ANDRÉS DAVID ARÁNZAZU CEBALLOSANDRÉS DAVID ARÁNZAZU CEBALLOSLAURA CRISTINA AGUDELO CARDONALAURA CRISTINA AGUDELO CARDONA

3rd SEMESTER3rd SEMESTERFACULTY OF MEDICINEFACULTY OF MEDICINE

U.P.BU.P.B

february 18/2013february 18/2013

The cells have capacity of self-The cells have capacity of self-reproduction through cell reproduction through cell division, resulting from one division, resulting from one parental cell to two daughter parental cell to two daughter cells.cells.

Eukaryotic cell cycle divide Eukaryotic cell cycle divide approximately every 24 hoursapproximately every 24 hours..

CELL CYCLECELL CYCLE

Normal cells in the body follow an Normal cells in the body follow an orderly path of growth, division, orderly path of growth, division, and death. Unlike regular cells, and death. Unlike regular cells, cancer cells do not experience cancer cells do not experience programmatic death and instead programmatic death and instead continue to anormal grow and continue to anormal grow and divide. divide.

CANCERCANCER

Cancer cells have less dependence on external stimulus and be Cancer cells have less dependence on external stimulus and be have as would be if they continually subject to a stimulation have as would be if they continually subject to a stimulation mechanism.mechanism.

IGFBP-3 : IGFBP-3 : Is a member of the insulin-like Is a member of the insulin-like growth factor binding protein growth factor binding protein (IGFBP), (IGFBP), most abundant in serum.most abundant in serum.

is a multifunctional protein that is is a multifunctional protein that is found to play a variety of roles in found to play a variety of roles in circulation, in the extracellular circulation, in the extracellular environment, and inside the cell.environment, and inside the cell.

Over the past decade it has become widely appreciated that Over the past decade it has become widely appreciated that IGFBP-3 contributes to improving the patho-physiology of a IGFBP-3 contributes to improving the patho-physiology of a variety of human diseases, such as cancer, diabetes, and variety of human diseases, such as cancer, diabetes, and malnutrition.malnutrition.

All cells require an external stimulus to All cells require an external stimulus to initiate a state of active proliferationinitiate a state of active proliferation

Cancer cells do not depend on a stimulus Cancer cells do not depend on a stimulus for cell division, are continually in for cell division, are continually in proliferation.proliferation.

The IGFBP-3 seeks to create an inhibitory The IGFBP-3 seeks to create an inhibitory effect on cell effect on cell

proliferation malignant cells and induce proliferation malignant cells and induce apoptosis of these apoptosis of these

cells to prevent cancer continue.cells to prevent cancer continue.

showed that IGFBP-3 exerted its growth inhibitory action through showed that IGFBP-3 exerted its growth inhibitory action through not only induction of apoptosis but also the G1 cell cycle.not only induction of apoptosis but also the G1 cell cycle.

Cultivo de células bajo Cultivo de células bajo condiciones especificas, que condiciones especificas, que permiten obtener: permiten obtener:

Resultados sobre alguna Resultados sobre alguna función normal de la célula.función normal de la célula.

El comportamiento de las El comportamiento de las celulas frente a una celulas frente a una determinadadeterminada manipulación.manipulación.

786-O 786-O A549 A549 MCF-7MCF-7

LINEAS CELULARES.

TEM:TEM:

Es un microscopio que utiliza un haz Es un microscopio que utiliza un haz de electrones.de electrones.

Utiliza muestras ultra finas.Utiliza muestras ultra finas.

Pueden mostrar estructuras mucho Pueden mostrar estructuras mucho más pequeñas.más pequeñas.

Se evaluó usando Anexina V / PI Kit.Se evaluó usando Anexina V / PI Kit.

APOPTOSISAPOPTOSIS

Serie de reacciones Serie de reacciones químicas que ocurren en químicas que ocurren en la célula produciendole la célula produciendole una muerte silenciosa, sin una muerte silenciosa, sin alterar la función normal alterar la función normal del organismo.del organismo.

se evaluó por citometría se evaluó por citometría de flujo con software de de flujo con software de análisis Cell-Quest.análisis Cell-Quest.

la distribución del ciclo celular la distribución del ciclo celular se midió mediante una técnica se midió mediante una técnica de fluorescencia de de fluorescencia de clasificación de células clasificación de células activadas .activadas .

ANALISIS DEL CICLO ANALISIS DEL CICLO CELULARCELULAR

Permite determinar la expresion de Permite determinar la expresion de genes en diversos tejidos.genes en diversos tejidos.

Amplificacion de RNA a traves de la Amplificacion de RNA a traves de la sintesis previa de su DNAc.sintesis previa de su DNAc.

Utiliza Utiliza TTranscriptasaranscriptasa inversa inversa

y varios ciclos de PCR.y varios ciclos de PCR.

Identificación de secuencias Identificación de secuencias especificas de DNAespecificas de DNA

Proteinas procedentes de celulas Proteinas procedentes de celulas son separadas por electroforesis son separadas por electroforesis (SDS-PAGE).(SDS-PAGE).

DisolucionDisolucion con SDS cargado con SDS cargado negativamente. negativamente.

Las proteinas van a un filtro donde Las proteinas van a un filtro donde se incuban con anticuerpos que se incuban con anticuerpos que reaccionan con las proteínas de reaccionan con las proteínas de interes.interes.

WESTERN BLOTWESTERN BLOT

Inducción de apoptosis en la línea celular MFC-7.Inducción de apoptosis en la línea celular MFC-7.

La línea celular La línea celular MFC-7MFC-7 se transfecto con se transfecto con 2 vectores PCIGFBP-32 vectores PCIGFBP-3 PCI-neoPCI-neo

En los cuadrantes superior e inferior derechos, se localizaron las En los cuadrantes superior e inferior derechos, se localizaron las células que sufrieron células que sufrieron APOPTOSISAPOPTOSIS

En los cuadrantes superior en inferior izquierdos, se localizaron En los cuadrantes superior en inferior izquierdos, se localizaron las células que quedaron vivas las células que quedaron vivas NECROSIS.NECROSIS.

Las células transfectadas con PCI-Las células transfectadas con PCI-IGFBP-3 fueron las que mas Sufrieron IGFBP-3 fueron las que mas Sufrieron APOPTOSIS.APOPTOSIS.

IGFBP-3 detiene el ciclo celular en la fase G1.

Citometría de flujo.Citometría de flujo.

Se transfectaron todas las líneas celulares (MFC-7, A549 Y 786-OSe transfectaron todas las líneas celulares (MFC-7, A549 Y 786-O)

PCI-Neo PCI-IGFBP-3

Las células transfectadas conLas células transfectadas con PCI-IGFBP-3 PCI-IGFBP-3 tuvieron mas tuvieron mas efecto con respecto a la detención del ciclo celular y su efecto con respecto a la detención del ciclo celular y su variación fue en la fase G1.variación fue en la fase G1.

MFC-7

786-O

A549

Efectos de IGFBP-3 EN RNAm a Efectos de IGFBP-3 EN RNAm a nivel de ciclina E1, CDK1,CDK2, nivel de ciclina E1, CDK1,CDK2, P16 Y P21; en la líneas celularesP16 Y P21; en la líneas celulares.

Análisis de cuantificación de PCR en tiempo real.

Se analizo el efecto de la IGFBP-E potencializado por PCR, en fase G1 y su relación con las factores implicados en el proceder del ciclo.

MFC-7

786-O

A549

Cilcina Cdk2 p21

Cilcina Cdk2 * p21

Cilcina Cdk2 p21

Efectos de IGFBP-3 en las proteínas reguladoras del ciclo celular.

Western blot.

El principal efecto del IGFBP-3 sobre el ciclo celular lo realiza en la fase G1, mediante:

Ciclina E1

P21

ANDRES DAVID ARANZAZU CEBALLOSANDRES DAVID ARANZAZU CEBALLOS

LAURA CRISTINA AGUDELO CARDONALAURA CRISTINA AGUDELO CARDONA

The IGFBP-3The IGFBP-3 serves to generate apoptosis, to avoid over-stimulation serves to generate apoptosis, to avoid over-stimulation of altered cells in addition to changing the activity of a series of of altered cells in addition to changing the activity of a series of elements that usually allow performing normal cell cycle.elements that usually allow performing normal cell cycle.

The action of IGFBP-3 to inhibit or halt the cell cycle at G1, makes this The action of IGFBP-3 to inhibit or halt the cell cycle at G1, makes this one becomes a possible treatment for patients suffering from a cancer.one becomes a possible treatment for patients suffering from a cancer.

The inclusion of IGFBP-3 in patients with cancer treatment would be a The inclusion of IGFBP-3 in patients with cancer treatment would be a good alternative as gene therapy, thus decrease the tedious use good alternative as gene therapy, thus decrease the tedious use treatments currently used, leading to a better quality of life for patients.treatments currently used, leading to a better quality of life for patients.

Knowledge about the most used tests of molecular biology in medical Knowledge about the most used tests of molecular biology in medical practice, have a fundamental value to always reach the most accurate practice, have a fundamental value to always reach the most accurate diagnosis face when the disorders report a high degree of difficulty.diagnosis face when the disorders report a high degree of difficulty.

Martinez Sanchez, Maria Lina. Molecular Biology. Martinez Sanchez, Maria Lina. Molecular Biology. 7. ed. Medellín: UPB. Faculty of Medicine, 2012. 7. ed. Medellín: UPB. Faculty of Medicine, 2012.