Manual Microbiología (1)

8/17/2019 Manual Microbiología (1)

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SINALOA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS

MANUAL DE PRÁCTICAS DE

MICROBIOLOGÍA

Quinto Semestre

Enero de 2013

María Elena Báez Flores

Magdalena de Jesús Uribe Beltrán

María del Carmen de la Cruz Otero

Juana Aurelia Sánchez Alarcón

Sylvia Páz Díaz Camacho



EL PROGRAMA EDUCATIVO DE QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

TIENE COMO MISIÓN:

Formar profesionales en las áreas de Farmacia y Biomédicas, capaces de aplicar, desarrollar y

generar conocimientos científicos y tecnológicos con sentido ético, que impacten en la prevención,

diagnóstico y seguimiento de las enfermedades, bajo normas de calidad y regulación sanitaria.

Y COMO VISIÓN AL 2018:

La Licenciatura de Químico Farmacéutico Biólogo es reconocida por:

La calidad de sus planes de estudios y de los productos que ofrece a la sociedad.

Los planes de estudios son impartidos por profesores con alto grado de habilitación integrados

a los CAC’s de Salud Pública (SP), Inmunogenética y Biología Molecular (IyBM) o al de

Ciencias Biomédicas (CBM), en donde se desarrollan LGAC pertinentes.

Posee suficiente infraestructura y equipamiento acorde a las necesidades del modelo educativo

centrado en el aprendizaje con enfoque por competencias.

Los índices de eficiencia terminal y de titulación acordes a los estándares nacionales.

Los estudiantes son apoyados en su trayectoria académica por un programa de atención

integral.

Cuenta con intercambio y movilidad académica de profesores, estudiantes con organismos y

universidades nacionales y extranjeras.

Sostiene una estrecha relación con los sectores social, público y productivo a través deconvenios de colaboración y de la prestación de servicios y asesorías técnicas.

Procesos de administración y de gestión, participativos y eficientes.

Impulso de la educación ambiental para el desarrollo sustentable.



D i r e c t o r i o

Dr. Juan Eulogio Guerra Rector

Dr. Jesús Madueña MolinaSecretario General

Dr. Fidencio López Beltrán Director de Servicios Escolares

Dr. Jorge Milán Carrillo Director

Dr. Ángel Valdez OrtizSub Director Académico

LI. Humberto Ledesma LópezSub Director Administrativo

Dra. Esperanza Ponce Torrecillas Jefa de Carrera de QFB

MC. Guadalupe de Jesús Valdez Zazueta Jefa de Carrera de IBQ

Dr. Oscar Martín Hernández Calderón Jefe de Carrera de IQ

QFB Rebeca Guadalupe Salcido GonzálezCoordinadora del Departamento de Servicio Social

IQ. Arlete Du-Pond Barrera

Coordinador del Departamento de Control Escolar

IQ. Ignacio Calderón AyalaCoordinador del Departamento de Planeación Educativa y Tutorías



Manual de Prácticas de Microbiología

3FACULTAD DE CIENCIAS QU MICO BIOL GICAS / UAS

CONTENIDO

Pág.

1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................4

2. PRÁCTICAS

2.1 Micr-01 Bioseguridad en el laboratorio de Microbiología .......................................5

2.2 Micr-02 Presencia de microorganismos en la naturaleza .........................................11

2.3 Micr-03 Forma y agrupamiento de células bacterianas .......................................... 15

2.4 Micr-04 Preparación y uso de medios de cultivo para bacterias........................................... 20

2.5 Micr-05 Morfología colonial bacteriana................................................................ 25

2.6 Micr-06 Introducción a pruebas bioquímicas para bacterias .................................. 31

2.7 Micr-07 Identificación microscópica de algas........................................................ 36 2.8 Micr-08 Morfología microscópica de hongos ........................................................ 39

2.9 Micr-09 Preparación de Medios de cultivo para hongos ........................................ 42

2.10 Micr-10 Morfología colonial de hongos................................................................. 45

2.11 Micr-11 Identificación de protozoos de vida libre ................................................ 48

2.12 Micr-12 Identificación microscópica de protozoos intestinales ............................. 51

2.13 Micr-13 Identificación microscópica de protozoos extraintestinales ..................... 57

2.14 Micr-14 Uso de agentes físicos y químicos en el control de

Microorganismos..................................................................................................... 60

3. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................65

4. ANEXOS ...................................................................................................... 66

4.1 Actividades previas4.2 Preparación de medios de cultivo4.3 Preparación de soluciones y reactivos4.4 Figuras





INTRODUCCIÓN

El presente Manual de Microbiología tiene el objetivo primordial de contribuir a que losalumnos adquieran habilidades que los capaciten en los aspectos básicos para el trabajoen el laboratorio. Deberán entrenarse y desarrollarán las habilidades técnicasfundamentales para trabajar con microorganismos de los diferentes grupos queconforman el mundo microbiano.Esta materia provee los conocimientos necesarios para una mejor comprensión yaprovechamiento de las materias subsecuentes del área de Microbiología como sonBacteriología, Micología, Virología y Parasitología. Por lo tanto, es importante que losalumnos estén conscientes de la importancia del buen aprovechamiento del trabajo de

laboratorio y pongan todo su empeño en la obtención y búsqueda de conocimientos através de la realización de las prácticas de Microbiología. Esto seguramente tendrá unefecto positivo en su formación académica ya que mediante la observación yexperimentación complementarán y reforzarán los conocimientos adquiridos en el aula.Al principio, las prácticas están orientadas hacia la comprensión por parte del alumno,del riesgo inherente al trabajo de laboratorio así como a los cuidados que puedenayudarles a minimizar ese riesgo. También comprobarán la distribución cosmopolita delos microorganismos mediante el análisis microscópico y microbiológico de muestrasque son parte de nuestro entorno.





Universidad Autónoma de SinaloaFacultad de Ciencias Químico Biológicas

Micr-01. Bioseguridad en el laboratorio de Microbiología

1.0 Objetivos 1.1 Concientizar a los alumnos de los riesgos de trabajo en un laboratorio de

Microbiología.1.2 Establecer las medidas generales de precaución y normas básicas para la

prevención de infecciones en el laboratorio.1.3 Valorar el efecto de la esterilización con productos químicos, calor húmedo y

calor seco sobre la viabilidad de los microorganismos.

2.0 Introducción

El personal que trabaja en un laboratorio está sujeto a diversos riesgos ocupacionales.Los profesionales y estudiantes que manejan agentes infecciosos pueden infectarse yenfermar de manera mas o menos grave, pudiendo quedar afectados a largo plazo.La mayoría de las infecciones adquiridas en un laboratorio de microbiología pueden seratribuídas a errores al realizar procedimientos rutinarios como por ejemplo:

1. Procedimientos ó técnicas que involucran el riesgo de inhalación de bacteriasdebido a la formación de aerosoles como la centrifugación, la homogenizacióny la manipulación de placas. Éstos deben realizarse con cubreboca y dentro deuna campana de flujo laminar en condiciones de esterilidad.

2. Procedimientos que involucren el riesgo de ingestión. Nunca deberá pipetearsecon la boca, sino usando una perilla o pipeta automática.

3. Procedimientos en los que se corre el riesgo de inoculación. Los pinchazos conmaterial contaminado pueden evitarse teniendo un gran cuidado al aplicar unasustancia o extraer una muestra. El material punzocortante debe desecharse encontenedores rígidos especiales para residuos biológico-infecciosos. Losmicroorganismos presentes en sangre y líquidos corporales como los virus de lahepatitis y de la inmunodeficiencia humana, constituyen un grave peligro si setiene contacto directo con dichos líquidos. Es importante mencionar que lasangre en hemocultivo, las muestras de suero en pruebas para anticuerpos,antígenos o agentes antimicrobianos conservan su infectividad y riesgo

potencial.

Hay que tener siempre presente que los errores humanos y las prácticas inadecuadascomprometen la seguridad en el laboratorio, por lo que es prioritario que se establezcany adopten normas apropiadas básicas para el trabajo y entre el personal de laboratorio,se designen responsables de la supervisión de las diferentes secciones, además de

establecer las medidas de emergencia para actuar en caso de accidente.El uso de bata y calzado cerrado no brinda protección suficiente, se requiere





indumentaria adicional para proteger rostro, manos y piernas si hay riesgo desalpicaduras.

Medidas generales de precaución

1. Colocar el material contaminado en un contenedor dispuesto para este propósito.2. Usar guantes para meter a esterilizar el material sucio.3. Colocar por separado pipetas, portaobjetos y cubreobjetos contaminados.4. Desinfectar con fenol, benzal o cloro las mesas, los materiales y las centrífugas

que hayan estado en contacto con el material contaminado.5. Usar siempre bata.6. Nunca comer, beber, fumar o aplicarse cosméticos en el área del laboratorio.7. Evitar accidentes avisando inmediatamente cuando algo se descomponga, se

rompa o se contamine.8. Seguir estrictamente las reglas establecidas de control de calidad en el trabajo

que se realiza.9. Verificar diariamente la temperatura de estufas y autoclaves, así como el estado

en general de los aparatos eléctricos que se utilizan en el laboratorio.

Normas básicas para prevenir infecciones en el laboratorio1. No pipetear con la boca.2. No comer, beber, fumar, almacenar alimentos, aplicarse cosméticos, etc, en el

área de trabajo del laboratorio.3. Mantener el laboratorio limpio y libre de materiales no relacionados con el

trabajo.4. La superficie de trabajo individual debe descontaminarse con un papel

absorbente, esponja o gasa humedecida con un desinfectante (fenol, benzal ocloro) al iniciar y finalizar cada sesión de trabajo.

5. Lavarse las manos después de manipular agentes infecciosos, materialcontaminado, animales y cuando abandone el laboratorio.

6. Efectuar cuidadosamente todos los procedimientos para reducir al mínimo laformación de aerosoles, de preferencia dentro de una campana de flujo laminar.

7. Todo residuo contaminado líquido o sólido deberá someterse a esterilización oincineración antes de ser desechado.

8. Utilizar guantes en aquéllos procedimientos que impliquen contacto directo conmaterial infeccioso.

9. Debe haber una guía disponible para acciones de emergencia.

Agentes desinfectantes útiles en el laboratorio

Agentes químicos. Hipoclorito de sodio. Es el agente químico más comúnmente empleado. Se prepara a

partir de soluciones que se expenden en el comercio como blanqueadores de ropa; sediluye a una concentración final de 10% o bien, se prepara a partir de soluciónconcentrada. Para desinfectar material de laboratorio se agrega hipoclorito de sodio enun recipiente donde se depositan portaobjetos, cubreobjetos, pipetas Pasteur, pipetasgraduadas y se dejan hasta el día siguiente. Posteriormente este material se lava. La

solución de hipoclorito debe permanecer limpia, libre de desechos orgánicos. Debecambiarse diariamente y mantenerse tapada.





Agentes físicos. Calor seco. Para esterilizar material de vidrio se utiliza calor seco a 180°C, durante unmínimo de 30 minutos. El horno es el equipo recomendado para esto. El material puedeestar envuelto en papel, pero de preferencia, se coloca dentro de recipientes adecuadosde acero inoxidable (portapipetas o portacajas), siempre acompañados de una tira de

papel testigo y con una etiqueta con la fecha y tipo de material. Debe vigilarse que lostubos y pipetas graduadas que contengan puntas y tapones de algodón no se quemen por efecto del calor ya que se producen alquitranes y otras sustancias bactericidas, muydifíciles de remover que pueden alterar los resultados en las siguientes ocasiones enque se utilice dicho material.

Calor húmedo.Se necesita vapor a presión generado en autoclave u olla express a alta temperatura.Las condiciones más comúnmente empleadas son 121°C, con 15 lbs/pulg2 de presióndurante 15 minutos.

3.0 Material y equipo

- Caja con cultivo bacteriano- Tubo con cultivo de hongos- Tres cajas petri con medio enriquecido (Anexo MicrM-01)- Dos tubos de caldo soya tripticasa (Anexo MicrM-02)- Dos cajas de medio PDA (Anexo MicrM-03)- Mecheros Bunsen- Asas microbiológicas- Hisopos

- Benzal

4.0 Técnica

1. Escoger un área de la mesa y dividirla en dos partes iguales.2. Lavar con agua y jabón una de las partes y luego desinfectar con benzal.3. Frotar con un hisopo estéril el área desinfectada y estriar en una caja de medio

enriquecido previamente rotulada.4. Frotar con un hisopo estéril la zona sin desinfectar y estriar en otra caja petri.5. Esterilizar un asa en la flama y estriar la tercera caja.6. Incubar las cajas a 37°C durante 24 horas.

7. Preparar el caldo soya tripticasa y vaciarlo en tubos. Cada equipo deberáesterilizar sólo un tubo.8. Incubar ambos tubos (el estéril y el que no se esterilizó) a 37°C durante 24

horas .9. Continuar con el cultivo fúngico sembrando el hongo en una caja de PDA.

Posteriormente esterilizar el tubo que contiene el cultivo del hongo y despuésde esterilizado, sembrar en la otra caja de PDA e incubar las dos cajas atemperatura ambiente durante 24 horas.

10. Registrar el desarrollo de los cultivos y registrar los resultados.





5.0 Resultados

Area desinfectada Área sin desinfectar Asa flameada

Desarrollo en medio estéril Desarrollo en medio sin esterilizar

Cultivo de hongo Cultivo de hongo esterilizado

6.0 Conclusiones y comentarios

7.0 Bibliografía Números 3 y 5 de la sección de bibliografía de este Manual

8.0 Anexos 8.1 MicrM-01, 8.2 MicrM-02, 8.3 MicrM-03






REPORTE DE LA PRÁCTICA

Nombre de la práctica: Bioseguridad en el laboratorio de Microbiología

Nombre del alumno: Fecha:

Grupo: Grado: Equipo: Carrera:

5.0 Resultados

Area desinfectada Área sin desinfectar Asa flameada

Desarrollo en medio estéril Desarrollo en medio sin esterilizar

Cultivo de hongo Cultivo de hongo esterilizado






¿Alcanzaron los objetivos? Sí No

Comentarios:

Nombre del Instructor:

Firma Sello






Micr-02. Presencia de microorganismos en la naturaleza.

1.0 Objetivo 1.1 Demostrar la presencia de diversos tipos de microorganismos en la naturaleza.

2.0 Introducción

Los microorganismos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza. Sus

hábitats naturales son extremadamente diversos. Prácticamente los encontramos entodas partes: en el agua que bebemos, en el aire que respiramos, en el suelo, en losalimentos que ingerimos, algunos pueden vivir en el interior de plantas y animales,incluso dentro de otros microorganismos, sobre nuestra piel, y en general sobrecualquier material que les proporcione nutrientes y condiciones de humedad ytemperatura favorables para su desarrollo y multiplicación.Hay muchos hábitats donde, debido a las extremas condiciones físicas o químicas, losorganismos superiores no pueden vivir. Sin embargo, existen microorganismos queincluso, crecen mejor en esos ambientes.

3.0 Material y equipo - Frasco gotero con agua estancada- Frasco gotero con suspensión de tierra de jardín- Frasco gotero con agua destilada- Alimento contaminado por hongos (verdura, fruta, pan, tortilla, etc.).- 3 portaobjetos - 3 cubreobjetos- Asa bacteriológica - Hisopos- Papel absorbente - Cerillos ó encendedor- Mechero Bunsen - Microscopio

4.0 Técnica

1. Poner en el centro de un portaobjetos limpio, una gota del agua estancada.2. Colocar sobre la gota de agua un cubreobjetos, cuidando que no se formen

burbujas de aire.3. Observar al microscopio utilizando primero el objetivo de 10X y

posteriormente el de 40X. Dibujar lo observado.5. Repetir lo anterior para la suspensión de tierra.6. Colocar en el centro de un portaobjetos limpio una gota de agua destilada.7. Tomar con el asa bacteriológica en condiciones asépticas (esterilizar el asa

calentándola al rojo vivo sobre la flama del mechero antes y después de hacer la preparación) tomar una porción del desarrollo fúngico del alimento ysuspenderla en la gota de agua.

8. Colocar un cubreobjetos sobre la preparación.





9. Observar al microscopio primero con el objetivo de 10X y posteriormente conel de 40X.

10. Registrar las observaciones y comparar con figuras del anexo 4.4.

5.0 Resultados

AGUA ESTANCADA:

10X 40XSUSPENSIÓN DE TIERRA:

10X 40XALIMENTO CONTAMINADO POR HONGOS:

10Xl 40X


7.0 Bibliografía Número 10 de la sección de bibliografía de este Manual.

8.0 Anexos

No aplica.






REPORTE DE LA PRÁCTICA Nombre de la práctica: Distribución de los microorganismos en la naturaleza.



5.0 Resultados

Dibujar las observaciones

AGUA ESTANCADA:

10X 40X

SUSPENSIÓN DE TIERRA:

10X 40X

ALIMENTO CONTAMINADO POR HONGOS:

10X 40X







Comentarios:


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Micr-03. Forma y agrupamiento de células bacterianas.

1.0 Objetivos 1.1 Observar el tipo de agrupamiento en ciertos grupos bacterianos de importancia

médica.1.2 Identificar la importancia de algunos métodos de coloración para definir

características o propiedades bacterianas.1.3 Realizar la tinción de Gram.

2.0 Introducción Las formas que asumen las bacterias tienen estrecha relación con las características

propias de su pared celular. Dentro del gran número de especies bacterianas que existen,resalta la pobreza morfológica de éstas, considerando que todas las bacterias conocidas ydescritas solo presentan dos formas básicas: cocos (ejemplo peptococcus niger) y bacilos(ejemplo Bacillus antharacis); sin embargo ambas formas presentan modificacionescomo los cocobacilos Brucella melitensis, los bacilos en espiral o helicoidiales comoTreponema pallidum y Leptospira interrogans, los bacilos curvos como Vibrio cholerae

y Campylobacter jejuni y los bacilos delgados fusiformes como Fusobacterium

nucleatum. A la vez, esta formas pueden agruparse en dos unidades como los diplococos( Neisseria meningitidis), en cuatro denominadas tétradas ( Aerococcus viridans) u ochodenominadas sarcinas (Sarcina spp.) en cadenas cortas o largas como los estreptococos(Streptococcus pneumoniae y S. pyogenes) y los estreptobacilos ( Bacillus antharacis), enracimos como los estafilococos (Staphylococcus aureus), o bien agrupándose asemejanza de letras chinas (Corynebacterium diphteriae).Aunque la subdivisión de bacterias según su forma y agrupamiento permite unaseparación burda de grandes grupos bacterianos, se recurre algunas veces a otros

parámetros morfológicos que confieren más información sobre la célula bacteriana,como demostrar por métodos de tinciones selectivas ciertas estructuras, tales como:cápsula ( Haemophilus influenzae [tinción de Gin-tinta china y Anthony]); esporas

(Clostridium tetani [tinción de Schaeffer y Fulton]); gránulos metacromáticos(Corynebacterium diphteriae [tinción de Albert]) y flagelos ( Proteus mirabilis [tinciónde Leisfon]).

No obstante que se recurre rutinariamente a la observación de forma, agrupamiento ytinción para iniciar un proceso de identificación de bacterias, no hay que perder de vistaque estos datos iniciales son insuficientes para definir una especie bacteriana, por lo quese requiere sistemáticamente de información adicional, como: aspectos fisiológicos ymetabólicos de las bacterias; además del apoyo de las características antigénicas ymoleculares para identificar un espécimen bacteriano.





3.0 Material y equipoCultivos de:

Escherichia coli

Streptococcus sppStaphylococcus spp

Bacillus spp - Asas bacteriológicas- Portaobjetos de 26 x 76 mm.- Frasco gotero con agua destilada- Puentes para tinción- Reactivos para la tinción de Gram (MicrR-03.1 a MicrR-03.4)- Mecheros de Bunsen- Aceite de inmersión- Papel limpia lentes- Microscopio- Marcador indeleble- Preparaciones fijas de bacterias con diferentes formas y agrupamientos.

4.0 Técnica

Preparaciones de frotes para tinción. 1 Trabajar en un área de aproximadamente 10 cm de distancia de la flama del

mechero (zona considerada estéril).2 Esterilizar el asa, flameándola y enfriarla.3 Tomar una pequeña porción de una colonia aislada.4 Resuspender el material del asa en una gota de agua destilada, colocada

previamente en un portaobjeto, mezclar y extender la suspensión en un área de2 cm como máximo.

5 Secar la preparación al aire libre.6 Fijar la preparación por cuatro o cinco pases sobre la flama del mechero

evitando el calentamiento excesivo.7 Identificar cada preparación con un marcador indeleble.8 Colocar el frote sobre el puente de tinción.Tinción 1 Cubrir los frotes con cristal violeta, durante un minuto.2 Lavar con agua corriente, ligeramente.3 Cubrir con lugol, durante un minuto.4 Lavar con agua corriente, ligeramente.

5 Decolorar con la mezcla alcohol-acetona (hasta que no salga colorante).6 Lavar con agua corriente, ligeramente.7 Cubrir con safranina (colorante de contraste), durante treinta segundos.8 Lavar con agua corriente.9 Secar al aire.10 Observar al microscopio con objetivo de 100x y comparar con figuras 1 a 8 en

anexo 4.4.

Interpretación: Las bacterias que retienen el colorante inicial y se tiñen de color violeta son Gram

positivas y las que se decoloran y adquieren la coloración roja del colorante de

contraste son Gram negativas. (Anexo 4.4).





5.0 Resultados Complete el cuadro con la morfología micrsoscópica observada para cadamocroorganismo.

Bacteria Forma Agrupamiento Afinidad al Gram Escherichia coli

Sstapphylococcus spp

Streptococcus spp

Bacillus subtilis


7.0 Bibliografía Números 3 y 9 de la sección de bibliografía de este Manual.

8.0 Anexos 8.1 MicrR-03.18.2 MicrR-03.2,8.3 MicrR-03.3,8.4 MicrR-03.48.5 Figuras 1 a 8.





HOJA PARA ANOTACIONES







Nombre de la práctica: Forma y agrupamiento de células bacterianas.



5.0 Resultados

Complete el cuadro con la morfología micrsoscópica observada para cadamocroorganismo.

Bacteria Forma Agrupamiento Afinidad al Gram

Escherichia coli

Sstapphylococcus spp

Streptococcus spp

Bacillus subtilis



Comentarios:


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Micr-04. Preparación y uso de medios de cultivo para bacterias.

1.0 Objetivo

1. Señalar los distintos tipos de medio de cultivo2. Diferenciar entre caldo de cultivo, agar inclinado y agar semisólido.3. Realizar la transferencia aséptica de bacterias desde un tipo de medio de

cultivo a otro.

2.0 Introducción Los medios de cultivo tienen cuatro componentes esenciales: fuentes de carbono,nitrógeno, minerales y vitaminas. Como fuente de carbono podemos utilizar sustanciascomo alcoholes, pentosas, hexosas, disacáridos, trisacáridos, glicoles, glucósidos,ácidos e hidroxiácidos. En cuanto a fuentes de Nitrógeno: aminoácidos y péptidos,hidrolizados de proteína de origen animal o vegetal como la soya, malta o levadura. Enel caso de las vitaminas que requieren las bacterias para su desarrollo pertenecen algrupo B y se le agregan al medio de cultivo como mezcla en forma de extracto delevadura o en forma individual. Los minerales se requieren en cantidades muy

pequeñas y se encuentran como contaminantes en otras sustancias. Los medios de

cultivo se pueden clasificar según su consistencia o su función.Por su consistencia:

- Líquidos (caldo nutritivo)- Semisólidos- Sólidos

Por su función:- Aislamiento- Diferenciales- Selectivos e inhibitorios- Enriquecimiento

- Caracterización- Mantenimiento

Las bacterias se cultivan en diferentes medios para facilitar la identificación y estudiarsu crecimiento y metabolismo, por ejemplo, caldos, agar profundo (tubo), agar en caja,agar semisólido, etc. La inoculación en el medio deben de hacerse sin introducción deotras bacterias ó contaminantes.Los caldos de cultivos proveen concentraciones muy elevadas de bacterias en pequeñosespacios y son fácilmente transportables. Los tubos de agar inclinado contienen mediode cultivo que solidificó en posición inclinada.Los tubos del agar inclinado igual que el agar en caja de Petri, proveen una superficie de

crecimiento, pero los tubos son más fáciles de almacenar y transportar que las cajas petri.





En el caso del agar profundo se deja solidificar el agar en posición vertical, ygeneralmente se usa para el crecimiento de bacterias que necesitan menos oxígeno queel que está presente en la superficie del medio. El agar semisólido vertical quecontiene 0.5 – 0.7 % de agar en vez del usual 1.5 %, puede utilizarse para determinar lamovilidad. Una bacteria móvil crecerá alejándose del punto de inoculación, dando una

apariencia de árbol de navidad invertido.

3.0 Material y equipo - Caldo de Staphylococcus epidermidis - Caldo de Pseudomonas aeruginosa - Tubo inclinado con Proteus vulgaris - 3 tubos con caldo nutritivo (Anexo MicrM-04.1) - 3 tubos con agar nutritivo inclinado (Anexo MicrM-04.2 ) - 3 tubos con agar nutritivo semisólido ( Anexo MicrM-04.3) - Asa de inoculación

- Aguja de inoculación- Mecheros Bunsen- Incubadora- Gradilla- Encendedor- Marcador indeleble

4.0 Técnica

1. Esterilizar el asa en la flama del mechero hasta el rojo vivo y dejarla enfriar.2. Tomar una asada de S . epidermidis, destapar el caldo nutritivo cerca de la

flama del mechero e inocularlo, agitando el asa dentro del medio. Flamear la boca del tubo y taparlo. Flamear el asa.3. Tomar otra asada de S. epidermidis y estriar la superficie de un tubo de agar

inclinado teniendo cuidado de no rasgar el agar. Flamear la boca del tubo ytaparlo. Flamear el asa.

4. Con la aguja de inoculación picar una colonia de S. lactis e inocular un tubo deagar nutritivo semisólido introduciendo la aguja hasta la mitad del medio yretirarla siguiendo el mismo trayecto de la punción. Flamear la boca del tubo ytaparlo. Flamear el asa.

5. Inocular de igual manera P. aeruginosa y Proteus vulgaris en otro caldonutritivo, agar inclinado y agar semisólido.

Medio de cultivo S. epidermidis P. aeruginosa P. vulgaris Caldo nutritivo * * *Agar inclinado * * *Agar semisólido * * *

6. Rotular todos los tubos e incubar a 37°C durante 24 horas.7. Registrar el desarrollo en cada medio de cultivo.

Nota. Trabajar con sólo un cultivo bacteriano a la vez, para prevenir cualquierequivocación o contaminación cruzada.





5.0 Resultado

Registre el desarrollo de cada cultivo.

Medio de cultivo S. epidermidis P. aeruginosa P. vulgaris

Caldo nutritivoAgar inclinadoAgar semisólido


7.0 Bibliografía

Números 8 y 9 de la sección de bibliografía de este Manual

8.0 Anexos

8.1 MicrM-04.18.2 MicrM-04.28.3 MicrM-04.38.4 Figuras 9 a 12












Nombre de la práctica: Preparación y uso de medios de cultivo para bacterias.



5.0 Resultados

Registre el desarrollo de cada cultivo.

Medio de cultivo S. epidermidis P. aeruginosa P. vulgaris

Caldo nutritivo

Agar inclinado

Agar semisólido



Comentarios:


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Micro-05. Morfología colonial bacteriana.

1.0 Objetivo 1. Diferenciar colonias de bacterias aisladas teniendo en cuenta la morfología

colonial de los cultivos: tamaño, forma, color, producción de pigmentos y dehemólisis mediante examen visual.

2.0 Introducción

La caracterización macroscópica de las colonias se lleva a cabo mediante el examenvisual del desarrollo en la superficie de las placas de agar.Se debe estudiar con cuidado la placa debido a que las bacterias aisladas inicialmente a

partir de muestras, constituyen a menudo cultivos mixtos y puede haber una granvariedad de colonias de diversos tipos.Las colonias puntiformes constituidas por bacterias de desarrollo lento, pueden pasarinadvertidas entre las de mayor tamaño principalmente si hay una tendencia a ladispersión del desarrollo por toda la superficie de la placa. Durante el examen de las

placas se debe de inclinar en distintas direcciones con iluminación brillante directa, demodo que la luz sea reflejada desde diversos ángulos. En algunos casos se utiliza unalupa o microscopio de disección para la mejor identificación de colonias minúsculas o

inmaduras, y así observar mejor sus características morfológicas en el agar.


Placas con cultivos de:Streptococcus β-hemolítico

Pseudomonas fluorescens

Proteus sppLupa

4.0 Técnica En cultivos bacterianos de 24 horas y con la ayuda de una lupa analizar las siguientescaracterísticas:

1. Tamaño: Diámetro de la colonia en mm.2. Forma: puntiformes, circular, fila-mentosa, irregular, rizoide, fusiforme.3. Elevación: Colonia plana, elevada, convexa, monticular, umbeliforme,

umbilicada.4. Margen (borde de la colonia): entero, ondulado, lobulado, aserrado,

filamentoso, rizado.

5. Color de la colonia: blanco, amarillo, negro, ante, naranja, etc.





6. Superficie (luz reflejada): brillante, mate, etc.7. Densidad (luz transmitida): opaca, translúcida, transparente, etc.8. Consistencia de la colonia: butirosa, viscosa, membranosa, quebradiza.9. Hemólisis en agar sangre (Se pueden distinguir tres tipo de hemólisis).

- alfa: aclaramiento parcial de la sangre alrededor de las colonias, concoloración verde del medio.- beta: Zona de aclaración completa de la sangre alrededor de la colonia,

debido a la lisis de los eritrocitos.- gamma: No hay cambio en el medio que rodea a la colonia, no hay lisis

de los eritrocitos.Además, puede haber doble zona de hemólisis: se observa halo de lisiscompleta inmediatamente alrededor de las colonias, con la segunda zona dehemólisis parcial ubicada en la periferia.

10. Producción de pigmentos en el medio de agar:

- Pigmentos hidrosolubles que colorean el medio.- Piocianinas.- Pigmentos fluorocrómicos (fluoresceína).- Pigmentos no difusibles, confinados a las colonias.

11. Olor. En algunos casos las bacterias producen olores característicos comolos que se anotan a continuación:

Bacteria Olor Pseudomonas spp. Zumo de uvas Proteus spp. Chocolate quemado

Streptomyces spp. Sótano enmohecidoClostridium spp. Fétido, nauseabundo





5.0 Resultados

Comparar las observaciones con anexo 4.4, figuras 13 a 16 y anotar los resultados en lasiguiente tabla.

Bacteria Olor Morfologíacolonial

Pcción. de pigmentos

Tipo dehemólisis

Pseudomonas spp Tamaño (mm):Forma:Elevación:Margen:Color:Consistencia:

Proteus spp Tamaño (mm):Forma:

Elevación:Margen:Color:Consistencia:

Streptococcus β-hemolítico Tamaño (mm):Forma:Elevación:Margen:Color:Consistencia:


7.0 Bibliografía

Números 3 y 9 de la sección de bibliografía de este Manual

8.0 Anexos

8.1 Figuras 13 a 16



Manual de Practicas de Microbiologia

28 FACULTAD DE CIENCIAS QUiMICO BIOLOGICAS I UAS








Nombre de la práctica: Morfología colonial bacteriana.



5.0 Resultados

Registre sus observaciones en la tablaBacteria Olor Morfología colonial Pcción. de

pigmentosTipo de

hemólisis Pseudomonas spp Tamaño (mm):

Forma:Elevación:Margen:Color:Consistencia:

Proteus spp Tamaño (mm):Forma:Elevación:Margen:Color:Consistencia:

Streptococcus β-hemolítico Tamaño (mm):Forma:Elevación:Margen:Color:Consistencia:







Comentarios:


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Micr-06. Introducción a pruebas bioquímicas para bacterias.

1.0 Objetivos

1.1 Llevar a cabo pruebas bioquímicas sencillas para detectar el tipo demetabolismo bacteriano.

2.0 Introducción

El proceso de identificación de bacterias está basado principalmente en ladeterminación de la presencia o ausencia de diferentes enzimas. Estas enzimas dirigenel metabolismo de las bacterias por distintas vías que pueden detectarse con mediosespeciales de cultivo en el laboratorio. Los sustratos de esas enzimas se incorporan almedio de cultivo junto con un indicador capaz de detectar la utilización del sustrato ola presencia de productos metabólicos específicos.La fermentación es un proceso metabólico de oxido-reducción en donde un sustratoorgánico sirve como aceptor electrónico de los electrones, en lugar del oxígenomolecular. En la fermentación el ácido pirúvico resultante de la glicólisis finalmentederiva en una variedad de ácidos orgánicos como ácido acético, propiónico, succínico,fórmico y otros. Como consecuencia, podemos diferenciar bacterias basándonos en sus

reacciones de fermentación, es decir, los hidratos de carbono que son capaces deutilizar y los tipos y cantidades de ácidos mixtos que producen.Otra característica metabólica importante que se usa para diferenciar bacterias es laactividad de citocromooxidasa. La presencia de esta enzima indica que la bacteria escapaz de llevar a cabo un metabolismo oxidativo donde se transfieren los hidrógenosdel ácido pirúvico al ciclo de Krebs y el aceptor electrónico final es el oxígenomolecular y se forma agua. Así por ejemplo, todo organismo que muestre actividad decitocromooxidasa se excluye de la familia Enterobacteriaceae.

3.0 Material y equipo - Cultivo de Escherichia coli en TSA ( Anexo MicrM-01.2)

- Cultivo de Klebsiella pneumoniae en TSA (Anexo MicrM-01.2) - Cultivo de Citrobacter freundii en TSA (Anexo MicrM-01.2) - Cultivo de Pseudomonas spp.- Cinco tubos de agar citrato de Simmon’s (Anexo MicrM-06.1) - Cinco tubos de agar hierro y lisina (LIA) ( Anexo MicrM-06.2) - Cinco tubos de medio MIO (Anexo MicrM-06.3) - Cinco tubos de rojo de fenol con sacarosa ( Anexo MicrM-06.4) - Discos para oxidasa- Aguja de inoculación (asa recta)- Hisopos estériles





4.0 Técnica 1. Trabajar siempre junto al mechero. Flamear el asa hasta el rojo vivo. Enfriar.

2. Picar una colonia aislada de E. coli . Flamear el tubo de medio fresco ydestapar. Sembrar como se describe a continuación:

a) En el medio citrato de Simmon’s hacer una estría sobre el medioinclinado.

b) En el LIA hacer una punción casi hasta la base del tubo y al retirar el asaestriar la superficie inclinada.

c) en el medio MIO inocular por punción hasta el fondo del tubo.d) En el medio rojo de fenol con sacarosa inclinar el tubo y poner la punta

del asa con el inóculo en el vidrio, cerca del caldo. Frotar contra elvidrio y enderezar el tubo para que el inóculo quede sumergido en elmedio.

3. Repetir el procedimiento para Klebsiella pneumoniae en todos los medios.

4. Realizar el procedimiento para Citrobacter freundii en todos los medios.

5. Realizar el procedimiento para Pseudomonas spp. en todos los medios.

6. De cada cultivo bacteriano tomar suficiente cantidad con el hisopo estéril yfrotarla sobre un disco para oxidasa. Esperar 10 segundos y observar si aparececoloración.

7. Registrar los resultados para cada bacteria y comparar con figura en anexo 4.4.

8. Incubar todos los tubos a 37º C durante 24 horas.

9. Registrar los resultados al término de la incubación y comparar con figuras 17 a21 en anexo 4.4.

5.0 Resultados

Bacteria Fermentación

de sacarosa

Prueba de oxidasa Descarboxilación

Lisina / ornitina Escherichia

coli

Klebsiella

pneumoniae

Citrobacter

freundii

Pseudomonas

spp







8.0 Anexos 8.1 MicrM-01.28.2 MicrM-06.18.3 MicrM-06.28.4 MicrM-06.38.5 MicrM-06.48.6 Figuras 17 a 21.












Nombre de la práctica: Introducción a pruebas bioquímicas para bacterias.



5.0 Resultados

Bacteria Fermentaciónde sacarosa

Prueba de oxidasa Descarboxilación Lisina / ornitina

Escherichia coli

Klebsiella pneumoniae

Citrobacter

freundii

Pseudomonas spp



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Micro-07. Identificación microscópica de Algas.

1.0 Objetivo

1.1 Observar la morfología de algas en muestras ambientales.

2.0 Introducción

Las algas son organismos aerobios fotosintéticos. La mayoría son organismos acuáticos

y microscópicos, aunque existen algas cuyo tamaño alcanza varios metros de longitud.Están muy extendidas en la naturaleza encontrándose en casi todos los ambientesdonde hay luz solar, incluso en las regiones polares y en las cumbres de las montañascoloreando el paisaje con los pigmentos de sus células. Contienen clorofila y otros

pigmentos como carotenoides y ficobilinas. La flora del mar o fitoplancton estáconstituída por diminutas algas en suspensión y constituye el inicio de la mayoría delas cadenas alimentarias acuáticas ya que son fuente importante de alimento para otrosorganismos incluyendo las ballenas. Muchas especies de algas existen como célulasaisladas que pueden ser esféricas, ovaladas o en forma de porra, móviles o inmóviles.Otras especies de algas forman colonias pluricelulares de células idénticas al quedarunidas después de la división; mientras que otras colonias se componen de diferentes

clases de células con funciones especializadas. Algunas otras son pluricelulares muygrandes y de morfología compleja.

En agua dulce podemos encontrar algas unicelulares representadas por clorofitas comoChlamydomona, Chlorella, Volvox y Scenedesmus. Estas algas son las responsables delagua verde.Hay también algas verdes filamentosas como Cladophora, Oedogonium, Vaucheria ySpirogyra que recubren los objetos y plantas con filamentos de color verde.Las algas azuladas y verde azuladas tapizantes se encuentran tanto en agua dulce comoen agua salada y están representadas por algas cianofitas como Anabaena, Oscilatoria

y Ribularia. Las diatomeas abundan tanto en agua dulce y salada, mientras que las

algas rojas tapizantes son propias del medio marino.


- Agua “verde” - Agua de acuario- Cubreobjetos de 22 x22 mm- Portaobjetos de 26 x 76 mm- Pipeta Pasteur con bulbo- Microscopio óptico





4.0 Técnica 1. Con la pipeta Pasteur colocar una gota de cada muestra en un portaobjeto,

cubrir con un cubreobjetos y observar con el objetivo de 10X y 40S.2. Registrar sus observaciones y comparar con figuras 22 a 26 en anexo 4.4.

5.0 Resultados

Agua “verde” Agua de acuario



8.0 Anexos

8.1 Figuras 22 a 26







Nombre de la práctica: Identificación microscópica de Algas.



5.0 Resultados

Agua “verde” Agua de acuario



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Micro-08. Morfología microscópica de hongos.

1.0 Objetivos

1.1 Hacer preparaciones para observar la estructura microscópica del micelio,conidios y cuerpos fructíferos de algunos hongos contaminantes de alimentos.

2.0 Introducción

Las características más importantes que se utilizan para la identificación de hongos sonla morfología de sus esporas sexuales y asexuales así como de sus cuerpos fructíferos(o estructuras portadoras de cuerpos fructíferos) y hasta cierto grado, las característicasde su micelio. Estos órganos se examinan directamente al microscopio compuesto. Laforma, color, tamaño y manera en que se disponen las esporas sobre los esporóforos ocuerpos fructíferos, así como la forma, color y tamaño de éstos últimos soncaracterísticas que sugieren, si se tiene experiencia en taxonomía de hongos, la clase,orden o el género al que pertenece un determinado hongo.

Existen muchas clases de esporas asexuales:1. Conidios. Existen conidios pequeños unicelulares. Los conidios grandes

pluricelulares se denominan macroconidios.2. Esporangiconidios. Se forman dentro de sacos o esporangios que están en elextremo de hifas denominadas esporangióforo.

3. Artroconidios. Se forman al desprenderse las células de la hifa. Sonunicelulares

4. Clamidoconidios. Se forman a partir de células de las hifas vegetativas. Sonesporas unicelulares de paredes gruesas.

5. Blastoconidios. Son las yemas que se forman sobre las células de levaduras.

Los hongos también forman esporas sexuales mediante la fusión de dos núcleos. Sonmenos abundantes que las esporas asexuales. Dentro de las esporas sexuales se

encuentran:

1. Ascosporas. Se producen dentro de un saco denominado asca2. Basidiosporas. Esporas unicelulares que nacen de una estructura con forma de

porra o basidio.3. Zigosporas. Se forman cuando los extremos de dos hifas sexualmente

compatibles se fusionan entre sí. Son esporas grandes.4. Oosporas. Se forman dentro de una estructura femenina denominada oogonio.

Tanto las esporas asexuales como las sexuales pueden estar rodeadas de una estructura protectora denominada cuerpo fructífero. Los cuerpos fructíferos asexuales se

denominan acérvulo y picnidio, los sexuales se conocen como peritecio y apotecio.





3.0 Material y equipo. - Tortillas con hongos- Naranja con hongos- Pan con hongos

- Solución salina al 0.85% (Anexo MicR-08) - Azul de lactofenol- Portaobjetos de 26x 76 mm- Cubreobjetos de 22 x 22 mm- Asas micológica- Microscopio- Mechero de Bunsen

4.0 Técnica

1. Tomar un portaobjetos y depositar una gota de solución salina. Con el asamicológica tomar un poco de micelio de la tortilla y depositarlo sobre la gota desolución salina. Cubrir con un cubreobjeto.

2. En otro portaobjetos repetir el procedimiento con azul de lactofenol .3. Igualmente hacer dos preparaciones con el hongo del pan y la naranja.4. Observar las preparaciones al microscopio con objetivos de 10X y 40X.5. Comprar las observaciones con figuras 27 a 35 en anexo 4.4.

5.0 Resultados Dibuje sus observaciones

Hongo en tortilla Hongo en pan Hongo en naranja


7.0 Bibliografía Números 1, 6 y 10 de la sección de bibliografía de este Manual.

8.0 Anexos

8.1 MicR-088.2 Figuras 27 a 35.







Nombre de la práctica: Morfología microscópica de hongos.



5.0 Resultados

Dibuje sus observaciones

Hongo en tortilla Hongo en pan Hongo en naranja

40X 40X 40X



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Micro-09. Preparación de medios de cultivo para hongos.

1.0 Objetivo

1.1 Preparar un medio de cultivo para hongos a base de papa.

2.0 Introducción Los hongos pueden soportar un ambiente desfavorable mejor que la mayoría de losmicroorganismos. Los hongos filamentosos y las levaduras pueden crecer en unsustrato o medio con concentraciones de azúcares que inhiben a la mayoría de las

bacterias. Los hongos son capaces de utilizar una gran variedad de materiales para sunutrición, sin embargo, son heterótrofos. Al contrario de lo que sucede con algunas

bacterias no pueden utilizar compuestos de carbono inorgánicos como el dióxido decarbono. El carbono debe proceder de una fuente orgánica como la glucosa. Algunasespecies pueden utilizar compuestos de nitrógeno como las sales de amonio. Todos loshongos pueden utilizar el nitrógeno orgánico, razón por la que los medios de cultivo

para hongos usualmente contienen peptona, que es un producto a base de proteínahidrolizada.


- Matraces- Vaso de precipitado- Olla de presión- Probeta- Alcohol- Agua destilada

- Dextrosa- Extracto de carne- Bactopetona- Balanza analítica- 1 papa- Gasa- Embudo

4.0 Técnica 1. PesarPapa ..........................200gDextrosa....................10gAgar...........................18gAgua purificada...........100ml

2. Se pone a cocer la papa en 500 ml de agua destilada.3. Se disuelve la dextrosa y el agar en un poco de agua.4. Cuando la papa esté cocida se agrega el agua de cocimiento a la mezcla del

paso número 2, filtrando con gasa. Se afora con agua destilada a 1000 mL.5. Esterilizar la mezcla durante 15 minutos a 15 lb/plg2.





5.0 Resultados

Medio Color Solidificación( buena o mala)

Medio PDA



8.0 Anexos







Nombre de la práctica: Medios de cultivo para hongos.



5.0 Resultados

Medio Color Solidificación (buena o mala)

PDA



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Micro-10. Morfología colonial de hongos.

1.0 Objetivo

1.1 Observación de la morfología colonial de algunos hongos

2.0 Introducción Los hongos son pequeños organismos productores de esporas, generalmentemicroscópicos, eucarióticos, ramificados y a menudo filamentosos que carecen de

clorofila. La mayoría de las 100 000 especies de hongos conocidas son estrictamentesaprofitas y viven sobre la materia orgánica muerta descomponiéndola. Alrededor de50 especies de hongos producen enfermedades en el hombre y casi el mismo númeroocasiona enfermedades en los animales.Los hongos crecen en dos formas básicas: levaduras y mohos. El crecimiento del hongoen forma de moho produce colonias filamentosas multicelulares, que constan detúbulos cilíndricos ramificados llamados hifas; cada hifa puede tener un grosoruniforme o bien, terminar en porciones más delgadas o más anchas. Además, las hifas

pueden ser septadas (con divisiones o tabiques) o cenocíticas (contínuas, sin ningunadivisión).El micelio puede clasificarse como reproductor (aéreo) o como nutritivo. El primero esaquél cuyas hifas se elevan por encima del sustrato donde crece, dando lugar a laformación de esporas. El segundo es el que penetra en el medio o sustrato y su funciónes de nutrición (vegetativo). El conjunto de micelio y diferentes estructuras dereproducción constituye la colonia del hongo, la cual presenta un crecimiento radial.


- Placas con cultivos de hongos- Microscopio estereoscópico- Lupa

- Asas micológicas

4.0 Técnica

1. Observar a simple vista las colonias de hongos por el frente y reverso de la caja

2. Colocar al caja en el microscopio estereoscópico y observar las colonias dehongos

3. Registrar las observaciones y comparar con figura 36 en anexo 4.4.





5.0 Resultados

Origen delhongo

ColorFrente Reverso

Aspecto Presencia demicelio

OtrasObservaciones


7.0 Bibliografía

Números 1, 7 y 10 de la sección de bibliografía de este Manual.

8.0 Anexos







Nombre de la práctica: Morfología colonial de hongos.



5.0 Resultados

Origen delhongo

ColorFrente Reverso

Aspecto Presencia demicelio

OtrasObservaciones



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Micro-11. Protozoos de vida libre.

1.0 Objetivo 1.1 Identificar protozoos presentes en agua de río y otros especimenes

ambientales.

2.0 Introducción Los organismos eucariotes se han clasificado dentro de cuatro reinos: Animalia, Fungi,Plantae y Protista. Los tres primeros son grupos monofiléticos, bien definidos; encambio, el Reino Protista contiene un extraordinario número de organismos másrelacionados con miembros de otros reinos que con otros protistas. Los protozoos sonun eslabón muy importante en la cadena alimentaria en ambientes acuáticos. Elzooplancton está constituido por protozoos que se alimentan del fitoplancton. Los

protozoos a su vez, son alimento de otros organismos marinos mayores. En tierrashúmedas pueden vivir como saprófitos y alimentarse de bacterias.Existen reportes de enfermedades causadas por algunos protozoos de vida libre con

distribución mundial, principalmente en EUA, Australia, Nueva Zelanda yChecoeslovaquia; en menor proporción en India, Africa, Perú y México. Comoejemplo, Naegleria que es un protozoo termofílico, se encuentra idealmente entre 30 -45 °C, mientras que Acanthamoeba entre 25 - 35 °C, por lo que se localizan en climastropicales y subtropicales, en presencia de materia órganica, durante todo el año. Estos

protozoos proliferan en zonas geográficas templadas durante el verano. Se handetectado en redes públicas de agua, albercas, estanques, lagos, ríos, aguas termales,lodos, suelos desnudos y encharcados, canales artificiales, aguas de desecho industrial,redes de agua potable, agua embotellada, unidades dentales, de diálisis, fisioterapia, yaire acondicionado, así como en materia fecal de diversos animales.


- Cultivo de paja- Agua de río- Portaobjetos de 26 x 36 mm- Cubreobjetos de 22 x 22 mm- Pipetas Pasteur- Bulbos de caucho- Microscopio





4.0 Técnica 1. Con una pipeta Pasteur tomar agua de río.2. Depositarla sobre un portaobjeto.3. Colocarle un cubreobjeto.4. Observar al microscopio con el objetivo de 10x y 40x.5. Repetir el procedimiento con cultivo de paja.6. Registrar observaciones y comparar con figuras 37 a 38 en anexo 4.4.

5.0 Resultados

Cultivo de Paja

Agua de Río

10x 40x



8.0 Anexos 8.1 Figuras 37 a 38







Nombre de la práctica: Aislamiento e identificación de Enterobacterias yPseudomonas.



5.0 Resultados

Dibuje sus observaciones

Cultivo de paja

Agua de río

10X 40X



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Micro-12. Identificación microscópica de protozoos intestinales.

1.0 Objetivo

1.1 Observar protozoos intestinales pertenecientes a las principales clases paraidentificar sus principales características morfológicas.

2.0 Introducción

Los protozoos son protistas eucarióticos que existen como células aisladas y que pueden distinguirse de otros protistas eucarióticos por su capacidad de desplazarsedurante algún estadío de su ciclo biológico y por su falta de pared celular. Los

protozoarios muestran una considerable variedad de formas y tamaños. Algunos sonalargados o esféricos, otros son ovalados y otros presentan diferentes aspectosmorfológicos en los diferentes estadíos de su ciclo biológico. Una célula típica de un

protozoo está rodeada por una membrana citoplasmática. Muchos poseen una capaexterna de citoplasma, el ectoplasma, que se distingue del citoplasma más interno oendoplasma. La mayoría de las estructuras celulares se encuentran en el endoplasma.Cada célula de protozoo tiene al menos un núcleo. Sin embargo, muchos protozoos

poseen múltiples núcleos durante la mayor parte de su ciclo biológico. Algunos

protozoos pueden formar quistes. De esta manera las formas vegetativas o trofozoitosse protegen de la desecación, el agotamiento de los alimentos o la acidez gástricacuando están dentro del huésped. El estadío de desarrollo de un protozoo parásito quese transmite de un huésped a otro es el quiste resistente. Algunos protozoos son

parásitos del hombre y le causan enfermedades graves.

3.0 Material y equipo - Materia fecal- Preparaciones de:- Entamoeba histolytica - Entamoeba coli - Giardia spp- Chilomastix mesnilii - Portaobjetos de 26 x 76 mm- Cubreobjetos de 22 x 22 mm- Lugol parasitológico (Anexo MicrR-03.2)- Solución salina- Aplicadores de madera





4.0 Técnica 1. Observar cada una de las preparaciones disponibles con objetivos de 10X y 40X.2. Registrar sus observaciones y comparar con figuras de anexo 4.4.3. Colocar en un portaobjetos una gota de solución salina isotónica.4. Con un aplicador de madera tomar una pequeña muestra de heces.5. Mezclarla con la solución salina isotónica procurando hacer una suspensión, no

un frote.6. Quitar de la suspensión fibras y otros elementos sólidos.7. Cubrir con un cubreobjetos y observar con objetivos de 10X y 40X.8. Repetir el procedimiento Lugol.9. Registrar sus observaciones y compararlas con anexo 4.4, figuras 39 a 43.

5.0 Resultados

Observación de preparaciones

Observación de materia fecal

Solución salina Lugol






7.0 Bibliografía

Número 10 de la sección de bibliografía de este Manual.

8.0 Anexos

8.1 MicrR-03.28.2 Figuras 39 a 43.












Nombre de la práctica: Identificación microscópica de protozoos intestinales.



5.0 Resultados

Observación de preparaciones

Observación de materia fecal

Solución salina Lugol







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Micro-13. Identificación microscópica de protozoos extraintestinales.

1.0 Objetivo

1.1 Observar las características morfológicas de algunos protozoos extraintestinalesde interés médico.

2.0 Introducción

Dentro de los protozoos flagelados, además de los intestinales, existe otro grupo, loshemoflagelados que son formas de la sangre o los tejidos. Los géneros de estosorganismos son Trypanosoma y Leishmania. La tripanosomiasis comprende laenfermedad africana del sueño, mientras que la leishmaniasis abarca lesiones de la pielu órganos viscerales dependiendo de la especie. Estos protozoos son transmitidos a las

personas por insectos chupadores de sangre causando infecciones graves.En el grupo de los esporozoos se encuentran parásitos con ciclos de vida complicados,ya que algunos estadíos pueden existir en un huésped y otros, en un huésped diferente.La toxoplasmosis y la malaria son las principales enfermedades humanas causadas poresporozoos. Los esporozoos más importantes son los causantes de la malaria y

pertenecen al género Plasmodium. En este padecimiento los esporozoitos infectan elhígado y los glóbulos rojos.


- Preparaciones de:- Leishmania spp - Tripanosoma cruzi - Plasmodium spp - Microscopio óptico- Papel limpialentes

- Aceite de inmersión

4.0 Técnica 1. Observar detenidamente al microscopio con los objetivos de 40X y 100X cada

una de las laminillas disponibles y registrar sus observaciones.2. Comparar con figuras 44 y 45 en anexo 4.4.





5.0 Resultados

Leishmania spp. Trypanosoma cruzi Plasmodium spp.



8.0 Anexos 8.1 Figuras 44 a 45







Nombre de la práctica: Identificación microscópica de protozoos extraintestinales.



5.0 Resultados

Leishmania spp. Trypanosoma cruzi Plasmodium spp.



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Micro-14. Uso de agentes físicos en el control de microorganismos.

1.0 Objetivo 1.1 Llevar a cabo un método físico para control de microorganismos.

2.0 Introducción

El control de microorganismos es esencial en la prevención de enfermedades así como para retardar la descomposición y deterioro de productos alimenticios. Losmicroorganismos se controlan mediante agentes físicos y químicos. Los agentes físicos

incluyen métodos de control como el uso de altas o bajas temperaturas, desecación, presión osmótica, radiación UV, radiación ionizante y filtración. El control medianteagentes químicos se refiere al uso de desinfectantes, antisépticos, antibióticos y otrassustancias químicas.


Sesión 1- 5 cajas de Agar soya tripticaseína (Anexo MicrM-01.2) - Cultivo en caldo de E. coli

- Campana o lámpara con luz ultravioleta- Hisopos estériles- Tijeras- Cartoncillo- Marcador

4.0 Técnica

1. Introducir un hisopo estéril en el cultivo.2. Remover el exceso de líquido presionando el hisopo contra la pared del tubo.3. Tomar una caja de TSA y estriar la superficie del agar hasta cubrirla totalmente.

4. Repetir los pasos 1-3 con las cuatro cajas restantes.5. Exponer tres de las cajas a luz UV como se indica:a. Remover la tapa de cada una de las 3 cajas y colocar un círculo de

cartoncillo con un círculo interior recortado de modo que por ahí pase la luzUV.

b. Exponer la primera caja durante 3 segundos, la segunda por 10 segundos yla tercera por 60 segundos.

c. Tapar de nuevo las cajas e incubar a temperatura ambiente durante 24 horas.

6. En la cuarta caja, dejar la tapa puesta y colocar el cartoncillo sobre ella.7. Exponerla a luz UV durante 60 segundos e incubarla a temperatura ambiente

durante 24 horas.8. Utilizar la quinta caja como control no irradiado e incubarla con las otras cajas.





5.0 Resultados

Dibuje los resultados en las cinco cajas del experimento con luz UV.

Control no irradiado Exposición UV 3 segundos Exposición UV 10 segundos

Exposición UV 60 segundos Exposición UV 60 segundoscon tapa



8.0 Anexos 8.1 MicrM-01.2







Nombre de la práctica: Uso de agentes físicos y químicos en el control demicroorganismos.



5.0 Resultados

Dibuje los resultados en las cinco cajas del experimento con luz UV.

Control no irradiado Exposición UV 3 segundos Exposición UV 10 segundos

Exposición UV 60 segundos Exposición UV 60 segundoscon tapa







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EVALUACIÓN DE PRÁCTICAS

La evaluación del desempeño del alumno en su formación práctica, considerará losaspectos siguientes:

- Asistencia obligatoria a realizar prácticas, en tiempo y forma.

Criterio Participación %1. Material solicitado para realizar las prácticas. 5%2. Condiciones del alumnos al presentarse a realizas las

prácticas de laboratorio (Seguridad).5%

3. Integración al trabajo en equipo. 10%4. Dominio de los conceptos teóricos utilizados en las prácticas. 10%5. Descripción de la técnica (Lectura previa). 10%6. Argumentación de resultados. 10%

7. Argumentación de conclusiones y comentarios. 10%8. Cumplimiento de fechas. 10%9. Presentación del reporte de prácticas. 30%

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS / UAS





BIBLIOGRAFÍA

1. Agrios, G.N. Fitopatología. México. Ed. Limusa. 1998.

2. Freggiaro L. E. Atlas de parasitología on line. Foro bioquímico.

3. Facultad de Medicina. UNAM. Manuales departamentales. Fascículo IIBacteriología. México. 1996.

4. Frederick L. Schuster. Cultivation of Pathogenic and Opportunistic Free-Living Amebas. Clinical Microbiology Reviews, 2002; 15: 342-354,Vol. 15. American Society for Microbiology.

5. Giono, C.S., A. Escobar, J.L. Valdés. Diagnóstico de laboratorio deinfecciones gastrointestinales. México.1994.

6. Instituto Geográfico de Agostini. Ciencias de la naturaleza. Botánica I,Vol. 4. España. Ed. Planeta. 1997.

7. Jawetz, Melnick and Adelberg. Microbiología médica.. Trad. Ilian Naget Arsof. México 17 ed. El manual moderno. 2001.

8. Kaiser, G. E. Microbiology Laboratory Manual. The Community College

of Baltimore County, Catonsville Campus. 2001.

9. Koneman, E.W., D.A. Stephen, V. R. Dowell, W.M. Janda, M.S. Herbertand C.W. Washington. Diagnóstico microbiológico. Texto y atlas color.Trad. del ingles por N.G. Meerot y B.E. Roel. México 3a. ed. Ed.Panamericana.1998.

10. Pelczar M. J., E.C.S. Chan. Elementos de microbiología.. México McGraw-Hill. 1991.





ANEXOS

4.1 Actividades previas a las prácticas:

Micro-01 1. Mencione las importancias de la implementación de medidas de bioseguridad en un laboratorio de microbiología

2. Mencione qué indumentaria sería la adecuada para trabajar con muestrasobtenidas de pacientes con ántrax en un laboratorio de microbiología.

3. Mencione tres acciones incorrectas que podrían conducir a un accidentegrae en el laboratorio cuando se trabaja con sangre contaminada por VIH

Micro-02 1. A qué se debe la amplia distribución de los microorganismos en la

naturaleza?

2. ¿Cómo se transfierien los microorganismos de un lugar a otro?3. ¿Qué propiedades de un microorganismo determinan su carácter útil o

perjudicial?

Micro-03 4. Enuncie el fundamento de la tinción de Gram.5. Explique la causa por la que las células Gram positivas retienen el

colorante y las Gram negativas lo pierden durante el proceso dedecoloración

6. Describa la utilidad diagnóstica de la reacción a la tinción Gram de las bacterias.

Micro-04 1. Mencione las características nutritivas que debe contener un medio de

cultivo2. ¿Qué importancia tiene la correcta preparación de un medio de cultivo?3. Mencione cuándo utilizaría un caldo, un agar inclinado y un agar

semisólido.

Micro-05 1. Mencione que debe hacer al inspeccionar una placa para que no pasen

inadvertidas las colonias de bacterias de desarrollo lento.2. Explique la utilidad y/o importancia del estudio de la morfología colonial

bacteriana en el diagnostico clínico.

Micro-06 1. Si una bacteria es capaz de fermentar azúcares ¿qué tipo de metabolismo

realiza? y ¿qué significa esto, en términos bioquímicos? Explique.2. ¿Cuáles son las implicaciones de que una bacteria realice metabolismo

oxidativo?3. Mencione tres bacterias fermentativas4. Explique en qué consiste el proceso de descarboxilación de ornitina y

lisina y qué enzimas intervienen.





Micro-07 1. ¿Cómo se clasifican las algas?. Esquematiza cada grupo2. ¿Cuál es la importancia de este grupo de microorganismos?3. ¿Qué medios de cultivo se utilizan para el cultivo y aislamiento de algas?

Micro-08 1. ¿Qué diferencias existen en la morfología microscópica de los hongos

filamentosos (mohos) y los levaduriformes (levaduras)?2. ¿En qué ambientes se encuentran este tipo de microorganismos?3. ¿Cuáles son las condiciones óptimas para el crecimiento de hongos y

levaduras?

Micro-09 1. Mencione tres medios de uso general en el laboratorio2. ¿Qué tipo de medio es el medio PDA?

3. ¿Por qué se utiliza papa, qué sustancias o nutrientes cree que aporta elmedio? Explique.

Micro-10 1. Mencione las diferencias entre la morfología colonial bacteriana y la

morfología colonial de hongos.

Micro-11 1. ¿Qué tipos de locomoción presentan los protozoarios? Esquematiza cada

grupo2. ¿Qué condiciones se necesitan para el crecimiento saprofito de un

microorganismo?

Micro-12 1. Investigar la clasificación de los protozoarios.2. ¿Mencione las diferencias que existen entre el quiste de Giardia lamblia y el

de Entamoeba coli?3. ¿En qué tipo de muestras podemos ver los trofozoitos?4. ¿Cuál es la utilidad de la solución salina y el lugol en la observación de

amibas?

Micro-13 1. ¿En qué grupos o “subphyla” se encuentran los protozoarios que causanenfermedades extraintestinales en el hombre?

2. ¿Cómo se transmiten estas enfermedades?3. Mencione las características más importantes del ciclo de vida de estos

protozoarios

Micro-14 1. Explique cómo la longitud de onda y el tiempo de exposición influyen en el

efecto bactericida de luz ultravioleta.2. Describa específicamente cómo la luz UV mata a los microorganismos

3. Explique por qué la luz UV es útil solamente en el control de contaminantessuperficiales y mencione varias aplicaciones prácticas.





4. Investigue de qué manera la radiación ionizante mata a los microorganismosy mencione algunas aplicaciones prácticas.

5. Defina los siguientes términos desinfección, desinfectante y antiséptico6. Mencione por qué los agentes químicos no son efectivos para esterilizar7. Mencione cinco factores que pueden afectar la acción antimicrobiana de

desinfectantes y antisépticos8. Describa los modos de acción de desinfectantes y antiséptico9. Explique por qué los resultados para una prueba in vitro para evaluar agentes

químicos no necesariamente funcionará “ in vivo”

4.2 Preparación de medios de cultivo

MicrM-01.1 Medio enriquecido MicrM-01.2 Medio soya tripticaseína (TSA)

- Suspender 40 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada

- Calentar agitando frecuentemente durante 1 minuto hasta disolver- Esterilizar en autoclave entre 118 y 121 °C durante 15 minutos- Enfriar y vaciar en placas petri

MicrM-01.3 Medio PDA - Disolver 39 g en un litro de agua destilada- Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121 °C- pH final: 3.5

MicrM-04.1 Caldo nutritivo - Disolver 8 g en un litro de agua destilada- Distribuir en tubos de 13 x 100- Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos

MicrM-04.2 Agar nutritivo inclinado - Disolver 20 g en un litro de agua destilada- Distribuir en tubos de 13 x 100- Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos- Dejar solidificar en posición inclinada

MicrM-04.3 Agar nutritivo semisólido - Disolver 10 g en un litro de agua destilada- Distribuir en tubos de 13 x 100- Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos- Dejar solidificar en posición vertical

MicrM-06.1 Agar citrato de Simmon’s - Suspender 24.2 g del medio deshidratado en 1 litro de agua destilada- Calentar agitando frecuentemente hasta ebullición y completa

disolución.- Distribuir en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm.- Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.

- Dejar enfriar los tubos en posición inclinada de manera que el medio decultivo en el fondo del tubo alcance una profundidad de 1 a 1.5 cm.





MicrM-06.2 Agar hierro y lisina - Suspender 33 g del medio deshidratado en 1 litro de agua destilada- Calentar cuidadosamente agitando con frecuencia hasta hervir por 1

minuto- Distribuir el medio en volúmenes de 3 mL, en tubos con tapón de rosca

de 13 x 100- Esterilizar a 121°C durante 12 minutos- Dejar solidificar en posición inclinada y cerrar con cuidado las tapas para evitar pérdida de agua por evaporación pH final: 6.5 +/- 0.2

MicrM-06.3 Medio MIO - Disolver 31 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada- Calentar hasta ebullición- Distribuir volúmenes de 2 - 2.5 mL en tubos de 13 x 100 mm.- Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.- Dejar solidificar en posición vertical.

MicrM-06.4 Rojo de fenol con sacarosa - Suspender y disolver completamente 20 g del polvo en un litro de aguadestilada (en caso de que el medio sea para cultivo de anaerobios, agregar0.5 a1.0 g de agar)- Envasar volúmenes de 2.5 mL en tubos de ensaye de 13x 100- Esterilizar de 116-118 ºC durante 15 minutos. No sobrecalentar

4.3 Preparación de soluciones y reactivos

MicrR-03.1 Cristal violeta Cristal violeta............................2 gAlcohol etílico al 95%...............20 mLOxalato de amonio.....................0.8 gAgua destilada............................80 mL

Disolver el cristal violeta en el alcohol etílico al 95% y filtrar en papel filtro.Disolver el oxalato de amonio en el agua destilada. Mezclar estas soluciones en

partes iguales 24 horas antes de su uso

MicrR-03.2 Solución de lugol Yoduro de potasio.......................2 g Yodo(cristales)............................1.0 g Aguadestilada..............................300 mLDisolver el yoduro de potasio (KI) en el agua destilada. Adicionar loscristales de yodo a la solución de yoduro de potasio y agitar hasta que elyodo se disuelva. Adicionar agua destilada hasta completar el volumende 300 mL

MicrR-03.3 Alcohol acetonaAlcohol etílico al 95%Acetona

Mezclar el alcohol etílico al 95% y acetona en partes iguales





MicrR-03.4 SafraninaSafranina.......................................2.5 gAlcohol etílico al 95%..................1000 mLDisolver la safranina en el alcohol etílico al 95%. Esta solución

constituye la solución stock. En el momento de usarla se diluyen 10 mLde esa solución en 100 mL de agua destilada.

MicrR-08 Solución salina al 0.85%Cloruro de sodio...........................0.85 gDisolver el cloruro de sodio en 100 mL de agua destilada.





Anexo Imágenes

Fig. 1 Cocos Fig. 2 Bacilos

Fig. 3. Etreptococos Fig. 4 Estreptococos

Fig. 5. Estreptobacilos Fig. 6. Estafilococos

Fig. 7 Reacción Gram positiva Fig. 8 Reacción Gram negativa





Fig. 9 Medios de cultivo líquidos Fig. 10 Medios de cultivo inclinados

Fig. 11 Medios de cultivo semisólidos Fig. 12 Medios de cultivo en placa

Fig. 13 Morfología colonial bacteriana





Fig. 14 Hemólisis Beta Fig. 15 Hemólisis alfa Fig. 16 Hemólisis Gamma

Fig. 17 Citrato de Simmon’s Fig. 18 Agar hierro y lisina

Fig. 19 Medio MIO Fig. 20 Rojo de fenol con sacarosa

Fig. 21 Prueba de oxidasa



Manual de Practicas de Mi.crobiologta

74 FACULTAD DE CIE NCIAS QuiMICO BIOLOGICAS/UAS

\

Fig. 22 Euglenofitos y cris6fitos pertenecientes a distintos ordenes

) /

\ Perdnemtt tnchophOtvm (cugleoales)

CntOSJ{ )hon sufcalllll (eug1enales)

Paschoroii:J ysetensis (cr somonadales)

Schyphosphaerl!apst e"'• (cocohiOIOIIClaceas )

')

Chrysosphaercltabrcvrspma

enlasecolon•al

(cnsosferales)



Manual de Practicas de .M icrobiologia

75 FACULTAD DE CJE NCIAS QuiJ:vfiCOBIOLOGICAS /UAS

Fig. 23 Pirrofitos pertenecientes a ordenes y clases distintas

Polykryl<os schwanzi plurinucleado

yplunflagclado (dinoficeas)

\

\

Glenod/nJu m sangv i neum en

tr es tases do su ctcloVl1al

(d<nof<ceas)





Fig. 24 Diseños aerodinámicos de Diatomeas.

Fig. 25 Porphyrium spp, alga roja de agua dulce.

Fig. 26 Phacus longicauda euglenófito deagua dulce.





Fig. 27 Cuerpos fructífero de Aspergillus spp

Fig. 28 Cuerpos fructíferos de Penicillium spp

Fig. 29 Esporangios, esporangióforos y esporangiosporas





Fig. 30 Esporas de Alternaria spp Fig. 31 Esporas de Fusarium spp

Fig. 32 Micrografía electrónica debarrido de esporas de Penicillium spp.

Fig. 34 Unión de hifas paraformar Zigosporas

Fig. 33 Micrografía electrónica debarrido de Aspergillus spp.

Fig. 35 Micrografía electrónica de barridode un esporangio de Rhizopus spp





Fig. 36 Morfología colonial de hongos ( cultivos de Penicillium spp).

Fig. 37 Euplotes spp. Fig. 38 Paramecium





Fig. 39 Trofozoito de Giardia duodenalis

Fig. 40 Trofozoitos de Entamoeba histolytica

Fig. 41 Quiste de Entamoeba histolytica Fig. 42 Quiste de Entamoeba coli




Fig. 43 Chi lomastix mesni l i

Fig. 44 Plasmodium spp en frote sanguíneo Fig. 45 Trypanosoma cruzi

Documents

Manual Microbiología (1)