Recientes avances en el diagnóstico de tuberculosis en el

eJIFCC2015Vol26No4pp310-325Page 310

In this issue Laboratory Medicine Perspectives from Latin America

Recientes avances en el diagnoacutestico de tuberculosis en el laboratorio cliacutenicoRommy Teran1 Jacobus H de Waard2

1 Laboratorio de Microbiologiacutea Facultad de Ciencias Quiacutemicas Universidad Central del Ecuador2 Programa Prometeo Facultad de Ciencias Quiacutemicas Universidad Central del Ecuador

INFORMACIOacuteN SOBRE EL ARTIacuteCULO R E S Uacute M E N

El laboratorio tiene un papel decisivo en el diagnoacutestishyco de tuberculosis (TB) asiacute como en la identificacioacuten y determinacioacuten de la sensibilidad de Mycobacterium tuberculosis a diferentes drogas (DST del ingleacutes drug sensitivity testing) El diagnoacutestico de laboratorio bashysado solo en microscopiacutea y cultivo ha sido utilizado por largo tiempo sin embargo y debido al lento creshycimiento de las micobacterias (3 a 4 semanas) se ha hecho indispensable la buacutesqueda de nuevos y raacutepishydos meacutetodos de diagnoacutestico Desde inicios de los 90s se dispone de teacutecnicas moleculares para una raacutepida deteccioacuten identificacioacuten y DST del M tuberculosis El presente artiacuteculo hace una revisioacuten de la nueva metodologiacutea que ha sido introducida en el laboratoshyrio cliacutenico Nosotros discutimos sobre la microscopiacutea LED y las teacutecnicas basadas en el PCR para el diagnoacutestishyco de TB ensayos inmunoloacutegicos para el diagnoacutestico de TB activa y latente meacutetodos de cultivo liacutequido y ldquoline probe assaysrdquo para un raacutepido DST y meacutetodos bashysados en PCR y ensayos de hibridizacioacuten para la idenshytificacioacuten de micobacterias Aunque estas nuevas teacutecnicas son uacutetiles para tener un resultado raacutepido enfatizamos en que el diagnoacutestico y seguimiento bashysado en el cultivo es todaviacutea el meacutetodo de referencia

Autores correspondentesDr Rommy Teran Dr Jacobus H de WaardFacultad de Ciencias Quiacutemicas Universidad Central del EcuadorCorreos electroacutenicos riteranuceeduecjacobusdewardgmailcom

Palabras clavetuberculosis diagnoacutestico molecular test de sensibilidad a drogas (DST) NAATs LAMP Xpert MTBRIF

AgradecimientosEl programa Prometeo de la SENESCYT (Secretariacutea de Educacioacuten Superior Ciencia Tecnologiacutea e Innovacioacuten del Ecuador) auspicioacute este trabajo


Rommy Teran Jacobus H de WaardRecientes avances en el diagnoacutestico de tuberculosis en el laboratorio cliacutenico

para la tuberculosis y que estas nuevas teacutecnicas moleculares no pueden reemplazarlo aunque proveen informacioacuten preliminar y mejoran el manejo del paciente

INTRODUCCIOacuteN

La tuberculosis (TB) una de las principales enshyfermedades infecciosas en el mundo y es resshyponsable por maacutes de 2 millones de muertes y 8 millones de nuevos casos anualmente La enfermedad es causada por una bacteria llashymada Mycobacterium tuberculosis La bacteria usualmente ataca los pulmones pero podriacutea infectar cualquier parte del cuerpo como los rintildeones el intestino la pleura la columna vershytebral y el cerebro Y si no es tratada adecuashydamente esta enfermedad infecciosa puede ser fatal

La estrategia de control maacutes importante para la TB es la deteccioacuten temprana y el apropiado tratamiento de casos infecciosos La tasa de deshyteccioacuten de casos (TDC) global es de alrededor el 64 lo cual implica que alrededor del 36 de casos de TB incidente no son detectados Esto deja una brecha de aproximadamente 33 mishyllones de personas con TB alrededor del mundo que se ldquoperdieronrdquo tanto porque no fueron diashygnosticadas o porque fueron diagnosticadas pero esto no se reportoacute (1) Para las Ameacutericas la TDC es alrededor del 79 lo cual significa que anualmente 33000 pacientes con TB no son detectados o reportados (1)

Los laboratorios tienen un rol central en el diashygnoacutestico de TB es asiacute que reforzar su desemshypentildeo y capacidad es prioritario para el control de esta enfermedad Sin embargo el diagnoacutestishyco de TB en la mayoriacutea de laboratorios se hace por los llamados meacutetodos convencionales y la mayoriacutea de casos de TB son diagnosticados por baciloscopiacutea La baciloscopiacutea tiene una sensishybilidad de cerca del 60shy70 de los casos de TB Adicionalmente alrededor del 25 de todos los

casos de TB son extrapulmonares y para el diashygnoacutestico de esta presentacioacuten de TB la examishynacioacuten de esputo no seriacutea aplicable afectando la deteccioacuten de estos casos La implementacioacuten del cultivo para el diagnoacutestico puede mejorar la tasa de deteccioacuten de TB en un laboratorio en alrededor de un 30 a 40 El cultivo detecta casos con baja carga micobacteriana y tambieacuten se solicita en casos en riesgo de ser TB resisshytentes para evaluar su sensibilidad a diferentes drogas (DST) o en casos donde se sospecha que la enfermedad se debe a otro miembro del geacutenero Mycobacterium Estos dos meacutetodos de laboratorio la baciloscopiacutea y el cultivo son todaviacutea los ldquogold standarsrdquo para el diagnoacutestico de TB siendo el cultivo el meacutetodo maacutes sensishyble Sin embargo debido al lento crecimiento de las micobacterias los resultados pueden tardar de 3 a 4 semanas es asiacute que nuevas y raacutepidas teacutecnicas de diagnoacutestico son requeridas para mejorar el diagnoacutestico de TB y el manejo del paciente

Desde inicios de los 90s nuevas teacutecnicas de laboratorio para el diagnoacutestico de TB y las prueshybas de sensibilidad a drogas han sido desarroshylladas basadas en el uso de medios de cultivo liacutequidos teacutecnicas de amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos (NAATs del ingleacutes nucleic acid amshyplification tests) hibridizacioacuten de ADN y teacutecshynicas para la deteccioacuten de mutaciones y deshyteccioacuten de antiacutegenos y anticuerpos Esta mini revisioacuten pretende ofrecer algo de informacioacuten general sobre nuevas teacutecnicas de laboratorio que estaacuten disponibles actualmente para el diashygnoacutestico de TB activa o la deteccioacuten de una infeccioacuten latente por TB Esta revisioacuten abarca solamente las teacutecnicas maacutes importantes que se han desarrollado La comparacioacuten de meacuteshytodos no estaacute dentro de los objetivos de este artiacuteculo y lectores interesados son referidos a la literatura maacutes especializada



MEJORAS EN LA BACILOSCOPIacuteA PARA EL DIAGNOacuteSTICO DE TB

La examinacioacuten microscoacutepica de muestras de esputo ha sido la base de la deteccioacuten de casos de TB por maacutes de 100 antildeos y todaviacutea es el meacutetodo principal en sitios con presupuestos limitados donde el diagnoacutestico de TB se basa uacutenicamente en la tincioacuten de ZiehlshyNeelsen y la observacioacuten del frotis con el microscopio oacutepshytico Este procedimiento detecta solamente alrededor del 60shy70 de los casos de TB Una alternativa es el uso del microscopio de fluoshyrescencia que puede ser 10 maacutes sensible que el microscopio oacuteptico debido a que el bacilo fluorescente puede ser visto a un aumento maacutes bajo y el frotis puede ser examinado en solashymente el 25 del tiempo que toma examinarlo con el microscopio oacuteptico Sin embargo ha sido difiacutecil implementar este microscopio en el diagshynoacutestico de TB debido al alto costo asociado con la compra de un microscopio con una laacutempara de vapor de mercurio la necesidad de reemplashyzar frecuentemente esta laacutempara de UV la cual dura solamente 200shy300h y la necesidad de un cuarto oscuro para la lectura de las placas (2)

El desarrollo reciente de la tecnologiacutea dio lugar al microscopio de fluorescencia el mismo que usa un sistema de iluminacioacuten basado en la luz emitida por un diodo (LED) con un tiempo de vida uacutetil de hasta diez mil horas lo cual reshysulta en la microscopiacutea de fluorescencia LED Es asiacute que microscopios fluorescentes LED relativamente econoacutemicos estaacuten disponibles La Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) ha evaluado la eficacia de la microscopiacutea LED y los resultados mostraron que el diagnoacutestico con este microscopio fue maacutes sensible (alrededor del 10) que con el microscopio oacuteptico (23) Basaacutendose en estas consideraciones la OMS recomienda que la microscopiacutea convencional y la fluorescente sean reemplazadas por la mishycroscopia LED

EL CULTIVO EN MEDIO LIacuteQUIDO PARA EL DIAGNOacuteSTICO DE TUBERCULOSIS

El ldquogold standardrdquo para el diagnoacutestico de TB es todaviacutea el aislamiento de M tuberculosis en un medio de cultivo El cultivo provee ademaacutes aislados para identificacioacuten (basada en pruebas bioquiacutemicas y moleculares) y para DST Hasta inishycios de los noventas el cultivo era usualmente hecho en medio soacutelido basado en huevo como el LowensteinshyJensen y el medio Stonebrink Una desventaja del cultivo en estos medios soacutelishydos es el lento crecimiento de la bacteria que puede tomar al menos de 2 a 4 semanas o a veces maacutes antes de que el cultivo deacute positivo

Los medios liacutequidos tienen una incrementada sensibilidad para el crecimiento de M tubercu-losis (hasta un 20 de incremento en la positivishydad) y un reducido tiempo de deteccioacuten (10shy14 diacuteas versus 2shy4 semanas) El inconveniente es la tasa de contaminacioacuten del medio liacutequido el cual parece ser maacutes alto en comparacioacuten con el soacutelido (4) La OMS recomienda el uso del medio soacutelido convencional junto con el medio liacutequido para el aislamiento primario de micobacterias

El medio liacutequido consiste en caldo Middlebrook 7H9 suplementado con 10 de OADC (aacutecido oleico albuacutemina dextrosa y catalasa) y para evitar la contaminacioacuten con otros microorshyganismos se agrega PANTA (una mezcla de antibioacuteticos polimixina anfotericina B aacutecido nalidiacutexico trimetoprim y azlocilina) En la acshytualidad se dispone tambieacuten de sistemas de cultivos elaborados que estaacuten disponibles comshyercialmente Estos van desde botellas simples y tubos tales como MGIT (BD Diagnostic Systems USA) SeptishyChek AFB (BD USA) y MB Redox (Biotest Diagnostics USA) hasta sistemas semishyautomatizados (BACTEC 460TB) y totalmente automatizados (BACTEC 9000 MB) BACTEC MGIT 960 (BD USA) ESP Culture System II [Trek Diagnostics USA] y MBBacT ALERT 3D System (BioMeacuterieux NC) Para estudios comparativos



de estos sistemas (semi) automatizados el lecshytor puede referirse a literatura especializada (5 6 7)

HERRAMIENTAS BASADAS EN EL ADN PARA EL DIAGNOacuteSTICO DE TB

Tests claacutesicos para la amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos (NAATs del ingleacutes Nucleic Acid Amplification Tests)

Desde inicios de los antildeos noventa varias metodologiacuteas han sido publicadas para la detecshycioacuten de M tuberculosis con la reaccioacuten en cashydena de la polimerasa (PCR) usando cebadores oligonucleoacutetidos para amplificar un fragmento de ADN especiacutefico para este microorganismo Estos NAATs pueden arrojar resultados en 3shy6 horas e incluyen a aquellos comerciales y a los ldquohechos en casardquo basados en un protocolo deshysarrollado en un laboratorio noshycomercial Cada NAAT usa un meacutetodo diferente para amplificar regiones especiacuteficas del aacutecido nucleico del comshyplejo Mycobacterium tuberculosis

Varios NAATs comerciales existen y la FDA (US Food and Drug Administration) ha aprobado el uso de algunos de ellos para muestras respiratoshyrias solamente Estos kits incluyen el GenProbe Amplified M tuberculosis Direct test (AMTD) el Roche Amplicor MTB test el Cobas Amplicor test el Abbott LCx test y el BDshyProbeTec (SDA) test (8) Ninguno de estos tests ha sido aproshybado para la deteccioacuten directa de M tubercushylosis de muestras extrapulmonares Aunque toda esta tecnologiacutea es raacutepida y ha demostrado excelente especificidad su desempentildeo puede variar y todaviacutea su sensibilidad no iguala a la de los meacutetodos basados en el cultivo especialshymente para muestras con baciloscopiacutea negatishyva Un metashyanaacutelisis reciente que analizaba la exactitud de los meacutetodos comerciales NAATs mostroacute 125 estudios que analizaban muestras con frotis positivos y determinoacute que habiacutea un alto grado de variabilidad en la exactitud entre

los estudios (9) Este anaacutelisis concluye que exisshyte la necesidad de mejorar la exactitud de los NAATs particularmente la sensibilidad y que NAATs comerciales no pueden ser recomendashydos para reemplazar el cultivo y la microscopiacutea para el diagnoacutestico de TB pulmonar (8 9)

La amplificacioacuten isoteacutermica de aacutecidos nucleicos (LAMP del ingleacutes Loop-Mediated Isothermal Amplification)

Otro ejemplo de NAAT comercial y que ha sido disentildeado recientemente es la amplificacioacuten isoteacutermica de aacutecidos nucleicos (LAMP del inshygleacutes Loopshymediated Isothermal Amplification) La experiencia en investigacioacuten de este test es limitada Este meacutetodo se fundamenta en la nueshyva plataforma loopshymediated isothermal amplishyfication (LAMP) de Eiken Chemical Co en Japoacuten Esta tecnologiacutea amplifica un ADN diana bajo condiciones isoteacutermicas (alrededor de 65degC) y estaacute disentildeado para detectar visualmente ADN de muestras cliacutenicas en menos de dos horas y con un miacutenimo de instrumentacioacuten No hay la neceshysidad de un paso previo de desnaturalizacioacuten de la doble cadena a su forma simple La amplifishycacioacuten y deteccioacuten del ADN se dan en el mismo microtubo (Figura 1) El relativamente compleshyjo proceso de amplificacioacuten se detalla en el sishytio web de Eiken en el que tambieacuten se incluye una animacioacuten de la reaccioacuten (httploopampeikencojpelampindexhtml) Un grupo exshyperto de la OMS concuerda en que la tecnologiacutea LAMP tiene potencial para ser una herramienta diagnoacutestica raacutepida de TB pero que la evidencia disponible de este ensayo es insuficiente para recomendarlo como prueba que sustituya a la microscopiacutea tradicional Actualmente en 14 sishytios la OMS conduce estudios independientes para probar el ensayo TB LAMP evaluando su factibilidad y costoshyefectividad Los resultados se esperan en el antildeo 2015 (10)



El Xpert MTBRIF test para el diagnoacutestico de TB resistente a drogas

Los meacutetodos NAATs disponibles para la deshyteccioacuten de ADN de M tuberculosis incluyen procesamiento de la muestra de esputo y exshytraccioacuten del ADN como dos pasos separados El Xpert MTBRIF integra procesamiento del esputo extraccioacuten de ADN y amplificacioacuten en un solo paso de preparacioacuten de la muestra (Figura 2) Este meacutetodo automatizado basado en cartuchos detecta directamente del esputo y en menos de dos horas simultaacuteneamente el complejo M tuberculosis y la resistencia a la rifampicina La tecnologiacutea se basa en la platashyforma GeneXpert (11) Esta plataforma posishybilita la deteccioacuten de resistencia a la rifamshypicina a traveacutes de la deteccioacuten de mutaciones en el gen rpoB El sistema cerrado de esta tecnologiacutea disminuye el riesgo de contamishynacioacuten y no son necesarias instalaciones de bioseguridad especiales Una revisioacuten sobre la precisioacuten de este meacutetodo y que incluye 27 estudios concluye que en comparacioacuten con la microscopiacutea el Xpertreg MTBRIF incrementa la

deteccioacuten de TB entre casos confirmados por cultivo en un 23 Para la deteccioacuten de reshysistencia a la rifampicina el Xpertreg MTBRIF muestra una sensibilidad acumulada de 95 y una especificidad acumulada de 98 (12) La OMS recomendoacute en diciembre del 2010 el uso del Xpertreg MTBRIF y en la actualidad estaacute promoviendo la introduccioacuten global de esta tecnologiacutea Con la finalidad de facilitar el acceso a esta tecnologiacutea el sector puacuteblico de ciertos paiacuteses puede adquirir los cartuchos a precios significativamente reducidos Hasta el 31 de diciembre del 2014 cerca de 4000 GeneXpert instrumentos y maacutes de 10 milshylones de cartuchos MTBRIF han sido adquirishydos por el sector puacuteblico de 116 de los 145 paiacuteses elegidos para acceder a ese beneficio (13)

SERODIAGNOacuteSTICO DE TUBERCULOSIS

La deteccioacuten de anticuerpos contra M tubercu-losis en suero serodiagnoacutestico podriacutea ofrecer resultados raacutepidos a bajo costo pero desaforshytunadamente los tests de los que se dispone

Figura 1 Reacciones positivas para LAMP

Reacciones positivas para LAMP se muestran en los dos tubos de la derecha Amplificacioacuten y deteccioacuten de ADN se dan en mismo tubo Los dos tubos de la izquierda son negativos La imagen se tomoacute bajo luz UV y la fluorescencia se debe a la adicioacuten de PicoGreen a todos los tubos un colorante que se liga al ADN el cual se integraraacute al producto amplificado Este complejo colorante-ADN emitiraacute fluorescencia bajo luz UV lo cual hace faacutecil distinguir entre reacciones positivas y negativas Adaptado de httpwwwfinddiagnosticsorgprogramstbfind_activitieslamp_assayhtml



actualmente tienen aplicacioacuten limitada debido a la reaccioacuten cruzada y baja sensibilidad

La deteccioacuten de anticuerpos es relativamente simple y es un meacutetodo costo shy efectivo pero reshycientes metashyanaacutelisis y revisiones sistemaacuteticas concluyen que las pruebas seroloacutegicas comershyciales disponibles proveen resultados inconsisshytentes (14) La OMS actualmente no aprueba su uso para el diagnoacutestico de TB pulmonar ni extrashypulmonar (15) Maacutes investigacioacuten es necesaria para desarrollar tests basados en la respuesta inmune o en el serodiagnoacutestico y que tengan un desempentildeo adecuado

DIAGNOacuteSTICO DE INFECCIOacuteN LATENTE POR M TUBERCULOSIS

Personas con infeccioacuten latente por TB estaacuten inshyfectadas por M tuberculosis pero no tienen la enfermedad Alrededor del 30 de la poblacioacuten mundial estaacute infectada con M tuberculosis y hasta hace poco esto podiacutea ser detectado con el test de la tuberculina (TST del ingleacutes tuberculin skin test) tambieacuten llamado test de Mantoux Este test se hace inyectando intradeacutershymicamente una pequentildea cantidad de proteiacutena derivativa purificada de M tuberculosis (PPD del ingleacutes purified protein derivative) en la piel de la parte interna del antebrazo Si ha habido

Figura 2 Procedimiento para la tecnologiacutea MTBRIF

De httpwwwfinddiagnosticsorgprogramstbfind_activitiesautomated_naathtml



exposicioacuten previa a M tuberculosis una indurashycioacuten se desarrollaraacute en el sitio de la inyeccioacuten dentro de 2 diacuteas

El test no diferencia entre infeccioacuten latente y enfermedad activa y sus limitaciones incluyenshydo la baja sensibilidad y especificidad han sido bien documentadas Resultados falsos positivos en el TST pueden resultar por contacto con mishycobacterias no tuberculosas o vacunacioacuten con el Bacilo de CalmetteshyGuerin (BCG) debido a que la PPD una preparacioacuten de proteiacutena cruda conshytiene antiacutegenos que estaacuten tambieacuten presentes en BCG y en ciertas micobacterias no tuberculoshysas (16 17) Sin embargo el test en piel todaviacutea permanece como el maacutes empleado para identishyficar la infeccioacuten de TB o el estado inmunoloacutegico del paciente frente a la infeccioacuten

Reconocer que el interferoacuten gamma (IFNshyγ) tiene un papel criacutetico en regular la respuesta inmune mediada por ceacutelulas frente a la infecshycioacuten por M tuberculosis condujo al desarrollo de pruebas alternativas para la deteccioacuten de la infeccioacuten de TB ensayos de liberacioacuten de IFNshyγ (IGRAs del ingleacutes IFNshyγshy release assays) IGRAs consisten en tests in vitro en sangre que mide la respuesta inmune mediada por ceacutelulas de hecho se mide la liberacioacuten de interferoacuten (IFNshyγ) por las ceacutelulas T luego de la estimulacioacuten de una muestra del sangre del paciente con antiacutegenos especiacuteficos de TB ESATshy6 y CFPshy10 uacutenicos para M tuberculosis En otras palabras IGRAs detec-ta la sensibilizacioacuten a M tuberculosis midiendo la liberacioacuten de IFNshyγ en respuesta a antiacutegenos representativos de M tuberculosis Hay dos IGRAs disponibles comercialmente Quantiferon TB Gold tests Cellestis Victoria Australia y TshySPOTTB Oxford Immunotec Abington UK Varios estudios publicados han demostrado un mejor desempentildeo de estos tests sobre el TST en el diagnoacutestico de infeccioacuten por M tubercushylosis (18) A pesar de la evidencia de estos estushydios el no tener un estaacutendar de referencia para la infeccioacuten hace difiacutecil acceder a la verdadera

exactitud de estos ensayos IGRAs no puede disshytinguir entre infecciones de TB activas y latentes y no deberiacutea ser usado para el diagnoacutestico de TB activa

Identificacioacuten de especies de Mycobacterium

El geacutenero Mycobacterium comprende maacutes de 150 especies y varias nuevas especies de mishycobacterias no tuberculosas (MNT) patogeacutenishycas han sido descritas en los uacuteltimos 20 antildeos Aunque la mayoriacutea de casos de TB a nivel munshydial son causados por M tuberculosis cada esshypecies del complejo M tuberculosis puede caushysar tuberculosis en humanos por ejemplo M bovis transmitido por el ganado o M caprae por las cabras Las especies de MNT maacutes frecuentshyemente asociadas con enfermedad pulmonar son M avium M kansaii y M abscessus y en algunos paiacuteses infecciones por MNT han sido maacutes importantes que la misma TB (19) Desde el punto de vista epidemioloacutegico y debido a que el tratamiento difiere dependiendo de la especie de micobacteria la identificacioacuten en el laborashytorio cliacutenico es definitivamente importante

Tradicionalmente las micobacterias fueron identificadas por meacutetodos fenotiacutepicos basado en el cultivo tales como caracteriacutesticas morshyfoloacutegicas tasas y temperaturas de crecimiento pigmentacioacuten y una serie de pruebas bioquiacutemishycas como la acumulacioacuten de niacina (M tuber-culosis) reduccioacuten de nitratos hidroacutelisis de Tween 80 actividad de arilsulfatasa y ureasa e ingesta de hierro Sin embargo la identificacioacuten por estos meacutetodos es laboriosa consume tiemshypo e implica riesgo bioloacutegico sumado a que una incorrecta identificacioacuten puede ocurrir ya que diferentes especies pueden tener perfiles morshyfoloacutegicos y bioquiacutemicos no distinguibles

Identificacioacuten basada en la tecnologiacutea ADN

En la uacuteltima deacutecada meacutetodos moleculares han sido desarrollados para la raacutepida y fiable idenshytificacioacuten de especies de micobacterias Un



meacutetodo relativamente faacutecil se basa en el PCR y anaacutelisis de enzimas de restriccioacuten (PRA del inshygleacutes PCR and restriction enzyme analysis) de los genes codificados por la proteiacutena de shock teacutermico hsp65 (20) Este gen estaacute presente en todas las especies de micobacterias y los pashytrones generados por dos enzimas (HaeIII y BstEII) de un producto de PCR de 439 pares de bases del gen hsp 65 pueden ser comparados con patrones disponibles en la base de datos para la identificacioacuten de especies tambieacuten llashymado sitio PRA con perfiles para casi todas la especies micobacterianas (httpappchuvchprasiteindexhtml)

Otro meacutetodo es la secuenciacioacuten del gen 16S ARN ribosomal el estaacutendar de referencia frenshyte al cual todos las nuevas teacutecnicas de identishyficacioacuten generalmente se comparan (23) El PCR para la amplificacioacuten del gen 16S ARNr puede hacerse por meacutetodos convencionales o con kits disponibles comercialmente como el MicroSeq 500 16S ribosomal DNA (rDNA) bacterial sequencing kit (Applied Biosystems Foster City Calif) Este kit se basa en el PCR y la secuenciacioacuten de las primeras 500 pares de bases del ARNr bacteriano El secuenshyciamiento puede hacerse faacutecil y econoacutemishycamente con proveedores del servicio de secuenciacioacuten disponibles comercialmente (aproximadamente $5 USD por secuencia) La identificacioacuten requiere una sola reaccioacuten de secuenciacioacuten lo cual es costoshyefectivo Para la identificacioacuten final de especies la secuenshycia obtenida puede ser comparada con bases de datos puacuteblicas disponibles la base de dashytos EzTaxon (httpwwwezbiocloudnet) o el (GenBank) del NCBI (National Center for Biotechnology Information httpwwwncbinlmnihgov)

Hay varios sistemas comerciales disponibles para la identificacioacuten de micobacterias El primer meacutetodo disponible fue el AccuProbe (Genshy Probe Inc) basado en sondas de ADN

especiacuteficas con un marcador quimioluminisshycente que se hibridiza al ARN ribosomal del organismo blanco El test es faacutecil de realizar y hace posible una identificacioacuten raacutepida Los reshysultados son leiacutedos con un luminoacutemetro Test individuales para la identificacioacuten de varias importantes micobacterias estaacuten disponibles incluyendo el complejo M tuberculosis M avium M intracellulare el complejo M avi-um M kansasii y M gordonae

Maacutes reciente es la introduccioacuten de otros sistemas moleculares para la raacutepida identifishycacioacuten del complejo M tuberculosis y MNT el INNOshy LiPA MYCOBACTERIA v2 (Innogenetics NV Ghent Belgium) y el GenoType MTBC and GenoType Mycobacterium CMAS (Hain Lifesciences Nehren Germany) Estos tests son tambieacuten llamados ensayos de sonda de liacutenea reversa (reverse line blot assay en ingleacutes) y detectan la presencia de ciertos loci de ADN representativos de especies en un ensayo de hibridizacioacuten con un producto de PCR del mishycroorganismo aislado (Figura 3) INNOshyLiPA MYCOBACTERIA v2 es un ensayo de sonda de liacutenea que simultaacuteneamente detecta e identishyfica el complejo M tuberculosis y 16 diferenshytes especies micobacterianas El test se basa en diferencias de nucleacuteotidos en la regioacuten espaciadora 16Sshy23S ARNr y puede ser realishyzado a partir de un cultivo en medio soacutelido o liacutequido El GenoType MTBC y el GenoType Mycobacterium CM and AS son tambieacuten enshysayos de sonda de liacutenea El GenoType MTBC pretende la diferenciacioacuten de miembros del complejo M tuberculosis incluyendo M bo-vis BCG El GenoType Mycobacterium CM and AS pueden identificar 40 de las especies maacutes comunes de MNT incluyendo al complejo de M tuberculosis El GenoType Mycobacterium CM permite la identificacioacuten geneacutetica molecushylar simultaacutenea del complejo M tuberculosis y de 24 de las especies de MNT maacutes comunes mientras que el GenoType Mycobacterium



AS identifica 19 especies adicionales de MNT En general los meacutetodos moleculares ofrecen vari as ventajas sobre las teacutecnicas convencioshynales para la raacutepida deteccioacuten e identificacioacuten de cepas del complejo M tuberculosis y de otras micobacterias como son el corto tiempo para tener resultados (5shy48 horas) confianza y reproducibilidad El uso de estos meacutetodos moleculares mejora el manejo del paciente y han sido recomendados por la OMS

Identificacioacuten basada en inmunocromatografiacutea

Tres ensayos raacutepidos inmunocromatograacuteficos ha sido desarrollados para diferenciar entre cepas del complejo M tuberculosis y MNT el BDrsquos MGIT TBc ID el Taunsrsquo Capilia TB (Japan) y el SD Bioline TB Ag MPT64 Rapid Test (Korea)

Los tres son ensayos inmunocromatograacuteficos de flujo lateral (Figura 4) El BD y el SD Bioline deshytectan el antiacutegeno MPT64 mientras que el Capilia

En la tira estaacuten covalentemente unidos en liacuteneas paralelas 23 sondas de oligonucleacuteotidos que representan regiones especiacuteficas de ADN de diferentes especies de MNT y cepas del complejo M tuberculosis Algunas especies como M kansasii y M chelonea tienen maacutes de una sonda en la tira porque estas especies tienen maacutes de un tipo de secuencia de una regioacuten especifica Un producto de PCR marcado de la micobacteria de prueba es incubado con la tira y se permite la hibridizacioacuten contra secuencias homoacutelogas lo que se evidencia con una banda visible de hibridizacioacuten en la tira

Figura 3 Disentildeo de una tira de ensayo de sonda de liacutenea reversa El INNO-LiPAreg MYCOBACTERIA v2 test

MSM - 24 M smegmatis

MCH-3 - 22

MCH-2 - 21

MPO - 23

M chelonae I

M chelonae III

M fortuitum complex

marker line

Conjugate control - 1

MCH-1 - 20

MHP - 19

MCE - 12

MMU - 11

MSI - 10

MGV - 8

MGO - 8

MXE - 7

MKA-3 - 6

MKA-2 - 5

MKA-1 - 4

MTB complex - 3

MYC genus - 2

MAIS - 13

MAV - 14

MIN-1 - 15

MIN-2 - 16

MSC - 17

MML - 18

Conjugate control

M chelonae I II III IV

M haemophilum

M celatum

M marinum+ M ulcerans

M simiae

M genavense

M gordonae

M xenopi

M kansasii III IV V

M kansasii II

M kansasii I

MTB complex

Mycrobacterium genus

MAIS complex

M avium

M intracellulare 1

M intracellulare 2

M scrofulaceum

M malmoense



detecta el antiacutegeno MPB64 ambas proteiacutenas secretoras especiacuteficas del complejo M tubercushylosis Tanto medios soacutelidos como liacutequidos pueshyden ser usados como muestras aunque el BD ha sido desarrollado para usarse con cultivos liacutequidos (MGIT) Si se usan cultivos soacutelidos una solucioacuten tampoacuten es requerida (24) Un control positivo interno es incluido para validar la prueshyba El tiempo de lectura es de 15 minutos y no se requiere de equipamiento especial Este test ha mostrado ser altamente sensible (gt 95) y especiacutefico (gt 95) en varios estudios cliacutenicos (24)

TEST DE SENSIBILIDAD A DROGAS (TSD DEL INGLEacuteS DRUG SENSITIVITY TESTING)

El surgimiento y diseminacioacuten de la tuberculoshysis multirresistente (TBshyMR) y de la tuberculosis extensamente resistente (TBshyER) son un imporshytante problema meacutedico y de salud puacuteblica La TBshyMR es un tipo de tuberculosis resistente

al menos a dos de los antibioacuteticos de primera liacutenea rifampicina e isoniacida La TBshyER se deshyfine como la TB que en adicioacuten a la rifampicina e isoniacida es resistente a cualquier fluoroshyquinolona y al menos a una de las tres drogas inyectables de segunda liacutenea (capreomicina kanamicina y amikacina) La deteccioacuten temshyprana de la resistencia a drogas es importante y reduce el tiempo desde el diagnoacutestico de TB al inicio de un tratamiento apropiado mejorando la recuperacioacuten del paciente y tambieacuten ayushydando al control de la transmisioacuten de cepas reshysistentes en la poblacioacuten Los meacutetodos convenshycionales para establecer la sensibilidad a drogas son lentos El maacutes usado el meacutetodo estaacutendar de proporciones en medio LoumlwensteinshyJensen o en agar Middlebrook requiere de 4 a 8 seshymanas para dar resultados El meacutetodo estaacutendar de proporciones es tambieacuten llamado ldquomeacutetodo indirectordquo ya que requiere un procedimiento secuencial aislamiento de micobacterias de las

Adaptado de httpwwwfinddiagnosticsorgprogramstbfind_activitiesrapid_speciation_testhtml

Figura 4 Un ejemplo de un test inmunocromatograacutefico de flujo lateral positivo para la identificacioacuten de cepas del complejo M tuberculosis en el medio soacutelido Lowenstein Jensen



muestras cliacutenicas identificacioacuten del complejo M tuberculosis y las pruebas de susceptibilishydad in vitro en presencia de drogas antishyTB En los uacuteltimos 15 antildeos otros meacutetodos basados en cultivo y biologiacutea molecular han sido desarroshyllados y algunos de ellos son ldquomeacutetodos direcshytosrdquo en los que se usan los especiacutemenes del paciente directamente evadiendo el tiempo necesario para aislar M tuberculosis en cultivos puros (25 26)

Meacutetodos no comerciales de DST basados en cultivo

Meacutetodos basados en cultivo han sido propuesshytos para la deteccioacuten raacutepida de la resistencia a drogas propuestos para ser usados en lugares de bajo presupuesto Entre estos meacutetodos esshytaacuten la observacioacuten microscoacutepica de la resistenshycia a drogas (MODS del ingleacutes microscopic obshyservation of drug susceptibility) agar de capa fina (TLA del ingleacutes thin layer agar) meacutetodos colorimeacutetricos con indicador redox (CRI del inshygleacutes colorimetric redox indicator) y el ensayo de nitrato reductasa (NRA del ingleacutes nitrate reshyductase assay) (27shy30) Estos meacutetodos pueden reportar resultados de susceptibilidad 1 a 2 seshymanas luego de la inoculacioacuten

En los meacutetodos MODS y TLA medios libres de drogas y medios que las contienen (liacutequidos para MODS y soacutelidos para TLA) son inoculados directamente con especiacutemenes de pacientes De esta manera no hay primero el crecimiento en cultivos puros Los cultivos son microscoacutepishycamente examinados para el crecimiento temshyprano de microshycolonias Crecimiento en el medio libre de drogas indica un cultivo posishytivo y el crecimiento en ambos medios indica resistencia

Los meacutetodos colorimeacutetricos con indicador reshydox (CRI) son meacutetodos indirectos de tal maneshyra que necesitan un cultivo puro de los espeshyciacutemenes cliacutenicos Estos meacutetodos se basan en la

reduccioacuten de un indicador adicionado al cultivo liacutequido en una microplaca donde el M tuber-culosis ha sido preincubado por varios diacuteas in vitro y frente a diferentes concentraciones de drogas La resistencia es detectada por un camshybio de color en el indicador lo cual es proporshycional al nuacutemero de micobacterias viables en el medio Entre los indicadores de crecimiento usados como indicadores redox estaacuten el azul de alamar y la resazurina

El ensayo de nitrato reductasa (NRA) es una teacutecshynica en cultivo soacutelido basado en la capacidad de M tuberculosis de reducir nitratos a nitritos lo cual es detectado al adicionar un reactivo esshypeciacutefico (Griess reagent) al medio convencional LoumlwensteinshyJensen (LJ) que contiene 1 mgml de nitrato de potasio (KNO3) La reduccioacuten de nishytrato es detectada por una reaccioacuten coloreada Este meacutetodo puede ser directo o indirecto La prueba de resistencia se hace inoculando dishyrectamente las muestras del paciente o el culshytivo puro de M tuberculosis en el medio que contiene antibioacuteticos Una reaccioacuten coloreada en el medio libre de drogas solamente indica un cultivo positivo y el crecimiento en ambos medios con y sin drogas indicariacutea resistencia

Los meacutetodos MODS CRI y el NRA recibieron la aprobacioacuten de la OMS no asiacute el TLA Estos meacutetodos tienen similar exactitud que los sisteshymas comerciales de cultivo liacutequido y podriacutean ser implementados a costos miacutenimos en lugares de bajos ingresos y con alta cantidad de muestras Sin embargo estas pruebas requieren un extenshyso entrenamiento del operador asiacute como estanshydarizacioacuten y aseguramiento de la calidad antes de su implementacioacuten (25 26)

Pruebas comerciales para la susceptibilidad a drogas (DST) en cultivos liacutequidos

El sistema comercial de DST maacutes comuacutenmente usado en cultivo liacutequido es el BACTEC MGIT 960 system con el kit BACTEC MGIT 960 SIRE



(Becton Dickinson Franklin Lakes New Jersey USA) Este es un meacutetodo indirecto para proshybar la susceptibilidad frente a antibioacuteticos de primera liacutenea (isoniacida rifampicina etamshybutol y pirazinamida) El test se hace con culshytivos positivos del complejo M tuberculosis inoculados en medios liacutequidos con las drogas y sin ellas y los resultados de susceptibilidad pushyeden reportarse en 1 a 2 semanas despueacutes de la inoculacioacuten El meacutetodo ha demostrado ser equivalente al meacutetodo estaacutendar de proporcioshynes y ha sido aprobado por la FDA y promovishydo por la OMS Otros sistemas automatizados de DST de M tuberculosis que usan medio de

cultivo liacutequido incluyen el sistema BacTALERT MB (bioMerieux Inc Durham North Carolina USA) y el VersaTREK system (Trek Diagnostic Systems West Lake Ohio USA) El uso de estos sistemas comerciales en los que se inoculan en medios de cultivo con drogas las especiacutemenes de pacientes que fueron positivos en el frotis potencialmente reduciriacutea el tiempo en el que se reportan los resultados de DST en 1 shy 3 seshymanas Sin embargo las ldquopruebas directas de susceptibilidadrdquo de los especiacutemenes cliacutenicos es problemaacutetica debido al potencial de tener bacterias contaminantes y otras especies noshytuberculosas lo que resulta en que estos tests

Se muestran los resultados de DST de 5 cepas del complejo M tuberculosis (1) cepa susceptible (2) cepa resistente a rifampicina y con alto nivel de resistencia a la isoniacida (3) cepa sensible a rifampicina y bajo nivel de resistencia a isoniacida (4) cepa resistente a rifampicina y un alto y bajo nivel de resistencia para isoniacida (5) cepa resistente a rifampicina y con alto nivel de resistencia a isoniacida La tira contiene 27 bandas 21 son para detectar mutaciones en regiones de genes asociados con resistencia (11 bandas detectan el loci del tipo salvaje y 10 bandas detectan el loci de resistencia a antibioacuteticos) Seis bandas en la tira son bandas controles control del conjugado control de amplificacioacuten control del complejo M tuberculosis y los controles de amplificacioacuten del loci de los genes rpoβ katG y inhA

Figura 5 Un ejemplo de un ldquoreverse line blot assayrdquo el Genotype MTBDRplus strip

Control

Resistencia a rifampicin

Resistencia de alto nivel a isoniacida

Resistencia de bajo nivel a isoniacida



pueden fallar hasta en un 15 Por esta razoacuten la mayoriacutea de laboratorios confiacutean en los meacutetoshydos indirectos usando un aislamiento primario para las pruebas de susceptibilidad

Meacutetodos moleculares raacutepidos para TSD

Mucho esfuerzo ha convocado la investigashycioacuten en describir las mutaciones presentes en aquellos genes de M tuberculosis asociados con la resistencia a las drogas antishyTB Este conocimiento ha posibilitado el desarrollo de ensayos raacutepidos basados en el ADN tambieacuten llashymados ldquomolecular line probe assaysrdquo que pershymiten la deteccioacuten simultaacutenea del complejo M tuberculosis y de las mutaciones asociadas con la resistencia a rifampicina (sola o en combishynacioacuten con isoniacida) Estos ensayos se basan en el PCR y pueden ser usados directamente con especiacutemenes cliacutenicos dando resultados dentro de 24 a 48 horas una mejora considerashyble en comparacioacuten al tiempo que requiere un convencional TSD que es generalmente de 1 a 2 meses A partir de un cultivo o una muestra cliacutenica positiva para M tuberculosis se amplishyfica por PCR la regioacuten del gen asociada a resisshytencia seguido por un segundo ensayo para deshyterminar si esta secuencia contiene mutaciones relacionadas a esa resistencia Esto se realiza con ensayos de hibridizacioacuten Los productos de PCR marcados son hibridizados con sondas de oligonucleoacutetidos inmovilizadas en tiras de nitroshycelulosa Las mutaciones se detectan por falta de unioacuten a las sondas de las cepas salvajes o por unioacuten a sondas especiacuteficas para mutaciones que ocurren comuacutenmente (Figura 5)

Actualmente dos ensayos comerciales de este tipo existen el INNOshyLiPA1 RifTB (Innogenetics Ghent Belgium) y el GenoType MTBDRplusreg (Hain LifeScience GmbH Nehren Germany) El LiPA detecta simultaacuteneamente el complejo M tuberculosis y la resistencia a la rifampicina El GenoType MTBDRplusreg detecta resistencia a rifampicina asiacute como altos y bajos niveles de

resistencia a isoniacida (Figura 5) En ambos tests la identificacioacuten de resistencia a la rifamshypicina se da por la deteccioacuten de mutaciones significantes en el gen rpoB (que codifica para la subunidad β de la ARN polimerasa) Para evaluar la alta resistencia a la isoniacida el gen katG (que codifica para la catalasa peroxidasa) es examinado y para el bajo nivel de resistencia se analiza la regioacuten del promotor del gen inhA (que codifica para la NADH enoyl ACP reducshytasa) Recientemente el GenoType MTBDRsl se ha disentildeado para evaluar la resistencia a droshygas antishyTB de segunda liacutenea (fluoroquinolonas e tambutol aminoglicoacutesidos y peacuteptidos ciacuteclicos) Este test puede ser usado en combinacioacuten con el MTBDRplus para identificar TBshyER

La OMS ha recomendado el uso del INNOshyLiPA1 RifTB y del GenoType MTBDRplusreg LiPA para el diagnoacutestico raacutepido de TBshyMR en sitios con niveles altos de TBshyMR Varios estudios evaluacutean y demuestran que los ldquoLine Probe Assaysrdquo son altamente exactos en detectar TBshyMR en una variedad de lugares y que son costoshyefectivos cuando se comparan con el cultivo de TB y los meacutetodos convencionales de DST (31shy33)

CONCLUSIONES Y DISCUSIOacuteN

En las deacutecadas pasadas varios meacutetodos moshyleculares han sido desarrollados para la detecshycioacuten identificacioacuten de especies y la evaluashycioacuten raacutepida de la susceptibilidad a drogas de las micobacterias Estos meacutetodos reducen el tiempo de diagnoacutestico de la TB de semanas a diacuteas Algunas teacutecnicas son simples pero otras son demandantes e incrementan el costo del diagnoacutestico considerablemente Algunos de esshytos nuevos meacutetodos han sido recomendados por la OMS y han mostrado su potencial para mejorar significativamente la deteccioacuten de cashysos y el manejo de pacientes inclusive los casos de TB resistente a drogas (3435) Sin embargo para la mayoriacutea de paiacuteses de bajos recursos



con altas tasas de TB donde esta tecnologiacutea es maacutes necesaria es praacutecticamente imposible que puedan acceder a la compleja infraestructura teacutecnica que estaacute nueva metodologiacutea requiere De acuerdo a reportes de la OMS el ochenta por ciento de todos los casos mundiales ocurshyren en 22 paiacuteses altamente poblados la mayoshyriacutea de ellos de bajos recursos En gran parte de estos paiacuteses el diagnoacutestico de TB se hace en base a la microscopiacutea solamente sumado a que muchos laboratorios son marginalizados por los programas de control de TB sin personal entreshynado equipo adecuado y sin mantenimiento Programas de aseguramiento de la calidad ni tampoco controles externos para algunos de esshytos laboratorios estaacuten presentes (36) Es priorishydad para estos paiacuteses el mejoramiento del sisteshyma nacional de laboratorios para proveerlos de microscopios de alta calidad y que accedan al cultivo convencional y a los tests de susceptibishylidad a drogas

Es importante puntualizar que la nueva tecshynologiacutea no puede reemplazar a los meacutetodos estaacutendares de diagnoacutestico cultivo y el tradishycional DST El cultivo es todaviacutea necesario para el diagnoacutestico de TB en pacientes con frotis negativo y el DST convencional se requiere para confirmar la resistencia detectada moleshycularmente La deteccioacuten molecular de la reshysistencia depende de la resistencia conferida por alguna mutacioacuten Sin embargo mecanisshymos alternativos de resistencia podriacutean desarshyrollarse o podriacutean aparecer mutaciones que no seriacutean detectadas por el test Para proveer reshysultados raacutepidos y confiables para el diagnoacutestishyco de TB y cuidado del paciente se necesita de una combinacioacuten de pruebas que incluyan tinshycioacuten de frotis usando microscopio de fluoresshycencia meacutetodos con medios de cultivo soacutelidos y liacutequidos y ensayos moleculares para la idenshytificacioacuten de TB y la deteccioacuten de resistencia a drogas Desde luego que la implementacioacuten de todas estas herramientas en laboratorios

de rutina requiere tambieacuten de sistemas aproshypiados de aseguramiento de la calidad

Algunos de los principales problemas en el diagnoacutestico de TB no han sido resueltos con nuevas teacutecnicas de diagnoacutestico Existe todaviacutea la necesidad de incrementar la sensibilidad en la deteccioacuten de TB entre los pacientes con TB extrashypulmonar o enfermedad paucibacishylar entre pacientes inmunocomprometidos (VIH) y nintildeos Se requiere tambieacuten de un enshysayo simple y de bajo costo para usarse en centros de atencioacuten primaria donde acuden la mayoriacutea de pacientes con TB pero en los que no se puede muchas veces tener acceso a un diagnoacutestico de la enfermedad confirmado por el laboratorio (37) Para tener un impacto en el problema de la TB en estos sitios de reshycursos limitados el diagnoacutestico ideal seriacutea un test sensible especiacutefico econoacutemicamente acshycesible y de realizacioacuten en el punto de atencioacuten a pacientes El progreso hacia un test de este tipo ha sido limitado pero talvez en un futuro cercano el descubrimiento de nuevos biomarshycadores que puedan ser medidos en el sitio de atencioacuten haraacute posible un diagnoacutestico exacto de TB con un simple test en tiemposhyreal Varias pruebas para TB en el punto de atencioacuten inshycluyendo ensayos seroloacutegicos mejorados aditamentos moleculares manuales ensayos basados en la respiracioacuten para la deteccioacuten de compuestos orgaacutenicos volaacutetiles en el paciente enfermo tecnologiacuteas con microchips y tests basados en proteomica y metaboloacutemica esshytaacuten bajo investigacioacuten (34 37) A medida que la tecnologiacutea avanza nuevas pruebas para TB y TB resistente estaraacuten disponibles en el mershycado y cuando la competencia aumente sus precios deberiacutean reducirse significativamente hacieacutendolas accesibles para paiacuteses donde los recursos son limitados y el presupuesto para la salud estaacute lejos de ser el ideal



BIBLIOGRAFIacuteA1 WHO Global tuberculosis report 2014 Geneva World Health Organization 2014 httpwwwwhointtbpublishycationsglobal_reporten (accessed Sept 12 2015)

2 Marais BJ Brittle W Painczyk K Hesseling AC Beyers N et al Use of lightshyemitting diode fluorescence microsshycopy to detect acidshyfast bacilli in sputum Clin Infect Dis 200847 203ndash207

3 Hanscheid T The future looks bright lowshycost fluoshyrescent microscopes for detection of Mycobacterium tuberculosis and Coccidiae Trans R Soc Trop Med Hyg 2008102 520ndash521

4 Somoskoumlvi A Koumldmoumln C Lantos A Baacutertfai Z Tamaacutesi L Fuumlzy J Magyar P Comparison of recoveries of mycobacshyterium tuberculosis using the automated BACTEC MGIT 960 system the BACTEC 460 TB system and LoumlwensteinshyJensen medium J Clin Microbiol 200038(6)2395shy2397

5 Heifets L Linder T Sanchez T Spencer D Brennan J Two liquid medium systems mycobacteria growth indicashytor tube and MB redox tube for Mycobacterium tubercushylosis isolation from sputum specimens J Clin Microbiol 200038(3)1227shy1230

6 WilliamsshyBouyer N Yorke R Lee HI Woods GL Comshyparison of the BACTEC MGIT 960 and ESP culture system II for growth and detection of mycobacteria J Clin Microshybiol 200038(11)4167shy4170

7 Piersimoni C Scarparo C Callegaro A Tosi CP Nista D Bornigia S Scagnelli M Rigon A Ruggiero G Goglio A Comparison of MBBact alert 3D system with radioshymetric BACTEC system and LoumlwensteinshyJensen medium for recovery and identification of mycobacteria from clinical specimens a multicenter study J Clin Microbiol 200139(2)651shy657

8 Update Nucleic acid amplification tests for tuberculoshysis MMWR Morb Mortal Wkly Rep200049593ndash594

9 Ling DI Flores LL Riley LW Pai M Commercial nucleicshyacid amplification tests for diagnosis of pulmonary tubershyculosis in respiratory specimens metashyanalysis and metashyregression PLoS One 20083(2)e1536

10 The use of a commercial loopshymediated isothermal amplification assay (TBshyLAMP) for the detection of tubershyculosis 2013 WHOHTMTB201305 Geneva Retrieved from httpappswhointirisbitstream10665831421WHO_HTM_TB_201305_engpdf

11 Cepheid GeneExpert Systems httpwwwcepheidcomuscepheidshysolutionssystemsgenexpertshysystemsgenexpertshyi

12 Steingart KR Schiller I Horne DJ Pai M Boehme CC Dendukuri N Xpertreg MTBRIF assay for pulmonary tubershyculosis and rifampicin resistance in adults Cochrane Dashytabase Syst Rev 2014 211shy 161

13 World Health Organization TB diagnostics and laboshyratory strengthening Retrieved from httpwhointtblaboratorymtbrifrollouten

14 Steingart KR Flores LL Dendukuri N et al Commershycial serological tests for the diagnosis of active pulmonary and extrashypulmonary tuberculosis an updated systematic review and metashyanalysis PLoS Med 2011 8 e1001062

15 World Health Organization Commercial serodiagnosshytic tests for diagnosis of tuberculosis policy statement WHOHTMTB20115 Geneva Switzerland WHO 2011

16 Wang L Turner MO Elwood RK Schulzer M FitzGershyald JM A metashyanalysis of the effect of Bacille Calmette Guerin vaccination on tuberculin skin test measurements Thorax 2002 57 804shy809

17 Farhat M Greenaway C Pai M Menzies D Falseshypositive tuberculin skin tests what is the absolute effect of BCG and nonshytuberculous mycobacteria Int J Tuberc Lung Dis 200610 1192shy1204

18 Centers for Disease Control and Prevention Updated Guidelines for Using Interferon Gamma Release Assays to Detect Mycobacterium tuberculosis Infection United States 2010 MMWR 201059(1shy25)

19 Prevots DR Marras TK Epidemiology of human pulshymonary infection with nontuberculous mycobacteria a review Clin Chest Med 201536(1)13shy34

20 Telenti A Marchesi F Balz M Bally F Boumlttger EC Bodshymer T Rapid identification of mycobacteria to the speshycies level by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis J Clin Microbiol 199331(2)175shy178

21 Kirschner P Springer B Vogel U et al Genotypic identification of mycobacteria by nucleic acid sequence determination report of a 2shyyear experience in a clinical laboratory J Clin Microbiol 199331(11)2882shy2889

22 Brent AJ Mugo D Musyimi R Mutiso A Morpeth S Levin M Scott JA Performance of the MGIT TBc identifishycation test and metashyanalysis of MPT64 assays for idenshytification of the Mycobacterium tuberculosis complex in liquid culture J Clin Microbiol 201149(12)4343shy4346

23 Palomino JC Vandamme P Martin A Classical and new assays for detecting drug resistance in tuberculosis Biomark Med 20148(9)1105shy1114

24 Palomino JC Molecular detection identification and drug resistance detection in Mycobacterium tuberculoshysis FEMS Immunol Med Microbiol 200956(2)103shy111

25 Minion J Leung E Menzies D Pai M Microscopicshyobservation drug susceptibility and thin layer agar asshysays for the detection of drug resistant tuberculosis a systematic review and metashyanalysis Lancet Infect Dis 201010(10)688shy698



26 Martin A Panaiotov S Portaels F Hoffner S Paloshymino JC Angeby K The nitrate reductase assay for the rapid detection of isoniazid and rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis a systematic review and metashyanalysis J Antimicrob Chemother 200862(1) 56shy64

27 Martin A Portaels F Palomino JC Colorimetric redoxshyindicator methods for the rapid detection of multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis a systematic review and metashyanalysis J Antimicrob Chemother 2007 59(2)175shy183

28 Montoro E Lemus D Echemendia M Martin A Porshytaels F Palomino JC Comparative evaluation of the nishytrate reduction assay the MTT test and the resazurin microtitre assay for drug susceptibility testing of clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis J Antimicrob Chemother 200555(4)500shy505

29 Morgan M Kalantri S Flores L Pai M A commercial line probe assay for the rapid detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis a systemshyatic review and metashyanalysis BMC Infect Dis 2005 5 1shy9

30 Ling D Zwerling A Pai M GenoType MTBDR assays for the diagnosis of multidrugshyresistant tuberculosis a metashyanalysis Eur Respir J 2008 32 1165ndash1174

31 Ling DI Zwerling AA Pai M Rapid diagnosis of drugshyresistant TB using line probe assays from evishydence to policy Expert Review of Respiratory Medicine 20082(5)583shy588

32 Boehme CC Saacks S OrsquoBrien RJ The changing landscape of diagnostic services for tuberculosis Semin Respir Crit Care Med 201334(1)17shy31

33 Parrish NM Carroll KC Role of the clinical mycobacshyteriology laboratory in diagnosis and management of tuberculosis in lowshyprevalence settings J Clin Microbiol 201149(3)772shy776

34 Parsons LM Somoskoumlvi A Gutierrez C Lee E Paramashysivan CN Abimiku A Spector S Roscigno G Nkengasong J Laboratory diagnosis of tuberculosis in resourceshypoor countries challenges and opportunities Clin Microbiol Rev 201124(2)314shy350

35 McNerney R Maeurer M Abubakar I et al Tuberculoshysis diagnostics and biomarkers needs challenges recent advances and opportunities J Infect Dis 201215205 Suppl 2S147shy58



para la tuberculosis y que estas nuevas teacutecnicas moleculares no pueden reemplazarlo aunque proveen informacioacuten preliminar y mejoran el manejo del paciente

INTRODUCCIOacuteN

La tuberculosis (TB) una de las principales enshyfermedades infecciosas en el mundo y es resshyponsable por maacutes de 2 millones de muertes y 8 millones de nuevos casos anualmente La enfermedad es causada por una bacteria llashymada Mycobacterium tuberculosis La bacteria usualmente ataca los pulmones pero podriacutea infectar cualquier parte del cuerpo como los rintildeones el intestino la pleura la columna vershytebral y el cerebro Y si no es tratada adecuashydamente esta enfermedad infecciosa puede ser fatal

La estrategia de control maacutes importante para la TB es la deteccioacuten temprana y el apropiado tratamiento de casos infecciosos La tasa de deshyteccioacuten de casos (TDC) global es de alrededor el 64 lo cual implica que alrededor del 36 de casos de TB incidente no son detectados Esto deja una brecha de aproximadamente 33 mishyllones de personas con TB alrededor del mundo que se ldquoperdieronrdquo tanto porque no fueron diashygnosticadas o porque fueron diagnosticadas pero esto no se reportoacute (1) Para las Ameacutericas la TDC es alrededor del 79 lo cual significa que anualmente 33000 pacientes con TB no son detectados o reportados (1)

Los laboratorios tienen un rol central en el diashygnoacutestico de TB es asiacute que reforzar su desemshypentildeo y capacidad es prioritario para el control de esta enfermedad Sin embargo el diagnoacutestishyco de TB en la mayoriacutea de laboratorios se hace por los llamados meacutetodos convencionales y la mayoriacutea de casos de TB son diagnosticados por baciloscopiacutea La baciloscopiacutea tiene una sensishybilidad de cerca del 60shy70 de los casos de TB Adicionalmente alrededor del 25 de todos los

casos de TB son extrapulmonares y para el diashygnoacutestico de esta presentacioacuten de TB la examishynacioacuten de esputo no seriacutea aplicable afectando la deteccioacuten de estos casos La implementacioacuten del cultivo para el diagnoacutestico puede mejorar la tasa de deteccioacuten de TB en un laboratorio en alrededor de un 30 a 40 El cultivo detecta casos con baja carga micobacteriana y tambieacuten se solicita en casos en riesgo de ser TB resisshytentes para evaluar su sensibilidad a diferentes drogas (DST) o en casos donde se sospecha que la enfermedad se debe a otro miembro del geacutenero Mycobacterium Estos dos meacutetodos de laboratorio la baciloscopiacutea y el cultivo son todaviacutea los ldquogold standarsrdquo para el diagnoacutestico de TB siendo el cultivo el meacutetodo maacutes sensishyble Sin embargo debido al lento crecimiento de las micobacterias los resultados pueden tardar de 3 a 4 semanas es asiacute que nuevas y raacutepidas teacutecnicas de diagnoacutestico son requeridas para mejorar el diagnoacutestico de TB y el manejo del paciente

Desde inicios de los 90s nuevas teacutecnicas de laboratorio para el diagnoacutestico de TB y las prueshybas de sensibilidad a drogas han sido desarroshylladas basadas en el uso de medios de cultivo liacutequidos teacutecnicas de amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos (NAATs del ingleacutes nucleic acid amshyplification tests) hibridizacioacuten de ADN y teacutecshynicas para la deteccioacuten de mutaciones y deshyteccioacuten de antiacutegenos y anticuerpos Esta mini revisioacuten pretende ofrecer algo de informacioacuten general sobre nuevas teacutecnicas de laboratorio que estaacuten disponibles actualmente para el diashygnoacutestico de TB activa o la deteccioacuten de una infeccioacuten latente por TB Esta revisioacuten abarca solamente las teacutecnicas maacutes importantes que se han desarrollado La comparacioacuten de meacuteshytodos no estaacute dentro de los objetivos de este artiacuteculo y lectores interesados son referidos a la literatura maacutes especializada
































































MCH-3 - 22

MCH-2 - 21

MPO - 23

M chelonae I

M chelonae III

M fortuitum complex

marker line


MCH-1 - 20

MHP - 19

MCE - 12

MMU - 11

MSI - 10

MGV - 8

MGO - 8

MXE - 7

MKA-3 - 6

MKA-2 - 5

MKA-1 - 4

MTB complex - 3

MYC genus - 2

MAIS - 13

MAV - 14

MIN-1 - 15

MIN-2 - 16

MSC - 17

MML - 18

Conjugate control


M haemophilum

M celatum


M simiae

M genavense

M gordonae

M xenopi

M kansasii III IV V

M kansasii II

M kansasii I

MTB complex


MAIS complex

M avium

M intracellulare 1

M intracellulare 2

M scrofulaceum

M malmoense



























Control


























































































































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M chelonae I

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MTB complex - 3

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M intracellulare 1

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MKA-2 - 5

MKA-1 - 4

MTB complex - 3

MYC genus - 2

MAIS - 13

MAV - 14

MIN-1 - 15

MIN-2 - 16

MSC - 17

MML - 18

Conjugate control


M haemophilum

M celatum


M simiae

M genavense

M gordonae

M xenopi

M kansasii III IV V

M kansasii II

M kansasii I

MTB complex


MAIS complex

M avium

M intracellulare 1

M intracellulare 2

M scrofulaceum

M malmoense



























Control











































































MCH-3 - 22

MCH-2 - 21

MPO - 23

M chelonae I

M chelonae III

M fortuitum complex

marker line


MCH-1 - 20

MHP - 19

MCE - 12

MMU - 11

MSI - 10

MGV - 8

MGO - 8

MXE - 7

MKA-3 - 6

MKA-2 - 5

MKA-1 - 4

MTB complex - 3

MYC genus - 2

MAIS - 13

MAV - 14

MIN-1 - 15

MIN-2 - 16

MSC - 17

MML - 18

Conjugate control


M haemophilum

M celatum


M simiae

M genavense

M gordonae

M xenopi

M kansasii III IV V

M kansasii II

M kansasii I

MTB complex


MAIS complex

M avium

M intracellulare 1

M intracellulare 2

M scrofulaceum

M malmoense



























Control




































































MCH-3 - 22

MCH-2 - 21

MPO - 23

M chelonae I

M chelonae III

M fortuitum complex

marker line


MCH-1 - 20

MHP - 19

MCE - 12

MMU - 11

MSI - 10

MGV - 8

MGO - 8

MXE - 7

MKA-3 - 6

MKA-2 - 5

MKA-1 - 4

MTB complex - 3

MYC genus - 2

MAIS - 13

MAV - 14

MIN-1 - 15

MIN-2 - 16

MSC - 17

MML - 18

Conjugate control


M haemophilum

M celatum


M simiae

M genavense

M gordonae

M xenopi

M kansasii III IV V

M kansasii II

M kansasii I

MTB complex


MAIS complex

M avium

M intracellulare 1

M intracellulare 2

M scrofulaceum

M malmoense



























Control





















































































Control













































































Control

































































Control


















































































































































































































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Recientes avances en el diagnóstico de tuberculosis en el