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Molecular Biology Seminary
Maria Alejandra López LoperaÉrika Marcela Martínez Pardo
Medicine students3° semester
U.P.B
A Novel PTEN/Mutant p53/c-Myc/Bcl-XL Axis Mediates
Context-Dependent OncogenicEffects of PTEN with
Implications for CancerPrognosis and Therapy
Xiaoping Huang, Ying Zhang,Yaqiong Tang, Napoleon Butler,Jungeun Kim, Fadila Guessous,
David Schiff, James Mandelland Roger Abounader.
INTRODUCTIONINTRODUCTIONINTRODUCTIONINTRODUCTION
INTRODUCTIONINTRODUCTIONGene mutationGene mutation
Altered protein expression Altered protein expression
Disturbances in the cell division
Disturbances in the cell division
Reduction of apoptosis
Reduction of apoptosis
CANCERCANCER
INTRODUCTIONINTRODUCTIONGENES RESPONSIBLE FOR
CANCERGENES RESPONSIBLE FOR
CANCER
INTRODUCTIONINTRODUCTION
Oncogenic effects on glioblastoma
cells
Oncogenic effects on glioblastoma
cells
p53 MUTATIONp53 MUTATION PTEN(Phosphatase and tensin homolog)
PTEN(Phosphatase and tensin homolog)
INTRODUCTIONINTRODUCTION
p53p53 Tumor suppresor Tumor suppresor Stop the cell
cycle in the G1/S checkpoint
Stop the cell cycle in the G1/S
checkpointApoptosisApoptosis
INTRODUCTIONINTRODUCTION
INTRODUCTIONINTRODUCTION
INTRODUCTIONINTRODUCTION
MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS
MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS
MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS
Células Células
Células glioblastomas
Células glioblastomas
U373SNB19
U87LNZ308
293TGBM6
Muestras de tumoresMuestras de tumores
Pacientes con glioblastomasPacientes con glioblastomas
Infectadas con p53
MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS
Silenciamiento de gen con lentivirus shRNA
Silenciamiento de gen con lentivirus shRNA
LentivirusLentivirus
Virus con periodos de incubación
muy altos.
Permiten el paso de ARN a ADN integrándolo al genoma
huésped y replicándolo junto con él.
shRNAshRNA
Horquilla corta de RNA
Inhibición estable o transitoria del
gen diana
MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS
Plásmido
Células 293T
FuGene6
Selección con
puromicina
Traducción
MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS
Adenovirus e infecciónAdenovirus e infección
AdenovirusAdenovirus
Virus que tienen ADN como material
genético.
Se utilizan como vehículos para
administrar genes en el tratamiento
del cáncer
Adenovirus mut-p53 (R273H)Adenovirus mut-p53 (R273H)
MOI:10
Verificación de la expresión de PTEN y mut-p53
Verificación de la expresión de PTEN y mut-p53
Análisis con inmunoblot
MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS
Análisis inmunoblotAnálisis inmunoblot
Primer paso Separación de proteínas mediante electroforesis en gel
Segundo paso Transferencia de proteínas a una membrana adsorbente.
Tercer paso Detección de la unión antígeno anticuerpo con fluorescencia.
MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS
Ensayo de proliferación celularEnsayo de proliferación celular
Con MTSCon MTS Complejo de sal de tetrazolio, ensayo colorimétrico, medición actividad enzimática
Cálculo de célulasCálculo de células
Con CellTiter96 AQ, kit de proliferación celular
Hemocitómetro
MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOSEnsayo de apoptosisEnsayo de apoptosis
Medición citoplasmática de histona asociada
a fragmentos del ADN
Kit Elisa
Degradación de internucleosomas
Detección de histonas por anticuerpos
acoplados a enzimas
Liberación al medio de nucleosomas por células
en apoptosis.
MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS
Ensayo de invasión celularEnsayo de invasión celular
células puestas en cámara superior con
recubierta de membrana de colágeno
IV.
10 porciento de FBS fue colocado en cámara
baja Incubación toda la noche.
Células que migraron a la parte inferior fijadas teñidas y contadas bajo
un microscopio.
MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS
Colágeno tipo IV
Componente de la membrana basal
Afectada en carcinomas invasivosPrimer paso de la
invasión tumoral
Primer paso de la invasión tumoral
Pérdida de la membrana
basal
• Descenso de la síntesis• Ensamblaje disminuido
de la componente.• Aumentos de la
destrucción por proteasas producidas por el tumor.
Marcador sello de la invasión
Clones de la células fijados y teñidos
MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS
Ensayo de formación de coloniasEnsayo de formación de colonias
Sembrado de células en 10% FBS
Tres semanasTres semanas
Sln 0.5% violeta cristal y 25% de
metanol
MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS
Análisis inmunoblotAnálisis inmunoblot
Lisis celular
Determinación de la concentración de proteínas
por el reactivo de ensayo Coomassie Plus
Análisis inmunoblot
Manchas seleccionadas sometidas a
densitometría
MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS
Precipitación inmunológicaPrecipitación inmunológica
Células lisadas fueron encubadas con anticuerpo
primario seguido de incubación con Proteína A
agarosa.
Sometidas a altas temperaturas con tampón de
sodio duodecil sulfato
Transferencia a nitrocelulosa
Incubación con anticuerpo secundario HRP
Señales detectadas con quimioluminiscencia
MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS
InmunodepresiónInmunodepresión
(Para remover molécula de una muestra)
Inmunodepresión de proteínas con anticuerpos
anti-p53/anti-NFYA
Inmunoprecipitación de sobrenadantes con
anticuerpo anti-NFYA/anti-p53.
Análisis de inmunoblot con anticuerpo anti-CBP.
MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS
Detección de complejo de proteínas con análisis Native PAGE
Detección de complejo de proteínas con análisis Native PAGE
Células U373 infectadas con adenovirus PTEN codificado (ad-PTEN).
2-3 días2-3 días
Células lisadas preparadas en una muestra tampón sin SDS
Puestas en PAGE en tampón Tris-glicina sin SDS.
Transferencia de proteínas del PAGE a membranas nitrocelulosa con
anticuerpo primario.
Análisis Western blot
MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS
IP cromatinaIP cromatina
Lisis del complejo DNA/proteína y puesto en vórtex para liberación de DNA
Corte de ADN a 37°C con mezcla de enzimas provistas por un kit
Centrifugación de lisados
Complejo proteína-DNA recogido con granos de proteína A o G agarosa y entrecruzado por calentamiento a 65°C.
Una nocheUna noche
Purificación de DNA con kit
QIAQuick
Análisis de reacción en cadena de polimerasa con primers específicos para la región
promotora de c-Myc
MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS
Inmunohistoquimica e inmunofluorescenciaInmunohistoquimica e inmunofluorescencia
(Determina los niveles de PTEN en tejidos humanos)
Localización de mut-p53, CBP o NFYA determinado por inmunofluorescencia.
Incubación de células con anticuerpos relevantes.
Incubación con isotiocianato de fluoresceína o anticuerpos secundarios conjugados.
MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS
Secuencia de exones p53Secuencia de exones p53
Análisis de las mutaciones de p53 mediante secuencia de DNA
Extracción de ADN
Amplificación de los exones de p53 por reacción en cadena de polimerasa.
Identificación y comparación de las secuencias resultantes con las secuencias en wt-p53
RESULTADORESULTADOSS
RESULTADORESULTADOSS
CrecimientoInvasión
CrecimientoInvasión
R273HU373 SNB19
ApoptosisApoptosis
MEDIACION DE PTEN POR MEDIACION DE PTEN POR mutP53mutP53
MEDIACION DE PTEN POR MEDIACION DE PTEN POR mutP53mutP53
mut-P53 y adPTEN:mut-P53 y adPTEN:mut-P53 y adPTEN:mut-P53 y adPTEN: Sh-mutP53 y adPTENSh-mutP53 y adPTENSh-mutP53 y adPTENSh-mutP53 y adPTENSh-RNASh-RNA
INVERSO
Mut-P53 regula Mut-P53 regula los efectos los efectos
oncogénicos de oncogénicos de PTENPTEN
Mut-P53 regula Mut-P53 regula los efectos los efectos
oncogénicos de oncogénicos de PTENPTEN
CONCLUSIÓNCONCLUSIÓNCONCLUSIÓNCONCLUSIÓN
SNB19
U373
Ad-PTENAd-PTEN
INFLUENCIA DE PTEN EN C-Myc y Bcl-XLINFLUENCIA DE PTEN EN C-Myc y Bcl-XLINFLUENCIA DE PTEN EN C-Myc y Bcl-XLINFLUENCIA DE PTEN EN C-Myc y Bcl-XL
INVERSOINVERSO
ad-PTEN
Mut-P53Mut-P53
ad-PTEN
Sh-mutP53Sh-mutP53
ad-PTEN
Mut-P53Mut-P53
ad-PTEN
Sh-mutP53Sh-mutP53
INFLUENCIA DE mut-P53 EN INFLUENCIA DE mut-P53 EN EFECTOS ONCOGÉNICOS DEL PTENEFECTOS ONCOGÉNICOS DEL PTEN
INFLUENCIA DE mut-P53 EN INFLUENCIA DE mut-P53 EN EFECTOS ONCOGÉNICOS DEL PTENEFECTOS ONCOGÉNICOS DEL PTEN
INFLUENCIA DE C-Myc SOBRE EFECTOS INFLUENCIA DE C-Myc SOBRE EFECTOS ONCOGÉNICOS DE PTENONCOGÉNICOS DE PTEN
INFLUENCIA DE C-Myc SOBRE EFECTOS INFLUENCIA DE C-Myc SOBRE EFECTOS ONCOGÉNICOS DE PTENONCOGÉNICOS DE PTEN
Ad-PTEN
Ad-cMycAd-cMycAd-cMycAd-cMyc
Sh-cMycSh-cMycSh-cMycSh-cMyc
CrecimientoInvasiónCrecimientoInvasión
ApoptosisApoptosis
Ad-PTEN
INVERSOINVERSO
RESULTADOSRESULTADOS
CONCLUSIÓNCONCLUSIÓNCONCLUSIÓNCONCLUSIÓN
C-Myc media C-Myc media parcialmente los parcialmente los
efectos efectos oncogénicos de oncogénicos de
PTENPTEN
C-Myc media C-Myc media parcialmente los parcialmente los
efectos efectos oncogénicos de oncogénicos de
PTENPTEN
INFLUENCIA DE Bcl-XL EN EL EFECTO INFLUENCIA DE Bcl-XL EN EL EFECTO ONCOGÉNICO DE PTENONCOGÉNICO DE PTEN
INFLUENCIA DE Bcl-XL EN EL EFECTO INFLUENCIA DE Bcl-XL EN EL EFECTO ONCOGÉNICO DE PTENONCOGÉNICO DE PTEN
PTEN
Ad-Bcl XLAd-Bcl XLAd-Bcl XLAd-Bcl XL
Sh-Bcl XLSh-Bcl XLSh-Bcl XLSh-Bcl XL
INVERSOINVERSO
ApoptosisApoptosis
Bcl-XL influye Bcl-XL influye parcialmente en parcialmente en
los efectos los efectos oncogénicos de oncogénicos de
PTENPTEN
Bcl-XL influye Bcl-XL influye parcialmente en parcialmente en
los efectos los efectos oncogénicos de oncogénicos de
PTENPTEN
C: Muestras de control
E: Muestras experimentales
FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN
SI HAY SI HAY COMPLEJO COMPLEJO
mut-P53/CBP/mut-P53/CBP/NFYANFYA
SI HAY SI HAY COMPLEJO COMPLEJO
mut-P53/CBP/mut-P53/CBP/NFYANFYA
INFLUENCIA DE PTEN EN EL INFLUENCIA DE PTEN EN EL COMPLEJO mut-P53/CBP/NFYACOMPLEJO mut-P53/CBP/NFYA
INFLUENCIA DE PTEN EN EL INFLUENCIA DE PTEN EN EL COMPLEJO mut-P53/CBP/NFYACOMPLEJO mut-P53/CBP/NFYA
Ad-PTENAd-PTENAd-PTENAd-PTEN Mut-P53/CBP/NFYA
RELACIÓN ENTRE LA SUPERVIVIENCIA DE RELACIÓN ENTRE LA SUPERVIVIENCIA DE PACIENTES CON GLIOBLASTOMA POR PACIENTES CON GLIOBLASTOMA POR
mut-P53 Y LA PRESENCIA DE PTENmut-P53 Y LA PRESENCIA DE PTEN
RELACIÓN ENTRE LA SUPERVIVIENCIA DE RELACIÓN ENTRE LA SUPERVIVIENCIA DE PACIENTES CON GLIOBLASTOMA POR PACIENTES CON GLIOBLASTOMA POR
mut-P53 Y LA PRESENCIA DE PTENmut-P53 Y LA PRESENCIA DE PTEN
PTENPTEN
SUPERVIVENCIASUPERVIVENCIA
GLIOBLASTOMA CON mut-P53
REACTIVACIÓN DE P53PRIMA1PRIMA1PRIMA1PRIMA1
P21P21: GEN
Mdm2: Mdm2: PROTEINA
TERAPIA FUTURA CONTRA CÁNCERTERAPIA FUTURA CONTRA CÁNCERTERAPIA FUTURA CONTRA CÁNCERTERAPIA FUTURA CONTRA CÁNCER
FASE G1
REGULADO POR P53
ESTRES
GEN REGULADO
POR P53
INFLUENCIA DEL PTEN EN INFLUENCIA DEL PTEN EN ACCIÓN DE PRIMA1ACCIÓN DE PRIMA1
INFLUENCIA DEL PTEN EN INFLUENCIA DEL PTEN EN ACCIÓN DE PRIMA1ACCIÓN DE PRIMA1
PTEN + PRIMA1PTEN + PRIMA1PTEN + PRIMA1PTEN + PRIMA1 SÍ TIENEN VALOR TERAPÉUTICO
DISCUSSIONDISCUSSIONDISCUSSIONDISCUSSION
PERSONAPERSONA IDEAIDEA SISI NONOJiang Z.Zheng X.Rich KM.
Inhibition of Bcl-XL induces apoptosis of glioblastoma cells
Meyer N.Penn LZ.Dang CV.Nilsson JA. Cleveland JL.
c-Myc is a key regulator of cellular outcomes in normal cells, and its dysregulation is associated with
cancer progression
Brosh RRotter V
A previous study found that gain-of-function mut-p53 increased the expression of c-Myc in cancer cells
Ghosh AK. Grigorieva I. Steele R.Hoover RG.Ray RB.
Although PTEN was reported to inhibit expression of c-Myc in
tumor cells
CONCLUSIONESCONCLUSIONESCONCLUSIONESCONCLUSIONES
Cells have components that monitor its cycle and prevent the spread of possible damage and mutations to daughter cells, however these components may be affected and this makes that its function is reversed, causing possible serious diseases.
Electrophoresis techniques are very important in this type of study because they allow us to safely show results
Inhiben
GRACIAS!!GRACIAS!!GRACIAS!!GRACIAS!!