Manual Laboratorio

Universidad Andrés Bello Facultad de Ciencias Exactas Departamento de Ciencias Químicas

QUIMICA ANALITICA E INSTRUMENTAL (QUI 141)

MANUAL DE LABORATORIO Carreras: Química y Farmacia

Bioquímica Licenciatura en Química

UNAB

Manual de Laboratorio “Química Analítica e Instrumental” QUI141

Departamento de Ciencias Químicas, Facultad de Ciencias Exactas 2

INDICE LABORATORIOS 1. VALORACIÓN POTENCIOMÉTRICA I.……………………………………......6 2. VALORACIÓN POTENCIOMÉTRICA II.………...………………....…………..8 3. VALORACIÓN POTENCIOMÉTRICA III……………………………………... 9 4. CONDUCTOMETRÍA……………………………………………………….........14 5. VOLTAMETRÍA...……………………………….……………………..……….....17 6. ESPECTROSCOPÍA UV-VISIBLE I…………………………………..……........19 7. ESPECTROSCOPÍA UV-VISIBLE II……………................................................24 8. ESPECTROSCOPÍA UV-VISIBLE III………….………………..........................26 9. ESPECTROSCOPÍA ABSORCIÓN ATÓMICA………………….......................28 10. CROMATOGRAFÍA CAPA FINA……………………………………………...30 11. CROMATOGRAFÍA COLUMNA………………………………………..….….35 12. HPLC…………………………………………………………………………........38 13. RECUPERATIVO…………….……………………………………………..……42



Reglamento de Laboratorio 1. El alumno deberá presentarse puntualmente a la hora de inicio del laboratorio. 2. Durante el desarrollo del práctico, es obligatorio el uso del delantal y gafas de seguridad. 3. Es obligación del alumno realizar el total de los laboratorios programados. Sólo se podrá recuperar 1 (uno) laboratorio siempre y cuando la inasistencia sea debidamente justificada, mediante un certificado médico a través de la Dirección

del Departamento de Ciencias Químicas, dentro de las 72 horas siguientes a la ausencia del práctico. La falta del práctico sin justificar A TIEMPO o la ausencia a más de una práctica significa automáticamente un 1.0 en las evaluaciones de control e informe. 4. El alumno es responsable de la destrucción de cualquier material de laboratorio y deberá reponerlo. 5. Como norma de seguridad, los alumnos dejarán sus pertenencias en los taquilleros con candado que se encuentran en el exterior del laboratorio. Por ningún motivo dentro del laboratorio o sobre los mesones de trabajo. 6. Frente al uso de algún reactivo, el alumno debe tomar las precauciones indicadas por el profesor y/o ayudante, como asimismo las señaladas por el fabricante. Ante cualquier duda, más vale preguntar. 7. Se dispondrá de recipientes para los deshechos. ÚSELOS 8. Se recomienda el uso del cuaderno de laboratorio ya que le ayudara a recopilar toda la información realizada en el laboratorio para posteriormente elaborar el informe que se entregará la semana siguiente al laboratorio, el cual será evaluado. 9. La no entrega oportuna del informe será calificada con la nota mínima y significará reprobar el correspondiente práctico. 10. Evaluaciones y ponderaciones se detallan a continuación:

Controles Laboratorio Semanales (CLS): (60 %) Informes de Laboratorio (I): (40%) Nota Presentación: (CLS* 0.60 + I*0.40)

Nota Presentación igual o mayor a 5.0 significa eximición

Examen Teórico: (30 %) Nota Final = (Nota presentación * 0.70) + (Nota examen * 0.30)

11. El examen teórico de laboratorio consistirá en una prueba de 40 preguntas de alternativas, de temas estudiados durante el semestre. 12. El alumno que obtenga una nota inferior a 4.0 se considerará reprobado en la asignatura.



Formato Informe Laboratorio: La letra debe ser Arial o Time New Roman 12, interlineado simple, hoja tamaño carta. 1. Nombre del laboratorio.

Nombre de los autores y número de grupo de trabajo. 2. Introducción (5 Puntos) (Media pagina como máximo).

- Breve explicación de los principios químicos en los que se basa el análisis. - Objetivos del trabajo práctico.

3. Parte Experimental (5 Puntos) - Materiales y reactivos usados. - Métodos y condiciones experimentales. - Descripción de la técnica.

4. Resultados (10 Puntos) - Resumen completo de los datos de pesadas, volúmenes y respuesta del instrumento, necesarios para calcular los resultados. - Cálculos, ejemplos de cálculos y tratamiento de error. - Debe incluir las ecuaciones químicas de las reacciones del análisis, así como también las ecuaciones algebraicas que muestren como se calcularon los resultados. - Presentación de datos: tablas, figuras, gráficos, etc.

5. Discusión (10 Puntos)

- Se deben colocar las reflexiones de los resultados obtenidos basados en el trabajo práctico y en los resultados obtenidos. Estas reflexiones deben ser apoyadas por bibliografía. - Un resumen de las observaciones que apoyan la validez de un resultado en particular o del análisis total.

6. Conclusión (5 Puntos)

Escribir claramente las conclusiones, en forma detallada, que se obtienen a partir de la experiencia realizada en base a los objetivos del trabajo práctico.

7. Bibliografía (5 Puntos) Recomendada: 1. D. Skoog, F, Holler, T. Nieman. “Principios de Análisis Instrumental”; 5ª Edición, Editorial Mc Graw-Hill. 2. D. Harvey, “Química analítica Moderna” Editorial Mc Graw-Hill. 3. K. Rubinson y J. Rubinson, “Análisis Instrumental”. Editorial Prentice Hall. 4. Paginas Web, con fecha y hora de visita. Solo si tienen una editorial asociada. Escala de puntajes:

P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 N 1.2 1.3 1.5 1.6 1.8 1.9 2.1 2.2 2.4 2.5 2.7 2.8 3.0 3.1 3.3 3.4 3.6 3.7 3.9 4.0

P 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 N 4.2 4.3 4.5 4.6 4.8 4.9 5.1 5.2 5.4 5.5 5.7 5.8 6.0 6.1 6.3 6.4 6.6 6.7 6.9 7.0



SEGURIDAD EN EL LABORATORIO Cuando se trabaja en un laboratorio existe el peligro potencial de un ACCIDENTE, en virtud de las sustancias y elementos que se utilizan, y la posibilidad de cometer algún error al realizar un experimento.

SUSTANCIA PELIGROSA + ERROR HUMANO = ACCIDENTE Por eso, cuando se trabaja en el laboratorio, deben tenerse presente una serie de reglas o consejos que disminuyen y en algunos casos logran evitar los accidentes. Como primera regla, para empezar a trabajar:

EL LUGAR DE TRABAJO DEBE ESTAR EN ORDEN

Es conveniente no olvidar estas REGLAS / CONSEJOS entre otros que debe conocer de acuerdo a la práctica que vaya a realizar: 1) INDICACIONES siga todas las indicaciones que le han sido dadas 2) ESTUDIE CADA EXPERIENCIA ANTES DE CLASE Ahorrará tiempo y evitará errores y accidentes innecesarios 3) SEGURIDAD DE SUS COMPAÑEROS El laboratorio es un lugar para trabajar con seriedad. 4) COMUNICAR LOS ACCIDENTES al profesor o ayudante de laboratorio. 5) VERTIDO DE SUSTANCIAS Trabaje con precaución. Avisar al profesor o ayudante de laboratorio si algo se derrama. 6) PREPARACIÓN DE ÁCIDOS DILUIDOS Nunca agregue agua sobre un ácido. Agregue siempre el ácido concentrado, en pequeñas cantidades, sobre el agua y agite continuamente. 7) SUSTANCIAS CORROSIVAS Manipule las mismas con máximo cuidado. 8) NUNCA COMER, BEBER O FUMAR ni apoyar comida sobre la mesa del laboratorio. 9) CABELLO LARGO Atarse el cabello para evitar accidentes con la llama del mechero. 10) SUSTANCIAS CORROSIVAS EN CONTACTO CON PIEL y/u OJOS Lavar inmediatamente con abundante agua. 11) LIMPIEZA DEL MATERIAL Todo el material que se utiliza debe ser limpiado al finalizar el práctico a fin de evitar contaminaciones y/o reacciones no deseadas en posteriores experimentos.



Laboratorio 1

Determinación potenciométrica de la concentración de H3PO4 Objetivos 1. Conocer algunos conceptos teóricos, procedimientos y lenguaje para la medición de pH. 2. Construir una curva de valoración potenciométrica experimental para la determinación de la concentración de H3PO4, por valoración potenciométrica. Introducción

Los métodos potenciométricos de análisis se basan en las medidas del potencial de las celdas electroquímicas en ausencia de corrientes apreciables. Desde hace mucho tiempo las técnicas potenciométricas se han utilizado para la detección de puntos finales en métodos volumétricos de análisis.

El equipo requerido para los métodos potenciométricos incluye un electrodo de referencia, un electrodo indicador y un dispositivo para medir el potencial.

El potencial de un electrodo indicador adecuado se puede utilizar para establecer el punto de equivalencia de una valoración (valoración potenciométrica). El punto final potenciométrico es ampliamente aplicable y proporciona datos más precisos que los métodos que utilizan indicadores. Este tipo de valoraciones es muy útil en la valoración de soluciones coloreadas, turbias y para detectar la presencia de especies insospechadas en solución.

La utilidad del pH como una medida de la acidez o basicidad de un medio acuoso y la amplia disponibilidad de electrodos indicadores de pH (electrodos de vidrio), han hecho que las medidas potenciométricas sean una de las medidas más utilizadas en el análisis químico. Parte experimental Materiales y reactivos

� Bureta de 25 mL � pH metro � Agitador magnético � Barra magnética � Pipeta aforada de 10 mL � Matraz aforado de 100 mL � Probeta de 100 mL � Pizeta con agua destilada � Vaso precipitado de 150 mL � NaOH 0.1 mol/L, estandarizada previamente � Buffer estándares (pH 4 y 7) � Muestra problema (H3PO4)

Procedimiento experimental 1. Calibre el medidor de pH con soluciones buffer estándares (pH 7 y 4). Lave y seque el electrodo cuidadosamente cada vez que cambie de solución. 2. Mida exactamente 10 mL de H3PO4 y viértala en un matraz de 100 mL, lleve con agua destilada al volumen total.



3. Tome una alicuota de 10 mL de la solución preparada y viértala en el vaso precipitado de 150 mL. Añada 75 mL de agua destilada. Introduzca la barra magnética e instale el vaso sobre el agitador magnético. Agite suavemente. Sumerja el electrodo en la solución. 4. Anote el pH inicial. Valore con la solución de NaOH que se halla en la bureta graduada adicionando 0.5 mL cada vez, anote el valor de pH después de cada adición. Continúe hasta pH 12. Tabule volumen de NaOH versus pH. 5. Grafique pH versus Volumen (en mL) de solución de NaOH y determine en forma aproximada el punto de equivalencia de la solución. 6. Repita dos veces la valoración, reduciendo el volumen de las alícuotas a 0.2 mL en las cercanías del punto de equivalencia (1 o 2 mL antes y después de la zona de inflexión de la curva). 7. Construya una tabla que incluya: pH (o E), ∆pH/∆V, ∆2pH/∆V2 y Volumen de NaOH (mL). 8. Grafique cada conjunto de datos versus volumen de NaOH agregado. 9. Calcule el volumen final (punto final) para la muestra. 10. Determine gráficamente el volumen del punto final. Grafico 2º derivada. 11. Con todos los datos obtenidos calcular la concentración del ácido problema en: g de ácido fosfórico en los 100 mL de solución. 12. Calcule el valor de pKa1, Ka1, pKa2 y Ka2 del H3PO4. 13. Establezca los equilibrios involucrados.



Laboratorio 2 Determinación potenciométrica de la concentración de HCl y H3PO4 en una mezcla Objetivos 1. Aprender el uso, cuidado y calibración de un electrodo medidor de pH. 2. Determinación de la concentración de HCl y H3PO4, en una mezcla, por valoración potenciométrica. Parte experimental Materiales y reactivos

� Bureta de 25 mL � pH metro � Agitador magnético � Barra magnética � Pipeta aforada de 10 mL � Probeta de 100 mL � Pizeta con agua destilada � Vaso precipitado de 150 mL � NaOH 0.1 mol/L, estandarizada previamente � Buffer estándares (pH 4 y 7) � Muestra problema (HCl – H3PO4)

Procedimiento experimental 1. Calibre el medidor de pH con soluciones buffer estándares (pH 7 y 4). Lave y seque el electrodo cuidadosamente cada vez que cambie de solución. 2. Mida exactamente 10 mL de una mezcla de HCl-H3PO4 y viértala en un vaso de 150 mL. Añada 75 mL de agua destilada. Introduzca la barra magnética e instale el vaso sobre el agitador magnético. Agite suavemente. Sumerja el electrodo en la solución. 3. Anote el pH inicial. Valore con la solución de NaOH adicionando 0.5 mL cada vez, anote el valor de pH después de cada adición. Continúe hasta pH 12. Tabule volumen de NaOH versus pH. 4. Grafique pH versus Volumen (en mL) de solución de NaOH y determine en forma aproximada el punto de equivalencia de la solución. 5. Repita dos veces la valoración, reduciendo el volumen de las alícuotas a 0.2 mL en las cercanías del punto de equivalencia (1 o 2 mL antes y después de la zona de inflexión de la curva). 6. Construya una tabla que incluya: pH (o E), ∆pH/∆V, ∆2pH/∆V2 y Volumen de NaOH (mL). 7. Grafique cada conjunto de datos versus volumen de NaOH agregado. 8. Calcule el volumen final (punto final) para la muestra. 9. Determine gráficamente el volumen del punto final. Grafico 2º derivada 10. Calcule la molaridad y normalidad del HCl y del H3PO4 en la mezcla. 11. Establezca los equilibrios involucrados.



Laboratorio 3 Determinación potenciométrica del contenido de iones cloruro y de iones fluoruro

usando un electrodo selectivo de iones (ISE) Objetivos 1. Conocer el manejo, mantenimiento y aplicaciones de electrodos selectivos de iones, ISE. 2. Construir curvas de calibración típica aplicables en potenciometría directa. 3. Se analizarán muestras de enjuagatorio bucal para la determinación de ión fluoruro. 4. Construir una curva de valoración potenciométrica experimental para la determinación de la concentración de Cl– en una muestra de vino, expresada como ppm de NaCl, en la cual se utiliza un electrodo selectivo de iones cloruro como electrodo indicador. Introducción

Los Electrodos Selectivos de Iones (ISE, por sus siglas en inglés) son dispositivos relativamente simples y económicos que, al sumergirse en una solución, desarrollan un potencial eléctrico cuya magnitud depende selectivamente de la concentración (en rigor, de la actividad) de un tipo de ión en particular, aún en presencia de otros iones en la solución.

Cuando este electrodo selectivo es utilizado conjuntamente con un electrodo de referencia, se forma una celda electroquímica cuyo potencial permite conocer la actividad de este ión particular realizando una calibración apropiada.

El ISE contiene en su estructura un sensor electroquímico, que consiste en una membrana de composición especial que permite establecer un equilibrio de intercambio iónico en forma selectiva con el ión analito al cual se aplica.

En el límite entre las fases membrana-solución se produce una distribución de cargas, la cual es responsable del potencial eléctrico. La magnitud de este potencial depende de la posición del equilibrio de intercambio iónico, la cual depende, a su vez, de la actividad de los iones “seleccionados” en esta zona límite, llamada interfase del electrodo.

Estos electrodos han encontrado una amplia gama de aplicaciones, que incluyen áreas como análisis de laboratorio, control de procesos industriales, mediciones en el campo de la fisiología, monitoreo ambiental, monitoreo de aguas residuales, control de calidad en alimentos, agricultura y pesca, diagnóstico médico, control de calidad en industrias farmacéuticas y de cosméticos.

Además, en titulaciones potenciométricas, estos electrodos amplían la aplicabilidad de esta técnica a una gran variedad de reacciones donde participan especies químicas para las cuales no existen electrodos apropiados basados en transferencias de electrones.

El electrodo selectivo de Fluoruro quizás sea el electrodo de estado sólido más común, está basado en la utilización de un cristal de fluoruro de lantano impurificado con europio (II). En este caso, la impurificación (o dopaje) consiste en añadir pequeñas cantidades de Eu(II) en vez de La(III). La solución de relleno interna del electrodo consiste en NaF y NaCl 0.1M. Su fundamento consiste en que el ión fluoruro en solución está selectivamente absorbido en las dos caras del cristal; por lo que los iones F− pueden moverse a través del cristal de LaF3. Al impurificar el LaF3 con EuF2 se producen lagunas reticulares de aniones en el cristal. Esto provoca que un ión F−

de un sitio adyacente a un hueco pueda saltar a éste, dejando a su vez un nuevo hueco en el



sitio que ocupaba. Así el fluoruro puede migrar de un lado a otro de la membrana y establecer una diferencia de potencial entre las caras del cristal, necesaria para el funcionamiento del electrodo. La respuesta del electrodo de ión F− viene dado por la ecuación:

Eind = K − 0.059log (F−)

Esta respuesta es casi Nernstiana (cumple la ecuación de Nernst) para un intervalo de concentración comprendido entre aproximadamente 10−6

y 1 M. Es importante que el pH sea controlado ya que a pH menores de 5 se forma HF o HF2−

los cuales no pueden ser detectados por el electrodo. Se utiliza un amortiguador de fuerza iónica (TISAB) para ajustar la fuerza iónica y el pH (± 5) de las muestras y patrones a un mismo valor. Parte experimental A) Materiales y reactivo. Determinación de Fluoruro

� Medidor de pH capacitado para mediciones con electrodos selectivos de iones (Ionómetro)

� Electrodo específico de ion fluoruro � Electrodo de referencia Ag/AgCl de doble puente salino (solución de relleno

externa: KNO3) � Agitador magnético, barrita magnética y extractor � Bureta de 25 mL � Vasitos plásticos desechables de 50 mL � Pipeta volumétrica de 25 mL � Matraz aforado de 250 mL � 6 Matraces aforados de 50 mL � Solución stock patrón de F− de 100 ppm (preparada a partir de NaF p.a. seco) � Amortiguador de ajuste de fuerza iónica (TISAB). Esta solución se vende

comercialmente. Se puede preparar en el laboratorio mezclando 57 mL de ácido acético glacial, 58 g de NaCl, 4 g de EDTA y 500 mL de agua destilada en un vaso de 1 L. Enfriar en un baño de hielo y agregar cuidadosamente NaOH 6 M hasta un pH de 5.0 – 5.5 y diluir a 1 litro. Guardar en frasco plástico.

B) Materiales y reactivos. Determinación de Cloruro ♦ Bureta de 25 mL, con su soporte y pinzas de sujeción. ♦ pH metro – potenciómetro ♦ Electrodo selectivo de iones cloruro, con referencia externa incorporada ♦ Agitador magnético ♦ Barra magnética ♦ 2 Matraces aforados de 100 mL ♦ Pizeta con agua destilada ♦ Vasos precipitado de 100 y 250 mL ♦ Probeta graduada de 50 mL ♦ Pipeta graduada de 5 mL ♦ Solución estandarizada de AgNO3 0.02 mol/L ♦ Soluciones 0.0100 – 0.100 – 0.500 mol/L de NaCl para calibración ♦ Solución 1.0 mol/L de KNO3, reguladora de fuerza iónica para la calibración (ISAB) ♦ Muestra problema de vino tinto



A) Procedimiento Experimental 1. Dependiendo del nivel de la concentración esperable en la muestra, prepare una curva de calibración para ion fluoruro (el tramo de concentraciones puede variar). 2. Para la determinación en un tramo diluido prepare 250 mL de una solución patrón de F− de 10 ppm por dilución de la solución estándar de 100 ppm y a partir de ésta prepare un conjunto de matraces con soluciones patrón que contengan 0.4, 1.0, 2.0, 4.0 y 5.0 ppm de F−. Utilice matraces aforados de 50 mL a los que se añaden 25 mL de solución TISAB. 3. Las muestras también deben contener la proporción correspondiente de TISAB (50%). 4. Después de enjuagar bien introduzca los electrodos en el estándar de 5.0 ppm (vaso plástico), agite durante 3 - 5 minutos hasta alcanzar un valor de equilibrio, registre el potencial. Repita con los estándares restantes y con la muestra. 5. Trace un gráfico de potencial versus log concentración de los estándares. Determine la ecuación y el coeficiente de regresión. (Analice la ecuación). 6. Utilice esta ecuación para determinar la concentración en ppm de F− en la muestra problema (esta concentración deberá ser corregida por la dilución que ha sufrido la muestra por efecto del TISAB). 7. Haga repeticiones para la determinación de la muestra (soluciones diferentes). 8. ¿Como se podría llevar a cabo una determinación mediante adición de estándar? Investigue como podría efectuarse una medición por lectura directa en el instrumento (calibración del instrumento para la medición de F−). 9. Escriba la ecuación que describe la relación entre potencial y concentración para un electrodo de F−. 10. ¿Por qué debemos efectuar las mediciones a una temperatura constante? 11. ¿La sensibilidad del electrodo de fluoruro es apropiada? 12. ¿Porqué el pH del TISAB debe mantenerse en el rango 5.0 - 5.5? 13. ¿Cómo funciona el control de la fuerza iónica? B) Procedimiento experimental Calibración del potenciómetro 1. Calibre el potenciómetro con las soluciones de NaCl para calibración (pCl 2.00 -1.00

y 0.301): ♦ Vierta 50 mL de cada una de las soluciones calibradoras en los vasos de 100 mL y

adicione 2.0 mL de la solución ISAB. ♦ Coloque el vaso sobre el agitador magnético, provisto de su barra magnética,

introduzca el electrodo combinado ISE – referencia y gradúe la velocidad de agitación de manera que no se produzcan turbulencias (remolinos).

♦ Después de espera unos segundos para la estabilización de la lectura del potencial, registre y anote su valor en mV.

♦ Lave y seque el electrodo cuidadosamente cada vez que cambie de solución. 2. Confeccione la curva de calibración correspondiente:

Grafique E de la celda medida en (mV) versus C, o bien, E de la celda medida en (mV) versus pCl ó – log [Cl–].

3. Calcule las pendientes ∆E / −log C, en mV/década de C en los dos intervalos de concentraciones (0.0100 M – 0.100 M y 0.100 M – 0.500 M).



Preparación para la titulación 4. Mida exactamente 100 mL de la muestra de vino tinto (matraz aforado de 100 mL) y viértala en un vaso de precipitados de 250 mL. Enjuague el remanente de muestra en el matraz con agua destilada, arrastrándolo hacia el vaso de precipitados. 5. Prepare el conjunto para la valoración potenciométrica: bureta con su soporte y pinza – agitador magnético. Coloque el vaso con la muestra de vino sobre el agitador, introduzca con cuidado la barra magnética y sumerja el electrodo combinado ISE – referencia en la solución. 6. Inicie la agitación magnética, aumentando gradualmente la velocidad, hasta alcanzar una agitación sin formación de remolinos. Titulación “gruesa” 7. Valore con la solución de AgNO3 0.02 mol/L adicionando porciones de 1.0 mL cada vez. Espere que la lectura de potencial se estabilice (10 a 15 seg) y anote el valor estabilizado, en mV. 8. Continúe las adiciones y anotaciones hasta alcanzar el volumen de titulante que produce el salto de potencial, y agregando posteriormente 5 ó 6 porciones de 1.0 mL de titulante adicionales. 9. Tabule volumen de AgNO3 versus potencial, en mV y confeccione la curva de E versus volumen de AgNO3 de la titulación “gruesa” realizada. Inspeccione el gráfico resultante, tomando nota cuidadosa del rango de volúmenes en que se ubica la elevación pronunciada (salto) del potencial, designando el volumen de punto de equivalencia aproximado que se obtiene. Titulación “fina” 10. Repita la titulación, pero ahora de la siguiente manera:

♦ Inicie adicionando porciones de 1.0 mL de solución de AgNO3 0.02 mol/L hasta un volumen equivalente 1.0 mL anterior al del punto de equivalencia aproximado asignado en (7), esperando cada vez la estabilización y anotando la lectura de potencial.

♦ Enseguida, continúe la titulación, pero ahora adicionando volúmenes de 0.1 (0.2) mL cada vez, anotando las lecturas de potencial estabilizadas.

♦ Realice estas adiciones de titulante y lecturas de potencial estabilizado hasta alcanzar un volumen de titulante equivalente a 1.0 mL posterior al del punto de equivalencia asignado en (7).

♦ Finalice la titulación agregando posteriormente 5 ó 6 porciones de 1.0 mL titulante adicionales, anotando los potenciales estabilizados.

Tratamiento de los datos. 11. Con los valores obtenidos en la titulación “fina” construya una tabla con las siguientes columnas: Volumen de AgNO3 (mL) – E(mV) – ∆vol – ∆E – ∆E/∆vol – ∆E(∆pCl)/∆vol – ∆

2E(∆2pCl)/∆vol2.

12. Grafique E (mV); ∆E/∆vol y ∆2E/∆vol2 versus volumen de AgNO3 agregado.

Determine el volumen correspondiente al punto de equivalencia en cada uno de los gráficos. 13. A partir del volumen de equivalencia obtenido del gráfico de segunda derivada, ∆

2E/∆vol2 versus volumen de titulante, calcule el contenido de iones cloruro en la

muestra de vino, expresándolo en ppm de NaCl.



Laboratorio 4

Valoración conductométrica de una mezcla de ácido fuerte y ácido débil y de precipitación

Objetivos 1. Aprender el uso, cuidado y calibración de un conductímetro. 2. Determinación conductométrica del punto final en la valoración de una mezcla de un ácido fuerte y un ácido débil con NaOH. 3. Determinación conductométrica del punto final en la valoración por precipitación de cloruro de potasio con nitrato de plata. Introducción

La conductividad es el recíproco de la resistencia y sus unidades más comunes son Ohms y Siemens. Las determinaciones de la conductividad reciben el nombre de determinación conductométricas.

La conductancia de una solución varía con el número, tamaño y carga de los iones y con algunas características del solvente, como la viscosidad. Además, del área (A) y la distancia (l) de las placas, es decir, depende del electrodo (o celda) que se esté utilizando. Así, para independizar la medida, se debe determinar previamente la constante de la celda (Θ = distancia/área), la cual es específica para cada electrodo. Si a través del tiempo, el área o la distancia de las placas varían, se obtendrá otro valor de conductividad.

Para determinar la constante de la celda generalmente se utilizan soluciones de KCl patrón de concentración exactamente conocida, se desgasan y se termostatizan a 25ºC. Luego se busca en tablas la conductividad específica (k) de estas soluciones y se calcula:

Θ = Conductividad específica (k, ohms/ cm)

Conductividad medida (L, ohms)

Para medir la conductividad de una disolución se debe usar corriente alterna, ya que la corriente continua produce cambios en la superficie del electrodo y/o en la disolución, debido a reacciones electroquímicas. Estas reacciones pueden producir depósitos que modifican el área del electrodo y/o pueden generar o consumir iones que varían la conductividad.

Los electrodos más comunes en las medidas de conductividad son los de platino. Para aumentar el área efectiva conviene “platinizarlos”, lo que se consigue depositando electroquímicamente una fina película de platino finamente dividido sobre ellos. Otra opción son los electrodos de grafito.

La medida de conductividad se utiliza mucho como criterio de pureza del agua desionizada y destilada, ya que es de alta sensibilidad. El “agua de conductividad” (grado 1), presenta una conductividad específica menor de 10−7 ohms/cm. El agua destilada, en equilibrio con CO2 atmosférico, tiene una conductividad específica del orden de 10-6 ohms/cm. En general, una buena pureza se

KCl (N) Conductividad específica (ohms/cm) a 25ºC 0.02 0.002765 0.01 0.001413



obtiene bidestilando agua de una solución de KMnO4 alcalina y recogiendo la porción intermedia, todo esto en corriente de N2.

La medida de conductividad puede ser útil en la detección del punto final de una valoración, ya que la variación de concentración de las diferentes especies a lo largo de la valoración se traduce en variación en la conductividad de la disolución. Si en el punto de equivalencia se producen cambios bruscos en la conductividad del medio, esto puede ser aprovechado para detectar el punto final de la valoración graficando: Conductividad vs Volumen de valorante agregado.

En el caso de la valoración de una base fuerte (ej. NaOH) con un ácido fuerte (ej. HCl) grafico Nº 1, la curva tiene la siguiente forma:

En el primer tramo la conductividad disminuye debido a que se está cambiando el protón por el ion sodio, que tiene menor movilidad. En el segundo tramo la conductividad aumenta drásticamente, ya que se están agregando iones Na+ y OH− en exceso. En todo la valoración lo milimoles de Cl− no varían.

El gráfico Nº 2 muestra la valoración de una mezcla de ácidos, fuerte y débil (HCl y HAc), con base fuerte. En el primer tramo se está reemplazando un ion H+ por un ion Na+, de menos movilidad, por lo que se observa una disminución drástica de la conductividad. En el segundo tramo, la conductividad aumenta, paulatinamente, ya que aparece en la disolución el anión acetato, Ac−, además del catión Na+, que se está agregando. En el tramo final, la conductividad aumenta con una pendiente mayor, lo que se debe a la presencia, en exceso, de los iones Na+ y OH−. Los milimoles de Cl− no varían.

Grafico Nº 1 Grafico Nº 2

La curva de la Figura 1 es típica de las titulaciones por precipitación. La pendiente de la porción inicial de la curva, puede ser positiva o negativa, dependiendo de la conductancia relativa del ion que está siendo determinado y el ion de igual carga del reactivo que lo sustituye. Una pendiente negativa producirá una curva de titulación con forma de V que provee una definición más precisa del punto final. Por consiguiente, es preferible elegir un reactivo en el cual la conductancia iónica del ion no-reactivo sea menor que la del ion que se titula.

En la figura se ilustra la titulación de cloruro de potasio con nitrato de plata. Los volúmenes agregados iniciales de reactivo producen una sustitución de iones cloruro por los iones nitrato del reactivo, resultando de ello una leve disminución de la conductancia. Después del punto de equivalencia, se produce un rápido aumento debido al volumen agregado en exceso de nitrato de plata.



Figura 1 Los métodos conductimétricos basados en reacciones de precipitación o

formación de complejos no son tan útiles como aquellos que involucran procesos de neutralización. Los cambios en la conductancia durante estas titulaciones raramente son tan grandes como los observados en las reacciones ácido-base puesto que ningún otro ion se aproxima a la conductancia del ion hidronio u hidroxilo. Factores tales como la lentitud de la reacción y la coprecipitación representan otras fuentes de dificultad en las reacciones de precipitación. En las valoraciones conductimétricas no importan los valores absolutos de la conductividad, ya que éstos desplazan la curva en el eje Y, sin que esto afecte el volumen del punto de equivalencia, eje X. Lo que sí es indispensable es realizar la corrección por la dilución:

Lcorregido = Lmedido x (Volumen inicial + Volumen agregado)

Volumen inicial

Parte experimental Materiales y reactivos

� Bureta de 25 mL � Pipeta volumétrica de 10 mL � Matraz aforado de 50 mL � Vaso precipitado de 100 mL � Conductímetro � Agitador magnético � Barra magnética � Soporte universal � Mariposa (pinza para buretas) � Pizeta � Propipeta � Solución de NaOH 0.1 mol/L, estandarizada previamente � Muestra Problema de HCl-HAc � Solución de AgNO3 0.01 mol/L, estandarizada previamente � Solución problema de KCl



Procedimiento experimental 1. Mida exactamente 10 mL de solución problema y diluya exactamente a 50 mL en un matraz aforado. Vierta en un vaso de 100 mL y anote el volumen final. 2. Instale el vaso sobre el agitador magnético. Coloque la celda de conductividad de modo que quede totalmente sumergida. Ajuste la velocidad de la agitación de forma tal que no produzca turbulencias. 3. Encienda el equipo y espere a que se estabilice. Con ayuda de su profesor seleccione la escala apropiada. 4. Tabule volumen en mL versus Conductancia Corregida. Anote la lectura inicial. Valore adicionando alícuotas de 0.5 mL de valorante, hasta completar 10-12 mL agregados (o lectura inicial). 5. Retire la celda y lave los electrodos. Valore una nueva alícuota con incrementos de 0.1 mL de valorante. 6. Tabule: Volumen, Conductancia leída, Conductancia corregida.

Cond. Corregida = Cond. Leída x VolTotal

VolInicial

7. Grafique Conductancia corregida versus volumen de NaOH. Defina los puntos de equivalencia de forma gráfica. 8. Grafique Conductancia corregida versus volumen de AgNO3. Defina el punto de equivalencia de forma gráfica. 9. Calcule la concentración de las especies en las soluciones valoradas en Molaridad.



Laboratorio 5

Voltamperometría del ferricianuro potásico en disolución acuosa de cloruro potásico

Objetivos 1. Aprender el uso de un equipo Voltamétrico. 2. Estudiar el comportamiento electroquímico del ferricianuro potásico en disolución clorurada. Introducción

Las medidas voltamperométricas son metodologías electroanáliticas en las que la información cualitativa y cuantitativa del analito se determina a partir de la medida de intensidad de corriente en función del potencial aplicado a un electrodo de trabajo, dependiendo del tipo de perturbación de potencial y de otras condiciones experimentales se pueden separar en varias técnicas: Polarografia, Voltametría lineal y cíclica, Voltametría de pulso normal, Voltametría de onda cuadrada y Voltametría de pulso diferencial.

En el presente práctico nos centraremos en la técnica de voltametría cíclica y consiste en aplicar una señal de potencial triangular (un ciclo) sobre un electrodo estacionario y sin agitación. El ciclo suele hacerse varias veces y los potenciales en los que se da el cambio se llaman potenciales de inversión. Estos se escogen de acuerdo a cuando se produce la oxidación o reducción del analito. Esta técnica permite estudiar la cinética de las reacciones, detectar especies intermedias, etc.

Se estudia el comportamiento electroquímico del ferricianuro potásico en disolución clorurada, mediante voltamperometría cíclica de barrido lineal y, también, por potenciometría, con el objeto de obtener información cinética y termodinámica del equilibrio:

[Fe(CN)6]K

3 + 1 ē + K+ ↔ [Fe(CN)

6]K

4 (1)

La cinética de reducción voltamperométrica del ferricianuro está controlada por

difusión en las condiciones experimentales de trabajo, por lo que se puede estimar un coeficiente de difusión voltamperométrico, mediante la expresión:

ipc(mA) = 65190 D1/2 c v

1/2 |Epc – Ep/2|

−1/2 (2)

En la que D es el coeficiente de difusión del ferricianuro (en cm2.s

−1), c

(mol.L−1

) es la concentración de ferricianuro, ipc, es la intensidad del pico catódico, Epc, es el potencial de pico catódico, Ep/2, es el potencial que corresponde a la mitad de la

intensidad de pico catódico, y v es la velocidad de barrido (en mV.s−1

). Parte experimental Materiales y Reactivos:

� 1 celda electroquímica � 1 agitador magnético � 1 barrita magnética � 1 termómetro � 1 equipo de Voltametría



� 2 pipetas aforadas: de 2 mL y 10 mL � 1 electrodo de referencia del tipo Ag/AgCl/KCl (3 mol/L) � 1 electrodo de Pt de disco (de área conocida) � 2 electrodos de Pt de placa � KCl 1 M � [Fe(CN)6]K3 0.17 mol/L � [Fe(CN)6]K4 0.25 mol/L � NH3 10% (para la limpieza de los electrodos)

Procedimiento experimental

Determinación potenciométrica del potencial formal, E’

1. Introducir 15 mL de KCl 1 mol/L y 3 mL de [Fe(CN)6]K3 0.17 mol/L en la celda

electroquímica. 2. Seguidamente se introducen, los electrodos de Pt (1 cm2), de referencia y la barrita agitadora. 3. Hacer adiciones sucesivas de 0.5 mL de [Fe(CN)6]K4

0.25 mol/L.

4. Se realiza la primera adición de ferrocianuro potásico, se agita con la barrita la disolución, y se realiza por triplicado la medida de F.E.M. pulsando el botón de “mV”, tres veces (sin agitación de la disolución) y tomando las medidas cuando su lectura se ha estabilizado. 5. La operación se repite 7 veces, hasta completar un total añadido de 3.5 mL de ferrocianuro potásico. El potencial E’ se determina a partir de la ley empírica de Nernst:

F.E.M. = E’ + (RT/nF) ln (CFe

III/CFeII)

(3)

Representando los valores de F.E.M. frente a ln (CFe

III/CFeII), para lo cual es necesario

medir previamente la temperatura de la disolución. Determinación voltamperométrica del coeficiente de difusión, D

1. Se introducen 15 mL de KCl 1 mol/L y 3 mL de ferricianuro potásico [Fe(CN)6]K3

0.17 mol/L. 2. Se monta la celda electroquímica como en el caso anterior, introduciendo, además, un electrodo auxiliar consistente en dos de Pt (1cm2) conectados. 3. Los tres electrodos se conectan al equipo de voltametría. Se fijan en éste los potenciales límites: el catódico a −300 mV y, el anódico, a +800 mV. 4. Seguidamente se realizan voltamperogramas cíclicos, en sentido catódico, para cada una de las velocidades de barrido siguientes: 500, 400, 300, 250, 200, 150, y 100 mV s-1 (se comienza por la menor velocidad de barrido). 5. Se registran los correspondientes voltamperogramas y, teniendo en cuenta las escalas de intensidad y de potencial, se miden las magnitudes iP, EP, y EP/2, tanto del pico catódico como del anódico. 6. El coeficiente de difusión del ferricianuro se obtiene mediante la ecuación (2), a partir

de la representación de iPc frente a (v / |Epc

– Ep/2|)

1/2. 7. La reversibilidad voltamperométrica de este proceso se puede constatar si se comparan entre sí las magnitudes medidas directamente en ambos picos.



Laboratorio 6

Determinación del contenido de fósforo por Espectrofotometría Objetivos 1. Análisis del contenido de fósforo en una muestra real mediante espectrofotometría UV – Visible. 2. Aplicación de métodos de cuantificación haciendo uso de curvas de calibración y de adición estándar. Introducción

La espectrofotometría, especialmente en la región visible se utiliza a menudo como método de análisis. Muchas sustancias pueden convertirse en derivados coloreados y, por lo tanto, pueden ser analizados en la región visible del espectro electromagnético.

La radiación electromagnética se puede considerar como una forma de energía radiante que se propaga como onda transversal con un movimiento ondulatorio. La distancia entre las ondas se describe en términos de longitud de onda (λ). La región visible es una parte muy pequeña del espectro electromagnético y se extiende desde el ultravioleta cercano, 380 nm hasta aproximadamente 780 nm.

La cantidad de radiación absorbida por una especie química se puede relacionar con la concentración de la sustancia que se analiza, mediante la Ley de Beer.

A = k b C Donde: A = absorbancia C = concentración del analito b = el paso óptico k = la constante de proporcionalidad.

La constante de proporcionalidad k se denomina absortividad (a) si la concentración de la sustancia a analizar se expresa en gramos/litro y absortividad molar ( ε ) si la concentración del analito se expresa en moles/litro.

Es posible realizar cálculos cuantitativos cuando dos especies absorbentes de la solución tienen espectros que se superponen. De acuerdo con la ley de Beer, la absorbancia total de una mezcla a determinada longitud de onda, será igual a la suma de las absorbancias individuales de las especies que absorben.

En la mayoría de los análisis químicos se mide la respuesta del procedimiento analítico a cantidades conocidas de analito (llamadas patrones o estándares) y basándose en ellas se puede interpretar la respuesta a una muestra de contenido desconocido. Para este fin se prepara una curva de calibrado, que es un gráfico que muestra la respuesta de un método analítico en función de cantidades conocidas de analito.

Las disoluciones que contienen concentraciones conocidas de analito se llaman disoluciones patrón o estándar. Las disoluciones que contienen todos los reactivos y disolventes usados en el análisis, pero sin analito, se llaman disoluciones blanco o simplemente blancos. Los blancos miden la respuesta del procedimiento analítico a las impurezas o especies interferentes que existan en los reactivos.



La curva de calibrado descrita, que se construye obteniendo la respuesta del método frente a soluciones de analito exactamente conocidas y crecientes, se denomina curva de calibración de patrón externo. Para determinar la concentración de analito en una muestra problema se grafica directamente “señal vs concentración de analito”. Es deseable que la señal de la muestra problema se encuentre en la zona lineal de la curva.

Curva de calibrado de patrón externo

Señal

Concentración El método de adición patrón consiste en añadir cantidades conocidas de analito

a la muestra problema, cuyo contenido en analito se quiere determinar. A partir del aumento de señal se deduce cuánto analito hay en la muestra problema. Este método requiere una respuesta lineal frente al analito.

Este método es especialmente apropiado cuando la composición de la muestra es desconocida o compleja y afecta a la señal analítica. La matriz es todo lo que hay en la muestra problema además del analito. Se define como efecto de matriz el cambio que experimenta una señal analítica por todo lo que hay en la muestra además del analito. La composición de la matriz afecta la magnitud de la señal analítica. Puede ser que la matriz contenga componentes desconocidos que, como tales es imposible incluir en las disoluciones patrón al construir la curva de calibrado. Si se agrega un volumen pequeño de solución concentrada de patrón a una muestra desconocida, no varía significativamente la concentración de la matriz, esto debido a que la matriz ejerce el mismo efecto sobre el mismo analito añadido que sobre el que hay en la muestra problema.

Señal Curva de calibrado de adición patrón

Volumen de patrón añadido

Zona Lineal

Señal

Señal de la muestra sin patrón añadido



Así, para determinar la concentración del analito en la muestra problema se puede utilizar el gráfico anterior donde se gráfica directamente la señal vs el volumen añadido de disolución estándar:

CMP = b CSt

m VMP Donde:

b = intercepto CSt = concentración del estándar m = pendiente VMP = volumen añadido de la muestra (mL)

Parte experimental Materiales y Reactivos:

� Espectrofotómetro de doble haz UV-Vis � Cubeta de 1 cm de paso óptico � Matraces aforados de 50 mL � Matraces aforados de 100 mL � Bureta de 10 mL � Pipeta aforada de 10 mL � Propipeta � Pipeta graduada de 10 mL � H2SO4 concentrado � Solución patrón stock de fósforo de aproximadamente 100 mg/L � Solución A: Molibdato de amonio con tartrato de antimonio y potasio en H2SO4

5 N � Solución B: Solución A más ácido ascórbico

Parte experimental Método de curva de calibración

1. A partir de la solución patrón stock de fósforo, preparar la solución patrón de 10 mg/L de fósforo de la siguiente manera:

� Tomar 10 mL de la solución patrón stock de fósforo. � Colocar la alícuota anterior en un matraz aforado de 100 mL. � Aforar con agua destilada y homogenizar.

2. Preparar una curva de calibración de fósforo, cinco puntos, en el rango 0.2 mg/L a 1 mg/L de la siguiente manera.

� Tomar 5 matraces aforados de 50 mL y colocar en ellos 1, 2, 3, 4, y 5 mL de la solución de fósforo de 10 mg/L.

� Agregar agua destilada hasta aproximadamente la mitad de volumen total del matraz.

� Adicionar 8 mL de la solución B y agitar por rotación, suavemente. � Diluir y enrasar cada matraz con agua destilada. � Homogeneizar cada solución.



Preparación de la muestra problema

1. Colocar 10 mL de la solución obtenida de la muestra problema en un matraz de 50 mL. 2. Agregar agua destilada hasta aproximadamente la mitad de volumen total del matraz. 3. Adicionar 8 mL de la solución B y agitar por rotación. 4. Enrasar cada matraz con agua destilada. 5. Homogeneizar cada solución. Preparación de un blanco

Colocar 8 mL de la solución B en un matraz de 50 mL y llevar a volumen con agua destilada. Medidas

1. Esperar 60 min para el desarrollo de color de cada una de las soluciones preparadas anteriormente. 2. Medir la absorbancia para cada una de las soluciones preparadas en el espectrofotómetro, a una longitud de onda de 882 nm. 3. Construir una tabla con los valores de absorbancia para cada una de las soluciones de la curva de calibración, del blanco y de la muestra problema. 4. Graficar y calcular la ecuación de la recta por medio de mínimos cuadrados, así como el coeficiente de correlación. 5. Las medidas se deben realizar en orden creciente de concentración empezando por el blanco e intercalando la solución problema. Método de adición estándar

1. A una serie de 4 matraces aforados agregue, a cada uno de ellos, una misma alícuota de solución de muestra problema. Durante el práctico su profesor le dirá qué volumen de muestra problema debe agregar. 2. Añadir ahora, volúmenes crecientes de la solución estándar de fósforo (0, 1, 2 y 3 mL). 3. Agregar agua destilada hasta aproximadamente la mitad de volumen total del matraz. 4. Adicionar 8 mL de la solución B y agitar por rotación suavemente. 5. Diluir y enrazar cada matraz con agua destilada. 6. Homogeneizar cada solución. 7. Preparación de un blanco. Colocar 8 mL de la solución B en un matraz de 50 mL y llevar a volumen con agua destilada. Medidas

1. Esperar 60 min para el desarrollo de color de cada una de las soluciones preparadas anteriormente. 2. Medir la absorbancia para cada una de las soluciones en el espectrofotómetro, a una longitud de onda de 882 nm. 3. Construir una tabla con los valores de absorbancia para cada una de las soluciones de la curva de calibración, del blanco y de la muestra problema. 4. Graficar y calcular la ecuación de la recta por medio de mínimos cuadrados, así como el coeficiente de correlación. 5. Determinar la concentración de fósforo (mg/L) en la muestra problema.



Laboratorio 7

Determinación de ácido acetilsalicílico por Espectrofotometría Ultravioleta Objetivos 1. Establecer el espectro de absorción del ácido acetilsalicílico (AAS) en HCl 0.05 molar. 2. Determinar el rango de respuesta lineal en una curva de calibración de AAS en HCl 0.05 molar. 3. Determinar la concentración de ácido acetilsalicílico en una muestra problema. Introducción La espectrofotometría o espectroscopía ultravioleta es aplicable al análisis de analitos que absorban radiación electromagnética en longitudes de onda correspondientes a la región ultravioleta, aproximadamente entre 180 y 350 nm. La mayoría de los analitos que presentan la propiedad de absorber en la región ultravioleta son moléculas con dobles enlaces y reciben el nombre de cromóforos. Parte experimental Materiales y reactivos

� Espectrofotómetro de doble haz UV-Vis � Cubetas de cuarzo 1 cm de paso óptico � Bureta de 25 mL � Matraces aforados de 25 mL � Pipeta aforada de 2 mL � Matraz aforado de 50 mL � HCl 0.05 mol/L � Ácido acetilsalicílico patrón � Muestra problema (diferentes tipos de aspirinas) � Mortero � Estufa � Vaso de precipitados de 50 mL � Pesa sales � Desecadora � Balanza analítica � Papel filtro � Embudo

Procedimiento Experimental Muestra Problema: Determinación del % de Humedad

1. Moler la muestra problema en un mortero. 2. Pesar la muestra problema molida (aprox. 0.2 g) en un vaso de precipitados de 50 mL o en un pesa sales, previamente pesado y seco, registre su masa con balanza analítica, y lleve a estufa a 105ºC durante 2 horas. 3. Luego retire de la estufa y coloque el vaso de precipitados o pesa sales en el desecador y deje enfriar. Anote el peso de la muestra.



Preparación de la muestra problema

1. Pese una tableta de aspirina en balanza analítica. 2. Pulverice la tableta en el mortero y pese aprox. 175 mg de muestra y disuélvalos en HCl 0.05 molar, luego filtre el volumen total directamente en un matraz de aforo de 25 mL. Una vez preparada esta solución, se toman 2 mL y se llevan a un matraz de aforo de 50 mL. Preparación de la curva de calibración:

1. Utilice una solución estándar de ácido acetilsalicílico (1.0 x 10−3 mol/L) para preparar 5 soluciones, en un rango de 7.0 x 10−4 a 2.0 x 10−5 molar, utilizando HCl 0.05 molar como disolvente en un volumen de 25 mL.

Tabla 1.- Preparación de soluciones de curva de calibración

N° solución Concentración (*10−4) mol/L

Volumen (mL)

1 7.0 2 4.0 3 1.0 4 0.6 5 0.2

2. Calibre el instrumento según instrucciones. Use el disolvente con el que preparó las soluciones como blanco. 3. Tome la solución 3 y determine la longitud de onda máxima del ácido acetilsalicílico en el disolvente utilizado. Para ello mida la absorbancia de la solución entre 350 y 250 nm con un intervalo de 1 nm. 4. Grafique Absorbancia vs Longitud de onda. 5. Determine gráficamente la longitud de onda máxima del ácido acetilsalicílico. 6. Determine la absorbancia de cada una de las soluciones preparadas a la longitud de onda máxima. 7. Grafique Absorbancia vs Concentración. 8. Determine la concentración de la muestra problema. 9. Compare la longitud de onda máxima encontrada con la longitud de onda del ácido acetilsalicílico informada en bibliografía. 10. Exprese sus resultados en base seca con la humedad determinada experimentalmente. 11. Exprese sus resultados en base a la muestra real (tableta, mg de ácido acetilsalicílico). 12. Compare los valores de la concentración de su muestra problema, obtenidos desde la curva de calibración y el valor dado por el fabricante.



Laboratorio 8

Determinación de la concentración de Co (II) y Ni (II) por Espectrofotometría Visible

Objetivos 1. Estudiar los principios de la espectrofotometría visible. 2. Conocer las características de operación de un espectrofotómetro. 3. Determinar la concentración de Co (II) y Ni (II) en una mezcla. Introducción

La absorbancia es una propiedad aditiva, es decir, en disoluciones que contengan más de una especie absorbente la absorbancia total es la suma de las absorbancias individuales de cada especie absorbente. Suponiendo que no haya interacción entre las distintas especies absorbentes (es decir, que estas sean independientes entre sí), la absorbancia total para un sistema absorbente multicomponente 1, 2, 3,... n, cuyas absorbancias individuales sean A1, A2, A3,....An viene dado por:

A TOTAL = Σ A i = A1 + A2 + A3 +.......... + An

A i = ε1bC1 + ε2bC2 + ε3bC3 + …………εnbCn

Parte experimental Materiales y reactivos

� Bureta de 10 mL � Matraces aforados de 50 mL � Matraces aforados de 25 mL � Espectrofotómetro UV-Visible � Celdas � Pizeta � Soluciones patrón de Co(II) y Ni(II) 0.5 mol/L � Muestra Problema

Procedimiento Experimental Espectro de Absorción

1. A partir de una solución estándar y mediante dilución apropiada prepare una solución de Cobalto (II) 0.075 molar y una solución de Níquel (II) 0.100 molar en matraces volumétricos de 50 mL. 2. Prepare una solución mezcla de concentración 0.100 molar en Co (II) y 0.050 molar en Ni (II) en un volumen final de 50 mL. 3. Utilizando el equipo, seleccione el rango de barrido en (nm) que Ud. desea analizar (370 a 550 nm, con un intervalo de 1 nm). 4. Mida la absorbancia de las soluciones de Co (II), Ni (II) y de la mezcla de ambos, que Ud. ha preparado. 5. El equipo le entregará un gráfico de absorbancia (A) vs longitud de onda para Co (II), Ni (II) y de la solución mezcla de ambos. Los gráficos de absorbancia vs longitud de onda se conocen como espectros de absorción. A partir de este espectro determine los valores de longitud de onda para cada solución y la mezcla.



Curva de calibración

1. Mediante diluciones apropiadas de la solución estándar, prepare 5 soluciones de Co (II) y 5 soluciones de Ni (II) de concentraciones comprendidas entre 0.15 y 0.02 molar para un volumen final de 25 mL. Debe disponer además, de una solución mezcla problema que se le proporcionará.

Tabla 1.- Preparación de soluciones

N° solución Concentración

(mol/L)

Volumen (mL)

1 0.15 2 0.10 3 0.08 4 0.04 5 0.02

2. Del espectro de absorción de cobalto y del espectro de Níquel seleccione 2 longitudes de onda de tal forma que:

o Absorbancia máxima para Cobalto, absorbancia mínima para Níquel (Razón ACo/ANi máxima).

o Absorbancia máxima para Níquel, absorbancia mínima para Cobalto (Razón ANi/ACo máxima).

3. En el equipo realice las lecturas de absorbancia para cada una de las soluciones de Co (II), Ni (II) y su muestra problema, desde la solución más diluida a la más concentrada en cada caso. Para ambas longitudes de onda seleccionadas anteriormente. 4. Grafique A vs concentración para cada solución a cada una de las longitudes de onda utilizadas. En total tendrá 4 gráficos: dos para cobalto y dos para níquel. 5. De los gráficos de la ley de Beer, calcule el valor de la pendiente y el coeficiente de absortividad molar (ε). 6. Calcule la concentración de cada componente en la solución problema, aplicando la Ley de Beer y la propiedad de aditividad de la absorbancia en una mezcla. Exprese sus resultados en gramos/litro (g/L), molar (moles/litro) y ppm (mg/L).



Laboratorio 9 Determinación de la concentración de Cobre por Espectrofotometría de Absorción

Atómica Objetivos 1. Conocer el funcionamiento de un equipo de absorción atómica. 2. Determinar la concentración de Cobre en una muestra. 3. Analizar los métodos de curva de calibración y de adición estándar. Introducción

La característica especial de la Espectroscopía de Absorción Atómica, (EAA) es que la muestra debe atomizarse. Esto se hace normalmente con una llama, horno calentado eléctricamente o un plasma de radiofrecuencia. La sensibilidad y los efectos de interferencia que se observan en la espectroscopia de Absorción Atómica dependen de los detalles del método de calentamiento.

En la atomización de la muestra mediante una llama la combinación más común de combustible y oxidante es acetileno/aire. Cuando se requiere de mayor temperatura puede utilizarse una combinación de acetileno/óxido nitroso. Los hornos calentados eléctricamente (hornos de grafito) presentan una mayor sensibilidad y necesitan un menor volumen de muestra.

La medición de Absorbancia en espectroscopia de Absorción Atómica se rige por la Ley de Beer. Aunque en la práctica a menudo se encuentran desviaciones de la linealidad, esto no constituye un obstáculo para trabajar con curvas de calibración empíricas.

Cuando no es posible eliminar las interferencias de matriz se puede utilizar el método de adición estándar, técnica que permite trabajar en presencia de un interferente, realizando una determinación correcta del analito. Con esta técnica es posible determinar más de 60 elementos. Parte experimental Materiales y Reactivos

� Equipo de Absorción Atómica � Estándar de Cu de 1000 ppm � Ácido nítrico al 5% v/v � Bureta de 10 mL � Matraces aforados de 50 y 100 mL � Pipetas aforadas de 10 y 25 mL � Pizeta � Propipeta � Muestra problema de Cu � Agua potable

Procedimiento Experimental Curva de calibración de patrón externo 1. Averigüe el rango de respuesta lineal para cobre (puede utilizar el manual del equipo). 2. A partir de la solución estándar de 1000 ppm prepare una solución de 100 ppm. 3. Prepare un conjunto de 5 soluciones de cobre de: 1; 2; 3; 4 y 5 ppm, utilizando ácido nítrico al 5% v/v para diluir y la solución de 100 ppm como patrón.



4. Opere el equipo de acuerdo a instrucciones del operador. Lea la absorbancia de las soluciones. 5. Grafique Absorbancia vs Concentración y determine el rango lineal. 6. Determine el contenido de cobre en una muestra problema. Curva de calibración de Adición de Estándar Prepare las siguientes soluciones: 1. Mida exactamente 25 mL de agua potable y enrase a 50 mL con ácido nítrico 5% v/v. 2. Mida exactamente 25 de agua potable y 2.5 mL de la solución de 5 ppm de Cobre y enrase a 50 mL con ácido nítrico 5% v/v. 3. Mida exactamente 25 de agua potable y 5 mL de la solución de 5 ppm de Cobre y enrase a 50 mL con ácido nítrico 5% v/v. 4. Mida exactamente 25 mL de agua potable y 10 mL de la solución de 5 ppm de Cobre y enrase a 50 mL con ácido nítrico 5% v/v. 5. Determine la absorbancia de las nuevas soluciones. 6. Grafique y determine la concentración de la cobre en agua potable de acuerdo a esta técnica. 7. Comente los resultados obtenidos en las soluciones analizadas. Aplique la forma gráfica y el cálculo con la formula utilizada para la absorción atómica.

Así, para determinar la concentración del analito en la muestra problema se puede utilizar el siguiente gráfico:

Señal Curva de calibrado de adición patrón

Volumen de estándar añadido

Esta forma en la que se puede determinar la concentración del analito en la muestra problema consiste en graficar directamente la señal vs el volumen añadido de disolución estándar:

CMP = b CSt

m VMP Donde:

b = intercepto CSt = concentración del estándar m = pendiente VMP = volumen añadido de la muestra (mL)

Señal

Señal de la muestra sin patrón añadido



Laboratorio 10

Separación de Aminoácidos por Cromatografía en Capa Fina Objetivos 1. Conocer la técnica de cromatografía en capa fina, sus características y factores que en ella intervienen. 2. Calcular los valores de Rf de varias sustancias. 3. Deducir, mediante los valores de Rf, la relación que existe entre la polaridad de las sustancias que se analizan y la de los eluyentes utilizados. 4. Aplicar la técnica de Cromatografía de Capa Fina como criterio de pureza de las sustancias. 5. Aplicar la técnica de Cromatografía de Capa Fina (TLC) como criterio parcial de identificación de sustancias. 6. Adquirir destreza de aplicación de muestras sobre cromatofolios. 7. Utilizar métodos físicos y químicos de localización de manchas. 8. Determinar la composición cualitativa de una muestra problema. Introducción

La cromatografía en capa fina (TLC), es un método analítico versátil, sensible en alto grado y rápido para separar en forma bien definida compuestos estructuralmente parecidos. El mecanismo de separación predominante es el de adsorción, pero también se puede dar el mecanismo de reparto, intercambio iónico, inclusión o una combinación de éstos, dependiendo de la fase estacionaria utilizada. Es una técnica muy usada con la que se logra la separación de sustancias de naturaleza hidrofílicas o hidrofóbicas.

La muestra aplicada en la placa es adsorbida en la superficie del material por la acción de fuerzas electrostáticas. Luego, cuando la placa es expuesta a un flujo por acción capilar, se inicia una competencia de enlace entre los sitios activos del adsorbente y la sustancia con el disolvente. Una vez aplicada la muestra sobre el cromatofolio se coloca en una cámara cromatográfica, la cual contiene la mezcla de disolventes adecuada para el desarrollo de la cromatografía, según se muestra en la figura. La técnica de cromatografía en capa fina permite:

� Determinar el grado de pureza de un compuesto. � Comparar muestras. � Realizar el seguimiento de una reacción. � Controlar el contenido de las fracciones obtenidas en una cromatografía en

columna. � Separar los componentes de una muestra, entre otros.



Los adsorbentes más utilizados en la cromatografía de capa fina son: � Sílica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones) � Óxido de aluminio o alúmina (ácida, neutra o básica) � Tierra silícea o Kieselguhr � Celulosa (nativa o microcristalina) � Poliamidas

Las características a tomar en cuenta para la elección correcta de los adsorbentes son: Tamaño de partículas

� Volumen de poro � Diámetro de poro � Área superficial

Homogeneidad

Se usan como soporte del adsorbente laminas de: vidrio, plástico o metálicos (ejemplo: aluminio).

Los tamaños de la placa para cromatografía en capa fina convencional son: 20 cm x 20 cm, 10 cm x 20 cm y 5 cm x 2 cm.

En la separación cromatográfica, el disolvente, el adsorbente y los compuestos de la mezcla que se está separando, interaccionan entre si y constituyen el sistema cromatográfico.

En la cromatografía de adsorción y reparto es muy importante la relación entre la velocidad de movimiento del soluto y la velocidad del movimiento del disolvente de desarrollo expresado mediante el Coeficiente de Reparto, Rf, el cual se define como:

Rf = Velocidad de movimiento del soluto

Velocidad de movimiento de la fase estacionaria

Si la fase estacionaria y el soluto empiezan a moverse al mismo tiempo, la

relación anterior se puede expresar en función de las distancias recorrida por cada uno según:

Rf = Distancia recorrida por el soluto

Distancia recorrida por el solvente

El Rf se calcula en base a la relación de la distancia recorrida por el solvente y la distancia recorrida por la muestra, como se muestra en la figura: Frente de disolvente Posición final del Compuesto 2.5 cm Rf = 1.8 cm = 0.72

2.5 cm

1.8 cm

Origen



El valor de Rf, siempre es menor o igual a 1, depende de las condiciones experimentales como identidad y composición de las fases estacionarias y móviles, temperatura, estructura química de los compuestos que se separan, pero es independiente del tiempo y dimensiones de la placa. Generalmente se corren las muestras junto con estándares sobre la misma placa en las mismas condiciones para poder comparar los Rf.

Es posible afirmar que: sustancias que poseen diferentes valores de Rf son distintas, siempre que se desarrollen en idénticas condiciones, pero no es posible asegurar que dos manchas con igual Rf correspondan a la misma sustancia. Se deben realizar otras pruebas para tener certeza de que son esas manchas.

Después del desarrollo de la cromatografía, la placa cromatográfica se retira de la cámara, se marca con un lápiz el frente del disolvente y se deja al aire hasta que se seque o se ayuda con un ventilador o secador de cabello o en un horno. Si los solutos son coloreados se verán a simple vista su localización. Si los solutos son incoloros hay que localizarlos por métodos especiales. Dentro de los métodos para localizar los solutos se tienen:

1. Métodos químicos 2. Métodos físicos 3. Radiactividad 4. Métodos biológicos y enzimáticos Dependiendo del tipo de analito a estudiar se podrán emplear diferentes

sustancias químicas para revelarlas. Por ejemplo: para aminoácidos se puede utilizar ninhidrina, para ácidos se puede realizar un revelado selectivo mediante un indicador ácido-base, utilizando la técnica de bañado.

Parte experimental Materiales y Reactivos

� Regla graduada � Lápiz grafito � Placa cromatográfica (Sílica gel) � Papel filtro � Secador de pelo* � Placas para cromatografía de 10x20 cm (cromatofolios) � Cámara cromatográfica � Capilares de vidrio � Tubos de ensayo � Gradilla para tubos � Aspersor � Estufa de secado a 105ºC � n-Propanol � NH4OH 34 % � Ácido acético glacial � n-Butanol � Agua destilada � Solución de ninhidrina (0.2% en etanol) � Solución de Yodo � Sulfato de amonio al 20%, acidificada con H2SO4 � Soluciones estándares de aminoácidos (AA)



� Muestra problema de aminoácidos Procedimiento experimental Sembrado de muestras y patrones de caracterización. 1. Se trabajará con una muestra problema de aminoácidos la cual será entregada por el Profesor. 2. Marcar línea de origen con lápiz grafito y con cuidado de no levantar la sílice, a una distancia de 1 cm desde el borde inferior del cromatofolio. 3. Realizar en el cuaderno una tabla en la que se indica el orden de sembrado como se indica a continuación: Siendo AAn, el estándar n de AA.

Placa Posición 1

Posición 2 Posición 3 Posición 4

1 AA1 AA2 MP AA3 2 AA4 AA5 MP AA6

4. Tomar un capilar para cada estándar y otro para la muestra, identificarlos. 5. Sembrar patrones y muestras, de manera que cada punto de aplicación diste 0.5 cm de los bordes y 1 cm entre sí. 6. Para la aplicación de los estándares y muestras, se debe introducir un capilar en la solución a sembrar y esperar que el nivel del líquido llegue a la marca correspondiente. El líquido se deposita con cuidado en la placa tocando la misma, manteniendo el capilar en posición perpendicular. Después de cada toque se debe esperar que se seque la mancha para volver a sembrar, para evitar la difusión en el origen. Preparación de la cámara cromatográfica 1. Preparar la mezcla de solventes adecuada según los componentes de la muestra a analizar para desarrollar la cromatografía. Su profesor le ayudará en este punto. 2. Colocar en la cámara cromatográfica la fase móvil anteriormente preparada, cuidando que el nivel de líquido no supere los 0.8 cm de altura. 3. Colocar un papel de filtro por alrededor de la cámara cromatográfica de forma de ayudar a saturar la misma más rápidamente. Desarrollo del cromatograma 1. Colocar la placa preparada con las muestras sembradas y tapar la cámara lo más rápido posible. 2. Una vez que el frente del solvente se encuentra a 1 cm del borde superior de la misma, retirar las placas, marcar el frente del solvente con un lápiz de grafito. 3. Dejar secar el solvente. Este proceso se puede acelerar secando la placa en estufa o con un secador de cabello. Estándares y disolventes para la cromatografía 1. Se usarán estándares de: glicina, arginina, histidina, alanina, triptofano y ácido glutámico. 2. Se utilizarán las siguientes mezclas de disolventes:

a. Fase móvil 1: n-Propanol: NH4OH 34% (7:3) b. Fase móvil 2: n-Butanol: Ácido acético glacial: Agua (6:2:2)



Localización de las manchas y Revelado Los aminoácidos se revelarán asperjando la placa cromatográfica con una

solución de ninhidrina. Este es el revelador clásico de los aminoácidos. Aparecerán manchas de color violeta, azul y amarilla, según sea el aminoácido estudiado. Una vez desarrollada la cromatografía: 1. Se coloca la placa bajo campana. 2. Se pulveriza la placa con la solución de ninhidrina. 3. Se deja secar al aire. 4. Trasladar las placas asperjadas con ninhidrina a una estufa a 105ºC, y dejar 5 minutos la placa en la misma. 5. Al cabo de ese tiempo las manchas de aminoácidos empezarán a aparecer de colores. Importante: La ninhidrina es cancerígena, por lo cual se debe tener precaución de

asperjar las placas cromatográficas utilizando guantes y lentes, las mismas deben ser

colocadas dentro de la campana. La localización de las manchas en la placa de cromatografía dependerá del

problema que se tiene en estudio. En forma general si se tiene un problema desconocido se procede en la siguiente secuencia: 1. Si se ha utilizado placas fluorescentes se observan éstas a la luz UV 254 nm. En los lugares en que en la placa aparece oscura se marca pues ahí hay un componente de la muestra. 2. Luego se introduce la placa en una cámara de yodo. Al cabo de 10-60 minutos, la mayoría de sustancias orgánicas aparecen como manchas pardas. 3. Otro revelador sería pulverizar las placas con una solución de sulfato de amonio al 20% acidificado con ácido sulfúrico. Las placas se calientan a 180ºC y las sustancias orgánicas se carbonizan. 4. Si se tienen información de los componentes de la muestra problema entonces se pueden utilizar reveladores específicos según el tipo de sustancias a identificar Identificación y conclusiones 1. Estudiar las características de las manchas, tales como: color, forma, tamaño, etc. 2. Medir las distancias que separan el frente de solvente y cada mancha del origen. 3. Calcular los Rf para los patrones y los diferentes componentes contenidos en la muestra problema. 4. Discutir y concluir sobre la composición de la muestra. 5. Discutir sobre la resolución obtenida de la muestra utilizando las mezclas de solventes indicadas.



Laboratorio 11

Cromatografía en columna. Análisis de tintas Objetivos 1. Aplicación de técnicas sencillas de laboratorio para el análisis de tintas presentes en lápices. 2. Conocer la técnica de cromatografía en columna, sus características y los factores que en ella intervienen. 3. Separar los componentes de una muestra problema.

Introducción

La cromatografía en columna se utiliza para la separación de mezclas o purificación de sustancias a escala preparativa. Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de sílice o alúmina dentro de una columna. La elección del solvente es crucial para una buena separación. Dicho solvente pasa a través de la columna por efecto de la gravedad o bien por aplicación de presión.

La columna se prepara mezclando el soporte con el disolvente en un vaso, formando así una pasta con la cual se rellena la columna. A la columna, se le coloca en el fondo un poco de algodón o lana de vidrio, para lograr que la sílica o la alúmina queden retenidas en ella y el disolvente pase a través de la misma hasta que la columna quede enrasada de soporte hasta el nivel requerido y con solvente sobre su superficie, como lo muestra la figura.

A continuación se introduce la muestra por la parte superior de la columna y se

eluye con el solvente elegido, recogiéndose, por lo general, en tubos de ensayo las fracciones que eluyen de la misma.

La principal ventaja de la cromatografía de capa fina frente a la de columna, es que permite analizar diversas muestras y estándares de manera simultánea y que, cuando las muestras son difíciles de resolver, pueden desarrollarse con dos sistemas de solventes distintos en sentido perpendicular.

En estos laboratorios se realizarán dos tipos de cromatografía: Cromatografía en capa fina y cromatografía en columna. Cada una de ellas posee una fase estacionaria y una fase móvil. El concepto primordial es que los componentes de una mezcla se debatirán entre la afinidad que tienen por la fase estacionaria, y la afinidad que tienen por la fase móvil. Por lo tanto, cada uno de ellos interaccionará de una manera diferente



y viajarán a través de estas fases con diferente rapidez, lo que provoca la separación de los componentes en la mezcla. Parte experimental Materiales y Reactivos

� Lápiz tinta Azul, Verde, Roja y Negro � Tubos de ensayos � Espátula � Gradilla � Varilla de vidrio � Vaso de precipitados de 100 y 250 mL � Probeta de 100 mL � Soporte universal � Nuez � Mariposa (pinza para buretas) � Columna para cromatografía � Pipeta Pasteur � Sílica gel G para columna � Diclorometano � Hexano � Ácido acético glacial � Etanol � Muestra problema

Procedimiento Experimental 1. Traspasar la solución obtenida del lápiz tinta disuelta en diclorometano a un tubo de ensayo cuidando de que no pasen partículas sólidas. 2. Tomar una columna cromatográfica e introducir un trozo de lana de vidrio dentro de la columna ayudándose con la varilla de vidrio. 3. Sujetar la columna en posición vertical en un soporte universal y añadir hexano en la columna. 4. En un vaso de precipitados preparar una suspensión de sílica gel (de 15 a 20 g) en hexano e introducir en la columna. 5. Dejar escurrir el solvente en un vaso de precipitados o tubo de ensayos. Se observará la formación de una columna de sílica gel a medida que escurre el solvente, dicha columna no debe quedar NUNCA sin solvente. 6. El goteo de la columna no debe ser ni muy rápido ni muy lento. 7. La altura de la columna de sílica gel debe alcanzar entre 10 y 15 cm de alto. Una vez que alcance esta altura, se deja escurrir el solvente hasta que su nivel quede al ras de la capa de sílica gel (sin que ésta se seque). 8. Tomar, con una pipeta Pasteur, aproximadamente 1 mL de la muestra problema a analizar y sembrar en la columna. 9. Una vez que se halla incorporado la muestra, ésta se hace entrar a la columna abriendo la llave de la misma de forma, de modo que quede otra vez el nivel al ras de la sílica gel. 10. En este momento se agrega hexano, suavemente y con una pipeta Pasteur. 11. A medida que avance la cromatografía, se observará la separación de los distintos pigmentos contenidos en la muestra problema a lo largo de la columna, a medida que pasa el solvente.



12. Cuando una banda de pigmentos se acerque al extremo inferior del tubo de vidrio, colocar en la salida del mismo un tubo de ensayo y recoger el pigmento así separado. 13. Se colectará cada fracción de acuerdo al color observado en diferentes tubos de ensayo. 14. Si apareciera alguna fracción que no eluya, se debe comenzar a formar un gradiente en polaridad con un disolvente más polar que el utilizado inicialmente (primero etanol y después una mezcla de etanol: ácido acético glacial 1:1). 15. Los tubos de ensayos que contienen las fracciones colectadas se colocan en un baño de agua a 100ºC en la campana de extracción para concentrar el extracto obtenido. 16. Las fracciones concentradas obtenidas se analizan mediante cromatografía de capa fina para determinar su pureza o composición. 17. Preparar una cámara cromatográfica con etanol y dejarla saturar mientras se siembra el cromatofolio con cada una de las fracciones obtenidas y con los extractos originales. 18. Desarrollar la placa como se indicó anteriormente y observar los resultados. Identificación y conclusiones 1. Estudiar las características de las manchas, tales como: color, forma, tamaño, etc. 2. Medir las distancias que separan el frente de solvente y cada mancha del origen. 3. Calcular los Rf para los patrones y los diferentes componentes de las muestras problemas contenidos en la misma. 4. Discutir y concluir sobre la composición de la muestra. 5. Discutir sobre la resolución obtenida de la muestra utilizando las mezclas de solventes indicadas.



Laboratorio 12 Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC). Determinacion de Teofilina en

una muestra problema Objetivos 1. Conocer y manejar un equipo HPLC. 2. Determinar el contenido de Teofilina en una muestra problema. Introducción

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna utilizada frecuentemente en Bioquímica y Química Analítica.

Es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica.

En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeñas partículas redondeadas con ciertas características químicas en su superficie) mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna.

El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser eluído de la columna se denomina tiempo de retención y se considera una propiedad identificativa característica de un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria. La utilización de presión en este tipo de cromatografías incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro la columna y reduce así su difusión dentro de la columna mejorando la resolución de la cromatografía. Los disolventes más utilizados son el agua, el metanol y el acetonitrilo.

El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el ácido trifluoroacético, que ayudan a la separación de los compuestos.

Un estándar interno (IS) es una sustancia que se añade a todas las muestras en una cantidad constante. La calibración supone representar la razón entre la señal del analito y la del estándar interno como una función de la concentración del analito.

El estándar interno puede compensar distintos tipos de errores indeterminados y sistemáticos. Si el IS y el analito responden proporcionalmente a los errores instrumentales y fluctuaciones del método, la razón entre las señales es independiente de las fluctuaciones.

La mayor dificultad es encontrar un IS adecuado, con señal reproducible y que genere una señal similar a la del analito. Parte experimental Materiales y reactivos

� Cromatografo HPLC � Fase móvil (30:70 = Metanol:Agua) � Patrón de Teofilina � Patrón de Teobromina (Estándar interno) � Metanol Calidad HPLC � Agua Milli-Q o Nanopure � Matraces aforados 50 mL



Procedimiento Experimental Determinación de la concentración de Teofilina, en una muestra problema

• Trabajando con una fase móvil isocrática (30:70 = Metanol:Agua), a un flujo de 1 mL/min y utilizando una longitud de onda de detección de 260 nm, se determinará la concentración de teofilina en una muestra problema, utilizando el método de estándar interno (10 ppm de teobromina), por interpolación en una curva de calibración, previamente medida usando patrones de teofilina de 5, 10, 15, 20 y 25 ppm.

Influencia del flujo de fase móvil

• Trabajando con el patrón de 10 ppm de teofilina, una fase móvil isocrática (30:70 = Metanol:Agua), a un flujo de 1 mL/min y utilizando una longitud de onda de detección de 260 nm, trabajar a los siguientes flujos de fase móvil :

mL/min

0.8 0.9 1.0 1.1 1.2

1. Analice como influyen los flujos de fase móvil sobre los tiempos de retención y la resolución de las señales cromatográficas. 2. Calcular la resolución de las señales y la selectividad en cada flujo. 3. Determine el número de platos teóricos promedio y la altura de los platos de la columna cromatográfica. 4. ¿Qué condiciones debe cumplir una fase móvil?

Material Adicional Curva de calibración con patrón interno Un patrón interno es un compuesto, diferente del analito, que se agrega en cantidad conocida y constante a la muestra y a los patrones. La señal del analito se compara con las del patrón interno para determinar la cantidad de analito presente en la muestra. La aplicación satisfactoria de una calibración con estándar externo o del método de adición de patrón depende de la capacidad del analista para manipular de forma reproducible las muestras y los patrones. Cuando no es posible controlar un procedimiento para que todas las muestras y patrones reciban el mismo procedimiento se ven afectadas la exactitud y la precisión de las medidas. Los patrones internos son especialmente útiles cuando la cantidad de muestra analizada o la respuesta del instrumento varían algo de experiencia a experiencia, por razones que son difíciles de controlar. Una curva de calibración sólo es válida si se mantiene el conjunto de condiciones como se obtuvo. Los patrones internos son muy utilizados en cromatografía debido a que la pequeña cantidad de muestra que se introduce en el cromatógrafo no es muy reproducible en algunos experimentos. También son útiles cuando se pueden dar pérdidas de muestra durante la preparación de la muestra antes del análisis (etapa pre – analítica). Si se agrega una cantidad conocida de patrón interno a la muestra antes de cualquier tratamiento, la relación patrón interno a analito se mantiene constante, ya que se pierde la misma fracción de ambos en cualquier operación.



Si una disolución contiene un analito a una concentración CA y un patrón interno a una concentración CPI, la señal producida por el analito, SA, y la producida por el patrón interno, SPI, serán:

AAA CkS =

PIPIPI CkS = Donde kA y kPI, son respectivamente, las sensibilidades del analito y del patrón interno. El cociente entre las dos señales será:

PI

A

PI

A

PI

A

PI

A

C

CK

C

C

k

k

S

S⋅=⋅=

De esta forma si se grafica SA/SPI en función de la concentración de analito, la pendiente estará dada por K/CPI.

SA/SPI

Concentraciónanalito

Curva de calibrado de patrón interno

pendiente = K/CPI

Ejemplo: En el análisis de un hidrocarburo C7 se añadió un compuesto afín como estándar interno a cada uno de los patrones y a la muestra. A continuación se muestran los datos obtenidos:

Porcentaje de analito Área del pico Analito

Área del pico Patrón Interno

0.05 18.8 50.0 0.10 48.1 64.1 0.15 63.4 55.1 0.20 63.2 42.7 0.25 93.6 53.8

Muestra 58.9 49.4



Determinar la concentración del hidrocarburo en la muestra. Debido a que se grafica área del pico del analito/área del pico del patrón interno en función de la concentración del analito, se calcula área del pico del analito/área del pico del patrón interno:

AA/API Concentración de analito (%) 0.376 0.05 0.750 0.10 1.151 0.15 1.480 0.20 1.740 0.25 1.192 Muestra

Son estos los gráficos que se obtienen:

y = 6,916x + 0,062

0

0,5

1

1,5

2

0 0,1 0,2 0,3

[Hidrocarburo]/%

Aan

ali

to/A

patr

ón

in

tern

o

Para calcular la concentración del hidrocarburo en la muestra se reemplaza y = 1.192 (AA/API con los datos obtenidos para la muestra)

bmxy +=

062.0916.6 += xy

%163.0916.6

062.0192.1=

−=muestraC



Laboratorio 13

RECUPERATIVO

Espectrofotometría de Absorción Molecular Visible Objetivos 1. Conocer la instrumentación y el manejo de un espectrofotómetro. 2. Obtener, interpretar y calcular el rango de concentraciones de trabajo en un espectro. 3. Utilizar métodos de cuantificación por curva de calibración y de adición estándar. Introducción

En la figura se muestra la radiación que atraviesa una solución de una especie

absorbente de concentración c y b cm de espesor. A causa de la interacción entre los fotones y las partículas absorbentes, la potencia del haz se atenúa de P0 a P. La transmitancia T de la solución es entonces la radiación incidente transmitida por la solución. También se expresa a la transmitancia como un porcentaje de la siguiente forma: Otra magnitud común para expresar la cantidad de luz absorbida es la absorbancia (A), la cual esta definida por: A diferencia de la transmitancia, la absorbancia de una solución aumenta cuanto mayor sea la atenuación de P haz.

0P

PT =

TA log−=

100%0

xP

PT =



Parte experimental Materiales y Reactivos

� Equipo espectrofotómetro de doble haz UV-Visible � Cubeta de 1 cm de paso óptico � Matraces aforados de 50 mL � Matraces aforados de 100 mL � Bureta de 10 mL � Pipeta aforada de 5 y 10 mL � Propipeta � Vaso precipitado de 250 mL � Pizeta � CuSO4

.5H2O patrón � NH3

Procedimiento Experimental A. Espectros de absorción de una solución Complejo Cu-Amoniacal, Cu(NH3)4

2+ Se dispone en el laboratorio de las siguientes soluciones:

- Solución de CuSO4 0.079 molar = 5,0 g/L Cu2+

- Solución de amoniaco 2.6 molar 1. Preparar una solución de complejo amoniacal de Cu2+ de 0.5 g/L por dilución de una solución de Cu2+ de 5,0 g/L y mediante la adición de amoniaco para obtener una concentración final de 0.26 mol/L. 2. Realizar un barrido automático de longitudes de onda entre 400-800 nm para el complejo. Menú barrido. 3. Observar el espectro obtenido en el espectrofotómetro de doble haz. 4. Establecer la longitud de onda de máxima absorbancia en su equipo y la A de la solución de 0.5 g/L. 5. Con los datos obtenidos de A para la solución de 0.5 g/L calcular los rangos de concentración para preparar una curva de calibración en la zona de menor error (20 y 70% T). 6. Diseñar un esquema de dilución para preparar 5 puntos para la curva de calibración. B. Ley de Beer: Curva de calibración Se va a comprobar si las sustancias bajo estudio obedecen la Ley de Beer al graficar la absorbancia vs concentración, para una serie de soluciones con diferentes concentraciones conocidas. El ancho de la cubeta (1 cm) y la longitud de onda se mantiene constante. Prepare las soluciones previamente determinadas. 1. Ajuste el 0 de absorbancia colocando solución blanco en el haz de medición. 2. Medir A (%T) para cada una de las soluciones preparadas anteriormente. 3. Registrar los datos de A vs C en una tabla confeccionada en su cuaderno. 4. Graficar y calcular la ecuación de la recta por ajuste de mínimos cuadrados. Determinar el coeficiente de correlación. 5. Preparar la muestra problema en forma similar a las soluciones estándares. 6. Medir la A de la muestra problema en forma inmediata, un mínimo de 4 repeticiones e interpolar su concentración. 7. Calcular la concentración de la muestra recibida, considerando la dilución efectuada.



C. Método de adición estándar 1. Preparar una batería de 4 matraces aforados y a cada uno de ellos agregue un volumen igual de solución de la muestra. 2. Al primero aforarlo directamente después de agregarle el amoniaco. 3. A los siguientes matraces aforados, agregarles volúmenes crecientes de solución estándar de Cu2+ (1, 2, 3 mL) y después de agregar amoniaco enrasar con agua destilada. 4. Medir la A de cada una de estas soluciones. 5. Con los valores de A obtenidos, calcular la ecuación lineal de A vs mL de estándar agregados, donde el intercepto lo denominaremos α y la pendiente β. La concentración buscada para la muestra es:

Donde:

α = intercepto CSt = concentración del estándar β = pendiente VMP = volumen añadido de la muestra (mL)

CÁLCULOS

1. Calcular la concentración de la muestra problema 2. Realizar su muestra por triplicado, de modo de poder calcular la media, la

desviación estándar y el coeficiente de variación de la muestra. 3. En el caso de una muestra con concentración conocida calcular el error relativo

para cada caso (interpolación y adición estándar). 4. Discutir los resultados obtenidos.

Vx

CstCx

×

×=

β

α

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