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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y VETERINARIA CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
ESTANDARIZACIÓN DEL TIEMPO DE INCUBACIÓN Y
CONCENTRACIÓN DE CaCO3, SO4(NH4)2 Y KNO3 PARA LA PRUEBA DEL
NMP CON BACTERIAS NITRIFICANTES Y DENITRIFICANTES USANDO
COMO MATRIZ COMPOST
NATALIA CAROLINA RODRIGUEZ MORENO CHRISTIAN ALFONSO TORO LOZANO
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Bogotá, D.C. Noviembre 22 del 2006
NOTA DE ADVERTENCIA "La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia". Artículo 23 de la Resolución No13 de julio de 1946.
ESTANDARIZACIÓN DEL TIEMPO DE INCUBACIÓN Y
CONCENTRACIÓN DE CaCO3, SO4(NH4)2 Y KNO3 PARA LA PRUEBA DEL
NMP CON BACTERIAS NITRIFICANTES Y DENITRIFICANTES USANDO
COMO MATRIZ COMPOST
NATALIA CAROLINA RODRÍGUEZ MORENO CHRISTIAN ALFONSO TORO LOZANO
APROBADO
__________________________ _________________________
Maria Mercedes Martínez M. Sc. Marcela Mercado Reyes M. Sc.
Directora Asesora
__________________________ _________________________
Ruth Bonilla Ph. D. Amanda Lozano M. Sc.
Jurado Jurado
ESTANDARIZACIÓN DEL TIEMPO DE INCUBACIÓN Y
CONCENTRACIÓN DE CaCO3, SO4(NH4)2 Y KNO3 PARA LA PRUEBA DEL
NMP CON BACTERIAS NITRIFICANTES Y DENITRIFICANTES USANDO
COMO MATRIZ COMPOST
NATALIA CAROLINA RODRIGUEZ MORENO CHRISTIAN ALFONSO TORO LOZANO
__________________________ _____________________________
Ángela Umaña Muñoz M. Phil. David Gómez M. Sc.
Decana Académica Director Carrera de Microbiología
Facultad de Ciencias Agrícola y Veterinaria e Industrial
DEDICATORIA
DEDICADO A NUESTROS PADRES, HERMANOS Y AMIGOS POR
QUIENES FUE POSIBLE ALCANZAR ESTE LOGRO TAN IMPORTANTE
EN NUESTRAS VIDAS
AGRADECIMIENTOS
• A la Pontificia Universidad Javeriana por el préstamo de sus instalaciones y
equipos para el desarrollo del trabajo.
• A la Doctora María Mercedes Martínez por la confianza depositada en
nosotros en momentos tan difíciles, su paciencia, asesoría y sugerencias.
• A la Doctora Marcela Mercado por sus valiosos aportes.
• A nuestros Padres y hermanos por su confianza, paciencia y dedicación.
• A nuestros amigos y compañeros por su apoyo incondicional.
• A Ti, por que sin tu apoyo y fortaleza nada habría sido posible.
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
1. INTRODUCCION 13
2. MARCO TEORICO 14
2.1. Bioinsumos agrícolas 14
2.2. Ciclos biogeoquímicos 16
2.2.1. Nitrógeno 16
2.2.1.1. Nitrificación 18
2.2.1.2. Reducción del nitrato y desnitrificación 21
2.3. Determinación microbiológica de la nitrificación y desnitrificación 23
2.4.Técnica del número más probable 25
3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION 26
3.1.Formulación del problema 26
3.2.Justificación 26
4. OBJETIVOS 27
4.1.Objetivo general 27
4.2.Objetivos Específicos 27
5. MATERIALES Y METODOS 27
5.1. Diseño de la Investigación 27
5.1.2. Población de Estudio y Muestra 28
5.1.3. Recolección de las Muestras 28
5.1.4. Regularidad de la Toma de Muestras 29
5.1.5. Variables de Estudio 29
5.2. Métodos 29
5.2.1. Determinación del pH del compost 29
5.2.2. Estandarización del Tiempo 30
5.2.3. Estandarización de Sales 30
5.2.4. Número Más Probable Bacterias Nitrificantes 31
5.2.5. Número Más Probable Bacterias Denitrificantes 32
Pág.
5.2.6. Análisis de Información 32
6. RESULTADOS 34
6.1. Muestras para estandarización del tiempo de incubación 35
6.2. Muestras para estandarización de sales 36
6.3. Estandarización del tiempo de incubación 39
6.4. Estandarización de Sales 47
6.4.1. Estandarización de la concentración de SO4(NH4)2 y la adición
o no de CaCO3 para bacterias nitrificantes 47
6.4.2. Estandarización de la concentración de KNO3 y la adición
o no de CaCO3 para bacterias denitrificantes 52
7. CONCLUSIONES 57
8. RECOMENDACIONES 58
9. BIBLIOGRAFÍA 59
ANEXOS 75
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Niveles del factor de diseño utilizados para estandarizar
la concentración de SO4(NH4)2 y KNO3 y la adición o no
de CaCO3
Figura 2. Pilas de compostaje muestreadas, Cultivos del Norte
Figura 3. Registro diario de las medias del NMP/g de bacterias
nitrificantes con desviación estándar
Figura 4. Registro de las medias del NMP/g de bacterias
nitrificantes el día 15 de las muestras recolectadas
para la estandarización del tiempo de incubación
Figura 5. Prueba positiva (roja) en caldo amonio para bacterias
nitrificantes, a los 15 días de incubación
Figura 6. Registro diario de las medias del NMP/g de bacterias de
denitrificantes con desviación estándar
Figura 7. Prueba negativa (roja) en caldo nitrato para bacterias
denitrificantes a los 15 días de incubación
Figura 8. Prueba positiva (amarilla) producida luego de la
incubación durante 15 días en caldo nitrato para bacterias
denitrificantes
Figura 9. Registro del NMP/g de bacterias denitrificantes de las
muestras recolectadas para la estandarización del tiempo
de incubación
Figura 10. Registro de las medias por tratamiento del NMP/g de
bacterias nitrificantes con desviación estándar
Figura 11. Registro de las medias por tratamiento del NMP/g de
bacterias denitrificantes con desviación estándar
Pág.
28
35
39
40
41
43
45
45
46
49
53
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Medio amonio (anexo 1) con componentes a diferentes
concentraciones
Tabla 2. Medio nitrato (anexo 1) con componentes a diferentes
concentraciones
Tabla 3. Muestras recolectadas para la estandarización del tiempo de
incubación del NMP en bacterias nitrificantes y
denitrificantes.
Tabla 4. Muestras recolectadas para la estandarización de la
concentración de SO4(NH4)2 y KNO3 y adición o no de
CaCO3 del NMP en bacterias nitrificantes y denitrificantes
Tabla 5. Estadística descriptiva. Media y desviación estándar del
NMP de bacterias nitrificantes para estandarización del
tiempo
Tabla 6. Estadística descriptiva. Media y desviación estándar del
NMP de bacterias denitrificantes para estandarización del
tiempo
Tabla 7. Media, desviación estándar y Test de Shapiro-Wilk
aplicado a tratamientos para la estandarización de sales en
NMP de bacterias nitrificantes
Tabla 8. Media, desviación estándar y Test de Shapiro-Wilk
aplicado a tratamientos para la estandarización de sales en
NMP de bacterias denitrificantes
Pág.
31
31
36
37
40
43
48
53
LISTA DE ANEXOS
Pág.
Anexo 1. Medios de cultivos y reactivos 75
1.1. Caldo amonio 75
1.2. Caldo nitrato 75
1.3. Reactivo de Nessler 75
1.4. Reactivo de Griess 76
1.5. Solución amortiguadora de pHmetro 76
Anexo 2. Análisis de la información 77
Tabla 9. Media y desviación estándar del NMP/g de compost de
bacterias nitrificantes, tomado diariamente para cada una de las
muestras.
77
Tabla 10. Media y desviación estándar del NMP/g de compost de
bacterias denitrificantes, tomado diariamente para cada una de las
muestras.
77
Tabla 11. Test de Shapiro-Wilk aplicado a NMP de bacterias nitrificantes
para estandarización del tiempo
78 Tabla 12. Prueba no paramétrica Kruskal-Wallis aplicada para
homogeneidad de grupos a NMP de bacterias nitrificantes para
estandarización del tiempo
78
Tabla 13. Test de Shapiro-Wilk aplicado a NMP de bacterias
denitrificantes para estandarización del tiempo 78
Tabla 14. Prueba no paramétrica Kruskal-Wallis aplicada a homogeneidad
de grupos a NMP de bacterias denitrificantes para estandarización
del tiempo
79
Tabla 15. Prueba no paramétrica Kruskal-Wallis aplicada para
homogeneidad de grupos a NMP de bacterias nitrificantes para
estandarización de sales con un α 0.05
79
Tabla 16. Prueba no paramétrica Kruskal-Wallis aplicada para
homogeneidad de grupos a NMP de bacterias denitrificantes para
estandarización de sales α 0.05
79
RESUMEN
En Colombia no se han realizado estudios para estandarizar metodologías que
permitan determinar la concentración de bacterias nitrificantes y denitrificantes en
compost. Las bacterias nitrificantes y denitrificantes basan su importancia en el
ciclaje del nitrógeno en diferentes ambientes, llevándolo de la forma más oxidada
(NO3) a la más reducida (N2). La importancia de estudiar estas bacterias en compost
se debe al uso de este bioinsumo en el país, por lo que resulta importante cuantificar
la presencia de estas bacterias en el compost para el suelo al que vaya a ser aplicado.
La técnica que se utilizó fue la del numero mas probable (NMP), revelando los tubos
con reactivo de Griess (nitrito), reactivo de Nessler (amonio), y el polvo de zinc
(nitrato). En este trabajo, se estandarizó el tiempo de crecimiento de estas bacterias,
dos concentraciones diferentes del sustrato, y la necesidad de agregar o no CaCO3 al
medio para obtener un mejor crecimiento, con estas últimas dos variables se aplicaron
4 tratamientos para bacterias nitrificantes y denitrificantes respectivamente,
trabajando a concentraciones de 0.5 o 0.33 g de SO4(NH4)2 y 0.5 o 2 g de KNO3. Las
tres variables se evaluaron con respecto al mayor crecimiento de biomasa. No se
encontró diferencias significativas en la biomasa de los días 14, 15 y 16 para las
bacterias nitrificantes, pero el día con mayor reporte fue el 15 con 115.88 NMP/g de
compost, mientras que para las bacterias denitrificantes el día 15 y 16 arrojaron el
mismo resultado con 31.42 NMP/g de compost. El tratamiento 1 (0.5 g de SO4(NH4)2
con 1 g de CaCO3 en nitrificantes y 0.5 g de KNO3 con 5 g de CaCO3 en
denitrificantes) obtuvo el mejor crecimiento en bacterias nitrificantes y denitrificantes
con 112.67 NMP/g de compost y 27.53 NMP/g de compost respectivamente. Los
resultados obtenidos, determinaron que el crecimiento optimo para los dos grupos de
bacterias se encuentra el día 15 debido a que es el tiempo que necesitan para
desarrollar su maquinaria enzimática y reproducirse, así como la importancia de la
cantidad de sustrato, y la adición del CaCO3 para el mantenimiento del pH en el
medio, promoviendo las reacciones y evitando la inhibición de las enzimas por este
factor.
1. INTRODUCCIÓN
El nitrógeno, uno de los macronutrientes de mayor importancia en los procesos
biológicos, es para los agricultores uno de los mayores problemas debido al costo de
los fertilizantes nitrogenados y a la facilidad con la que el sistema puede perderlos.
Los microorganismos en el suelo desarrollan funciones bioquímicas de gran
importancia en el ciclaje de nutrientes debido a que muchos de los compuestos
orgánicos pueden ser degradados o transformados como ocurre en los procesos de
compostaje o degradación de materia orgánica. En general dependiendo del sustrato
que utilicen, los microorganismos asociados a la transformación del nitrógeno,
incluyen grupos funcionales que realizan procesos de oxidorreducción como bacterias
nitrificantes y denitrificantes.
La importancia agronómica de las bacterias nitrificantes se basa en la capacidad de
oxidar el NH4 a formas más asimilables como NO3 para las plantas. Los grupos
bacterianos que intervienen en este proceso son las bacterias oxidantes de amonio
como Nitrosomonas sp., y las bacterias oxidantes de nitrito como Nitrobacter sp. Las
bacterias denitrificantes evitan las perdidas de nitrógeno por escorrentía y lixiviación,
al reducir formas oxidadas del nitrógeno reintegrándolo al ambiente. Algunas
bacterias de este grupo incluyen varias especies de Pseudomonas., Alcaligenes y
Bacillus.
La técnica del numero mas probable (NMP) se utiliza para observar la densidad
poblacional de un grupo determinado de microorganismos de forma indirecta. Girard
y Rougieux desde 1964 describieron la metodología NMP para realizar recuento de
bacterias nitrificantes y denitrificantes empleando suelo como matriz, con 0.5 g de
SO4(NH4)2 como sustrato y adicionando CaCO3 como estabilizador de pH. En 1991,
Verhagen y Laandbroek, realizaron un recuento de bacterias nitrificantes
quimiolitotrófas y heterótrofas utilizando una concentración de 2 g de KNO3 para la
13
misma técnica sin adición de CaCO3. Hashimoto et al., en el 2005 modificaron la
técnica del NMP de Tiedje 1982 para enumerar bacterias denitrificantes copiótrofas y
oligótrofas de la superficie del suelo en la región de Okinawa en el sur de Japón,
usando 0.5 g de SO4(NH4)2.
Sin embargo en matrices diferentes a suelo como es el caso de compost, no se han
reportado estudios con relación a tiempos de incubación, concentraciones de sustrato
y requerimiento de CaCO3. Siendo el nitrógeno necesario para la descomposición de
la materia orgánica por parte de los microorganismos y pretendiendo concluir que tan
determinante es la concentración del sustrato, la adición de CaCO3 y el tiempo de
incubación en el crecimiento de bacterias nitrificantes y denitrificantes recolectadas a
partir de una pila de compostaje se estandarizará una técnica que aun no ha sido
reportada para dicha matriz, que a su vez sea aplicable como una herramienta
confiable y de fácil manejo.
2. MARCO TEÓRICO
2.1. BIOINSUMOS AGRÍCOLAS
Los bioinsumos son recursos o productos de origen biológico elaborados
comercialmente con el fin de ser utilizados en nutrición vegetal principalmente en
programas de control, manejo integrado de los cultivos o mejoramiento de las
características biológicas del suelo (ICA 2004). Dentro de los bioinsumos se incluyen
agentes biológicos para el control de plagas, inoculantes biológicos, bioabonos,
inóculos microbiales para compostaje y productos bioquímicos. Es importante
destacar que no se consideran bioinsumos los extractos botánicos complejos como
rotenona, piretrinas, butóxido de piperonilo; productos obtenidos de algas, tales
como: giberelinas y citoquininas, ni productos de fermentación, como antibióticos y
betaexotoxina de Bacillus thuringiensis (Gutiérrez et al., 2005).
14
El compost es un tipo de bioinsumo en el cual se produce una transformación de los
materiales orgánicos, de tal suerte que ya no es posible reconocer a las partes que le
dieron origen. Este producto rico en nutrimentos (carbono, nitrógeno, fósforo, azufre,
etc.) y flora microbiana ayuda a mejorar la estructura del suelo haciéndolo mas
esponjoso y permitiendo aumentar la densidad poblacional de los organismos
habitantes en el suelo (Labrador 1996).
Un factor que afecta el proceso de compostaje es la temperatura, la cual depende de la
flora microbiana y puede disminuir si hay falta de oxigeno y humedad (Cegarra
1994). El compost alcanza su máxima eficiencia con una humedad entre 50 y 60%
debido a que por debajo del 40% la descomposición es aeróbica y por ende mas lenta,
mientras que por encima del 60% la cantidad de poros libres de agua es muy pequeña
con dificultad para la difusión de oxigeno, con lo cual se obtiene como resultado la
anaerobiosis (Pla 1994). La concentración de oxigeno necesaria para que no se limite
el proceso esta entre el 5 y el 10% en los macroporos, pero si la concentración de
oxigeno es alta en los macroporos es posible que se presente anaerobiosis en los
microporos (Cegarra 1994). La relación C:N ideal para un compostaje rápido es
25:35, debido a que relaciones menores pueden causar la volatilización del amonio y
relaciones mayores resultan en compostaje mas lento. Durante el compostaje el
nitrógeno total disminuye relativamente rápido al comienzo y luego se re distribuye
entre fracciones sin perdidas significativas (Paré et al., 1998). Los compuestos
nitrogenados presentes en residuos orgánicos son elevadamente heterogéneos y los
materiales proteínicos son algunos de los primeros en ser usados por los
microorganismos. Otras formas más complejas de nitrógeno sufren cambios a fin de
proveer a la planta de formas asimilables de nitrógeno, debido a que no son
inmediatamente amonificables (Dalzell et al., 1987). El compostaje genera amonio y
nitrato, y compuestos aminos que son rápidamente asimilados por la planta antes o
después de la hidrólisis por las enzimas del suelo. Todos estos compuestos están
asociados con las perdidas de nitrógeno (Smith et al., 1989).
15
El valor optimo de pH esta entre seis y siete cinco, debido a que los valores extremos
inhiben la actividad microbiana durante el proceso de degradación. Al disminuir el
tamaño de las partículas aumenta la superficie para el ataque microbiano, por esta
razón el exceso de partículas mas pequeñas puede conducir a la compactación y
formación de gran cantidad de microporos, favoreciendo el desarrollo de condiciones
anaeróbicas (Labrador 1996, Mejía et al, 2005 y Osorio 2005).
2.2. CICLOS BIOGEOQUIMICOS
Los ciclos biogeoquímicos describen el movimiento de materia a través de reacciones
en toda la biosfera de manera cíclica. Los principales elementos de la biomasa que
son ciclados por los microorganismos son carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y
oxigeno. Las actividades humanas, como la liberación de desechos, uso de
agroinsumos, deforestación, pueden tener una gran influencia en las tasas de actividad
cíclicas de los microorganismos, ocasionando cambios significativos en las
características bioquímicas de un hábitat determinado (Gómez 2004).
2.2.1. NITROGENO
El nitrógeno es uno de los elementos mas ampliamente distribuidos en la naturaleza.
En la atmósfera se halla en forma de dinitrógeno N2, donde representa alrededor del
78%, lo que equivale a 2.8 x 1014 Tm de nitrógeno. El N en la atmósfera se encuentra
presente un 25%, mientras que en la litosfera se encuentra estable en rocas primarias
y sedimentarias, de modo que únicamente un 0.03% se encuentra en el suelo y que de
este suelo una proporción muy pequeña esta en forma asimilable por los seres vivos
(Guerrero 1990; Atlas y Bartha 2002).
El nitrógeno es un elemento muy importante para las plantas debido a que es un
constituyente de los tejidos vegetales, formando parte de numerosas biomoléculas,
como los son las proteínas, ácidos nucleicos, porfirinas y alcaloides (Ingham et al.
16
1978). Al fijarse nitrógeno (reducción del N2 atmosférico), las plantas pueden obtener
nitrógeno por absorción del suelo en forma de NO3 y NH4, estableciendo asociaciones
simbióticas con diversas bacterias, no obstante este debe ser modificado antes de que
pueda ser utilizado por la mayoría de los sistemas vivos. Dicho elemento sufre una
serie de transformaciones en las cuales participan compuestos orgánicos e
inorgánicos (Aparicio y Arrese 1996). No es posible que una planta asimile nitrógeno
orgánico directamente, necesita determinadas condiciones de humedad, temperatura y
la actividad de la enzima ureasa para transformarlo rápidamente en nitrógeno
amoniacal, el cual es soluble en agua y es retenido por absorción del suelo (Aparicio
y Arrese 1996, Mayea 1982).
El ciclo inicia con la materia orgánica muerta estructurada de compuestos orgánicos
complejos ricos en nitrógeno de modo que hongos y bacterias presentes en los suelos
lo transforman a partir de aminoácidos y proteínas, y se deshacen del nitrógeno
restante en forma de iones amonio, proceso denominado amonificación (Atlas y
Bartha 2002). En los suelos habitan bacterias capaces de oxidar iones amonio al
transformarlos en iones de nitrato produciendo energía en el proceso denominado
nitrificación (Prosser 1989). La aminación consiste en que estos iones de nitrato
penetran en las células de las plantas, donde son nuevamente reducidos a iones
amonio y transformados en componentes que contienen carbono para producir
aminoácidos y otros componentes orgánicos ricos en nitrógeno. Los aminoácidos y
componentes orgánicos retornan al suelo al morir las plantas, o a través de los
excrementos de los animales que las ingieren. De este modo se vuelve a dar comienzo
el proceso denominado amonificación (Madigan et al., 2000; Atlas y Bartha 2002). El
ciclo del nitrógeno comprende varias etapas en las que participan diversos
organismos edáficos. Fijación de nitrógeno, mineralización o amonificación,
inmovilización, nitrificación y desnitrificación (Atlas y Bartha 2002).
17
2.2.1.1. NITRIFICACIÓN
En medios alcalinos se puede liberar nitrógeno a la atmósfera en forma de amoníaco
gaseoso, y otra gran parte del amoníaco sufre el proceso denominado nitrificación, en
el cual los iones de amonio se oxidan a iones nitritos y estos son transformados a
iones nitrato. Este proceso parece estar limitado en su mayor parte a un número
restringido a microorganismos aerobios quimiolitoautótrofos (Focht y Verstraete
1977; Hooper 1990; Owen y Jones, 2001). La formación de nitrito y de nitrato la
realizan poblaciones de bacterias distintas, sin embargo, los dos están muy
relacionados de modo que no habría una acumulación de nitrito (De Boer and
Kowalchuck 2001).
La oxidación del amonio a nitrito y luego a nitrato son procesos exotérmicos. Debido
a que las bacterias nitrificantes son quimiolitotrofas utilizan la energía derivada de la
nitrificación para asimilar el CO2 en el paso del amonio a nitrito en donde el oxigeno
molecular se incorpora a la molécula de amonio. Las bacterias que usan estos
compuestos como dadores de electrones utilizan un complejo de citocromos para
bombear al espacio periplásmico protones que usarán luego en la síntesis de ATP. A
partir del CO2 se generarán compuestos orgánicos utilizando la energía acumulada en
el ATP. Hay un primer grupo de bacterias que oxidan el amoníaco a nitrito en una
reacción catalizada por la enzima amoníaco monooxigenasa (Ecuación 1),
posteriormente la hidroxilamina oxidorreductasa oxida la hidroxilamina a nitrito
(Ecuación 2), por ultimo un grupo de bacterias se encarga de oxidar los nitritos a
nitratos usando la nitrito oxidorreductasa (Ecuación 3) (Harrison 2003; Maier 2000).
NH3 + O2 + 2H+ + 2e- → NH2OH + H2O (1)
NH2OH + H2O → NO2- + 5H+ (2)
NO2- + H2O → NO3- + 2H+ (3)
18
La cantidad de energía que obtienen estas bacterias a partir de estos procesos es
bastante baja, de ahí que sean especies con crecimiento lento. (Koops and
Pommerening 2001; Atlas y Bartha 2002; Myrold 2002). El paso de nitrito a nitrato
depende también del oxigeno el cual se obtiene de una molécula de agua; pero el
oxigeno molecular solo sirve como aceptor de electrones. La oxidación del nitrito es
un proceso de un paso que produce una pequeña cantidad de energía (Atlas y Bartha
2002).
Las bacterias nitrificantes se encuentran en la mayoría de los suelos y aguas con pH
de 4.5 a 8.0, teniendo un óptimo desempeño entre 6.6 y 7.8; estas no son activas a un
pH menor de 4.5 (Maier 2000). Las especies nitrificantes son bacterias de los géneros
Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosococcus, Nitrosolobus y Nitrosovibrio que están
especializadas para convertir amonio a nitrito, y además de Nitrobacter miembros de
los géneros Nitrospira, Nitrospina y Nitrococcus están especializadas para convertir
nitrito a nitrato (Head et al., 1993; Bock et al. 1990). La acumulación de nitrito
inhibe la acción de Nitrosomonas, así que dependen de Nitrobacter para que lo
conviertan en nitrato. A su vez, Nitrobacter depende de Nitrosomonas para generar
nitrito (Utåker y Nes 1998). Es posible que cualquier tipo de estrés ambiental afecte
gravemente el proceso de nitrificación debido a que son relativamente pocos los
géneros bacterianos los que intervienen en él (Bollag y Kurek 1980; Bremner y
McCarty 1993; Teske et al., 1993; De Boer y Kowalchuck 2001).
Las bacterias nitrificantes son comunes en un suelo oxigenado y con agua adecuada,
de manera que generan importantes consecuencias ambientales, la mayoría del
amonio que capturan es convertido a nitrato. Casi la totalidad de plantas y
microorganismos pueden tomar tanto amonio como nitrato. Sin embargo, el nitrato
con carga negativa no es retenido por el suelo como se retiene el amonio por su carga
positiva ya que las arcillas y coloides están cargados negativamente, por esta razón el
nitrato puede ser fácilmente lixiviado o lavado. Es así como se puede perder
nitrógeno de los suelos (Utåker y Nes 1998).
19
La disponibilidad de nitrógeno usualmente limita la productividad de las plantas en
ecosistemas terrestres. Los factores que controlan la mineralización y la nitrificación
han sido estudiados porque estos procesos determinan la disponibilidad de nitrógeno
para plantas y la captación microbial (Montagninp et al., 1989). El resultado de la
nitrificación es la formación de iones de nitrato que pueden lixiviarse, readucirse o
perderse en formas gaseosas. Los factores que afectan principalmente la nitrificación
son la temperatura, humedad, pH, y substratos como NH4-N, 02 y CO2 (Stevenson
1986). Evidencia de que la nitrificación se inhibe por la descomposición de los
productos de residuos orgánicos en los suelos, o por excreción de metabolitos por
parte de plantas o microorganismos aun no se han podido establecer (Montagninp et
al., 1989). En suelos ácidos no hay fosfato ni calcio disponible, los cuales son
esenciales para las bacterias nitrificantes (Bundy y Bremner 1973; De Boer y
Kowalchuck 2001).
El suelo inicialmente esta cargado positivamente pero al llevarse a cabo el proceso de
nitrificación, se realiza una transformación de iones amonio a nitrito y nitrato y se
provoca un cambio en la carga de la molécula de modo que esta pasa a ser negativa
(Atlas y Bartha 2002). Durante dicho proceso las bacterias nitrificantes se
especializan en obtener energía de la oxidación del amonio y la utilización del CO2
como fuente de carbono para la síntesis de compuestos orgánicos.
El proceso de nitrificación debe verse como un proceso de movilización del nitrógeno
entre diferentes hábitat del suelo. En el suelo el amonio es oxidado por acción de las
bacterias nitrificantes de modo que las plantas pueden asimilarlo en forma de
compuestos orgánicos (Atlas y Bartha 2002), no obstante, la captación de nitrato y
nitrito puede provocar una perdida por lixiviación debido a que dichos iones son
fácilmente lavados y dirigidos generalmente a aguas subterráneas (Maier 2000),
perdiendo así, suelo que podría ser utilizado por las plantas para producir biomasa
(Atlas y Bartha 2002).
20
2.2.1.2.REDUCCION DEL NITRATO Y DENITRIFICACION
Una gran cantidad de organismos pueden usar el nitrato producido por el proceso
anteriormente descrito como fuente de nitrógeno. Muchas bacterias pueden usarlo
también como aceptor de electrones en la respiración anaerobia de la materia
orgánica, en un proceso de reducción del nitrógeno que finaliza con la liberación a la
atmósfera de N2 o, menos comúnmente, de NO o N2O, proceso conocido como
desnitrificación (Gottschalk 1986, Robertson 1989). La actividad desnitrificante es
controlada por varias condiciones ambientales, como la humedad del suelo,
concentración de oxígeno, concentración de NO3-, contenido de carbono, pH y
temperatura (Tiedje, 1988; Vermoesen et al., 1993; Nelson y Terry, 1996
Del inicio de estas reacciones se encarga la nitrato reductasa (reacción 1, ecuación 4),
una enzima de membrana que incluye molibdeno en su estructura y que se ve inhibida
en presencia de O2 (Atlas y Bartha 2002; Priemé et al., 2002). Luego el nitrito es
sometido a un proceso de reducción por la nitrito reductasa (reacción 2, ecuación 4),
donde el producto inicial es óxido nítrico seguido por el óxido nitroso con la
participación de la óxido nítrico reductasa (reacción 3, ecuación 4) y finalmente
nitrógeno gaseoso con la óxido nitroso reductasa (reacción 4, ecuación 4) (Maier
2000; Atlas y Bartha 2002).
Los sistemas enzimáticos asimiladores de nitrato se inactivan en presencia de amonio
o de metabolitos orgánicos nitrogenados reducidos (Atlas y Bartha 2002). Si el
amonio esta presente en el ambiente en exceso, la reducción asimilatoria del
nitrógeno se podría llegar a interrumpir (Maier 2000; Atlas y Bartha 2002). Las
nitrato reductasas asimilatorias (Nas) dependientes de ferredoxina o flavodoxina las
poseen las Cianobacterias, Azotobacter sp., respectivamente y las Nas dependientes
de NADH son Klebsiella oxytoca, Bacillus subtilis, Rhodobacter capsulatus (Atlas y
Bartha 2002; Myrold 2002; Priemé et al., 2002).
21
Otras bacterias autótrofas usan el mismo nitrato como fuente de energía, usando la
acumulada en los enlaces N-O, pero sin aprovechar el oxígeno que se libera
(Ecuación 5). Y así, con el retorno al nitrógeno gas, se cierra el ciclo del nitrógeno.
Las verdaderas bacterias denitrificantes realizan todo este proceso. Sin embargo
muchas bacterias anaerobias facultativas, enterobacterias principalmente poseen
únicamente la nitrato reductasa y sólo son capaces de realizar la reacción (Ecuación
6).
NO3 - → NO2 - → NO → N2O → N2 (4)
2NO3- + 5H2 → N2 + 4 H2O + 2OH- (5)
NO3- + 2H+ → NO2- + H2O (6)
4 3 2 1
A partir de aquí usan el nitrito como aceptor de electrones, y así al reducirse y
eliminar H2 del medio citoplasmático favorece una reacción fermentativa propia de
estas bacterias que transforma acetilfosfato en acetato (o butirilfosfato en butirato),
captando el fosfato inorgánico que libera una molécula de ADP para transformarse en
ATP (Ye et al., 1994; Vitousek et al., 1997; Myrold 2002).
Los microorganismos pueden utilizar el nitrato como aceptor final de electrones
durante la respiración anaeróbica y actuar en la oxidación de compuestos orgánicos
(Maier 2000). Este proceso se conoce como respiración de nitrato o reducción
desasimilatoria de nitrato. Hay dos vías separadas para este procedimiento, uno, es la
reducción desasimilatoria de nitrato a amonio donde este es el producto final y otro es
la desnitrificación donde una mezcla de gases se producen, incluyendo la formación
del N2 y N2O (Maier 2000; Atlas y Bartha 2002). Algunas bacterias anaerobias
facultativas como Alkaligenes sp, Escerichia sp., Nocardia sp. y Vibrio sp. reducen el
nitrato a nitrito en condiciones anóxicas, en donde dicho proceso permite el uso de
compuestos orgánicos con una reducción mayor de energía que la que se obtiene de la
fermentación (Atlas y Bartha 2002). A partir del nitrato se produce nitrito que bajo la
22
acción de la hidroxilamina puede producir amonio y muy posiblemente nitrógeno
orgánico (Atlas y Bartha 2002; Priemé et al., 2002).
La desnitrificación es un proceso biológico en el cual el nitrato es reducido a
nitrógeno gaseoso (Zumft 1997), y esto juega un papel importante en el ambiente
global teniendo como rol la reacción inversa a la fijación del nitrógeno (Takaya y
Shoun 2000). Por mucho tiempo se pensó que la desnitrificación era una
característica exclusiva de los procariotes pero varios hongos filamentosos han sido
encontrados exponiendo dicha actividad (Shoun et al. 1992). El sistema de hongos
denitrificantes no puede reducir el oxido nitroso (N2O) a nitrógeno gaseoso (N2), y de
esta manera N2O queda como producto final (Shoun y Tanimoto 1991). Esto ha sido
observado debido a que las enzimas involucradas están localizadas en la mitocondria
respaldando la síntesis de ATP (Kobayashi et al. 1996), actuando como sistemas de
respiración anaeróbica similar a lo ocurrido en bacterianos (Heiss et al. 1989; Myrold
2002).
La ruta manejada por los reductores de nitrato desnitrificadotes como Paracoccus
denitrificans, Thiobacillus denitrificans y diversas Pseudomonadaseas, para convertir
de nitrato a nitrógeno atmosférico es activada en carencia de oxigeno (Hutchinson
1970; Zumft 1997), principalmente se habla de E. coli, Pseudomonas, Bacillus,
Mycobacterium, Thermus thermophilus, Ralstonia eutropha, Paracoccus
denitrificans, Bradyrhizobium japonicum (Tiedje 1994; Nielssen et al. 1996).
2.3. DETERMINACIÓN MICROBIOLOGICA DE LA NITRIFICACION Y
DENITRIFICACIÓN
El nitrógeno disponible es equivalente al nitrógeno mineralizado, que está compuesto
por el nitrato y el nitrito soluble, junto con el nitrógeno amónico capaz de
intercambiarse y el soluble. Usualmente para el estudio de las diferentes formas de
23
nitrógeno se han utilizado metodologías a nivel químico las cuales exponen datos
acerca de los elementos que mas tarde serán definitivos en el éxito de los procesos,
entre ellos está la determinación de los nitratos mediante el electrodo selectivo para el
ión, la determinación del N amónico extraíble, e innumerables técnicas mas que
dependen de la forma de nitrógeno a estudiar, con las cuales es posible determinar la
cantidad de nitrógeno disponible en el suelo. Las diferentes concentraciones de
nitrógeno fluctúan a lo largo de periodos cortos de tiempo y dependen mucho de la
actividad microbiana; como el gas amónico que puede escapar de la muestra por
volatilización (Faithfull, 2005). De este modo haciendo un análisis microbiológico
con el cual no se tiene en cuenta la cantidad de nitrógeno sino la población
microbiana y su actividad que lo hace capaz de ciclar de modo que pueda llevar al
nitrógeno a sus formas más oxidadas o a sus formas más reducidas las cuales serán
utilizadas por las plantas o retornadas a la atmósfera.
Uno de los métodos más utilizados para el estudio de la nitrificación son las curvas de
absorbancia las cuales están basadas en técnicas de colorimetría dependiendo de la
forma del nitrógeno objeto de estudio, en donde luego de la incubación de la muestra
según el protocolo a seguir, arrojará resultados del porcentaje de nitrógeno existente,
los cuales serán empleados para determinar la actividad microbiana utilizando
cálculos matemáticos (Cataldo et al., 1975). En otra metodología para observación de
la actividad nitrificante y/o denitrificante se utilizan tubos inoculados con suelo y con
las formas de nitrógeno a estudiar, estos son incubados y por medio de reactivos se
verifican los procesos (Loynachan, 1985). Para observar el proceso de
desnitrificación se emplea la cromatografía, en la cual se analiza el N2O usando un
electrón de nitrógeno marcado el cual funciona como detector, los valores arrojados
se llevan a una tabla de factores de corrección con el fin de cuantificar la reducción
(Payne 1991). Para la cuantificación de la población se utiliza la técnica de recuento
en placa, la cual se fundamenta en la estimación del número de células presentes en la
muestra sembrada, por medio de diluciones (Girard, y Rougieux, 1964; Mayea et al.
1982; Tiedje 1994). La siguiente técnica es el número más probable, la cual es una
24
metodología eficiente de estimación de densidades poblacionales especialmente
cuando una evaluación cuantitativa de células individuales no es factible. El estimado
de densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en
diluciones seriadas y el uso de una tabla probabililística (Cochran 1950; Rowe et al.
1977; Hashimoto et al. 2005).
2.4. TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE
La técnica del numero mas probable (NMP), es un método eficiente de estimación de
densidades poblacionales especialmente cuando una evaluación cuantitativa de
células individuales no es factible, esta técnica se basa en la determinación de
presencia o ausencia (positivo o negativo) en réplicas de diluciones consecutivas de
atributos particulares de microorganismos presentes en muestras de suelo u otros
ambientes. Por lo tanto, un requisito importante de este método es la necesidad de
poder reconocer un atributo particular de la población(es) en el medio de crecimiento
a utilizarse. El estimado de densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia
de ese atributo en diluciones seriadas y el uso de una tabla probabililística (Blodgett
2006).
Algunas de las ventajas del NMP son: la capacidad de estimar tamaños poblacionales
basados en atributos relacionados a un proceso (selectividad); provee una
recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de suelos diversificados,
determina sólo organismos vivos y activos metabólicamente, y suele ser más rápido e
igual de confiable que los métodos tradicionales de esparcimiento en cajas de petri,
entre otros (Blodgett 2006).
25
3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION
3.2. Formulación del problema
¿Es determinante la concentración de SO4(NH4)2 o KNO3, la adición o no de CaCO3 y
el tiempo de incubación en el crecimiento de bacterias nitrificantes y denitrificantes
en compost?
3.3. Justificación
Para favorecer la concentración de nitrógeno disponible en el suelo y mejorar el
ciclaje de nutrientes en general se han propuesto técnicas como la rotación de
cultivos, uso de labranza conservadora, el manejo integrado de plagas y la aplicación
de materia orgánica, rutinas que mantengan un mejor equilibrio en la microbiota del
suelo. El compost como bioinsumo con capacidad mejoradora de la estructura del
suelo, aporta a este, nutrientes y flora microbiana, puede llegar a utilizarse, como se
hace en diferentes agroecosistemas, para optimizar y aliviar los desfavorables
resultados de las prácticas regulares, pero debido al desconocimiento de la flora
presente, el control de calidad se realiza únicamente desde el punto de vista químico
(% N total generalmente). Por lo anterior este proyecto de tesis tuvo como finalidad
estandarizar el tiempo de incubación, necesidad de CaCO3, y concentración de
SO4(NH4)2 y KNO3 para la prueba del NMP con bacterias nitrificantes y
denitrificantes respectivamente usando como matriz compost, para tener una técnica
en una matriz diferente al suelo que permita mejorar el control de calidad de
bioinsumos agrícolas.
26
4. OBJETIVOS
4.2. Objetivo general
Estandarizar el tiempo de incubación y concentración de CaCO3, SO4(NH4)2 y KNO3
para la prueba del NMP con bacterias nitrificantes y denitrificantes usando como
matriz compost.
4.3. Objetivos Específicos
4.3.1. Establecer diferencia entre los valores de NMP para bacterias nitrificantes y
denitrificantes provenientes del proceso de compostaje determinando el día de
mayor abundancia.
4.3.2. Determinar la importancia de la adición de CaCO3 sobre la recuperación de
biomasa y actividad de bacterias nitrificantes y denitrificantes provenientes
del proceso de compostaje.
4.3.3. Evaluar dos concentraciones de SO4(NH4)2 y KNO3 necesarias para
estandarizar cual favorece el mayor recuento de bacterias nitrificantes y
denitrificantes respectivamente por la técnica del NMP en compost.
5. MATERIALES Y METODOS
5.1.Diseño de la Investigación
La investigación realizada fue de tipo experimental teniendo como factores de diseño:
requerimiento de CaCO3, concentración de SO4(NH4)2 y KNO3, y tiempo de
incubación. Los niveles del factor de diseño concentración de sales y requerimiento
de CaCO3 en los medios de cultivo para bacterias nitrificantes y denitrificantes se
presentan en la figura 1.
27
Figura 1. Niveles del factor de diseño utilizados para estandarizar la concentración
de SO4(NH4)2 y KNO3 y la adición o no de CaCO3
TRATAMIENTOS
Con Sin
CaCO3 CaCO3
Medio
AmonioMedio Nitrato
Medio Nitrato
Medio Amonio
3 2 1 3 1 4 2 4 2 g KNO30.5 KNO3 0.5 KNO3 2 g KNO30.5 g SO4
(NH4)2
0.33 g SO4(NH4)2
0.33 g SO4(NH4)2
0.5 g SO4(NH4)2
5.1.1. Población de Estudio y Muestra
El área de estudio está en las pilas de compostaje del cultivo de flores (Cultivos del
Norte) con siembras de rosas, crisantemo y pompón, ubicado en el municipio de
Tocancipá departamento de Cundinamarca a 2.600 msnm con temperatura promedio
de 14 ºC (IGAC 1996).
5.1.2. Recolección de las Muestras
De la pila de compost de 18x1.5x1 m3 proveniente de residuos de flores con 13
semanas de maduración se colectaron 10 submuestras con el fin de obtener una
muestra compuesta, este procedimiento de repitió cinco veces utilizando tubos PVC
70 cm y 3” de diámetro. Al iniciar cada muestreo la temperatura de la pila fue
registrada y se procedió a tomar las muestras en bolsas ziploc las cuales fueron
almacenadas en nevera a 4ºC hasta el momento del procesamiento (24 horas). Luego
28
de tener todas las muestras, se rotularon (nombre del propietario, nombre de la finca,
ubicación geográfica, número de muestra y lote, superficie que representa,
condiciones climáticas) (Landon 1984).
5.1.3. Regularidad de la Toma de Muestras
Para la estandarización del tiempo de incubación se recolectaron 11 muestras durante
22 días de modo que se obtuvo una muestra preliminar y 10 muestras prueba. Para la
estandarización de la concentración de sales la recolección de cinco muestras se hizo
durante un periodo de 15 días.
5.1.4. Variables de Estudio
La variable dependiente fue la concentración de bacterias por el NMP/g de muestra
medido en variables independientes de concentración de SO4(NH4)2 y KNO3,
requerimiento de CaCO3, y tiempo de incubación de las muestras.
5.2. METODOS
Para el análisis de las muestras, a partir de la muestra compuesta se tomaron 10 g
aproximadamente y cada uno de los procesos descritos se realizaron con tres réplicas,
excepto la determinación del pH.
5.2.1. Determinación del pH del compost.
Se determinó el pH utilizando un potenciómetro digital. Se realizó una solución
acuosa pesando 10 g de compost con 25 ml de agua desmineralizada. Luego esta
mezcla fue agitada por 5 min, y se dejada en reposo 30 min. Nuevamente fue agitada
por 2 min, e instantáneamente colocado el electrodo previamente calibrado con la
29
solución amortiguadora (anexo 1). Luego se esperó hasta que arrojó un valor exacto
del pH, y este fue el valor correspondiente al pH del compost (Benavides 2004).
5.2.2. Estandarización del Tiempo
Para estandarizar el tiempo de incubación de la técnica se tomó como base la
información obtenida de la aplicación de la técnica en matriz suelo (tablas 1 y 2). En
esta modificación se utilizó únicamente el tratamiento 1 (figura 3) para los dos grupos
debido a que en el único estudio que se ha aplicado NMP para bacterias nitrificantes y
denitrificantes según Kowalchuk et al., (1999) fue en compost procedente de
desechos animales en donde utilizaron las concentraciones usadas por Verhagen y
Laanbroek (1991). Cada muestra compuesta fue sembrada en caldo nitrato (anexo 1)
por triplicado y en caldo amonio (anexo 1) por triplicado y la lectura se realizó a los
12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18 días, con el fin de estandarizar el tiempo de incubación.
Con el análisis estadístico de los resultados obtenidos se seleccionó el día de mayor
producción de biomasa para todas las muestras.
5.2.3. Estandarización de Sales
Para matriz compost, la modificación con respecto a la técnica propuesta por Girard y
Rougieux 1964, Verhagen y Laandbroek 1991 y Hashimoto et al., 2005, se centró en
la evaluación de dos concentraciones de SO4(NH4)2 o KNO3, y en la adición o no de
CaCO3 sobre la recuperación de la microbiota nitrificante y denitrificante. Se
probaron dos medios, amonio y nitrato (anexo 1), con diferentes concentraciones de
los mencionados componentes (figura 1) (tablas 1 y 2).
30
Tabla 1. Medio amonio (anexo 1) con componentes a diferentes concentraciones Concentración de CaCO3 Concentración de SO4(NH4)2
1 g (Verhagen y Laandbroek 1991) 0.5 g (Verhagen y Laandbroek 1991)
0 g (Girard y Rougieux 1964) 0.5 g (Verhagen y Laandbroek 1991)
1 g (Verhagen y Laandbroek 1991) 0.33 g (Girard y Rougieux 1964)
0 g (Girard y Rougieux 1964) 0.33 g (Girard y Rougieux 1964)
Tabla 2. Medio nitrato (anexo 1) con componentes a diferentes concentraciones
Concentración de CaCO3 Concentración de KNO3
5 g (Verhagen y Laandbroek 1991) 0.5 g (Hashimoto et al., 2005)
0 g (Girard y Rougieux 1964) 0.5 g (Hashimoto et al., 2005)
5 g (Verhagen y Laandbroek 1991) 2 g (Girard y Rougieux 1964)
0 g (Girard y Rougieux 1964) 2 g (Girard y Rougieux 1964)
Luego de la estandarización del tiempo se recolectaron cinco muestras nuevas que
fueron sembradas en los 4 tratamientos (tabla 1 y 2) y fueron leídos el día de
incubación que se determinó previamente.
5.2.4. Número Más Probable Bacterias Nitrificantes
Se realizaron diluciones seriadas de la muestra hasta 10-3. Luego se sembró 1 ml en 5
tubos con caldo amonio (anexo 1) para cada una de las diluciones y cada uno de estos
fueron incubados a 28 oC en durante dos semanas. Se procedió a calcular el valor de
NMP a partir de la determinación del número de tubos positivos, en cada dilución
para bacterias oxidantes de amonio. Se adicionaron 2 gotas del reactivo Griess (ver
anexo 1) con el fin de realizar la detección de nitritos. Los tubos positivos tomaron
coloración roja después de 5 minutos. Los datos fueron anotados según el número de
tubos positivos y negativos por dilución. A los tubos negativos se les adicionó polvo
de zinc para detectar la presencia de nitrato en el medio, los tubos positivos tomaron
31
coloración rojiza naranja, los que no cambiaron fueron tubos negativos a los cuales se
les adicionó reactivo de Nessler (anexo 1), y así se confirmó la presencia de amonio,
indicativo de que no existió proceso de nitrificación. Luego se realizó el recuento por
medio de las tablas de Cochran (Cochran 1950), con el ajuste dependiendo de las
diluciones tomadas para leer (Girard y Rougieux 1964; Schmidt y Belser 1982;
Loynachan 1985; Verhagen y Laandbroek 1991; Deni y Penninckx 1999).
5.2.5. Número Más Probable Bacterias Denitrificantes
Se realizaron diluciones seriadas de la muestra hasta 10-3. Luego se sembró 1 ml en 5
tubos con caldo nitrato (anexo 1) para cada una de las diluciones y cada uno de estos
fue incubado a 28 oC en campanas de anaerobiosis durante dos semanas. Se procedió
a calcular el valor de NMP a partir de la determinación del número de tubos
positivos, en cada dilución para bacterias reductoras de nitrato. Se adicionaron 2
gotas del reactivo Griess (anexo 1) con el fin de realizar la detección de nitritos. Los
tubos positivos tomaron coloración roja después de 5 minutos. Los datos fueron
anotados según el número de tubos positivos y negativos por dilución. A los tubos
negativos se les adicionó 2 gotas del reactivo de Nessler (anexo 1) para detectar la
presencia de amonio en el medio, los tubos positivos tornaron coloración amarilla, los
que no viraron fueron tubos negativos y se les adicionó polvo de zinc, confirmando
así la presencia de nitratos lo que significó que no hubo desnitrificación. Luego se
realizará el recuento por medio de las tablas de Cochran (Cochran 1950), y haciendo
el ajuste dependiendo de las diluciones tomadas para leer (Girard y Rougieux 1964;
Hashimoto et al. 2005).
5.2.6. Análisis de Información
Para definir el tiempo adecuado de incubación se calcularon las medias del resultado
de NMP arrojado por las muestras colectadas para dicho fin. Las medias fueron
sometidas a la prueba de Shapiro Wilk y al no distribuirse normalmente se les aplicó
32
la prueba de Kruskal-wallis con un α de 0.05 (Sokal y Rohlf 2000). Las hipótesis
planteadas fueron las siguientes:
H0: las medias de la biomasa en los días 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18 de incubación son
iguales
Hi : al menos una de las medias es diferente
µ1= Biomasa el día 12
µ2= Biomasa el día 13
µ3= Biomasa el día 14 H0 = µ1 = µ2 = µ3 = µ4 = µ5 = µ6 = µ7
µ4= Biomasa el día 15 Hi = µ1 ≠ µ2 = µ3 = µ4 = µ5 = µ6 = µ7
µ5= Biomasa el día 16
µ6= Biomasa el día 17
µ7= Biomasa el día 18
Para determinar si la concentración de SO4(NH4)2 con y sin CaCO3 ejerce diferencia
sobre la biomasa de bacterias nitrificantes y denitrificantes, se calcularon las medias
del resultado de NMP arrojado por las muestras colectadas para dicho fin. Las medias
fueron sometidas a la prueba de Shapiro Wilk y al no distribuirse normalmente se les
aplicó la prueba de Kruskal-wallis con un α de 0.05 (Sokal y Rohlf 2000). Las
hipótesis planteadas fueron las siguientes:
µ1 = Biomasa con 0.33 g de SO4(NH4)2 con CaCO3
µ2 = Biomasa con 0.5 g de SO4(NH4)2 con CaCO3
µ3 = Biomasa con 0.33 g de SO4(NH4)2 sin CaCO3
µ4 = Biomasa con 0.5 g de SO4(NH4)2 sin CaCO3
H0 = µ1 = µ2 = µ3 = µ4
Hi = µ1 ≠ µ2 = µ3 = µ4
33
Para determinar si la concentración de KNO3 con y sin CaCO3 apropiada para la
biomasa de bacterias nitrificantes y denitrificantes, se calcularon las medias del
resultado de NMP arrojado por las muestras colectadas para dicho fin. Las medias
fueron sometidas a la prueba de Shapiro Wilk y al no distribuirse normalmente se les
aplicó la prueba de Kruskal-wallis con un α de 0.05 (Sokal y Rohlf 2000). Las
hipótesis planteadas fueron las siguientes:
µ1 = Biomasa con 2 g de KNO3 con CaCO3
µ2 = Biomasa con 0.5 g de KNO3 con CaCO3 H0 = µ1 = µ2 = µ3 = µ4
µ3 = Biomasa con 2 g de KNO3 sin CaCO3 Hi = µ1 = µ2 ≠ µ3 = µ4
µ4 = Biomasa con 0.5 g de KNO3 sin CaCO3
Cabe resaltar que las desviaciones estándares que se encontraron el los resultados
fueron proporcionales a la estadística aplicada para la determinación de biomasa de la
tabla del número más probable.
6. RESULTADOS Las muestras de compost provienen del cultivo de flores Cultivos del Norte
maduradas por 13 semanas, a partir de residuos de pompón, papel, un inoculante
microbiano y leche. La adición de estos últimos compuestos se hace de acuerdo a la
resolución número 00074 de 2002 del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural
en donde se especifica que es posible utilizar las preparaciones apropiadas a base de
vegetales o de microorganismos no patógenos y están permitidas las sustancias de
origen animal como leche y productos lácteos, respectivamente, para activar el
compost. Teniendo en cuenta la adición de residuos de pompón es posible denominar
este insumo agrícola también como abono foliar de origen natural y preparados
vegetales, el cual tiene como condición de uso la exclusión de sustancias y/o material
vegetal de especies de uso restringido (Min. Agrícola 2002).
34
Figura 2. Pilas de compostaje muestreadas, Cultivos del Norte
6.1. Muestras para estandarización del tiempo de incubación
Las muestras de compost de flores recolectadas en Cultivos del Norte, para la prueba
de estandarización del tiempo de incubación del NMP en bacterias nitrificantes y
denitrificantes presentaron un promedio de temperatura de 21ºC con un rango mínimo
de 19ºC y máximo de 24ºC y pH entre 7.89 y 8.54 (tabla 3).
35
Tabla 3. Muestras recolectadas para la estandarización del tiempo de incubación del NMP en bacterias nitrificantes y denitrificantes.
Muestra
Fecha montaje de
pila de Compost
Fecha recolección
Temperatura (ºC) pH
1 06/03/06 10/06/06 19 8.07
2 20/03/06 30/06/06 22 8.53
3 20/03/06 30/06/06 22 8.3
4 20/03/06 30/06/06 22 8.54
5 27/03/06 04/07/06 19 8.5
6 27/03/06 05/07/06 19 7.89
7 27/03/06 07/07/06 19 7.89
8 27/03/06 07/07/06 19 8.06
9 10/04/06 18/07/06 21 7.89
10 10/04/06 18/07/06 21 8.14
11 17/04/06 27/07/06 24 8.2
6.2. Muestras para estandarización de Sales
Las muestras de compost de flores recolectadas en Cultivos del Norte, para la prueba
de estandarización de la concentración de SO4(NH4)2 y KNO3 y adición o no de
CaCO3 del NMP en bacterias nitrificantes y denitrificantes presentaron un promedio
de temperatura de 21 ºC, con un rango mínimo de 19 ºC y máximo de 24 ºC y pH
entre 8.08 y 8.24 (tabla 4).
36
Tabla 4. Muestras recolectadas para la estandarización de la concentración de SO4(NH4)2 y KNO3 y adición o no de CaCO3 del NMP en bacterias nitrificantes y denitrificantes
Muestra Fecha Inicio Fecha de Recolección
Tº pH
1 12/06/06 11/09/06 19 8.11 2 19/06/06 18/09/06 23 8.24 3 19/06/06 18/09/06 23 8.17 4 26/06/06 20/09/06 20 8.16 5 26/06/06 20/09/06 20 8.08
La importancia que tiene el periodo de incubación de muestras (Belser 1977) en
general para todos los procesos, y en este caso para los relacionados con el nitrógeno,
fue la razón por la cual se tomaron 11 muestras para la estandarización del tiempo, y
cinco para la estandarización de las sales, ya que con el seguimiento realizado durante
siete días fue posible reconocer la fluctuación de los valores de NMP/g. De otro modo
al analizar los resultados obtenidos se demostró que cinco muestras fueron suficientes
para lograr resultados estadísticamente significativos para una estandarización.
Gephart (2006) observó que en un compost con 60 días de maduración, hay 320 mg
NH4/kg de nitrógeno y 240 mg de nitrato/kg de nitrógeno.
Se tomó compost de 13 semanas de madurez, debido a que es suficientemente estable
por baja emisión de CO2 y alta mineralización (Costa et al. 1991) de modo que pueda
ser usado con propósitos agrícolas sin ningún riesgo para la cosecha.
El promedio de la temperatura del compost muestreado fue mayor al promedio de la
del ambiente (14º), debido posiblemente a la fase de maduración en la que se
encuentra el proceso, la cual implica una disminución en la temperatura (Labrador
1996). Zibilske 2005, indica que a los 100 días del proceso, la materia orgánica
restante es degradada lentamente, por lo cual la baja actividad microbiana genera
menos calor del que se pierde en el sistema, por lo tanto el material se enfría. El pH
final del proceso se acercó a la neutralidad, producto de la actividad y procesos
metabólicos que afectaban fuertemente el pH de los materiales (Costa et al. 1991).
37
Aunque el uso del compostaje con desechos vegetales como biofertilizante ha
incrementado en estos años, es insuficiente lo que se conoce acerca de los
microorganismos responsables de las transformaciones de nitrógeno ocurridas en
este. El departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA 2006) ha hecho
algunas revisiones con respecto al compost y microorganismos como Azospirillum sp,
Bacillus sp, Azospirillum brasilense, fijadores de nitrógeno, bacterias sulfato
reductoras, microflora de compost urbano, entre otros.
El compost provee productos estables con alta cantidad de nutrientes y de fácil acceso
para las plantas, como el amonio, que durante la rápida hidrólisis de la urea y la
deaminación de péptidos no incorporados es transformado a NH3+, compuesto
nitrogenado mas disponible en compost. Al no ser esta la forma de nitrógeno más
usada por las plantas, las bacterias amonio-oxidadoras quimiolitótrofas lo utilizan
como sustrato para la nitrificación (Fauci et al., 1999).
En el compost, la nitrificación puede llevar a la lixiviación del nitrato que
acompañado de una desnitrificación incompleta da como resultado una pérdida de
nitrógeno del sistema por la producción de oxido nitroso (Bauhus y Melwes 1991;
Paul et al., 1993). La nitrificación es un proceso muy importante para el material
compostado, debido a que si no se presenta, el nitrógeno puede perderse por
volatilización del amonio, evitando así la acidificación del sustrato (Eghball y Power
1994; Hom et al., 1994).
Según Invar et al, 1993, la nitrificación se cualificó como un proceso normal en el
compostaje que depende totalmente de las condiciones y sustratos usados en el
compost. En la fase de maduración de los sistemas de compostaje, siempre se hallan
micro sitios anaeróbicos, los cuales contienen muchos microorganismos anaerobios
facultativos encargados de mas de la mitad del proceso de descomposición,
obteniendo como resultado productos usualmente reducidos a compuestos como
amonio y sulfuro que son acumulados durante el compostaje (Zibilske 2005).
38
6.3. Estandarización del tiempo de Incubación
Se decidió estandarizar el tiempo para bacterias nitrificantes y denitrificantes con el
T1 (0.5 g de SO4(NH4)2 con 1 g de CaCO3 y 0.5 g de KNO3 con 5 g de CaCO3
respectivamente), debido a que en el único estudio que se ha aplicado NMP para
bacterias nitrificantes según Kowalchuk et al., (1999) fue en compost procedente de
desechos animales en donde utilizaron las concentraciones usadas por Verhagen y
Laanbroek (1991).
Con el fin de establecer el mejor día para hacer la lectura después de la incubación,
obteniendo mayor biomasa en caldo amonio, se calcularon las medias (tabla 5) para
cada una de las muestras registrando el mayor crecimiento el día 15 (figura 3). Dichos
datos no se distribuyeron normalmente según el test de Shapiro Wilk (anexo 2 tabla
11), por tanto se aplicó la prueba de Kruskal-Wallis con un α=0.05, (anexo 2 tabla
12) obteniendo un p ⟨ 0.00001, con lo que se demostró que no existen diferencias
significativas entre los días 14,15 y 16 pero el mayor índice de crecimiento fue del
día 15, de modo que se rechaza la Ho de igualdad de medianas y se deduce que por lo
menos una de las medianas es diferente (anexo 2, tabla 12).
D12 D13 D14 D15 D16 D17 D180
50
100
150
() b
acte
rias
nitri
fican
tes
(NM
P/g
)
Tiempo de Incubación (Días) Figura 3. Registro diario de las medias del NMP/g de bacterias nitrificantes con desviación
estándar
39
Tabla 5. Estadística descriptiva. Media y desviación estándar del NMP de bacterias nitrificantes para estandarización del tiempo
Variable N Media Desviación estándar
D12 33 13.436 2.8877 D13 33 27.394 12.949 D14 33 102.52 31.912 D15 33 115.88 25.134 D16 33 98.394 30.254 D17 33 33.000 18.635 D18 33 13.500 5.2817
Aunque no se presentaron diferencias significativas entre la concentración de
bacterias de los días 14, 15 y 16, la concentración máxima de bacterias nitrificantes se
obtuvo el día 15, con biomasa mayor de 143 NMP/g de compost de la muestra 10 con
(figura 4), mientras que la más baja fue de 70 NMP/g de compost obtenida de la
muestra 5 (figura 4). Las diferencias que se encontraron entre las muestras se
debieron a la alta variabilidad de la tabla del NMP ya que sus valores oscilan
determinantemente dependiendo del número de tubos positivos, sin tener en cuenta la
similitud de los resultados cualitativos arrojados.
020406080
100120140160
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Muestra
NM
P/g
Figura 4. Registro de las medias del NMP/g de bacterias nitrificantes el día 15 de las muestras
recolectadas para la estandarización del tiempo de incubación
40
Según Neil (1992) al incubar las bacterias nitrificantes siete días, no se observó
presencia a causa de que usan varios senderos aeróbicos para reciclar el nitrógeno
orgánico compuesto en nitrato y nitrito. Según Verhagen y Laanbroek (1991) 15 días
es el tiempo suficiente para que las bacterias amonio-oxidadoras pasen el amonio a
nitrito, en condiciones óptimas, lo que sugiere que se gastaría un mes para evidenciar
la presencia de bacterias nitrito oxidadoras, ya que en los últimos 15 días de
incubación ocurriría el paso de nitrito a nitrato, si se parte de caldo amonio como
sustrato. Quastel y Scholefield (1951) utilizaron un aparato de perfusión en el suelo,
el cual agregaba cloruro de amonio, y luego tomaban una muestra del suelo
perfundido, y leían la cantidad nitrito o nitrato que se acumulaba en el suelo por
medio de colorimetría, dándose cuenta que la mayor intensidad de color se daba el día
14 y luego se mantenía, por tanto la formación de nitrato a partir de cloruro de
amonio se encontraba del día 14 al 16.
Figura 5. Prueba positiva (roja) en caldo amonio para bacterias nitrificantes, a los 15 días de
incubación
Según Yuan et al. (2005) y Degrange y Bardin (1995) el color de los tubos persiste
luego de un mes de incubación a 28ºC. Con este fenómeno se sugiere que el NO2
NITRITO
POSITIVO
41
puede coexistir con el NO3 en el medio amonio del NMP y los reactivos no
diferencian entre NO3 y NO2. Por esto Belser y Schmidt (1978), afirman que el NMP
es un acercamiento tradicional a estudiar la dinámica de población de nitrificantes en
suelo, y por tanto esta técnica debe leerse cuando se observe la mayor cantidad de
tubos positivos, ya que por razones fisicoquímicas, las poblaciones desaparecen a
menudo con la incubación.
Por tanto cabe la posibilidad de que pasados 15 días de incubación con nitrito o
nitrato formado puede suceder desnitrificación incompleta que podría formar oxido
nitroso (reacción 7) que se va a perder, por cual los resultados de biomasa del día 16
en adelante resultaron menores, al reaccionar dichos compuestos con el reactivo de
Griess o el polvo de Zinc. También puede que se haya dado el ciclo completo del
nitrógeno en algunos micrositios por presencia de bacterias capaces de reducir en
bajas condiciones de oxigeno, llevando NO3 a N2, (reacción 8) (Cadrin 1997) o por
último realice una reducción desasimilatoria que lleve el nitrito o nitrato formado a
amonio nuevamente, razón por la cual los tubos dieron negativos a la reacción con el
reactivo de Nessler.
4CH2O + 4 NO3 + 4H + 5e → 4CO2 + 2N2O + 6 H2O (7)
5CH2O + 4 NO3 + 4H + 5e → 5CO2 + 2N2 + 7 H2O (8)
Fue necesario incubar los tubos de bacterias nitrificantes por 15 días, ya que según
Gómez y Nageswara 1995, y Fleisher et al. 1987, el periodo comprendido entre los
días 7 y 14 se denomina “lag”, el cual es completamente independiente de la cantidad
de material existente en el suelo y representa el tiempo necesario para que estos
microorganismos alcancen su máxima actividad y crecimiento.
Con el fin de establecer el día de incubación en que se obtuvo mayor biomasa de
bacterias denitrificantes en caldo nitrato del NMP, se calcularon las medias para cada
una de las muestras (tabla 6) registrando el mayor crecimiento los días 15 y 16 (figura
42
6). Dichos datos no se distribuyeron normalmente según el test de Shapiro Wilk
(anexo 2 tabla 13) por tanto se aplicó la prueba de Kruskal-Wallis con un α=0.05,
obteniendo un p ⟨ 0.00001, (anexo 2 tabla 14) con lo que se demostró nuevamente
que el mayor índice de crecimiento se evidenció los días 15 y 16, de modo que se
rechaza la Ho de igualdad de medianas y se deduce que por lo menos una de las
medianas es diferente (anexo 2, tabla 14).
D12 D13 D14 D15 D16 D17 D180
10
20
30
40
() ba
cter
ia d
enitr
ifica
ntes
(NM
P/g
)
Tiempo de Incubación (días) Figura 6. Registro diario de las medias del NMP/g de bacterias de denitrificantes con desviación
estándar
Tabla 6. Estadística descriptiva. Media y desviación estándar del NMP de bacterias denitrificantes para estandarización del tiempo
Variable n Media Desviación estándar
D12 33 4.6515 1.9712 D13 33 9.4576 2.5720 D14 33 21.030 6.5693 D15 33 31.424 6.2100 D16 33 31.424 6.2100 D17 33 21.758 7.5168 D18 33 11.358 3.3640
Estos resultados contradicen lo descrito por Belser 1977, quien atribuye buenos
resultados en experimentos con bacterias denitrificantes a las tres semanas utilizadas
43
como tiempo de incubación, mientras que en el presente estudio se evidenció que
luego del aumento inicial de biomasa seguido de una estabilización, el número de
individuos disminuye en función del tiempo. Es de resaltar que los días con mayor
biomasa presentaron altas desviaciones estándares (anexo 2, tabla 10).
En cuanto a la utilización del nitrato como fuente de nitrógeno Samuelsson y
Gustafsson en 1988, describen mayor la acumulación de oxido nitroso en siembra con
caldo nitrito comparada con el caldo nitrato, posiblemente debido a la toxicidad del
nitrito, ya que Kaspar (1982) enuncia que la reducción de nitrito a oxido nitroso
puede ser la detoxificación del proceso.
Por otro lado las bacterias denitrificantes reducen nitrato produciendo coloración roja
con la adición del reactivo de Griess (Valerie y Bardin 1995), indicativo del primer
paso de la desnitrificación (nitrato a nitrito) (figura 5); luego con la adición del
reactivo de Nessler (Mariorri et al., 1982), la producción de amonio en el medio
causa tonalidad amarilla (figura 9). La presencia de nitrato en el medio sumado a la
adición de polvo de zinc, indica ausencia de bacterias denitrificantes o alguna falla en
el proceso evidenciado con viraje del medio a rojo. Si el color rojo no aparece, el
microorganismo ha reducido todo el nitrato y probablemente ha ocurrido
desnitrificación.
Adicionalmente Samuelsson, 1985, encontró que la desnitrificación puede llevarse a
cabo en caldo con medio nutritivo a las 12 horas de incubadas las muestras, de modo
que el polvo de zinc pudo haberse inactivado después del un período de
almacenamiento; por lo tanto, algunos de los tubos pudieron haber arrojados falsos
negativos, aunque este factor pudo haber sido controlado con la observación diaria de
la capacidad de reducir nitrato a nitrito.
44
Figura 7. Prueba negativa (roja) en caldo nitrato para bacterias denitrificantes a los 15 días de
incubación
Figura 8. Prueba positiva (amarilla) producida luego de la incubación durante 15 días en caldo
nitrato para bacterias denitrificantes
NITRATO POSITIVO
AMONIO POSITIVO
45
Con la lectura del NMP para bacterias denitrificantes se obtuvo una concentración
máxima de 39 NMP/g de compost, a partir de la muestra 4 (figura 9). Mientras que la
mínima fue 23.3 NMP/g de compost obtenido de la muestra 3 (figura 9).
Figura 9. Registro del NMP/g de bacterias denitrificantes de las muestras recolectadas para la
estandarización del tiempo de incubación
Pese a que las muestras tres y cuatro fueron recolectadas el mismo día, reportaron pH
y temperatura similar, y el tiempo y temperatura de incubación fue la misma, los
resultados obtenidos demuestran una biomasa heterogénea. Es posible que tal
diferencia se deba a que las muestras no fueron incubadas en la misma campana de
anaerobiosis y la muestra tres haya albergado microorganismos denitrificantes que
realizan reducción desasimilatoria de nitrato y nitrito y alguna falencia en el
procedimiento haya permitido una entrada de oxigeno que interfirió enzimáticamente
la desnitrificación ya que inhibió la nitrato, nitrito reductasa (Revsbech 1988) u oxido
nitroso reductasa (Bell y Ferguson 1991). En este caso, con el oxigeno y el nitrato
como aceptores de electrones puede haberse presentado acumulación de nitrito
(Samuelsson y Gustafsson 1988). No obstante Mckenney et al., 1982 encuentra que
con establecer condiciones anaeróbicas se muestra un aumento rápido de NO2
45 40 35 30
Con
cent
raci
ón (N
MP/
g)
25 20 15 10 5 0
1 2 3 9 10 4 5 6 7 8 11
Número de Muestra
46
seguido de su disminución gradual. El comportamiento similar es expuesto por NO y
N2O, aunque el aumento inicial de N2O sea menos pronunciado.
Respecto a la enzima nitrato reductasa desasimilatoria Letey et al., 1980 encontraron
que tiene la capacidad de desarrollarse rápidamente, mientras que la enzima óxido
nitroso reductasa desasimilatoria se desarrolla lentamente luego del inicio de las
condiciones anóxicas.
Es de mencionar que las muestras dos y ocho, las cuales presentaron baja biomasa,
fueron incubadas en la misma campana de anaerobiosis donde se incubó la muestra
tres. Del mismo modo se evidenció que la actividad denitrificante no fue nula,
posiblemente gracias a que los mecanismos de inhibición de las oxido nitroso
reductasa difieren por cada enzima. En algunas especies de denitrificantes estas
funciones dependen de condiciones aeróbicas o de la presencia de mecanismos para
protegerse del oxigeno, como el reportado en Azotobacter sp. para proteger la
nitrogenasa (Bell y Ferguson 1991). Los mismos autores concluyeron que la
reducción del nitrato y la formación de gas puede observarse en presencia de oxigeno,
pero hay directa evidencia de que la producción de nitrógeno atmosférico no es
viable, de modo que el oxigeno sigue siendo considerado como inhibidor de la
desnitrificación.
6.4. Estandarización de Sales
6.4.1. Estandarización de la concentración de SO4(NH4)2 y la adición o no de
CaCO3 para bacterias nitrificantes
En la estandarización de dos concentraciones de SO4(NH4)2 y la adición o no de
CaCO3 sobre la recuperación de biomasa, actividad y contribución del mayor
recuento de bacterias nitrificantes por la técnica del NMP, se trabajaron
concentraciones en combinación (tabla 7).
47
Tabla 7. Media, desviación estándar y Test de Shapiro-Wilk aplicado a tratamientos para la estandarización de sales en NMP de bacterias nitrificantes
Variable n Concentración de SO4(NH4)2
Adición de CaCO3
media Desviación estándar Amplitud p
T1 15 0.5 g 1 g 112.67 7.0373 0.4128 0.0000T2 15 0.5 g 0 g 5.3333 0.9759 0.6034 0.0000T3 15 0.33 g 1 g 27.600 2.2297 0.5470 0.0000T4 15 0.33 g 0 g 2.6667 0.9759 0.6034 0.0000
Con el objeto de puntualizar con que tratamiento se obtenía mayor biomasa en caldo
amonio del NMP para bacterias nitrificantes se calcularon las medias para cada una
de las muestras (tabla 7 figura 10) obteniendo el mayor crecimiento para el T1 (tabla
7 figura 10), con 112 NMP/g de compost, mientras que el tratamiento menos eficiente
fue el número cuatro (tabla 7 figura 10) con 2.67 NMP/g de compost, con esto se
realizó el test de Shapiro Wilk dando como resultado que los datos no se distribuían
normalmente (tabla 7), por tanto se realizó una prueba de Kruskal-Wallis con un
α=0.05, (anexo 2 tabla 15) obteniendo un p ⟨ 0.00001, con lo que se demostró
nuevamente que el mayor índice de crecimiento fue el del T1 (tabla 7), de modo que
se rechaza la Ho de igualdad de medianas y se deduce que por lo menos una de las
medianas es diferente (anexo 2, tabla 15).
T1 T2 T3 T40
40
80
120
() ba
cter
ias
nitri
fican
tes
(NM
P/g
)
Tratamiento Figura 10. Registro de las medias por tratamiento del NMP/g de bacterias nitrificantes con
desviación estándar
48
Claramente se observa diferencias significativas entre los tratamientos, demostrando
mayor crecimiento el T1 (tabla 7 figura 10) con desviación estándar 112.67± 7.04, y
luego el T3 (tabla 7 figura 10) con 27.60 ± 2.23, estos tratamientos eran los que
tenían en sus medios CaCO3, demostrando la importancia de adicionarlo en un medio
de cultivo para evaluar el crecimiento.
La nitrificación es un proceso muy débil, debido a la diversidad de condiciones
químicas y físicas que puede inhibirlo como ocurre con la materia orgánica en
exceso, los metales tóxicos, exceso de NH3, pH´s drásticos (<4.5 - >11),
temperaturas extremas (<5ºC - >65ºC) o radiación.(Koops y Moller 1992; Hastings et
al,. 1997; Mendum et al,. 1999). Según White et al., (1977) un medio de cultivo de
bacterias nitrificantes, así como en el suelo se necesita roca fosfórica, como el
bicarbonato de Sodio o el CaCO3, con el fin de que se de una pobre nitrificación o
hasta se inhiba.
Los resultados anteriores se deben a cambios de pH en el caldo amonio a causa de la
acidificación que se da por la nitrificación, por lo que la presencia de CaCO3 actúa
como estabilizador de pH que mantiene el pH neutro en el medio evitando la
inhibición de las enzimas de las bacterias nitrificantes, como son la Amonio
Monooxigenasa (AMO), la Hidroxilamina Oxidoreductasa (HAO), y la Nitrito
Oxidoreductasa (NOR).
Según Juliette et al., (1993), la AMO mas que la HAO es comúnmente identificada
como la enzima blanco para inhibir la nitrificación. Es de suma importancia ya que
esta enzima se inhibe a pH´s menores de 4.5 y mayores a 11, por esta razón el
CaCO3 jugó un papel fundamental en los T1 y T3 (tabla 7), debido a que el segundo
paso de la nitrificación es el paso de hidroxilamina a nitrito, en el cual se forma el
ácido nítrico, el cual, es el mayor causante del descenso de pH en el medio, por lo que
no dejaría producir el nitrito necesario en el T2 y T4 (tabla 7), con esto el reactivo de
49
Griess no tenia sustrato con el que reaccionar, y por ende tampoco el polvo de zinc,
por tanto tuvieron tan bajo crecimiento a falta del CaCO3.
Por otra parte la oxidación del nitrito según Yuan et al. (2005) debe estar en un rango
de pH de 7.5-8.6, por lo tanto el CaCO3 tomó nuevamente importancia al mantener el
pH y evitando que se acidificara en los medios del T1 y T3 (tabla 7), y así llevando el
amonio hasta nitrato. Christianson et al., (1979) y Gómez y Nageswara (1995), dicen
que es posible que bajo condiciones alcalinas del medio, a causa de la no
estabilización del pH, la incidencia de estas bacterias resulte aun mayormente
afectada, por las altas concentraciones de amonio libre.
En general, según Matulewich et al., (1975), los microorganismos nitrificantes de
diferentes ambientes (agua, sedimento, suelo) con un buen buffer que les mantenga el
pH de 7.8 a 8.5, 0.5 g de SO4(NH4)2 y una alta concentración de oxígeno, son los mas
activos, y obtienen mayor crecimiento.
La concentración de SO4(NH4)2 a la cual hubo mayor biomasa fue con 0.5 g en el T1
(tabla 7), por encima de los tratamientos dos, tres y cuatro (tabla 7). El segundo
tratamiento en crecimiento de biomasa fue el tres (tabla 7), el cual tenia una
concentración de 0.33, los dos tenían CaCO3 por lo tanto los otros dos tratamiento no
tuvieron posibilidades de crecer a causa de esto (figura 10).
A mayor concentración de SO4(NH4)2 no siempre va a ver mayor crecimiento, debido
a que el exceso de los iones de amonio, inhiben la nitrificación. Según Quastel y
Scholefield (1951) a una concentración de 0.01N y con un pH de 7.5-8.0 inhibe un
18% del crecimiento de la población de bacterias nitrificantes, así como con la misma
concentración y un pH de 9.0-9.5 inhibe el 55%.
En la nitrificación microbiana el mayor proceso es la oxidación de amonio a nitrito,
en el cual la hidroxilamina es el único recurso disponible para la actividad de la
50
AMO, porque la hidroxilamina deriva los electrones a partir de una fuente reductante
con el fin de permitir la amoniooxidación (Juliette et al., 1993). Según Juliette et al.,
(1993) y Hyman et al., (1990) la oxidación del amonio es susceptible a la inhibición
con efectos directos sobre la AMO, e indirectos sobre la HAO, como es el suplir
electrones a AMO. Al encontrar una mayor cantidad de amonio las bacterias
amoniooxidadoras fueron capaces de producir mayor cantidad de hidroxilamina, así
mismo como se mencionó anteriormente HAO suplió a AMO de mayor cantidad de
electrones dando como resultado mayor cantidad de nitrito formado en T1 (tabla 5)
frente al tres (tabla5).
El proceso de la nitrificación en su mayoría se presenta por la acción de bacterias
autotróficas, aunque con 0.33 las bacterias heterotróficas, muchas veces hacen parte
este proceso. El resultado es la inhibición de la nitrificación por causa de la
producción de glucosa o compuestos organicos a partir de estas bacterias (Verhagen
et al., 1993). Así mismo según Verhagen y Laanbroek (1991) la ausencia o bajos
rangos de formación de nitrato se adscrito a la supresión del proceso de nitrificación
por más bacterias heterotrofas competitivas. Estas bacterias inmovilizan el nitrógeno
mineral existente, por lo cual el crecimiento de las bacterias en el tratamiento con
0.33 g de SO4(NH4)2 fue menor ya que al haber competencia por el sustrato se
consumió mucho mas rápido el amonio presente. Por lo tanto el T1 (tabla 7) presentó
mayor crecimiento.
Quastel y Scholefield (1951) indicaron que el clorato de potasio produce una
oxidación bacterisotatica sobre la nitrito oxidación, la cual puede ser otra causa en el
crecimiento de las bacterias, ya que el caldo amonio contenía cloruro de sodio y
fosfato de potasio en sus componentes pudiéndose dar esta reacción e inhibiendo
estas a bacterias, evitando la producción del nitrito.
Por otra parte, según Tortoso y Hutchinson (1990), Anderson y Levine (1986) y
Goreau et al., (1980) Nitrosomonas europaea tiene la capacidad de producir NO y
51
N2O proveniente de amonio e hidroxilamina, por lo tanto el nitrógeno se estaría
perdiendo sin comenzar un proceso de nitrificación, y en el caso del T3 sería mas
rápida la perdida al tener menor cantidad de amonio en el medio.
Los tratamientos estuvieron los 15 días en una incubadora en ausencia de luz, algo
que pudo haber afectado el crecimiento, ya que según White et al., (1977), el efecto
de la luz solar aumenta la nitrificación paralelo un aumento en el consumo de
oxigeno.
6.4.2. Estandarización de la concentración de KNO3 y la adición o no de CaCO3
para bacterias denitrificantes
En la estandarización de dos concentraciones de KNO3 y la adición de CaCO3 sobre
la recuperación de biomasa, actividad y contribución del mayor recuento de bacterias
denitrificantes por la técnica del NMP fueron calculadas las medias para cada una de
las muestras (anexo 2 tabla 19) donde se obtuvo que el tratamiento mas eficaz fue el 1
(tabla 8) con 27.5 NMP/g de compost, mientras que le tratamiento menos eficiente
fue el 4 con 3.55 NMP/g de compost. Con esto se realizó el test de Shapiro Wilk
dando como resultado que los datos no se distribuían normalmente (tabla 8), por tanto
se realizó una prueba de Kruskal-wallis con un α=0.05, (anexo 2 tabla 16) obteniendo
un p ⟨ 0.00001, con lo que se demostró nuevamente que el mayor índice de
crecimiento fue el del T1, de modo que se rechaza la Ho de igualdad de medianas y
se deduce que por lo menos una de las medianas es diferente (anexo 2, tabla 16).
Tabla 8. Media, desviación estándar y Test de Shapiro-Wilk aplicado a tratamientos para la
estandarización de sales en NMP de bacterias denitrificantes
Variable Concentración de KNO3
Adición de CaCO3
Media Desviación estándar Amplitud p
T1 0.5 g 5 g 27.533 3.6814 0.8114 0.0052 T2 0.5 g 0 g 6.6867 1.6177 0.8708 0.0347 T3 2 g 5 g 16.400 2.9952 0.9132 0.1514 T4 2 g 0 g 3.5533 1.3389 0.7869 0.0025
52
T1 T2 T3 T40
8
16
24
32
() ba
cter
ias
deni
trific
ante
s (N
MP
/g)
Tratamiento Figura 11. Registro de las medias por tratamiento del NMP/g de bacterias denitrificantes con
desviación estándar
Aunque en compost de residuos vegetales no ha sido reportado el uso de la técnica
del NMP, la enumeración de las bacterias denitrificantes en suelo por esta técnica fue
propuesto primero por Halvorson y Ziegler (1933) y fue mejorado por Alexander
(1965) y Focht y Joseph (1973). Weier y Macrae (1992) reportaron la enumeración de
bacterias denitrificantes de suelo usando el método del NMP. Los tubos del NMP que
resultaron positivos para la desnitrificación fueron sometidos a la prueba
confirmatoria de Tiedje (1982) antes de que las bacterias denitrificantes fueran
aisladas en cultivos puros.
Blaszczyk (1993), estudiando el efecto de la composición del medio sobre la
desnitrificación del nitrato hecha por Paracoccus denitrificans, encuentra que los
mayores aumentos de la biomasa bacterial durante el proceso son evidenciados en el
medio enriquecido con una concentración de 1.8 g/l KNO3, esto difiere a lo
encontrado en este estudio donde la concentración mas próxima a la que Blaszczyk
utiliza (T3), (tabla 8, figura 11) arrojó menor recuperación de biomasa, actividad y/o
mayor recuento de bacterias denitrificantes que el T1 (tabla 8, figura 11).
53
En la misma investigación indican que la dependencia de las bacterias denitrificantes
a la fuente de carbono que en ese caso fue almidón y a la concentración de nitrato en
el medio, al respecto Mycielski et al., 1985 exponen que la glucosa puede llegar a
hacer la selección de las bacterias que son capaces de reducir nitrato a nitrito.
Posiblemente las bacterias denitrificantes provenientes del T1 y T3 (tabla 8)
capturaron el carbono proveniente de la glucosa y de la adición de CaCO3 de modo
que se sustentó la mayor biomasa de bacterias denitrificantes en dichos tratamientos.
Posible ecuación (ecuación 9).
C6H12O6+4NO3¯ 6CO2+6H2O+2N2 (9)
Del mismo modo Smith (1982), encontró que con la baja concentración de glucosa y
nitrato el producto predominante es el nitrito y la producción de amonio también se
evidencia. Igualmente Samuelsson (1985), plantea que cuando Pseudomonas
putrefaciens fue cultivado anaeróbicamente con glucosa como fuente de carbono y
nitrato como aceptor de electrones, el consumo de nitrato y la producción de nitrito
muestran en mismo patrón reportado para Citrobacter sp. El nitrito fue reducido a
amonio tanto como el nitrato se presentó en el medio. Según Smith (1982), esta
acumulación de nitrito puede deberse tanto a la toxicidad que se puede presentar en el
medio al acumularse nitrito como a la inhibición en el sistema de reducción de nitrito
por exceso de nitrato. No obstante algunas especies como Pseudomonas aeruginosa
son capaces de reducir nitrato con acumulación de nitrito en el medio (Samuelsson
1985). Es de aclarar que los niveles de nitrito acumulado dependen de la
concentración inicial de nitrato en el medio, ya que Blaszczyk et al., (1985), afirma
que en altas concentraciones de NO3 la cantidad de nitrito acumulado podría llegar a
ser casi 1 g de N por litro de medio y que definitivamente la acumulación de nitrito
durante la reducción de nitrato depende del equilibrio apropiado y no apropiado de las
fuentes de carbono y nitrógeno.
54
Benavides (2006), menciona que se determinó que la acumulación del nitrito en todos
los aislamientos era más alta cuando el nitrato era la fuente única del nitrógeno. Este
estudio sugiere que cuando el amonio existe junto con el nitrato, la reducción aerobia
del nitrato no produce una alta acumulación del nitrito.
Son varias las razones por las cuales ocurre acumulación de nitrito durante la
reducción de nitrato en cultivos con bacterias denitrificantes: la nitrito reductasa
puede ser inhibida por nitrato, ya que este puede ser utilizado competitivamente como
un aceptor de electrones en la presencia de nitrito (Komada et al., 1969); también la
óxido nítrico reductasa puede ser inhibida por el nitrato que precede la inhibición de
la nitrito reductasa por el óxido nítrico acumulado (Payne y Riley 1969).
Adicionalmente pueden las reacciones de reducción de nitrato y nitrito catalizadas por
reductasas apropiadas ser desbalanceadas (Betlach y Tiedje 1981); y la inducción de
nitrito reductasa puede retrasarse respecto a la inducción de nitrato reductasa
(Williams et al., 1978).
Por otra parte, es posible que con la adición de CaCO3 haya sido posible la regulación
del pH del medio nitrato de modo que se contribuyera a la recuperación de bacterias
denitrificantes como se demuestra en los resultados obtenidos (figura 11) ya que
McKeeney, 1985, encontró que en arcilla las condiciones suavemente ácidas pueden
llegar a inducir autodescomposición de ácido nitroso (McKeeney et al., 1985) que
podría constituir uno de los principales mecanismos de pérdida nitrito (Van Cleemput
et al., 1976). Del mismo modo la descomposición de HNO2 es el dependiente pH y es
más significativa con pH menor a 5 (Smith y Chalk 1980).
Para Fauci et al., 1999 la concentración de nitrato aumenta con la maduración de las
pilas de compostaje mientras los niveles de amonio disminuyen rápidamente. Debido
a que en la nitrificación se producen reacciones acidas estas concentraciones elevadas
de nitrato puede explicar el bajo pH de la mayoría de las pilas de compostaje, hecho
confirmado por Campbell et al., 1997.
55
Al medio nitrato se le adiciona solución de oligoelementos que contiene sulfato de
cobre, hecho que pudo haber estimulado la enzima oxido nitroso reductasa
compensando así, la sensibilidad del dicha enzima por el oxigeno (Snyder 1987).
Es importante destacar que es posible que numerosas especies bacterianas puedan
desnitrificar en medios de cultivo pero este hecho no asegura que el organismo sea
capaz de hacer lo mismo en suelo u otro sustrato (Nash y Bollag 1974). Beijerinck et
al., 1970 encontraron que algunos organismos denitrificantes en el suelo, como
Bacillus sp. al ser incubado con nitrato no favorecía el proceso de desnitrificación.
56
7. CONCLUSIONES
• La técnica del número mas probable para bacterias nitrificantes y
denitrificantes en compost, arrojó datos importantes, teniendo en cuenta que
era muy poca la información de esta técnica en esta matriz. Se obtuvo un día
ideal para la lectura, en el cual la microbiota tuvo su máximo crecimiento, sin
necesidad de hacer nuevamente un seguimiento para observar los procesos
que se llevan en diferentes tiempos dentro del medio.
• Se pudo estandarizar una concentración de sustrato para cada grupo con la
cual el microorganismo, va a tener un buen crecimiento, y no va a ser inhibido
por exceso del mismo.
• También se demostró la importancia del CaCO3 en el medio, como buffer para
mantener el pH debido a que la carencia de este puede disminuir las
reacciones al inhibir la maquinaria enzimática de cada grupo de bacterias en el
medio por tanto disminuir la biomasa.
• Con esto se pudo evidenciar la presencia de bacterias denitrificantes en un
proceso “aeróbico” como es el compostaje, lo cual demuestra la microaerofilia
o anaerobiosis que se produce en ciertas etapas.
• Del mismo modo, se evidenció la gran cantidad de bacterias nitrificantes
presentes, lo que es muy bueno para los procesos agrícolas, al ser usado el
compost como un insumo asegura de cierto modo el ciclaje de nitrógeno en el
suelo.
57
8. RECOMENDACIONES
• Debido a que las reacciones colorimétricas difieren dependiendo de las
concentraciones de nitrito, nitrato y amonios utilizados como sustratos, se
sugiere no confundir falsos negativos.
• Así mismo se aconseja la utilización de reactivos preparados recientemente
con el fin de que estos no interfieran en las reacciones de las pruebas.
• Realizar la conversión dependiendo de la dilución utilizada para la lectura del
número más probable.
• Para la incubación de bacterias nitrificantes se pueden obtener mejores
resultados si los tubos se incuban en presencia de luz.
• Para la incubación de bacterias denitrificantes se recomienda el uso de
campana de CO2 controlado.
• Por ultimo se señala la inutilidad de la realización de la técnica de recuento en
placa para bacterias nitrificantes y denitrificantes debido a la baja sensibilidad
de dicho método con respecto al NMP.
58
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74
ANEXOS
ANEXO 1. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
1.3. CALDO AMONIO
El agar amonio está compuesto por 0.5 o 0.33 g de sulfato de amonio, 1 g o sin
carbonato de calcio, 1 g de fosfato de potasio, 0.3 g de sulfato de magnesio, 0.3 g de
cloruro de sodio, 0.03 g de sulfato ferroso, 18 g de agar-agar en caso de requerir
medio sólido y 950 ml de agua destilada (Girard y Rougieux 1964; Verhagen and
Laandbroek 1991).
1.4. CALDO NITRATO
El agar nitrato está compuesto por 2 o 0.5 g de nitrato de potasio, 5 g o sin carbonato
de calcio, 10 g de glucosa, 50 ml de solución salina standard, 1 ml de oligoelementos,
18 g de agar-agar en caso de requerir medio sólido y 950 ml de agua destilada (Girard
y Rougieux 1964; Verhagen and Laandbroek 1991; Hashimoto et al. 2005).
1.3. REACTIVO DE NESSLER
Para la detección de amonio se preparará el reactivo Nessler en el cual se debe
utilizar: 50 g de Ioduro mercúrico, 36.5 g de Ioduro de Potasio. Se le añadirá 1 ml de
agua destilada y se tritura. Luego se mezcla 150 g de potasa en pastillas y se completa
con un litro de agua destilada caliente.
75
1.4. REACTIVO DE GRIESS
Para la preparación del reactivo para detección de nitrito se debe utilizar: Solución de
ácido sulfanílico: 0.5 g de ácido sulfanílico en 70 ml de agua destilada caliente. Se
dejará enfriar y posteriormente se adicionarán 30 ml de ácido acético.
1.5. SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE pHmetro
Para calibrar el pHmetro a 6.86 se disuelven 3.39 g de Fosfato monopotásico
(KH2PO4) y 3.53 g de Fosfato disódico anhidro (Na2HPO4) en agua destilada y diluya
a un litro. La solución debe prepararse con agua destilada.
76
ANEXO 2. ANÁLISIS DE LA INFORMACIÓN
Tabla 9. Media y desviación estándar del NMP/g de compost de bacterias nitrificantes, tomado
diariamente para cada una de las muestras. NMP/g
Muestra Día 12 Día 13 Día 14 Día 15 Día 16 Día 17 Día 18 Preliminar 8.87±1.85 18.3±2.31 130±17.3 130±17.3 130±17.3 21.7±4.04 6.80±0.00
1 16.0±1.73 26.0±0.00 120±17.3 120±17.3 99.7±17.9 16.0±1.73 9.37±2.60 2 16.0±3.46 29.0±3.46 96.3±42.2 120±10.0 94.3±15.5 30.3±3.79 14.0±3.00 3 16.0±1.73 28.3±4.04 110±30.5 120±17.3 99.7±46.4 63.0±12.1 19.7±7.77 4 15.0±1.73 23.0±5.20 70.0±0.00 70.0±0.00 70.0±0.00 32.7±11.6 10.4±1.04 5 13.0±1.73 18.0±1.73 113±31.1 133±11.6 118±23.1 63.3±34.5 21.7±4.51 6 15.0±1.73 28.0±3.46 125±26.6 140±0.00 104±31.8 36.7±4.04 18.7±2.89 7 9.93±1.85 22.7±2.89 83.3±23.1 110±0.00 94.3±27.1 24.3±2.89 12.0±1.73 8 14.0±0.00 24.7±2.31 78.0±13.86 78.0±13.86 78.0±13.86 18.7±2.89 9.93±1.85 9 12.0±1.73 58.7±27.8 126±45.6 143±23.1 94.3±69.3 33.7±6.51 14.0±0.00
10 12.0±1.73 24.7±2.31 76.3±30.9 110±0.00 99.7±17.9 22.7±2.89 12.0±1.73
Tabla 10. Media y desviación estándar del NMP/g de compost de bacterias denitrificantes, tomado diariamente para cada una de las muestras.
NMP/g Muestra Día 12 Día 13 Día 14 Día 15 Día 16 Día 17 Día 18
Preliminar 2.67±1.16 7.60±1.38 18.0±3.46 34.0±3.46 34.0±3.46 21.67±4.04 6.80±0.00 1 5.87±1.61 6.80±0.00 15.0±1.73 26.0±0.00 26.0±0.00 20.3±6.03 12.0±1.73 2 3.33±1.15 7.60±1.39 19.0±6.24 23.3±2.31 23.3±2.31 19.7±7.77 12.0±1.73 3 6.57±0.40 13.7±2.89 26.3±10.9 39.0±0.00 39.0±0.00 25.3±11.9 13.0±1.73 4 4.00±0.00 9.27±0.06 20.3±5.77 26.7±0.58 26.7±0.58 15.0±1.73 6.03±1.73 5 4.70±1.21 11.7±2.36 28.0±11.5 38.0±3.46 38.0±3.46 29.3±9.71 15.0±1.73 6 4.93±1.62 8.30±1.82 21.7±2.08 37.0±3.46 37.0±3.46 23.7±8.32 12.7±1.16 7 2.67±1.16 8.40±1.39 17.0±0.00 26.0±0.00 26.0±0.00 17.0±7.94 8.43±4.96 8 4.70±1.21 11.1±1.56 26.0±6.00 29.0±0.00 29.0±0.00 27.7±10.0 12.7±1.16 9 8.40±1.39 11.1±1.56 20.0±5.20 30.7±4.04 30.7±4.04 21.3±4.51 15.0±1.73 10 3.33±1.16 8.53±3.00 20.0±5.20 26.0±0.00 26.0±0.00 18.3±2.31 11.3±0.58
77
Tabla 11. Test de Shapiro-Wilk aplicado a NMP de bacterias nitrificantes para estandarización del tiempo
Variable N Amplitud P D12 33 0.9022 0.0061 D13 33 0.5646 0.0000 D14 33 0.9236 0.0230 D15 33 0.8868 0.0025 D16 33 0.9602 0.2616 D17 33 0.7859 0.0000 D18 33 0.8896 0.0029
Tabla 12. Prueba no paramétrica Kruskal-Wallis aplicada para homogeneidad de grupos a NMP
de bacterias nitrificantes para estandarización del tiempo
Variable Rango medianas Numero de muestras
Homogeneidad de grupos
D12 37.1 33 C D13 95.5 33 B D14 177.6 33 A D15 190.9 33 A D16 173.7 33 A D17 101.0 33 B D18 36.2 33 C Total 116.0 231
Valor de p 0.0000
Tabla 13. Test de Shapiro-Wilk aplicado a NMP de bacterias denitrificantes para estandarización del tiempo
Variable n amplitud p
D12 33 0.8641 0.0007 D13 33 0.8689 0.0009 D14 33 0.8212 0.0001 D15 33 0.8306 0.0001 D16 33 0.8306 0.0001 D17 33 0.8995 0.0052 D18 33 0.8904 0.0030
78
Tabla 14. Prueba no paramétrica Kruskal-Wallis aplicada a homogeneidad de grupos a NMP de bacterias denitrificantes para estandarización del tiempo
Variable Rango mediana
Numero de
muestras
Homogeneidad de Grupos
D12 20.6 33 D D13 59.7 33 CD D14 138.2 33 B D15 189.4 33 A D16 189.4 33 A D17 140.0 33 AB D18 74.7 33 C Total 116.0 231
Valor de 0.0000
Tabla 15. Prueba no paramétrica Kruskal-Wallis aplicada para homogeneidad de grupos a NMP
de bacterias nitrificantes para estandarización de sales con un α 0.05 Variable Rango
Mediana Numero de
muestra Homogeneidad de
grupos T1 53,0 15 A T2 22,2 15 BC T3 38,0 15 AB T4 8,8 15 C
Total 30,5 60 Valor –P
0.0000
Tabla 16. Prueba no paramétrica Kruskal-Wallis aplicada para homogeneidad de grupos a NMP
de bacterias denitrificantes para estandarización de sales α 0.05 Variable Rango
Mediana Numero de
muestra Homogeneidad de
grupos T1 52,9 15 A T2 22,0 15 BC T3 38,1 15 AB T4 9,0 15 C
Total 30,5 60 Valor-P
0.0000 1
79
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANAFACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y VETERINARIA E INDUSTRIAL
Estandarización del tiempo de incubación y concentración de CaCO3, SO4(NH4)2 y KNO3 para la prueba del NMP con bacterias nitrificantes y denitrificantes usando
como matriz compost
NATALIA CAROLINA RODRIGUEZ MORENOCHRISTIAN ALFONSO TORO LOZANO
RemineralizaciónNitrificación
Heterótrofos Amonificación
CICLO DEL NITROGENO
Reducción
Desnitr
ificac
ión
DesasimilatoriaFijación de N
AEROBIOSIS
ANAEROBIOSIS
Freshwater Ecology, Dodds 2001, Academic press
N ORG
NITRIFICACION
NH3 + O2 + 2H+ + 2e- → NH2OH + H2O → NO2-+ 5H+ H2O → NO3- + 2H
1. Amonio Monooxigenasa (AMO)2. Hidroxilamina Oxidoreductasa (HAO)3. Nitrito Oxidoreductasa (NOR)
1 2
3
BACTERIAS NITRIFICANTES
• Gram negativas• Bacilar, espiral o esférica• Flagelos • Quimiolitótrofas / quimioautotrofas • pH de 4.5 a 8 / Tº 25-35ºC• Nitrosomonas, Nitrosospira,
Nitrosococcus, Nitrosolobusy Nitrosovibrio
• Nitrobacter, Nitrospira, Nitrospinay Nitrococcus
(Head et al., 1993; Bock et al. 1990)
Inhibición: Alta humedad, materia orgánica, metales pesados, exceso de amonio
http://www.procrastin.fr/blog/images/bacterie/Nitrosomonas
http://www.science.oregonstate.edu/bpp/Labs/arpd/Nedivzoomin.jpg
DENITRIFICACION
NO3 - → NO2 - → NO → N2O → N22NO3- + 5H2 → N2 + 4 H2O + 2OH-
(1)Nitrato Reductasa (NAR)(2)Nitrito Reductasa (NIR)
(3)Oxido Nítrico Reductasa (NOR)(4)Oxido Nitroso reductasa (NOS)
1 2 3 4
BACTERIAS DENITRIFICANTES• Características filamentosas
• Dependen: Humedad del suelo[] O2[] de NO3-[] carbonopH y Tº
(Tiedje 1988; Vermoesen et al., 1993; Nelson y Terry 1996)
• Alcaligenes sp, Nocardia sp. E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Paracoccus denitrificans, Thiobacillusdenitrificans, Thiosphaera pantotropha
(Hutchinson 1970; Zumft 1997; Bell y Ferguson)
• Inhibidores: amoniaco o metabolitos orgánicos nitrogenados reducidos, ↑↑ amonio, acidez, Acetileno, O2
(Revsbech et al., 1988; Maier 2000; Atlas y Bartha 2002)
http://genome.jgi-psf.org/draft_microbes/images/thide.jpg
http://v2.pseudomonas.com/images/paeruginosa.jpg
Técnicas Microbiológicas
• Cromatografía
• Recuento en placa
• Numero Mas Probable (NMP)
• Colorimetría
http://www.calidadambiental.info/murcia/images/cromatografo.jpg
http://www.isasaleon.com.mx/productos/ovibond/pfx880p.jpg
__________________________________________
1. Halvorson y Ziegler→ Enumeración de las bacterias denitrificantes en suelo2. Girard y Rougieux → NMP → Describen técnica bacterias nitrificantes y denitrificantes3. Alexander4. Focht y Joseph Técnica en Microplacas5. Tiedje → Describe la técnica para Nitrificantes 6. Verhagen y Laanbroek → bacterias nitrificantes quimiolitotrófas y heterótrofas7. Weier y Macrae → enumeración de bacterias denitrificantes 8. Hashimoto et al → modificaron NMP de Tiedje
1933 1964 1965 1973 1982 1991 1992 2005
NMP ⇒ Densidad poblacional de un grupo determinado de microorganismos de forma indirecta
NH2
⏐
⏐SO3H
+ HNO2 →⏐
SO3H
⏐N
N
ll
+
Acido Sulfanílico Acido Nitroso Acido sulfanílico diazotizado α-Naftilamina
(incoloro) (sal de diazonio incoloro) (incolora)
Acoplam
iento
ρ-Sulfobenceno-azo-α-naftilamina(colorante azo rojo) (hidrosoluble)
⏐NH2
⏐SO3H
⎯N=N⎯
+ H2O
⏐NH2
CH3COOH +
Acido acético
Agente reductor
Polvo de Zn++
Arilhidrazina (compuesto coloreado)
[C6H5NHN+H3] ⎯ OSO3H
Reactivo de Griess
Recurso o producto de origen biológico elaborados comercialmente BIOINSUMO →
Inoculantes microbiales
Controlador de plagasBioabono
COMPOST
↑↑ nutrimento ↑↑ flora microbiana
Mejora calidad del suelo
Formas inorgánicas nitrogenadas
NH4
NO3
Nutrición vegetal MIC Características biológicas del suelo
OBJETIVO GENERAL
Estandarizar el tiempo de incubación y concentración de CaCO3, SO4(NH4)2 y
KNO3 para la prueba del NMP con bacterias nitrificantes y denitrificantes usando como
matriz compost.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Establecer diferencia entre los valores de NMP para bacterias nitrificantes y denitrificantes provenientes del proceso de compostaje determinando el día de mayor abundancia.
• Determinar la importancia de la adición de CaCO3 sobre la recuperación de biomasa y actividad de bacterias nitrificantes y denitrificantes provenientes del proceso de compostaje.
• Evaluar dos concentraciones de SO4(NH4)2 y KNO3 necesarias para estandarizar cual favorece el mayor recuento de bacterias nitrificantes y denitrificantes respectivamente por la técnica del NMP en compost.
DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN
Investigación ⇒ experimental
Factores de diseño
Concentración KNO3 Concentración de SO4(NH4)2
Tiempo de incubación Requerimiento de CaCO3
Niveles del factor de diseño
Concentración de sales y requerimiento de CaCO3
en los medios de cultivo para bacterias nitrificantes y denitrificantes
TRATAMIENTOS
Con CaCO3
Sin CaCO3
Medio Amonio
Medio Nitrato
10.5 g SO4(NH4)2
30.33 g
SO4(NH4)2
10.5 KNO3
32 g KNO3
Medio Amonio
Medio Nitrato
40.33 g
SO4(NH4)2
20.5 g
SO4(NH4)2
20.5 KNO3
42 g KNO3
Figura 1. Niveles del factor de diseño utilizados para estandarizarla concentración de SO4(NH4)2 y KNO3 y la adición o no de CaCO3
Población de Estudio y Muestra
Compost de 13 semanas a partir de cultivo de flores↓
Tocancipá (Cundinamarca)⇓
2.600 m.s.n.m. temperatura promedio de 14 ºC
(IGAC 1996)
Compost de 13 semanas de maduración
10 submuestras Muestra compuesta
Estandarizaciónde la concentración
de sales ↓
5 muestras↓
15 días
Estandarización del tiempo de incubación
↓11 muestras durante
22 días↓
muestra preliminar y 10 muestras prueba
Variable Dependiente ↓
Concentración de bacterias por el NMP/g de muestra
Variables independientes
Concentración de RequerimientoSO4(NH4)2 y KNO3 de CaCO3
Tiempo de incubación
MÉTODOS
• Determinación del pH del compost
• Estandarización del Tiempo de Incubación
• Estandarización de Sales
• Número Más Probable Bacterias Nitrificantes
• Número Más Probable Bacterias Denitrificantes
• Análisis de Información
Estandarización del tiempo de Incubación
11 muestras T1
NITRIFICANTES DENITRIFICANTES1 g CaCO3 5 g CaCO3
0.5 g SO4(NH4)2 0.5 g KNO3
CALDO AMONIO CALDO NITRATO
• 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18 días
• Análisis estadístico de los resultados obtenidos se seleccionó el día de mayor producción de biomasa para todas las muestras
Kowalchuk et al., 1999
Estandarización de Sales
Concentración de CaCO3
Concentración de SO4(NH4)2
1 g (Verhagen y Laandbroek 1991)
0.5 g (Verhagen y Laandbroek 1991)0.33 g (Girard y Rougieux 1964)
0 g (Girard y Rougieux 1964)
0.5 g (Verhagen y Laandbroek 1991)0.33 g (Girard y Rougieux 1964)
Concentración de CaCO3
Concentración de KNO3
0.5 g (Hashimoto et
al., 2005)5 g (Verhageny Laandbroek
1991) 2 g (Girard y Rougieux
1964)2 g (Girard y
Rougieux1964)
0 g (Girard y Rougieux
1964) 0.5 g (Hashimoto et
al., 2005)
Tabla 2. Medio nitrato con componentes a diferentes concentraciones
Tabla 1. Medio amonio con componentes a diferentes concentraciones
• 5 muestras nuevas• 4 tratamientos
• Leídos el día de incubación determinado
Número Más Probable Bacterias Nitrificantes
10 g + 90 ml
10-1 1 ml
Caldo amonio
10-3
10-2
1 mlCaldo amonio
1 mlCaldo amonio
28ºC
2 semanas
+ + + + +
+ + + + +
2 gotas de reactivo de Griess
Rojo
↓
nitritos
Incolora
polvo de zinc
Naranja-Rojo
↓
Nitrato
Incolora
2 gotas de reactivo de
Nessler
Tablas de Cochran 1950 Amonio amarillo
Número Más Probable Bacterias Denitrificantes
10-1 1 ml
Caldo nitrato
10-3
10-2
1 mlCaldo nitrato
1 mlCaldo nitrato
+ + + + +
+ + + + +
2 gotas de reactivo de Griess
Rojo
↓
nitritos
10 g + 90 ml
28ºC2 semanas
Anaerobiosis
Incolora
2 gotas del reactivode Nessler
Amarillo
↓
Amonio
Incolora
+
polvo de zinc
Tablas de Cochran 1950
Análisis de Información
Tiempo de incubación
1. Medias del resultado de NMP2. Prueba de Shapiro Wilk 3. No distribución normal4. Kruskal-wallis con un α de 0.05 (Sokal y Rohlf 2000)
5. Hipótesis:
H0: Las medias de la biomasa en los días 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18 de incubación son iguales
Hi : Al menos una de las medias es diferente
Concentración de SO4(NH4)2 / KNO3 con y sin CaCO3
1. Medias del resultado de NMP de bacterias 2. Prueba de Shapiro Wilk 3. No distribución normal4. Kruskal-wallis con un α de 0.05 (Sokal y Rohlf 2000)
5. Hipótesis:
H0 = µ1 = µ2 = µ3 = µ4
Hi = µ1 ≠ µ2 = µ3 = µ4
RESULTADOSRESULTADOS
http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/images/Citrobacter.jpg
Figura 2. Pilas de compostaje muestreadas, Cultivos del Norte
Residuos de pompón, papel, un inoculante microbiano y leche
00074 de 2002 del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural
Abono foliar de origen natural y preparados
vegetales
Características de las muestras para estandarización del tiempo de Incubación
0
5
10
15
20
25
30
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 117.4
7.6
7.8
8
8.2
8.4
8.6
TpH
Figura 3. pH y temperatura de las muestras recolectadas para la estandarización del tiempo de incubación del NMP en bacterias
nitrificantes y denitrificantes
21ºC 19ºC / 24ºC
pH 7.89/ 8.54
Tº → ↓ Actividad microbiana
Día de Muestreo
pH
Tem
pera
tura
ºC
pH → Actividad y procesosmetabólicos
Características de las muestras para estandarización de Sales
0
5
10
15
20
25
1 2 3 4 58
8.05
8.1
8.15
8.2
8.25
8.3
TpH
Figura 4. pH y temperatura de las muestras recolectadas para laestandarización de sales del NMP en bacterias nitrificantes y denitrificantes.
21ºC 19ºC / 24ºC
pH 8.08/ 8.24
Día de Muestreo
pH
Tem
pera
tura
ºC
Estandarización del tiempo de Incubación
BACTERIAS NITRIFICANTES
BACTERIAS DENITRIFICANTES
T1
0.5 g de SO4(NH4)2 0.5 g de KNO3con 1 g de CaCO3 con 5 g de CaCO3
Verhagen y Laanbroek (1991)Kowalchuk et al., (1999)
BACTERIAS NITRIFICANTES
NH4 → NO3 → 15 díasQuastel y Scholefield 1951;Verhagen y Laanbroek 1991
116 NMP/g de compost14 NMP/g de compost
D12 D13 D14 D15 D16 D17 D180
50
100
150
() b
acte
rias
nitri
fican
tes
(NM
P/g
)
Tiempo de Incubación (Días)
Figura 5. Registro diario de las medias del NMP/g de bacterias nitrificantes con desviación estándar
D12 D13 D14 D15 D16 D17 D18Tiempo de Incubación
Figura 6. Registro de las medias del NMP/g de bacterias nitrificantes el día 15 de las muestras recolectadas para
la estandarización del tiempo de incubación
020406080
100120140160
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Numero de Muestra
Con
cent
raci
on (N
MP/
g)
143 NMP/g de compost70 NMP/g de compost
Figura 7. Prueba positiva (roja) en caldo amoniopara bacterias nitrificantes, a los 15 días de incubación
NITRITO POSITIVO
Coexisten NO2 y NO3Yuan et al. (2005) y Degrange y Bardin (1995)
Leer técnica ↑ tubos positivosBelser y Schmidt (1978)
4CH2O + 4 NO3 + 4H + 5e → 4CO2 + 2N2O + 6 H2O5CH2O + 4 NO3 + 4H + 5e → 5CO2 + 2N2 + 7 H2O
Desnitrificación completaCadrin 1997
7-14 días → ↑ actividad ↑ crecimiento Gómez y Nageswara 1995; Fleisher et al. 1987
Figura 8. Registro diario de las medias del NMP/g de bacteriasde denitrificantes con desviación estándar
31.42 NMP/g de compost
21 días de incubación a 4 diferentes
profundidades de sueloBelser 1977
D12 D13 D14 D15 D16 D17 D180
10
20
30
40
() ba
cter
ia d
enitr
ifica
ntes
(NM
P/g
)
Tiempo de Incubación (días)
BACTERIAS DENITRIFICANTES
D12 D13 D14 D15 D16 D17 D18 Tiempo de Incubación
Suelo árido y suelohumedecido
Smith y Parsons 1985
NITRATO POSITIVO AMONIO POSITIVO
12 horas ⇓
Incubación ⇓
Sobre incubación de muestras↓Zn
Samuelsson 1985
Figura 9. Registro del NMP/g de bacterias denitrificantes de lasmuestras recolectadas para la estandarización del tiempo de incubación
05
10
15202530
354045
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Numero de Muestra
Con
cent
raci
on (N
MP/
g)
39 NMP/g de compost23.3 NMP/g de compost
Interrupción enzimáticadel proceso por O2
↓Nitrato Nitrito
Oxido nitroso reductasa⇓
P. denitrificans → mRNA
Bell y Ferguson 1991
↓Thiosphaera pantotrophaAzotobacter: Nitrogenasa
Concentraciones de biomasa fueron heterogéneas.
Acumulación de nitrito
Samuelsson et al., 1988
P. fluorescensO2NO3
Estandarización de la concentración de y KNO3 la adición o no de CaCO3
Estandarización de Sales
Bacterias Nitrificantes Bacterias Denitrificantes
SO4(NH4)2,
Figura 12. Registro de las medias por tratamiento del NMP/g de bacterias nitrificantes con desviación estándar
BACTERIAS NITRIFICANTES
CaCO3 estabiliza ácidosLuz solar → ↑ nitrificación
White et al., 1977
AMO se inhibe <4.5→NH2OH→HNO2NH2OH cede e- a AMO
Juliette et al.,1993 y Hyman et al.,1990
Clorato de Potasio → Acción BacteriostáticaQuastel y Scholefield 1951
Bacterias Heterótrofas → Glucosa/compuestos orgánicos Inmovilización NVerhagen et al., 1993 y Verhagen y Laanbroek 1991
T1 T2 T3 T40
40
80
120
() ba
cter
ias
nitri
fican
tes
(NM
P/g
)
TratamientoT1 T2 T3 T4
112.67 NMP/g de compost
2.67 NMP/g de compost
Nitrosomonas europaeaNH3 y NH2OH→NO y N2O
(Tortoso y Hutchinson 1990, Anderson y Levine 1986 y Goreau et al.,1980)
Nitrosomonas europaeaNH3 y NH2OH→NO y N2O
(Tortoso y Hutchinson 1990, Anderson y Levine 1986 y Goreau et al.,1980)
http://www.science.oregonstate.edu/bpp/Labs/arpd/Nedivzoomin.jpg
Figura 13. Registro de las medias por tratamiento del NMP/g de bacterias denitrificantes con desviación estándar
T1 T2 T3 T40
8
16
24
32
() ba
cter
ias
deni
trific
ante
s (N
MP
/g)
Tratamiento
BACTERIAS DENITRIFICANTES Paracoccus denitrificans⇓
1.8 g/l KNO3 ≈ T2Blaszczyk 1993
NH4 y NO3 no acumulaciónBenavides 2006
Acumulación de nitrito depende[] iniciales de NO3Blaszczyk et al., 1985
P. aeruginosaSamuelsson 1985
T1 T2 T3 T4
→N2 + Inhibidores = incremento y → acumulación de N2O y NO2
Bollag y Kurek 1980
27.53 NMP/g de compost
3.55 NMP/g de compost
Acumulación de nitrito⇓
NO3 - → NO2 → NO → N2O → N2
CaCO3Contribuye a la recuperación de bacterias
↓HNO2 → mutágeno → NOR → NO
Dependencia de fuente de N y C⇓
C6H12O6 + 4NO3 → 6CO2+ 6H2O + 2N2
⇓Pseudomonas putrefaciens y Citrobacter sp.
Acumulación de N2O↓
Stainer et al., 1963
http://v2.pseudomonas.com/images/paeruginosa.jpg
http://medecinepharmacie.univ-fcomte.fr/bacterio_web/img/phototheque/Examens%20microscopiques/BGN/Pseudomonas_aeruginosa_Culture.jpg
NMP
http://homepages.wmich.edu/~rossbach/bios312/LabProcedures/Nitrate%201.jpg
Desventajas
• No realiza identificación se especies bacterianas
• Pueden coexistir diferentes formas inorgánicas del N
Ventajas
• Estimar tamaños poblacionales →
selectividad
• Recuperación uniforme
• Vivos y activos metabólicamente
• Rápido y mas confiable de confiable
CONCLUSIONES
• Fue posible cuantificar bacterias nitrificantes y denitrificantes utilizando NMP en una matriz diferente a suelo como es el compost.
• Se logró estandarizar el tiempo de la técnica en el día 15 basados en la mayor producción de la biomasa.
• Se obtuvo una concentración de sustrato optima para cada grupo con la cual el microorganismo va a tener un buen crecimiento sin que este sea inhibido por exceso del mismo.
• La importancia del CaCO3 en el medio radica en el mantenimiento del pH, evitando la inhibición de la Amonio Monooxigenasa, Hidroxilamina Oxidoreductasa, Nitrato reductasa y Oxido Nítrico reductasa.
• Con esta técnica se pudo evidenciar la presencia de bacterias denitrificantes en un proceso aeróbico como el compostaje, lo cual demuestra la microaerofilia o anaerobiosis que se produce en ciertas etapas.
• Se evidenció la gran cantidad de bacterias nitrificantes presentes, favorable para los procesos agrícolas, al ser usado el compost como un insumo que asegura de cierto modo el ciclaje de nitrógeno en el suelo.
RECOMENDACIONES
• Debido a que las reacciones colorimétricas difieren dependiendo de las concentraciones de nitrito, nitrato y amonios utilizados como sustratos, se sugiere no confundir falsos negativos.
• Se sugiere evaluar la técnica con medio nitrito para observar el tiempo de oxidación de nitrito a nitrato.
• Así mismo se aconseja la conservación de los reactivos en refrigeración y vigencia máxima de 3 meses.
• Estandarizar la técnica del NMP en lugar con temperatura ambiente de 28-30ºC con luz y sin luz
• Realizar seguimiento al pH del medio durante los días de incubación.
• Para la incubación de bacterias denitrificantes se recomienda el uso de campana de CO2 controlado.
GRACIAS
