STEROIDS UP REGULATE p66Shc IN GROWTH

REGULATION BY INHIBITING ITS UBIQUITINATION

Santosh KumarBy

Kelly Agudelo and Laura Areiza

MEDICINE UPB 2011

INTRODUCTION

STEROIDS p66Shc UBIQUITIN

UBIQUITINATION

RELATIONS

STEROIDS

Steroids are derivatives of cholesterol, molecule obtained in the membrane lipids, LDL, fats, among others.

They have different functions such as regulation, structure, hydrolytic balance, the compensation against stress, pharmacologic use.

TYPES OF STEROIDS: *Gonadal hormones: androgens, estrogens, testosterone. *Progestational hormones: progesterone, estrogens. *Adrenal hormones: aldosterone, cortisol, DHT *Derivatives of vitamin D: calcitriol.

WHAT

HOW

P53

ROS

FUNCTIONS

APOPTOTIC

P66Shc

WHAT IS p66Shc?

« It is an isoform of Shc, localized in the mitochondrion matrix, adoptor proteins, mediate diverse signals, including cellular stress and mause longevity."

HOW IS THE MECHANISM?

The acts as a downstream target of the tummor suppressor p53 and is indispensable for the ability of stress activated p53 to induce elevation of intracellular oxidants, cytochrome c release and apoptos.

FUNCTIONS OF THE PROTEINP66Shc regulates life span in mammals a is a critical componet of the apoptotic response

to oxidatice stress.

P66Shc is know to promote trimeric complex formation involving Eps8, E3b1 and Sos1, thus leading to a

increasae in rac 1 activity.

Is involved in the delayed

wound healing process in the

setting of diabetes and

ischemia.

Relation with P53

P66Shc protein level is increased in cells with highly metatastatic

abaility and is level in lymph node positive

tumors.

Its functions as a downstream target of the tumor suppressor p53 and is indispensable for the ability of oxidative stress.

This protein parcipates in the

carciogensis pathay.

The expression level of a

protein can be controlled

through the regulation of its transcription.

P66Shc can modulates high glucose or

angiotensin induced mitocondrial disfunction

and proximal tubular cells.

UBIQUITIN Ubiquitin is a small protein that occurs naturally in eukaryotic cells. Its main function is to mark other proteins for destruction. This process is known as proteolysis. Several ubiquitin molecules are anchored to the protein to remove and it moves toward the proteasome, a barrel-shaped structure which performs the process of proteolysis.

 

The ubiquitin proteasome pathway is involved in the turnover of intracellular proteins and plays an important role in the degradation of short-lived regulatory proteins, involved in a broad range of cellular processes such as cell cycle regulation, modulation of surface receptors.

UBIQUITINATION

The process of ubiquitination is the marking of a ubiquitin molecule.

The ubiquitination process is essential in many processes such as shortening and degradation of proteins by the proteasome, RNA repair and inflammation.

PROCESSS ubiquitin-activating enzyme E1,

(there are 16 different): This enzyme is responsible for activating the ubiquitin with energy expenditure.

Ubiquitin conjugating enzyme E2, (there are 53 different): This enzyme has been activated ubiquitin to the substrate.

Ubiquitin E3 ligase (527 is different): Member terminal conjugantes cascade of enzymes.

RELATION

The main relationship between ubiquitination, ubiquitin, the p66Shc and steroids is linked to the presence of the P53, which during the cancer is removed and damaged molecules therefore can not be identified and coded incorrectly, leading to p66Shc activation of which increases apoptosis in the cells.

Ubiquitination also allows through the proteasome degradation of damaged molecules which have previously been marked by ubiquitin, and treatment with steroids help to increase the presence of p66Shc for development and therapy with cancers diferenes .

GENERAL OBJECTIVE:Identify the relationship between the increase in p66Shc protein and steroid therapy in ovarian, breast and prostate cancers.

MATERIALES Y METODOS

LINEAS CELULARES Se origina a partir de un

subcultivo primario obtenido de un cultivo celular, en el cual las células poseen características semejantes al cultivo de inicio.

El cultivo celular se identifica por la proliferación de las células y por la formación de una monocopa, de las cuales se extrae una muestra para seguir con la proliferación celular.

LINEAS CONTINUAS

Poseen caracteristicas de la célula de origen, son diploides, se inhiben por contacto y no estan presentes en la tumorigenicidad.

LINEAS INFINITAS

No poseen las caracterisiticas de la célula de origen, son heteroploides, no se inhiben por contacto y están presentes en la tumorigenicidad.

APLICACIÓN DE LAS LINEAS CELULARES Para visualizar las líneas celulares se hizo: 1. Someter las células LNCaP FGC 33 (Próstata), CaOV-3 y OVCAR (Ovario) a un medio de cultivo nutritivo rojo fenol positivo RPMI 1640, las cuales crecían una vez por semana.

2. Después estas células se trataron sin rojo fenol RMPI1640 y se les agrego CHX ( Cicloheximida) una hora antes de colocarles DHT, proceso realizado en 24 horas.

INMUNOBLOT La electroforesis es una

técnica de separación basada en la migración diferencial de especies cargadas en un medio conductor de la corriente eléctrica.

La separación electroforética depende de la densidad de cargas de la molécula y su tamaño.

APLICACIÓN DEL INMUBLOT

Las células fueron sometidas a HEPES buffer salino, encargado de mantener el PH fisiológico, en este medio agregaron inhibidores de las proteasas y las fosfatasas para cuantificar la intensidad de la hibridación de las bandas.

DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO CELULAR

Es una prueba utilizada para la cuantificación del numero de células presentes en un cultivo y para la determinación exponencial de su tamaño, además permite diferencial entre las morfologías de las células en diferentes periodos de tiempo.

APLICACIÓN DEL CRECIMIENTO CELULAR

Para determinar el crecimiento de las células fueron sembradas 6 placas de cultivo, determinando el tiempo de evolución el cual fue capturado por tripsinizacion y medido por el cell meter.

INMUNO PRECIPITACION

La inmuno precipitación es una técnica que utiliza los anticuerpos específicos a una proteína para quitar esas proteínas de la solución. Los complejos del anticuerpo-proteína se precipitan fuera de la solución con la adición de una forma insoluble de proteínas obligatorias del anticuerpo.

APLICACIÓN DE LA INMUNO PRECIPITACION

La célula recibió un lavado con HEPES a 20 mM y aquí se hizo una recolección de las células para luego centrifugar y lisar en hielo con tripsina, HCl a un ph de 7.4, EDTA, inhibidores de la proteasa y NP40.

Después se ultilizo A-sefarosa y Laemmli.

RESULTADOS

Casodex.

DTH.

Células OVCAR, LNCaP fGC 33.

OVCAR.

CaOV-3

E2

Tamoxifin.

FIGURA UNO

FIGURA DOSLos tratamientos a base de los esteroides demuestran un aumento de la p66Shc y cuando se hace una inhibición de los esteroides disminuyen significativamente la CPSA, la síntesis Novo de AR y la p66Shc dependiente de DHT , tal y como se evidencia cuando se utilizan CHX, Act D y Cont.

FIGURA 3

En presencia de la los inhibidores de la proteosoma tales como el MG132 y el Laptacystin los niveles de la p66Shc se aumentaron al igual que los de las p52 y p46.

Por otra parte el inhibidor de la proteasa lisosomal leupeptina no mostro cambios significativos-

FIGURA CUATRO

Se hizo un estudio con presencia de MG132 y la DHT donde en periodos de 6 horas se mostraban aumentos significativos de la p66Shc.

Por tanto LNCaP C33 pueden ser reguladas postrancripcional.

FIGURA CINCO

Se hizo una investigación para visualizar si los inhibidores del proteosoma pueden tener efectos sobre la proteína de la P66Shc pueden tener efectos sobre el cáncer de ovario.

Por tanto las células OVCAR-3 que son sensibles a los estrógenos al igual que las CaOV no mostraron un aumento significativo de la p66Shc como las CaOV.

FIGURA SEIS

Se hizo una electroforesis utilizando la ubiquitina Ab, seguida de una inmunotransferencia con ABS especifica para las proteínas Shc, la cual revelo quela p66Shc combinada con la DHT y la ubiquitina tenia un peso mayor que los complejos de las demás Shc.

DISCUSSION

Person What he said Agree/Disagree

Lee MS “our data clearly show that DHT treatment of androgen-sensitive prostate cancer LNCaP C-33 cells leads to an increase in p66Shc protein, but not p52Shc or p46Shc and cell proliferation”

Agree

Trinei M “previous studies indicated that tumor suppresser p53 protein increases p66Shc protein stability in mouse embryonic fibroblast cells, apparently signaling for apoptotic pathway.”

Disagree

Veeramani S “in the steroid-reduced condition, as an androgen –sensitive cell,Ser36 phosphorylation of p66Shc protein is at a high level in LNCaP C-33.”

Agree

Khanday FA “Alternatively, Ser54 and Ser286 phosphorylation may play a role in steroid-induced p66Shc protein stability.”

Agree

CONCLUSSION We conclude that in prostate and ovarian cancers

where it is damaged or diminished the activity of p53 (protein that slow the replication of genetic material when there is a previous mistake) p66Shc protein shows a high activity to lead the damaged replicated cell to apoptosis.

We conclude that p66Shc protein plays an important role on oxidative stress when is used in conjunction with steroids, the latters prevent the degradation of p66Shc on proteasome way.

Recent findings indicate that p66Shc protein acts in the healing of tissues damaged by ischemia and helps in the identification of processes that show diabetes, all thanks to the ubiquitin signaling in cells or tissues that are in harm.

Using this new mechanism of steroid degradation on p66Shc pathway, presents a new alternative for future research and treatments for advanced cancers.

LAURA

KELLYKELLY

GRACIAS