-
PCR
PCR : Polymerase Chain ReactionDitemukan oleh Kary Mullis
1984Memperbanyak potongan DNABahan :
DNA
Primer
Enzyme Taq Polimerese
4 macam deoxynucleoside triphosphate
Magnesium ion.
PCR terdiri atas beberapa proses:
Pemanasan DNA untuk mendenaturasi DNA ( memisahkan 2 rantai DNA
)
Dinginkan dan oliganucleotide primer menera panjang rantai
DNA.
Terjadi polimerisasi karena adanya primer dan deoxynucleoside
triphosphate serta enzyme.
Kemudian proses 1) diulang kembali ke tahap 2) dan tahap 3).
Proses tersebut diulang-ulang sampai 25-30 kali.
-
PCR
(Polymerase Chain Reaction)
Keunggulan:
Dapat menganalisis DNA yang sangat sedikit.
Spesifik, sederhana
Dapat menganalisis banyak sample dengan cepat.
Mampu mendeteksi kelainan.
-
Kelemahan:
Optimasi perlu waktu, jika tidak optimum menyebabkan terjadinya
kesalahan interprestasi.
Karena sangat sensitive menyebabkan problem kontaminasi sangat
tinggi kesalahan.
Kebersihan, atau tanpa adanya kontaminasi dituntut sangat tinggi
pada saat bekerja.
-
Agar berhasil dengan baik,Perlu
OPTIMASI
Konsentrasi:
EnzymesDNTPsMg. IonPrimer
Suhu dan Waktu:
AnnealingsDematurasiPemanjangan / Extension
-
Optimasi Amplifikasi DNA dengan PCR
Konsentrasi Enzyme
1 - 2,5 unit/ 100 l larutan reaksi Namun tergantung dari template
target dan primerSetiap sample perlu dioptimasiKalau optimasi
dianjurkan antara 0.5 5 unit/ 100 l[ Innis, et al 1990 ].0.5 unit/
15 l larutan reaksi 30 cyclis.[ Ruiz et, 1997 ]
- Deoksinukleotida Trifosfat
Stok DNTPs harus netral ( pH 7.0 )Disimpan dengan konsentrasi 10mM,
pada suhu -20o CKeempat macam DNTP harus samaKonsentrasi pada
larutan DNTPs.Spesifitas dan ketelitian naik dengan rendahnya
konsentrasi, sebab dengan konsentrasi yang rendah memperkecil
kemungkinan terjadinya salah penempelan primer. ( 20 M/ 100 larutan
Reaksi)Namun konsentrasi tersebut juga tergantung DNA yang
diamplifikasi.Konsentrasi DNA, diukur dengan spektrofotometri.
- Konsentrasi Mg2+ Optimasi konsentrasi ion Mg ini sangat
penting, sebab konsentrasi ion Mg akan mempengaruhi
penempelanprimer, suhu dissosiasi baik jalin DNA template maupun
produk PCR, spesifitas produk, pembentukan primer, dimmer,
aktifitas enzim dan ketelitian.Konsentrasi sebaiknya antara 0.5 2.5
mM.
- Konsentrasi Primer
Konsentrasi primer ini dianjurkan antara 0.1 0.5 M.Semakin tinggi
konsentrasi primer, menyebabkan terjadinya:salah temple
(misprinning))terjadi penumpukan produk yang tidak diinginkan,
dankemungkinan terjadinya primer-dimerini semua substrat PCR.Oleh
Ruiz, et al 1997 diberikan rumus untuk mengirakan konsentrasi
primer
0.067 / oD 260 =
= volume reaksi dalam l. = volume primer yang akan dipakai dalam
loD 260 = optical density 260 nm.
- Suhu Annealing
Suhu dan waktu yang diperlukan untuk primer Annealing tergantung
dari:
Komposisi basanya
Panjangnya
Konsentrasinya
Suhu annealing terbaik biasanya 5o C dibawah Tm nya.Biasanya suhu
antara 5o 72o C akan menghasilkan produk yang bagus.Suhu terlalu
tinggi menyebabkan penempelan primer tidak betul dan kesalahan
perpanjangan pada ujung 3 primer. Sehingga suhu annealing sangat
kritis lebih-lebih pada putaran-putaran permukaan.
- Pemanjangan Primer
(primer Extention)Waktu prmanjangan tergantung dari:Panjangnya DNA
yang diamplifikasiKonsentrasi DNA yang diamplifikasiSuhu Suhu
pemanjangan umumnya 72oCSuhu 72o C selama 1 menit cukup untuk
produk dengan panjang 2 Kb.
- Suhu dan Waktu DenaturasiPenyebab utama gagalnya reaksi PCR
adalah tidak sempurnanya proses Denaturasi.
Biasanya, 95o C selama 30 detik atau 97o C selama 15 detik.
Namun, lebih tinggi mungkin lebih baik, terutama DNA yang kaya
pasangan G-C (Innis, et al., 1990)
Jika dinaturasi tidak sempurna, mungkin DNA kembali berikatan
ataupun tidak mampu (menerima primer yang akan menempel, sehingga
sensitifitasnya turun produk turun.
Ini terjadi jika waktu denaturasi terlalu pendek.
Jika waktu terlalu lama enzyme Taq polimerase akan rusak.
Beberapa protocol menganjurkan denaturasi mula-mula 94o C selama 1
10 menit (Ruiz, et al., 1997)
Ines et al (1990) menyebutkan waktu paro Taq Polymerase DNA kadang
dari 2 jam 92.5 0C.40 menit suhu 950C5 menit suhu 97.50C
- Jumlah PutaranJumlah putaran tergantung dari hasil konsentrasi
DNA mula-mula, dengan catatan semua parameter sudah
dioptimasi.Amplifikasi lebih dari 40 putaran akan menghasilkan
produk PCR yang salah.Terlalu sedikit putaran akan mendapatkan
produk yang sedikit.
-
Rekomendasi putaran versus konsentrasi mula-mula:
Number of target molicules:
3 x 105
1.5x 104
1 x 103
50
Number of cycles:
25 to 30
30 to 35
35 to 40
40 to 45
-
PCR
PCR : Polymerese Chain ReactionDitemukan oleh Kary Mullis
1984Memperbanyak potongan DNABahan :
DNA
Primer
Enzyme Taq Polimerese
4 macam deoxynucleoside triphosphate
Magnesium ion.
PCR terdiri atas beberapa proses:
Pemanasan DNA untuk mendenaturasi DNA ( memisahkan 2 rantai DNA
)
Dinginkan dan oliganucleotide primer menera panjang rantai
DNA.
Terjadi polimerisasi karena adanya primer dan deoxynucleoside
triphosphate serta enzyme.
Kemudian proses 1) diulang kembali ke tahap 2) dan tahap 3).
Proses tersebut diulang-ulang sampai 25-30 kali.
-
SKEMA CARA KERJA PCR
