Kee Woei Ng, Stella P.K. Khoo, et al.

THE ROLE OF THE TUMOR SUPPRESSOR P53 PATHWAY IN THE CELLULAR DNA DAMAGE

RESPONSE TO ZINC OXIDE NANOPARTICLES

María José ÁlverezNatalia Zuleta Rendón

Estudiantes3° Semestre

MedicinaUniversidad Pontificia

Bolivariana 2011

http://www.aprea.com/home/content/view/21/75/

Texto adicional Texto adicional

Texto adicional texto adicional

Texto adicional texto adicional

INTRODUCTION

Protein p53

• Is a DNA binding protein that responds to cellular damage.

• Is found at low levels in the cell, but when there is damage level increases

http://www.bioinf.org.uk/p53/

• It works producing proteins that stop the cell cycle for DNA repair mechanisms repair.

• When damage is very big and irreparable, p53: by regulating transcription of genes that produce proteins to induce apoptosis and cell suicide.

http://www.web-books.com/eLibrary/ON/B0/B9/47MB9.html

Tumors• It is an abnormal mass of tissue. Tumors can be

cancerous (malignant) or noncancerous (benign).

• Tumors appear to occur when there is a problem with the division of cells in the body. Altering the balance of division and death of cells, can form a tumor.

Dna Damage

• Changes in the DNA molecule leading to alterations in transcription and replication. These changes may be point mutations, insertions or deletions.

• May be caused by: Spontaneous mutations (replication) Induced mutations(mutagens): physical or

chemical agents that cause mutations; as reactive oxygen species, UV radiation and heat.

http://www.disinfo.com/2010/12/los-alamos-scientist-tsa-scanners-shred-human-dna/

Zinc oxide nanoparticles • Is an inorganic salt, often used in consumer products

such as sunscreens and cosmetics.

• It is believed to have genotoxic effects.

SUPPRESSION OF p53 INDUCED BY ZnO

Exposure to particles

of ZnO entering the

cell

They produce   reactive

oxygen species

Nuclear  membrane cross c

ausing damage to DNA

p53 protein is activated

If the damage is minor apoptosis 

occurs

If the damage is severe there

may be a tumor

GENERAL AIM

• The deep understanding of whether the cellular DNA damage pathway, through tumor suppressor p53, is activated by ZnO nanoparticles.

Materiales y métodos

Caracterización de las nanopartículas de ZnO

Nanopartículas preparadas en metanol y sometidas a ultrasonido.

Observadas bajo microscopio de transmisión de electrones, medidas y

dispersadas a un pH de 6 en soluciones coloidales.

Para determinar el tamaño hidrodinámico, el índice de poli-

dispersidad y el potencial zeta de las partículas

Cultivo celular

Células epiteliales bronquiales humanas, fibroblastos de prepucio

neonatal y macrófagos de roedores, fueron cultivadas en DMEM*,

suplementadas con FBS** 10%, L-glutamina 1% y

antibiótico/antimicóticos

FBS: usado en la producción de proteínas, anticuerpos

monoclonales, enzimas.DMEM para estabilizar el medio de

cultivo con aminoácidos y vitaminas.

Método Material & fundamentoFunción

DMEM*:high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s MediaFBS**: fetal bovine serum

Empaquetamiento del retrovirus shp53 y transducción de las

células BJ

Células 2-239, por medio del fosfato de calcio, infectadas con plásmidos retrovirales codificados con shp53, o un vector de control vacío y lavadas con PBS.

Células con virus almacenadas a -80 C. Células BJ de receptor ecotrópico guardadas en contenedores después de transducción. igual volumen de medio viral mezclado con medio de crecimiento de polibreno y añadido a las células.

El calcio queda en el fondo y los fostatos quedan en la parte más alta del precipitado junto con el

DNA.

Exposición de las células a las

nanopartículas

Soluciones de nanopartículas de ZnO preparadas en PBS estériles, adicionadas al DMEM y 'sonicadas' para obtener las concentraciones deseadas de 5, 10, 15, 20, 25 µg/ml.

Cultivo de BEAS-2B y RAW264.7 por 24H expuestas a nanopartículas.

Células BJ cultivadas por 24 H en contacto con nanopartículas.

BEAS-2B y RAW264.7: análisis de citotoxicidad

Células BJ: estudios de genotoxicidad

Células sonicadas y cultivadas en DMEM: control negativo.

Método Material & fundamento Función

BEAS-2B:Human bronchial epithelial cellsBJ: human neonatal foreskin broblastsRAW264.7: murine macrophages DMEM: high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Media

Proliferación celular y perfil metabólico

las células tratadas con nanopartículas fueron lavadas en

PBS, lisadas con tritón X-100 0.1% v/v en agua desionizada.

Todo se mezcla por 30 min a 80 RPM.

solución pico-green mezclada con las células lisadas, y todo

incubado por 5 min a temperatura ambiente en la

oscuridad.

Cuantificación de las cantidades de DNA.

Picogreen: prepara los ejemplares lisados para la fluorescencia

Lavado con PBS: para el análisis de los perfiles metabólicos de las células que interactuaron con las

nanopartículas.

los perfiles metabólicos relativos se obtienen comparando los

niveles de absorbancia con los valores de DNA cuantificado por

fluorescencia.

Ensayo cometa

células BEAS-2B sembradas e incubadas 16 H.

Nanopartículas adicionadas e incubadas 4 h.

Células lavadas con PBS, tripsina y mezcladas con agarosa en

relación 1: 3. Suspensión célula-agarosa

distribuida sobre una lámina de vidrio con agarosa pre-cubierta.

Todo colocado en 1.2M NaCl, 100mM EDTA, 1% Tritón, 0.26M

NaOH por 16h en oscuridad.Láminas lavadas y teñidas con

verde SYBR.

Almacenamiento por 16 H con las soluciones lisantes: para preparar

la mezcla para electroforesis.

verde SYBR: para observación bajo microscopio de fluorescencia

y respectivo score.

Método Material & Fundamento Función

Western blotting

células lavadas con PBS, se les agrega 50µl de Buffer: (31.25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 12.5% glicerol,

0.05% ß-mercaptoetanol, 1% SDS, 0.005% azul bromofenol)

Adición de inhibidores de proteasas y fosfatasas .

almacenamiento en hielo, sonicación y centrifugación.

sobrenadante analizado con kit de ensayos de proteínas y agente de compatibilidad con detergentes

iónicos.

muestras de 7µg de proteínas fueron calentadas antes del SDS-

PAGE* usando geles de gradiente a 120 V, 90 min, electrotransferidas a

membranas de nitrocelulosa. INMUNOBLOTTING: bloqueo de

sitios inespecíficos con leche seca sin grasa filtrada en TBS-T. Las membranas fueron puestas en

contacto con anticuerpos primarios diluidos en un buffer e incubados

con agitación constante.después de lavados, fueron incubadas con anticuerpos

secundarios conjugados con HRP.

sonicación, buffer y detergentes iónicos: lisis

celular

centrifugación: Precipitación de restos celulares.

Kit de ensayos: análisis de proteínas del sobrenadante.

Método Material y fundamento Función

SDS-PAGE*: electroforesis en gel de poliacrilamida

RESULTADOS

• Caracterización de ZnO El diámetro de las nanopartículas: 22.5 - 4.9 nm, obtenidos

de las mediciones de 50 nanopartículas.

Las nanopartículas de diferentes propiedades físico-químicas, tales como tamaño, forma y carga superficial puede ejercer diferentes efectos citotóxicos en las células.

• Citotoxicidad y la genotoxicidad de las nanopartículas de ZnO

•El ensayo cometa muestra migración del DNA en la cavidad de agarosa lo cual comprueba el daño de éste.

• Efectos en la p53

Se demostró una disminución de la función metabólica de las células BJ con respecto al grupo de control (sin ZnO).

Se cuantificó el DNA (ensayo PicoGreen) y se observó que el número de células disminuía a medida que se incrementaba la concentración de ZnO.

Microscopía electrónica que muestra la poca proliferación de células tras la exposición de 24h a ZnO.

•Papel de la p53

A P53 responde al aumento de ZnO por lo cual lleva a la célula a un estado pre-apoptótico.

B P53 no responde a aumento de Zno, debido a su fosforilación lo que disminuye su acción sobre el ciclo celular.

• El daño del DNA también pudo haber sido causado por incrementos de ROS inducidos por el ZnO, estos también son citotóxicos.

http://circres.ahajournals.org/content/101/7.cover-expansion

Xia et. al [16]* salts and proteins could help in nanoparticle dispersion in an aqueous environment

Yes

Singh et. al [2] removal of structural defects from MWCNT was sufficient to substantially reduce their inflammatory response and overall toxicity.

Yes

Heng et.al [33]* 13.9% of BEAS-2B cells were found to have internalized the same spherical ZnO nanoparticles used here, introduced at 15 mg/ml, after 4 h incubation’’

Yes

Brayner et. al * [34]decreased progressively due to stress

induced by the presence of the

nanoparticles in the culture medium. After

contact with ZnO-TOPO nanoparticles, this

decrease was followed by cell death.

yes

DISCUSSION

Heng et. al [14] *the high cell density monolayer was

consistently more resistant to the cytotoxic

effects of ZnO nanoparticles compared to

the sparse monolayer for all four different

cell types

Yes

Heng et. al [15] Hence, it is obvious that initial transient exposure of BEAS-2B cells to oxidative stress sensitized their sub- sequent response to cytotoxic challenge with ZnO nanoparticles

Yes

Xia et. al [16]*results demonstrate that metal oxide

nanoparticles induce a range of biological

responses that vary from cytotoxic to

cytoprotective

No mention of cytoprotection.

Yuan et. al [17] The results indicated the obvious dose-effect cyto- toxicity relationship between all the ZnO NPs and HELF cells. In

Yes

Puzin et. al [35] *the number and variety of engineered

nanoparticles will increase rapidly over the

next few years, and there is a need for new

methods to quickly test the potential toxicity of

these materials.

Yes

Ng et. al [36]* Metabolic assays by themselves are not directly correlated with cell numbers since the same number of cells of the same cell type may have very different metabolic activities in different environments

Yes

Muller et. al [37]*Our study demonstrates that ZnO toxicity in

HMMs is due to pH-triggered, intracellular

release of ionic Zn2+

rather than the high-

aspect nature of the Cell death had features

of necrosis, apoptosis, with mitochondria

displaying severe structural changes

Yes

Xia et. al [38]*the dissolution of ZnO nanoparticles and Zn

2+

shedding leads to a series of sublethal and

lethal toxicological responses at the cellular

level that can be alleviated by iron doping.

Yes

Wätjen et. al [38] the mechanism of induction of apoptosis by zinc may involve calcium mobilization

Yes

Saji et. al [40]*Among the materials, dissolution of ZnO

nanoparticles and Zn2+

release were capable

of ROS generation and activation of an

integrated cytotoxic pathway that includes

intracellular calcium flux, mitochondrial

depolarization, and plasma membrane

leakage.

Yes

Huan et. al [41]*The predictive toxicological approach is

defined as establishing and using

mechanisms and pathways of injury at a

cellular and molecular level to prioritize

screening for adverse biological effects and

health outcomes in vivo

Yes

Schiestl et. al [42] * Although TiO2 is chemically inert, TiO2

nanoparticles can cause negative health

effects, such as respiratory tract cancer in

rats.

Yes

Osmond et. al [6] post-production processing and packaging, is the possibility that ZnO nanoparti- cles may be released incidentally as ‘dust’ or as aerosol droplets into the ambient air.

Yes

Borm et. al [43] The formation of large complex particles incorporating nano- scale components will need to be considered in the risk assessment for nanotechnology because they create a potential route for uptake of Nanoparticles and fibre

Yes

Nohynek et. al [44]* Vesicle materials do not penetrate into living human skin. Vesicle formulations may enhance or reduce skin absorption of ingredients, albeit at a limited scale

Yes

Mortensen et. al [45]Our findings raise concern that NP of similar

size and surface chemistry, such as metal

oxide NP found in sunscreens, may also

penetrate UV damaged skin.

Yes

Korting et. al [46]Since inhibition of mitotic activity is linked to

the atrophogenicity of topical corticosteroids,

the results suggest that liposome

encapsulation may improve the benefit-risk

ratio in eczema

Yes

kocbek et. al [47]*Transmission electron microscopy images

show NPs in vesicles within the cell cytoplasm.

Keratinocyte alterations.

Yes

Geiser et. al [48] Uptake of ZnO nanoparticles may also occur via passive diffusion through the cell membrane into the cytoplasm

Yes

CONCLUSIONS

• This study is very important to the medical practice because  through this we can determine that generate particles damage the genetic material that can cause cancer.

• This investigation proves once again the importance of p53 in cell cycle control.

• Some components of your commonly used products could induce cellular damage, so it’s important to know the composition of them.

• Specifically ZnO nanoparticles can cause skin cancer because it induces DNA damage.

MAPAS CONCEPTUALES

Natalia Zuleta Rendón

BIBLIOGRAFÍA

• MARTINEZ SÁNCHEZ, Lina María. Biología molecular. 6. ed. Medellín: UPB. Fac. de Medicina, 2011. p 127-133

• http://www.adcis.net/es/Applications/SuccessStories/CometAssay.html