MANUAL PRÁCTICAS AP 2015-2016.pdf

8/19/2019 MANUAL PRÁCTICAS AP 2015-2016.pdf

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PRÁCTICAS DE LABORATORIO

Análisis Microbiológico y Parasitológico

Área de Parasitología

Grupo A: Prof. Teresa Santamarina Fernández

Grupo B: Prof. Esperanza Paniagua Crespo

PARASITOLOGÍA:

Práctica 1.

Coprología parasitaria: Examen macroscópico. Tinción. Técnicacoprológica de concentración. Identificación de formas parasitarias almicroscopio.

Práctica 2.

Hematología parasitaria: Identificación microscópica de formasparasitarias en preparaciones teñidas de sangre. Identificación

microscópica de formas parasitarias tisulares.

Práctica 3.

Métodos especiales. Graham, Baerman. Determinación de formasparasitarias en muestras ambientales.

ALUMNA/O .................................................................


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Práctica 1Coprología parasitaria:

- Examen macroscópico de heces:

Visualización vídeo (5 min)

La inspección directa de las heces es importante, ya que puede conducir a un diagnósticode infección parasitaria, ictericia obstructiva, diarrea, malabsorción, obstrucciónrectosigmoidea, disentería o colitis ulcerosa, o pérdida de sangre en el conductogastrointestinal.

a. Debe anotarse la consistencia (especificando si son pastosas, blandas, semilíquidas ólíquidas ó duras) y color del excremento (café, amarillo, rojizo, negruzco, verde, etc.)

b. Detectar en el examen general, manchas de sangre o moco y presencia de restosalimenticios (grasa….).

c.

Detectar macroparásitos: los proglótides o adultos de helmintos para identificarmicroscópicamente.

- Examen microscópico heces: Visualización vídeo (15 min)

Diversas formas parasitarias microscópicas de protozoos (quistes, trofozoítos y ooquistes)así como huevos y larvas de helmintos pueden ser visualizados mediante su examendirecto o tras ser sometidas las heces a concentración u otras técnicas especiales.

- Tinciones:

Tinción con Lugol *1

• Mezclar bien el sedimento y transferir una gota a un portaobjetos limpio.• Añadir al portaobjetos una gota de lugol diluido al 20% (1:5) en suero salino y colocar

un cubreobjetos de 20 x 20 mm.

• Examinar a 400x.

Con suero fisiológico, los trofozoítos y quistes de los protozoos se observan en forma

natural y con lugol se observan las estructuras internas, núcleos y vacuolas.

Tinción negativa de Heine

Colocar en portaobjetos una pequeña cantidad de heces.

Añadir una gota de fucsina básica fenicada y con ayuda de un palillo, extender yhomogenizar la mezcla.

Secar al aire no más de 15 min. y examinar a 400x.

Los ooquistes de Cryptosporidium aparecen como pequeñas estructuras circulares

refringentes sin teñir sobre fondo rojo-fucsia.


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Técnica de tinción de Kato *2: Frotis fecal grueso en celofán

Visualización vídeo (1,5 min)

Este método (cualitativo) se basa en la acción que tiene la glicerina como aclarador de los

huevos de helmintos, y el verde de malaquita como colorante de contraste.

Depositar sobre un portaobjetos una pequeña cantidad de heces (equivalente a ungrano de arroz).

Cubrir la muestra con el cubreobjetos de celofán de grosor medio, recortado en el

tamaño aproximado de un portaobjetos y embebido en solución de verde demalaquita al 3 % en glicerol.

Invertir la preparación, presionar sobre una hoja de papel filtro contra la superficie dela mesa de trabajo, para lograr la extensión de la muestra hasta cubrir un área de 20 a25 mm de diámetro.

Dejar reposar la preparación con el cubreobjetos de papel celofán hacia arriba duranteuna hora a temperatura ambiente o 30 minutos a 34-40°C. Esto motivará el aclarado

de las heces, sin que se aclaren los huevos de helmintos. Debe evitarse exceder eltiempo porque esto dificultaría la observación de los huevos.

- Técnica coprológica de concentración:

CONCENTRADOR PARASITARIO EVERGREEN (Modificación del método de RITCHIE)Se emplean muestras frescas o fijadas en formol al 10%, MIF (Mertiolato-iodo-formaldehido), PVA (Alcohol polivinílico) o SAF (Formaldehido-acetato sódico). Si las hecesson líquidas, previamente deben centrifugarse a 2000 rpm durante 3-4 minutos, desechar elsobrenadante y utilizar el sedimento.

Material:

Tubo de 15 ml de fondo plano.

Tubo de 15 ml de fondo cónico.

Tapón de rosca.

Filtro acoplado con tapón doble. Bandeja perforada para acoplar tubos.

Varilla de algodón.

Pipetas pasteur.

Portas y cubreobjetos.

Centrífuga y balanza.

Microscopio óptico.

Reactivos:

Formol 10 %

Acetato de etilo (tóxico e inflamable). Tritón X-100 al 20 %


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Método:

1. Se agregan 9 ml de formol en el tubo de base plana y se añade una medida de heces (mássi son fijadas).

2. Se homogeniza la muestra con ayuda de la cucharilla y se deja reposar 30 min, si las hecesson frescas.

3. Se añaden 2-3 gotas de la solución de tritón para facilitar la homogenización y el paso dela mezcla por el filtro bidireccional.

4. Se agregan 3 ml de acetato de etilo.

5. Se acopla el filtro bidireccional al tubo cónico, disponiendo el tubo de ventilación a 1,5-2cm, para igualar presiones.

6. Se enrosca el otro lado del filtro al tubo que contiene la mezcla, asegurándose de queambos lados estén bien cerrados.

7. Se agita vigorosamente el conjunto en posición vertical y con el tubo de fondo cónicohacia arriba, durante 30-60 segundos. Después se invierte el conjunto de manera que eltubo cónico quede abajo esperando hasta que toda la muestra atraviese el filtro, ayudandocon ligera agitación.

8. Se desenrosca primero el tubo de fondo plano, después el filtro, y el tubo que contieneahora toda la mezcla se enrasa con formol, se tapa con el tapón de rosca y se centrifuga a2000-2500 rpm durante 3-5 min.

9. Se despega la capa intermedia de desechos sólidos con el mango de la varilla y se eliminael sobrenadante invirtiendo el tubo. Después se limpian los restos de las paredes con elalgodón de la varilla.

10. Se resuspende el sedimento con unas gotas de formol, SSF, MIF o SAF y se homogeniza.

11. Se pone una gota con la pipeta pasteur entre porta y cubreobjetos y se observa al

microscopio inmediatamente después.

NOTA: Para Cryptosporidium parvum o Isospora belli el sedimento obtenido se puede emplear:

- En tinciones ácido-resistentes de ooquistes, realizando un frotis en capa fina con varias gotas del sedimento

- Para realizar el método de flotación en azúcar de Sheather, sobre el mismo tubo se añade 1 ml de solución

azucarada, se agita, se deja reposar 3 minuto, se toma una gota de la capa superficial y se examina en busca

de ooquistes.

- Identificación de formas parasitarias al microscopio


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Visualización de artefactos y restos alimenticios

Fibras musculares: Se presentan en forma de cilindros con estrías longitudinales ytransversales.

Grasas neutras: Aparecen como esferas refringentes de diferentes tamaños. Ácidos grasos: Se observan como agujas incoloras.

Almidones: Tienen formas irregulares y son refráctiles al agregar el lugol. Fibras vegetales: Se caracterizan por ser de doble pared, contienen clorofila y poseen

un canal central muy marcado. pelos vegetales, polen etc. Productos de irritación de la mucosa: Moco, e observa

en cualquier patología. Glóbulos Rojos: Su hallazgo indica lesión en la parte baja

del aparato digestivo. Células epiteliales: Indican una excesiva irritabilidad. Bacterias: Carecen de significación clínica. Leucocitos: Si hay gran cantidad indica irritación

bacteriana. Cristales de origen alimentario como oxalato de calcio,

medicamentos. Los cristales de Charcot-Leyden se venen forma de rombos alargados.

Fecal Microscopy. Artifacts Mimicking Ova and Parasites

http://labmed.ascpjournals.org/content/32/2/80.full.pdf

Visualización de formas parasitarias en microscopio virtual

http://www.parasite-diagnosis.ch/virtualmicroscope;jsessionid=6ECA4AE8AA0AAEB4E629FF0755EFD61E

Observación de formas parasitarias en microscopio óptico

Examinar al microscopio para detectar la presencia de quistes y huevos. Utilizar el objetivo

seco de 10x barriendo toda la preparación para la detección de huevos y larvas, y el objetivode 40x para la identificación de quistes.

Helmintos: Ascaris, Trichuris, Hymenolepis, Fasciola, Uncinarias , Schistosoma ...Protozoos: Entamoeba coli, E. histolytica, Giardia, Cryptosporidium, Isospora ...

http://www.monografias.com/trabajos11/apadi/apadi.shtmlhttp://labmed.ascpjournals.org/content/32/2/80.full.pdfhttp://labmed.ascpjournals.org/content/32/2/80.full.pdfhttp://www.parasite-diagnosis.ch/virtualmicroscope;jsessionid=6ECA4AE8AA0AAEB4E629FF0755EFD61Ehttp://www.parasite-diagnosis.ch/virtualmicroscope;jsessionid=6ECA4AE8AA0AAEB4E629FF0755EFD61Ehttp://www.parasite-diagnosis.ch/virtualmicroscope;jsessionid=6ECA4AE8AA0AAEB4E629FF0755EFD61Ehttp://www.parasite-diagnosis.ch/virtualmicroscope;jsessionid=6ECA4AE8AA0AAEB4E629FF0755EFD61Ehttp://www.parasite-diagnosis.ch/virtualmicroscope;jsessionid=6ECA4AE8AA0AAEB4E629FF0755EFD61Ehttp://www.parasite-diagnosis.ch/virtualmicroscope;jsessionid=6ECA4AE8AA0AAEB4E629FF0755EFD61Ehttp://www.parasite-diagnosis.ch/virtualmicroscope;jsessionid=6ECA4AE8AA0AAEB4E629FF0755EFD61Ehttp://labmed.ascpjournals.org/content/32/2/80.full.pdfhttp://www.monografias.com/trabajos11/apadi/apadi.shtml


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Práctica 2

Determinación del tamaño de formas microscópicas

- Calibrado del Microscopio

•

Se instala el micrómetro ocular que presenta unaescala dividida, en sustitución de un ocular.

• Se coloca sobre la platina del microscopio unportaobjetos gravado con una escala en la que cadadivisión mide 0,01mm (10 m), y se enfoca la escalacon el objetivo 10X.

• Se alinea el extremo izquierdo de la escala ocular conel izquierdo de la escala de platina.

• Se busca el lugar más lejano hacia la derecha endonde vuelva a coincidir una línea del micrómetro

ocular con una del micrómetro de la platina.• El número de micras indicado por cada división de la

escala ocular se calcula mediante la siguientefórmula:

• Repetir para cada objetivo y elaborar una tabla.

Cuantificación de formas parasitarias para determinar la intensidadde parasitación

http://www.thiswormyworld.org/training/operational-procedures-for-schistosomiasis-and-sth-diagnostics (Diagnóstico de schistosomosis y geohelmintosis)

- Técnica cuantitativa de Mc MasterEsta técnica, para el recuento de los huevos de helmintos,emplea la cámara de Mc Master, y un líquido de flotación(solución sobresaturada de elevada densidad 1.18 a 1.20)en el que se homogenizan las heces. El volumen bajo elárea grabada de cada cámara es de 0,15 ml (el área degrabado es de 1 cm x 1 cm y la cámara es de 0,15 cm deprofundidad) por lo que el volumen total examinado es de0,3 ml. Para estimar el número de huevos por gramo deheces, se cuentan el número de huevos observados dentro

ó sobre las líneas de demarcación y se tiene en cuenta elnúmero de ml totales y los gramos de heces utilizados.También se aplica a la cuantificación de larvas de nematodos como T. spiralis.

ocular micrómetroespaciomicras

ocular micrómetrodel espaciosde N

micras platinalademicrómetrodel espaciosde N

º

10º

http://www.thiswormyworld.org/training/operational-procedures-for-schistosomiasis-and-sth-diagnosticshttp://www.thiswormyworld.org/training/operational-procedures-for-schistosomiasis-and-sth-diagnosticshttp://www.thiswormyworld.org/training/operational-procedures-for-schistosomiasis-and-sth-diagnosticshttp://www.thiswormyworld.org/training/operational-procedures-for-schistosomiasis-and-sth-diagnosticshttp://www.thiswormyworld.org/training/operational-procedures-for-schistosomiasis-and-sth-diagnosticshttp://www.thiswormyworld.org/training/operational-procedures-for-schistosomiasis-and-sth-diagnosticshttp://www.thiswormyworld.org/training/operational-procedures-for-schistosomiasis-and-sth-diagnostics


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Hematología parasitaria

- Frotis sanguíneo

Frotis fino o Extensión fina

1. Se coloca una gota de sangre cerca de uno delos extremos de un portaobjetos.

2. Se extiende la sangre con el arista de otroporta con un ángulo de unos 40°.

3. Se deja secar completamente la muestra ydespués se tiñe.

Gota gruesa

1. Se colocan 3 gotas de sangre en el centro de un portaobjetos.

2. Se extiende la sangre con la arista de otro porta, haciendo un movimiento en Z o en N.

3. Se deja secar completamente la muestra y después se tiñe.

Visualización vídeo de elaboración de frotis (8 min) http://www.youtube.com/watch?v=hxO_Nlr0DFI

- Identificación de formas parasitarias al microscopio



http://www.cdc.gov/dpdx/resources/pdf/benchAids/malaria/Pfalciparum_benchaidV2.pdf

Visualización de formas parasitaria en microscopio óptico

Helmintos: Filarias (Wuchereria bancrofti, Brugia malayi , Loa loa y Mansonella spp.)Protozoos: Plasmodium spp. y Trypanosoma spp.

Identificación microscópica de formas parasitarias tisulares- Identificación de formas parasitarias al microscopio



http://www.cdc.gov/dpdx/resources/pdf/benchAids/Oncho_Mansonella_benchaid_who.pdf

Visualización de formas parasitaria en microscopio óptico

Helmintos: Trichinella, Schistosoma spp., Taenia solium, Onchocerca volvulus Protozoos: Leishmania sp. y Trypanosoma cruzi

http://www.youtube.com/watch?v=hxO_Nlr0DFIhttp://www.youtube.com/watch?v=hxO_Nlr0DFIhttp://www.parasite-diagnosis.ch/virtualmicroscope;jsessionid=6ECA4AE8AA0AAEB4E629FF0755EFD61Ehttp://www.parasite-diagnosis.ch/virtualmicroscope;jsessionid=6ECA4AE8AA0AAEB4E629FF0755EFD61Ehttp://www.parasite-diagnosis.ch/virtualmicroscope;jsessionid=6ECA4AE8AA0AAEB4E629FF0755EFD61Ehttp://www.parasite-diagnosis.ch/virtualmicroscope;jsessionid=6ECA4AE8AA0AAEB4E629FF0755EFD61Ehttp://www.parasite-diagnosis.ch/virtualmicroscope;jsessionid=6ECA4AE8AA0AAEB4E629FF0755EFD61Ehttp://www.cdc.gov/dpdx/resources/pdf/benchAids/malaria/Pfalciparum_benchaidV2.pdfhttp://www.cdc.gov/dpdx/resources/pdf/benchAids/malaria/Pfalciparum_benchaidV2.pdfhttp://www.cdc.gov/dpdx/resources/pdf/benchAids/malaria/Pfalciparum_benchaidV2.pdfhttp://www.cdc.gov/dpdx/resources/pdf/benchAids/malaria/Pfalciparum_benchaidV2.pdfhttp://www.cdc.gov/dpdx/resources/pdf/benchAids/malaria/Pfalciparum_benchaidV2.pdfhttp://www.parasite-diagnosis.ch/virtualmicroscope;jsessionid=6ECA4AE8AA0AAEB4E629FF0755EFD61Ehttp://www.parasite-diagnosis.ch/virtualmicroscope;jsessionid=6ECA4AE8AA0AAEB4E629FF0755EFD61Ehttp://www.parasite-diagnosis.ch/virtualmicroscope;jsessionid=6ECA4AE8AA0AAEB4E629FF0755EFD61Ehttp://www.parasite-diagnosis.ch/virtualmicroscope;jsessionid=6ECA4AE8AA0AAEB4E629FF0755EFD61Ehttp://www.parasite-diagnosis.ch/virtualmicroscope;jsessionid=6ECA4AE8AA0AAEB4E629FF0755EFD61Ehttp://www.cdc.gov/dpdx/resources/pdf/benchAids/Oncho_Mansonella_benchaid_who.pdf%0chttp://www.cdc.gov/dpdx/resources/pdf/benchAids/Oncho_Mansonella_benchaid_who.pdf%0chttp://www.cdc.gov/dpdx/resources/pdf/benchAids/Oncho_Mansonella_benchaid_who.pdf%0chttp://www.cdc.gov/dpdx/resources/pdf/benchAids/Oncho_Mansonella_benchaid_who.pdf%0chttp://www.cdc.gov/dpdx/resources/pdf/benchAids/Oncho_Mansonella_benchaid_who.pdf%0chttp://www.cdc.gov/dpdx/resources/pdf/benchAids/Oncho_Mansonella_benchaid_who.pdf%0chttp://www.parasite-diagnosis.ch/virtualmicroscope;jsessionid=6ECA4AE8AA0AAEB4E629FF0755EFD61Ehttp://www.parasite-diagnosis.ch/virtualmicroscope;jsessionid=6ECA4AE8AA0AAEB4E629FF0755EFD61Ehttp://www.cdc.gov/dpdx/resources/pdf/benchAids/malaria/Pfalciparum_benchaidV2.pdfhttp://www.cdc.gov/dpdx/resources/pdf/benchAids/malaria/Pfalciparum_benchaidV2.pdfhttp://www.parasite-diagnosis.ch/virtualmicroscope;jsessionid=6ECA4AE8AA0AAEB4E629FF0755EFD61Ehttp://www.parasite-diagnosis.ch/virtualmicroscope;jsessionid=6ECA4AE8AA0AAEB4E629FF0755EFD61Ehttp://www.youtube.com/watch?v=hxO_Nlr0DFI


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Práctica 3

Métodos especiales

- Método de Graham Apropiado para el diagnóstico de la Enterobiosis determinando la

existencia de huevos del nematodo en los márgenes anales.

Visualización vídeo (2 min)

- Método de BaermanApropiado para el diagnóstico de Strongyloides (basándose en la termofilia, geofilia ehidrofilia de sus larvas).

Se toman 5 a 10 g de heces La muestra se deposita sobre una capa de gasa, la cual a su vez, será

dispuesta en un colador corriente colocado en un embudo a cuya

extremidad se le conecta un tubo de goma, sellado en su extremolibre por una pinza de Mohr.

Se llena el embudo con solución salina a 37ºC de manera de que éstaentre en contacto con la materia fecal.

Se mantiene el conjunto durante 12-24 h. Para muestras conmuchas larvas bastarán 30-60 min.

El calor estimula la motilidad de las larvas, las cuales van a salir delseno de las heces por su propiedad higrotrópica para concentrarse enel extremo inferior del tubo de goma.

Se toma una gota del fondo del tubo para su observación al

microscopio con aumento de 10X. En caso de que sean escasas las larvas podemos realizar la

centrifugación del líquido recogido en tubo.

Se aplica también para el aislamiento de larvas de Trichinella, cuantificando dichas larvas con la cámara de Mc Master.

Determinación de formas parasitarias en muestras ambientales

- Método de Flotación en muestras de tierra.

Materiales y reactivos

Bolsas de muestreo

Espátula para recogida de muestras

Cedazo con malla de 4 mm

Tubos de centrífuga

Mortero

Solución saturada de sulfato de Mg (331 g en un litro de agua destilada)

Solución de tween-20 al 0.05%


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Método

1. Hacer pasar la muestra de tierra a través del cedazo para eliminar las piedras yfragmentos sólidos de tamaño grande.

2. Tomar 10-20 g de muestra, depositarla en el mortero y añadir 100 ml de la solución detween-20. Homogenizar durante 5 minutos.

3. Distribuir la suspensión en dos tubos de centrífuga de 50 ml de capacidad.4. Centrifugar a 2.500 r.p.m. durante 5-10 minutos.

5. Eliminar el sobrenadante. Repetir el proceso si la muestra contenía muchos elementosque flotaran en el líquido.

6. Resuspender el precipitado en solución saturada de sulfato de magnesio, agitar ycentrifugar 5-10 minutos a 2.500 r.p.m.

7. Rellenar cada tubo hasta el borde con solución saturada y dejar reposar durante 5minutos.

8. Mediante una pipeta pasteur invertida depositar la porción superior del líquido sobre unportaobjetos y colocar cubreobjetos

9. Observar al microscopio con el objetivo de 10X. Los huevos no operculados de helmintos y otras formas parasitarias o de vida libre podrán ser identificados en función de sutamaño y morfología típicos.

- Método de detección de Cryptosporidium y Giardia en agua.

Los métodos de detección de protozoos intestinales en ambientes acuáticos,desarrollados en diversos países son constantemente evaluados para optimizarlos y mejorar susensibilidad y especificidad.

El método estándar para el estudio de Cryptosporidium y Giardia en aguas presenta 3procedimientos básicos: concentración, purificación y detección.

Concentración y purificación: filtración de 10-1000L , lavado del filtro con solucionesdetergentes, centrifugación a 1100-1500 g y separación selectiva con partículas magnéticasconjugadas con anticuerpos específicos.

Detección: mediante microscopía de fluorescencia utilizando anticuerpos específicosmarcados con isotiocianato de fluoresceína, realizando la confirmación mediante microscopíaóptica.

Centro mundial de referencia en la determinación de Cryptosporidium y Giardia enaguas: EPA - (United States Environmental Protection Agency)

http://www.epa.gov/dwlabcert/training-drinking-water-laboratory-certification

Visualización vídeo ( 10 min) Método ENVIROCHEK CAPSULES

Overview of US EPA Cryptosporidium and Giardia Detection Methods

http://www.epa.gov/dwlabcert/training-drinking-water-laboratory-certificationhttp://www.epa.gov/dwlabcert/training-drinking-water-laboratory-certificationhttp://youtu.be/akXNxM94qkUhttp://youtu.be/akXNxM94qkUhttp://youtu.be/akXNxM94qkUhttp://youtu.be/akXNxM94qkUhttp://youtu.be/akXNxM94qkUhttp://youtu.be/akXNxM94qkUhttp://www.epa.gov/dwlabcert/training-drinking-water-laboratory-certification


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Identificación Microscópica (ZIP) (14 MB).

- Este módulo de autoaprendizaje ayuda a identificar y caracterizar Cryptosporidium y Giardiautilizando el Método 1623 y permite la caracterización de los organismos, empleando unmicroscopio de fluorescencia a través de FITC, DAPI, y DIC.

FITC (Isotiocianato de fluoresceína)

-Fluorocromo utilizado para marcar los anticuerpos monoclonales utilizadosfrente a los antígenos presentes en la pared celular de ambos protozoos.- Color verde brillante- En ambos casos tiñe la superficie. Observación 200X.

DAPI (4,6-diamino-2-fenilindona)- Colorante que tiñe los núcleos. Se emplea como indicador de viabilidad

(colorante vital). Observación 400X.

DIC Microscopía de Contraste Diferencial interferencial- Similar a una visión 3D empleando luz polarizada que permite visualizar las

estructuras internas presentes. Observación 1000X.

- Ejemplo de aplicación de estos métodos: Recuento y determinación de viabilidad de Giardia spp. y aguas

potables y residuales en la cuenca alta del río Bogotá. Biomédica vol.25 no.3 Bogotá Sept. 2005.

http://www.scielo.org.co/scielo.php?pid=S0120-41572005000300011&script=sci_arttext

Métodos de observación microscópica de

Ooquistes de Cryptosporidium y quistes de

Giardia. Ambos resistentes a la cloración

http://www.epa.gov/sites/production/files/2015-09/microscopic_identification-2.ziphttp://www.epa.gov/sites/production/files/2015-09/microscopic_identification-2.ziphttp://www.epa.gov/sites/production/files/2015-09/microscopic_identification-2.ziphttp://www.scielo.org.co/scielo.php?pid=S0120-41572005000300011&script=sci_arttexthttp://www.scielo.org.co/scielo.php?pid=S0120-41572005000300011&script=sci_arttexthttp://www.scielo.org.co/scielo.php?pid=S0120-41572005000300011&script=sci_arttexthttp://www.epa.gov/sites/production/files/2015-09/microscopic_identification-2.zip


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Anexo A (*)

1) Solución madre de lugol

Yodo metálico.................................................. 1,00 g

Yoduro de potasio................ ................... ........ 2,00 g

Agua destilada...... ....................... .................... 100,00 ml

Triturar juntos el yodo y yoduro en un mortero, añadir agua poco a poco y mover lentamente hasta su disolución, añadir el restode agua y conservar en un frasco ámbar.

2) Verde de malaquita con solución glicerinada (método Kato)

Glicerina comercial......................................... 100,00 ml

Agua destilada...... ........................ .................. 100,00 ml

Verde de Malaquita 0,3%.......................... ..... 1,00 ml (1 g + alcohol de 95% 100 ml)

TÉCNICA DE KATO-KATZ CUANTITATIVO

Permite el recuento de huevos de helmintos en muestras de heces tras el aclarado de las heces mediante glicerina, loque facilita el recuento de los huevos presentes en la misma.

Material y reactivos

1. Tiras de celofán hidrófilo impregnados en glicerina: Preparar una solución de glicerina-verde malaquita (a 1 ml de

solución acuosa de verde malaquita preparada al 3%, se le añaden 100 ml de glicerina y 100 ml de agua destilada.

Mezclar bien). Verter la mezcla sobre las tiras de celofán en un tarro, dejando luego que repose la mezcla por lo menos

durante 24 h antes de utilizarla.

2. Pinzas

3. Portaobjetos

4. Papel higiénico o absorbente

5. Espátula de plástico

6. Patrón/plantilla calibrado de cartón o plástico (para

recuento cuantitativo)

7. Rejillas metálicas o de plástico

Procedimiento

1. Colocar el patrón calibrado centrado sobre el portaobjetos.

2. Mediante una espátula rellenar el hueco con la muestra de heces.

3. Colocar una rejilla encima del patrón que contiene las heces y raspar el exceso de heces con la espátula.

4. Desechar el patrón y la rejilla manteniendo las heces sobre el portaobjetos.

5. Cubrir el material fecal con una tira de celofán impregnada en glicerina (usando las pinzas).

6. Invertir el portaobjetos y comprimir bien la muestra sobre una superficie lisa. El material fecal debe quedar bien

extendido entre el portaobjetos y la tira de celofán.

7. Levantar con cuidado el portaobjetos (para evitar que se retire el celofán) y colocar el portaobjetos con el celofán

hacia arriba. Dejar transcurrir varias horas para aclara el material fecal antes de examinarlo al microscopio. Para

acelerar el aclaramiento y el examen puede dejarse la muestra en una estufa (37ºC – 40ºC) durante unos minutos.

NOTA: una vez aclarado los caracteres de imprenta de un periódico deben ser visibles a través del frotis.

8. Examinar sistemáticamente el frotis con el objetivo 10 X. Los huevos de Ascaris y Trichuris se aclaran más

lentamente y son fácilmente visibles en las preparaciones de este tipo. Los huevos de uncinarias se aclaran

rápidamente y dejan de ser visibles al cabo de 30-60 min. Los huevos de Schistosoma o Fasciola también se

aclaran, pero pueden ser reconocibles durante bastante tiempo en estas preparaciones (aparecen sin teñir y no se

aprecian las estructuras interiores del huevo).

9. El número de huevos encontrados se multiplica por un factor k, que depende del patrón/plantilla utilizado (k=20, si es

de 50 mg; k=50 si es de 20 mg; k=25 si es de 40 mg, etc.), obteniéndose el número de huevos por gramo de heces

(hpg).


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Procedimientos de diagnóstico en parasitología.http://www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/index.html

CLAVE PARA LA IDENTIFICACION DE ALGUNOS HUEVOS DE IMPORTANTES HELMINTOS HUMANOS DE POSIBLEHALLAZGO EN HECES

La observación al microscopio óptico de adultos y larvas de helmintos requiere una preparación previa y específica para cada

tipo de parásito. Los huevos de helmintos no requieren un tratamiento previo pudiendo ser observados directamente almicroscopio óptico en preparaciones (en fresco - húmedas). Pueden ser conservados mediante su fijación y mantenimiento en

formol (5-10%).

Características de los huevos : Tamaño, forma, cubierta, contenido y ocasionalmente color y estructuras externas. Eltamaño, que se refiere a la mayor longitud de éste, puede ser estimado en comparación con el de un glóbulo rojo, que mide de

7’5-8 micras (1 micra = 1/1000 mm) o exactamente determinado después de realizar el calibrado del microscopio mediante el

micrómetro ocular.

http://www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/index.htmlhttp://www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/index.htmlhttp://www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/index.html


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IDENTIFICACIÓN DE AMEBAS Y FLAGELADOS INTESTINALES

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