad

Riesgo individual moderado y bajo riesgo comunitario. Agentes asociados con enfermedades en humanos, especialmente por ingestión o exposición percutánea o mucosa.Patógenos que pueden producir enfermedad en humanos animales pero es poco probable que sea un problema para los trabajadores del laboratorio, la comunidad, los animales o el ambiente. La exposición en el laboratorio puede producir una enfermedad seria pero existe tratamiento efectivo y las medidas preventivas están disponibles, el riesgo de dispersión de la enfermedad es limitado.

Salmonella spp. Virus de la Hepatitis B Toxoplasma spp.Bacillus anthracisBordetella pertussis

Agentes de Riesgo - Grupo IIIBioseguridad

Alto riesgo individual, bajo riesgo comunitario. Trabajo con animales infectados con agentes exóticos que tienen riesgo de transmisión por aerosoles y pueden causar una enfermedad seria o potencialmente letal.Patógenos que usualmente causan serias enfermedades en animales y humanos pero que comúnmente no se propagan de un individuo infectado a otro. Las medidas preventivas y de tratamiento efectivo están disponibles.

Brucella bortusCoxiella burnetiiMycobacterium

Agentes de Riesgo - Grupo IVBioseguridad

Alto riesgo individual y comunitario. Trabajo con agentes peligrosos que tienen alto riesgo de amenazar la vida, transmitirse por vía aérea o que se desconoce su riesgo de transmisión.Patógenos que usualmente causas serian enfermedades en los animales o los humanos y que pueden transmitirse de un individuo de forma directa o indirecta. Usualmente no están disponibles ni medidas preventivas ni tratamiento efectivo.

Virus de Marburg EbolaVirus Junín

Gabinetes de seguridad biológicaClase I (Campana)

Bioseguridad

A. Apertura frontal

B. VentanaC. Filtro deEscape HEPA

D. Pleno de Escape

Gabinetes de seguridad biológicaClase II (Flujo Laminar)

Bioseguridad

A. Apertura Frontal; B. Ventana; C. Filtro de escape HEPA; D. Pleno posterior; E. Filtro HEPA de Suministro; F. Ventilador

A. Apertura Frontal; B. Ventana; C. Filtro de Escape HEPA; E. Pleno de Escape de Presión Negativa; F. Ventilador; G. Filtro HEPA adicional para enviar aire.

Gabinetes de seguridad biológicaClase III (Flujo Laminar)

Bioseguridad

A. Inserciones para guantes con aros circulares para instalarles guantes del largo del brazo al gabinete;B. Ventana, C. Filtro de Escape HEPA; D. Filtro HEPA de Suministro; E. Caja para Autoclave de Doble Extremo.

Transporte de material riesgosoBioseguridad