KARAKTERISASI FISOLOGIS DAN UJI KEMAMPUAN ISOLAT ...fkptpi.unsyiah.ac.id/images/PDF PROSIDING/PDF/pdf proteksi tanaman/425... · Isolasi difokuskan pada tiga kelompok rizobakteri

425

Prosiding Forum Komunikasi Perguruan Tinggi Pertanian Indonesia( FKPTPI) 2018 Universitas Syiah Kuala Banda Aceh

KARAKTERISASI FISOLOGIS DAN UJI KEMAMPUAN ISOLAT RIZOBAKTERI UNTUK MENGHAMBAT PERTUMBUHAN KOLONI PATOGEN TERBAWA BENIH

CABAI (Capsicum annuum L.)

CHARACTERIZATION PHYSIOLOGICAL OF RHIZOBACTERIA ISOLATED, AND ITS CAPABILITY TEST TO INHIBIT THE GROWTH OF COLONI OF

PEPPER SEEDBORN PHATOGENS (Capsicum annuum L.)

Syamsuddin1*, Hasanuddin1, Marlina2, Cut Chamzurni2

1Staf Pengajar Program Studi Agroteknologi, Fakultas Pertanian Universitas Syiah Kuala 2Staf pengajar Program Studi Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian Universitas Syiah Kuala

*Email: [email protected]

ABSTRAK

Penggunaan agens pengendalian hayati sebagai alternatif penggunaan pestisida kimia semakin banyak dikembangkan sejalan dengan meningkatnya kesadaran terhadap dampak dari pestisida kimia tersebut. Rizobakteri yang berasal dari rizosfer tanaman yang secara biologis telah menyatu dengan ekosistemnya, mempunyai kemampuan secara spesifik untuk menekan berbagai penyakit tanaman. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi rizobakteri yang berasal dari daerah rizosfer tanaman cabai sehat diantara tanaman cabai yang terinfeksi patogen P.capsici. Isolasi difokuskan pada tiga kelompok rizobakteri yaitu kelompok Bacillus spp., Pseudomonas spp., dan Serratia spp. Penelitian juga bertujuan untuk mengevaluasi daya hambat rizobakteri yang diperoleh terhadap pertumbuhan koloni P. capsici. Di samping itu penelitian ini juga akan mengevaluasi kemampuan isolat rizobakteri untuk mensekresikan enzim ekstraseluler (kitinase, protease, dan selulase), memproduksi senyawa siderofor dan senyawa volatil hidrogen sianida (HCN). Hasil penelitian menunjukkan dari 18 isolat rizobakteri, 7 isolat, sangat potensial untuk berperan sebagai agen biokontrol. Isolat rizobakteri RB1NA1, RB3SPA1, RBNA4, RBKB1, RBSPA19, RBSPA12, dan RBSPA14, sangat potensial sebagai agen biokontrol terhadap patogen terbawa benih cabai. Isolat Rizobakteri secara efektif menghambat pertumbuhan koloni patogen P. capsici. Enzim kitinase dihasilkan oleh rizobakteri isolat RB2NA1, RBSPA2, RB2SPA1, RBNA4, RBKB1, RBSPA19, RBSPA14, dan isolate RBNA3. Secara umum semua isolate rizobakteri memproduksi enzim dan senyawa HCN. Hasil studi dari 18 isolat rizobakteri, 4 isolat, memproduksi senyawa siderofor yaitu isolat RB2NA1, RBNA13, RBNA8, dan isolate RBKBI. Sementara 14 isolat rizobakteri tidak memproduksi senyawa siderofor. Kata kunci: agen antagonis sellulose kitinase protease siderofor,

ABSTRACT

The use of biological control agents as an alternative to the use of chemical pesticides has been much developed in line with the increasing awareness of the negative impact of the chemical pesticides. Rhizobacteria, derived from plant rhizospher which has biologically been united with its ecosystem, has the ability specifically to suppress various plant diseases. The objectives of this research was to isolate rhizobacteria from the area of the red pepper plant rhizospher and to characterization the isolate effectiveness to inhibit the growth of colony of fungal pathogen Phytophthora capsici. This study also sought to evaluate the ability of the rhizobacteria isolate in secreting an extracellular enzyme and to produce the compound of siderofor and hydrogen cyanide (HCN). The result of study was form of 18 rhizobacteria isolates, 7 isolates, were very potential to act as biocontrol agents. The isolates RB1NA1, RB3SPA1, RBNA4, RBKB1, RBSPA19, RBSPA12, dan RBSPA14, were very potential to act as biocontrol agents. Rhizobacteria isolates was more effective to inhibit colony of pathogen fungi P. capsici. Kitinase was secreted by rhizobacteria RB2NA1, RBSPA2, RB2SPA1, RBNA4, RBKB1, RBSPA19, RBSPA14, and RBNA3 isolates. Almost all rizobacteria isolates produced cellulose enzymes and HCN. The result of study was in form of 18 rhizobacteria isolates, 4 isolates, produced siderofor compound by rhizobacteria RB2NA1, RBNA13, RBNA8, dan RBKBI isolates while not even 14 rhizobacteria isolate produced siderofor.

Keywords: antagonic agents, cellulose, HCN, kitinase, protease, siderofor,

426


1. PENDAHULUAN

Salah satu usaha untuk mengeliminasi patogen dan kejadian penyakit pada tanaman dapat dilakukan dengan penggunaan agens pengendali hayati yang berasal dari rizosfer tanaman. Penggunaan agens pengendalia hayati sebagai alternatif penggunaan pestisida kimia semakin banyak dikembangkan sejalan dengan meningkatnya kesadaran terhadap dampak dari pestisida kimia tersebut. Rizobakteri yang berasal dari rizosfer tanaman yang secara biologis telah menyatu dengan ekosistemnya, mempunyai kemampuan secara spesifik untuk menekan berbagai penyakit tanaman (Yamaguchi 1996).

Rizobakteri, merupakan bakteri saprofit yang hidup pada rizosfer dan mengkolonisasi sistim perakaran tanaman, telah dipelajari sebagai pemacu pertumbuhan tanaman untuk meningkatkan produksi pertanian dan sebagai agens biokontrol untuk mengendalikan penyakit (Silva et al. 2003). Strain rizobakteri pemacu pertumbuhan tertentu telah digunakan sebagai inoculant biofertilizer (Kennedy et al. 2004). Beberapa jenis rizobakteri yang kini banyak dikembangkan sebagai agens antagonis diantaranya spesies Pseudomonas, Bacillus, Serratia, Streptomyces, Enterobacter, Azospirillum, Agrobacterium, Phyllobacterium, Enterobacter, Alkaligenes, Burkholderia, Beijerinkia, Klebsiella, Xanthomonas dan Arthrobacter (Kim 1997; De Silva 2000; Bullied 2002; Lugtenberg 2002). Selain sebagai agens biokontrol, beberapa jenis rizobakteri juga berperan sebagai agens pemacu pertumbuhan tanaman (plant growth promoting rhizobacteria).

Peran rizobakteri sebagai agens antagonis dalam menghambat patogen secara in vitro berhubungan dengan kemampuannya dalam mensintesis metabolit sekunder seperti senyawa antibiotik, siderofor, hidrogen sianida (HCN) dan sintesis berbagai enzim degradasi dinding sel patogen seperti kitinase, 1,3-glukanase, 1,4-glukanase, selulase, lipase, dan protease, serta produksi l-aminociklopropane -l-

carbocylate (ACC) deaminase (Baharum et al. 2003; Gohel et al. 2004; Diby 2004; Sutariati 2006; Kumar et al. 2007).

Strain Pseudomonas secara in vitro menunjukkan aktifitas antagonistik terhadap patogen R. solani, Piricularia oryzae, Xanthomonas oryzae, dan Fusarium (Vidhyasekaran et al. 2001; Nandakumar 2001), P. flurescen menghambat pertumbuhan koloni P. capsici isolat tanaman lada (Diby 2005), isolat Bacillus spp., Psedudomonas spp., dan Serratia spp. secara in vitro efektif menghambat pertumbuhan koloni patogen C.capsici, F.oxysporum, A. niger, R.solani, dan S. rolfsii (Sutariati 2006). Sedangkan strain Serratia plymuthica C48, menghambat pertumbuhan patogen Botrytis cenera (Frankowski et al. 2001).

Busuk phytophthora termasuk salah satu penyakit yang mengakibatkan kehilangan hasil cabai di seluruh dunia. Sementara pengendalian penyakit ini masih sulit dikendalikan karena belum tersedianya varietas yang resisten, dan patogen dapat terbawa benih dan tular tanah, serta metoda pengendaliannya masih terbatas. Benih telah dilaporkan merupakan salah satu sumber inokulum patogen Phytophthora pada tanaman cabai (Erwin & Ribeiro 1996; Roberts et al. 2000; Louws et al. 2002).

Sejauh ini pengendalian penyakit busuk phytophthora pada cabai dilakukan secara kimiawi dengan menggunakan fungisida metalaxyl, mefenoxam atau berbagai fungisida lainnya. Pengendalian secara biologis dengan memanfatkan rizobakteri yang diisolasi dari rizosfer tanaman masih belum banyak dilaporkan. Walaupun banyak hasil penelitian telah dilaporkan bahwa penggunaan agens biokontrol secara efektif mengendalikan berbagai penyakit pada beberapa komoditas tanaman. Tetapi pada tanaman cabai, khususnya untuk pengendalian patogen P. capsici yang menginfeksi tanaman cabai masih belum banyak informasinya. Oleh karena itu perlu diisolasi dan karakterisasi kemampuannya untuk mengetahui daya hambat

427

Prosiding Forum Komunikasi Perguruan Tinggi Pertanian Indonesia (FKPTPI)2018 Universitas Syiah Kuala Banda Aceh

pertumbuhan koloni berbagai patogen tanaman cabai. Evaluasi daya hambat rizobakteri secara in vitro merupakan langkah awal untuk mengetahui efektivitasnya sebagai agens biokontrol.

Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi rizobakteri yang berasal dari daerah rizosfer tanaman cabai sehat diantara tanaman cabai yang terinfeksi patogen P.capsici. Isolasi difokuskan pada tiga kelompok rizobakteri yaitu kelompok Bacillus spp., Pseudomonas spp., dan Serratia spp. Penelitian juga bertujuan untuk mengevaluasi daya hambat rizobakteri yang diperoleh terhadap pertumbuhan koloni P. capsici. Di samping itu penelitian ini juga akan mengevaluasi kemampuan isolat rizobakteri untuk mensekresikan enzim ekstraseluler (kitinase, protease, dan selulase), memproduksi senyawa siderofor dan senyawa volatil hidrogen sianida (HCN).

2. MATERIAL DAN METODE

Isolat patogen Phytophthra capsici yang digunakan merupakan isolat hasil isolasi pada penelitian Stranas tahun 2011. Dari lima isolat yang diperoleh, isolat P. capsici PCSTL2 merupakan isolat yang digunakan dalam percobaan ini. Hal ini didasarkan pada hasil karakterisasi secara molekuler dan uji patogenitas pada empat genotipe tanaman cabai, bahwa isolat P. capsici PCSTL2 secara genetik merupakan isolat P. capsici dan bersifat patogenik pada tanaman cabai. Sedangkan isolat rizobakteri yang digunakan merupakan isolat hasil isolasi yang dilakukan pada penelitian Stranas tahun pertama. Isolat yang digunakan sebanyak 18 isolat yang merupakan isolat yang potensial berdasarkan hasil daya hambat terhadap pertumbuhan koloni patogen terbawa benih cabai.

Karakterisasi Fisiologis Isolat Rizobakteri

Kemampuan mensekresikan enzim ekstraseluler (kitinase, protease dan selulase) merupakan salah satu penentu kemampuan isolat rizobakteri sebagai agens antagonis.

Dalam percobaan ini, 18 isolat rizobakteri dievaluasi kemampuan mensekresikan enzim ekstraseluler secara kualitatif. Dalam percobaan yang dilakukan, kultur ditumbuhkan dalam medium SPA. Aktifitas Kitinase

Medium koloidal kitin dibuat dengan melarutkan 15 g bahan kitin dengan aseton, kemudian dimasukkan dalam 120 ml HCl dingin lalu distirer selama 45 menit di dalam ice bath. Selanjutnya supernatan disaring dengan kain tipis dan koloidal kitin dipresipitasi. Suspensi yang mengandung koloidal kitin disentrifugasi pada 4000 rpm. Supernatan dibuang, sedangkan pelet koloidal kitin digunakan untuk medium kitin. Untuk pengamatan aktivitas kitinase rizobakteri bakteri agens, dibuat medium agar kitin yang mengandung 0.2 % koloidal kitin (pH 6.2). Medium dituang ke dalam petri (Ǿ 9 cm), lalu dibuat dua lubang dengan cork borer dan diisi 0.2 ml suspensi bakteri agens biokontrol dengan kerapatan 109 cfu atau setara OD= 0.164 (Bcillus spp.), OD=0.072 (Serratia spp.), dan OD=0.192 (Pseudomonas spp.). Selanjutnya medium diinkubasi pada suhu 24 °C selama 4 hari. Aktivitas kitinase ditunjukkan oleh adanya halo disekitar lubang yang berisi suspensi bakteri (Chernin et al. 1995).

Aktivitas Selulase

Penentuan aktivitas selulolitik oleh bakteri agens biokontrol dilakukan menurut prosedur Coronel dan Jonson (1986). Untuk menentukan aktivitas selulolitik, digunakan carboxy methylcellulose (CMC) sebagai substrat. Bahan A terdiri atas 0.25 g NaCl, 1.5 g K2HPO4, 2.5 g CMC, 400 ml air. Secara perlahan-lahan CMC dimasukkan ke dalam air. Larutan digoyang dengan shaker pada suhu 50 °C dan 100 rpm selama 24 jam. Bahan B: larutan MgSO4 1.0 M. Bahan C terdiri atas 3.0 g Na2HPO4, 0.5 g NH4C1, 2.5 g gliserol, 0.5 g yeast extract, 6.5 g agar dan 100 ml air. Bahan D: CaCl2 7.5% (w/v).

Semua bahan diautoklaf secara terpisah pada 120 °C selama 20 menit. Bahan A dan C dicampur dan 1.0 ml bahan

428


B dan 1.0 ml bahan D dimasukkan ke dalam bahan A+C lalu dicampur hingga homogen. Selanjutnya medium dituang ke dalam petri lalu dibuat empat lubang dengan cork borer dan diisi dengan 0.2 ml suspensi bakteri agens biokontrol. Petri diinkubasi pada suhu 28 °C selama tiga hari. Untuk menentukan aktivitas selulolitik, 10 ml larutan congo-red 0.1% ditambahkan ke dalam medium, diinkubasi selama 10 menit dan dibersihkan dengan 1.0 M NaCl selama 15 menit. Bakteri yang memiliki aktivitas selulolitik akan menunjukkan halo disekitar lubang yang berisi suspensi bakteri. Aktivitas Protease

Untuk menentukan aktivitas proteolitik digunakan gelatin sebagai substrat. 5 g agar dimasukkan ke dalam 400 ml air steril lalu dipanaskan pada suhu 50 °C selama 4 jam. Larutan gelatin dibuat dengan menambahkan 4 g gelatin yang telah dilarutkan dalam 50 ml air steril ke dalam medium agar. Medium diautoklaf pada 120 °C selama 20 menit. Setelah agak dingin, medium dituang ke dalam petridis dan dibuat empat lubang dengan cork borer. Lubang diisi 0.2 ml suspensi bakteri, selanjutnya dilakukan inkubasi pada suhu 28 °C selama 3 hari. Untuk menentukan aktivitas proteolitik, 5 ml larutan ammonium sulfat jenuh dimasukkan ke dalam medium. Aktivitas proteolitik akan menunjukkan perubahan zone yang lebih terang mengelilingi lubang yang berisi suspensi bakteri. Analisis Produksi Senyawa Siderofo

Bakteri agens biokontrol yang akan digunakan ditumbuhkan pada medium cair dengan kadar besi (FeCB) rendah. Komposisi medium yang digunakan terdiri atas 20 g sukrosa, 2 g L-asparagin, 1 g K2HPO4, 0.5 g MgSO4.7H2O dalam 1 liter air destilata dengan pH 7.0. Suspensi bakteri ini diinkubasikan pada suhu 27 0C selama 24 jam. Selanjutnya suspensi disentrifugasi dengan kecepatan 11000 rpm selama 30 menit. Supernatan disaring dengan membran nitroselulosa berporositas 0.2 µm. Untuk analisis, 3 ml supernatan

ditambah dengan 1 ml FeCb 0.01 M sebagai sumber senyawa besi yang terbatas, sebagai pembanding digunakan 3 ml supernatan tanpa ditambah FeCb. Deteksi siderofor dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 410 nm (Zehnder et al. 2001). Kemampuan agens memproduksi Hidrogensianida (HCN)

Penentuan adanya pembentukan hidrogensianida oleh bakteri agens biokontrol dilakukan menurut prosedur yang dijelaskan oleh Bakker & Schippers (1987) dalam Munif (2001). Bahan yang digunakan sebagai medium adalah 4.4 g glisin, 2 g asam pikrat, 8 g natrium karbonat, 15 g agar, 30 g TSB, 1000 ml air steril dan potongan kertas saring steril (1x1 cm). Glisin, TSB dan agar dimasukkan ke dalam 1000 ml air steril lalu diautoklaf dan dituang ke dalam petridis. Selanjutnya dibuat larutan untuk mendeteksi HCN (CDS) yang terdiri atas 2 g asam pikrat dan 8 g natrium karbonat dilarutkan dalam 200 ml air steril. Potongan kertas saring steril dimasukkan ke dalam larutan CDS. Bakteri digores pada medium glisin, kemudian potongan kertas saring diletakkan di bagian tengah tutup petridis. Selanjutnya dilakukan inkubasi pada suhu 24 °C selama 4 hari. Selama inkubasi, bakteri yang memproduksi HCN akan menyebabkan perubahan warna kertas saring dari kuning menjadi coklat muda (HCN sedikit), coklat (HCN sedang) dan merah bata (HCN tinggi).

Daya Hambat Rizobakteri terhadap Cendawan Patogen

Pengujian efektifitas daya penghambatan rizobakteri sebagai kandidat agens biokontrol terhadap pertumbuhan koloni patogen terbawa benih secara in vitro dilakukan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) non faktorial. Terdapat 18 isolat rizobakteri sebagai kandidat agens biokontrol (sesuai dengan hasil uji potensi awal). Kedelapan belas isolat rizobakteri diuji kemampuan menghambat terhadap patogen terbawa benih (P. capsici). Masing-masing merupakan percobaan

429


tersendiri. Percobaan diulang sebanyak 3 kali. Data hasil pengamatan yang diperoleh dianalisis menggunakan ANOVA. Untuk menguji beda antar rata-rata perlakuan dilanjutkan dengan uji jarak DMRT pada taraf α = 0.05. Pengujian daya hambat isolat rizobakteri terhadap pertumbuhan koloni patogen uji dihitung menggunakan rumus Soytong (1988 dalam Noveriza 2003) yang dimodifikasi: Daya Hambat (DH)(%) = d1 - d2/d1 X 100 (d1 = diameter koloni patogen ke arah petri (cm), d2 = diameter koloni patogen ke arah rizobakteri (cm). Penilaian daya hambat berdasarkan skala persentase penghambatan pertumbuhan koloni sebagai berikut: aktivitas sangat tinggi (++++ = >75% DH), aktivitas tinggi (+++ = 61-75% DH), aktivitas sedang (++ = 51-60% DH), aktivitas rendah (+ = <50% DH) dan tidak ada aktivitas (-). Dari hasil percobaan ini dipilih yang paling efektif, untuk percobaan berikutnya. Data daya hambat yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan program statistik SAS dan perbedaan nilai tengah daya hambat antar perlakuan diuji dengan uji jarak berganda Duncan pada taraf nyata α= 0.05.

3. HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil pengujian terhadap kemampuan mensekresikan enzim ekstraseluler kelompok rizobakteri, beberapa isolat rizobakteri mampu mensekresikan enzim, sementara yang lainnya tidak mensekresikan enzim sama sekali (Tabel 1). Dari 18 isolat rizobakteri terdapat 8 isolat mensekresikan kitinase, sisanya tidak mensekresikan enzim kitinase. Dari Tabel 1 dapat dilihat bahwa terdapat 11 isolat rizobakteri yang dianalisis mampu mensekresikan enzim peotease, 6 isolat tidak mensekresikan enzim protease, yaitu isolat RBNA13, RBNA14, RBSPA2, RB2SPA1, RBKB5, RBNA8, dan RBNA3. Hasil pengujian terhadap kemampuan isolat rizobakteri untuk mensekresikan enzim selulase ternyata semua isolat mensekresikan enzim sellulase (Tabel 1). Contoh hasil positif evaluasi aktivitas enzim ekstraseluler (kitinase, protease, dan

selulase) yang disekresikan isolat rizobakteri dapat dilihat pada Gambar 1.

Hasil pengukuran produksi senyawa siderofor dari 18 isolat rizobakteri sebagai kandidat rizobakteri yang berperan sebagai agens PGPR menunjukkan bahwa 12 isolat menghasilkan senyawa siderofor, sisanya 6 isolat rizobakteri tidak menghasilkan senyawa siderofor (Gambar 2). Diantara 12 isolat rizobakteri yang menghasilkan senyawa siderofor 4 isolat rizobakteri menghasilkan senyawa siderofor lebih tinggi dibandingkan isolat rizobakteri lainnya, yang diindikasikan oleh nilai absorbansinya (Gambar 2).

Hasil evalusi terhadap kemampuan menghasilkan senyawa hidrogen sianida (HCN) dari 18 isolat rizobakteri yang diuji berbeda-berbeda kemampuannya dalam memproduksi HCN) tergantung kepada isolatnya. Dari 18 isolat rizobakteri, semuanya memproduksi HCN, hanya saja berbeda dalam jumlahnya. Diantara 18 isolat yang memproduksi HCN, 8 isolat memproduksi HCN dalam jumlah yang tinggi, 5 isolat memproduksi HCN dalam jumlah sedang, dan 5 isolat memproduksi HCN dalam jumlah yang rendah (Tabel 1, Gambar 3 a,b,c).

Hasil analisis sidik ragam (Uji F) menunjukkan bahwa isolat rizobakteri kandidat agens biokontrol mempunyai kemampuan penghamabatan berbeda-beda terhadap pertumbuhan koloni patogen terbawa benih cabai (P. capsici). Kemampuan isolat rizobakteri berbeda tergantung kepada jenis isolat itu sendiri (Tabel 1). Diantara 18 isolat rizobakteri yang dievaluasi, diperoleh 7 isolat yang paling efektif menghambat pertumbuhan koloni patogen uji, yaitu isolat RB3SPA1, RB1NA1, RBNA4, RBKB1, RBSPA19, RBSPA12, dan RBSPA14. Ketujuh isolat rizobakteri tersebut menghambat pertumbuhan koloni melebihi 75% atau daya penghambatan sangat tinggi. Lima isolat rizobakteri menghambat dengan kemampuan sedang atau daya hambat berkisar anytara 41,90-64,76%. Sisanya 6 isolat yang kemampuan menghambatnya di bawah 61,90% atau daya menghambat rendah.

430


Isolasi rizobakteri pada daerah rizosfer tanaman cabai sehat diperoleh sejumlah isolat rizobakteri yang berpotensi sebagai agens biokontrol untuk mengendalikan patogen terbawa benih cabai. Hasil evaluasi secara in vitro terhadap pertumbuhan koloni salah satu cendawan patogen terbawa benih yaitu P.

capsici bahwa isolat rizobakteri yang diisolasi dari sistim perakaran tanaman cabai sehat bersifat menghambat pertumbuhan koloni cendawan patogen P. capsici. Beberapa isolat rizobakteri memiliki daya penghambatan lebih tinggi dibandingkan isolat rizobakteri lainnya.

Tabel 1. Kemampuan berbagai isolat rizobakteri dari untuk mensekresikan enzim ekstraseluler kitinase, protease,

dan selulase, memproduksi hidrogen sianida (HCN), dan daya hambat (DH) masing-masing isolat rizobakteri terhadap pertumbuhan koloni cendawan patogen P. capsici

Kelompok Rizo-Bakteri

Indeks Aktivitas enzim ekstraselulase*)

Kitinase Protease Selulase ProduksiH

CN** DH (%)

Kontrol - - - - 0.00 ISOLAT RB2NA1 + + + ++ 62,86 bcd ISOLAT RB3SPA1 - + + +++ 76,19 abc ISOLAT RBNA14 - - + ++ 41,90 fgh ISOLAT RB1NA1 - + + +++ 79,05 a ISOLAT RBSPA2 + - + + 21,90 ij ISOLAT RBNA13 - + + + 61,90 b-e ISOLAT RB2SPA1 + - + + 56,19 def ISOLAT RBSPA5 - + + ++ 64,76 abd ISOLAT RBNA4 + + + +++ 74,29 abc ISOLAT RBKBI + + + +++ 77,14 ab ISOLAT RBKB3 - - + + 46,67 efg ISOLAT RBKB5 - - + + 27,62 hij ISOLAT RBSPA19 + + + +++ 75,95abc ISOLAT RBNA9 - + + + 60,95cde ISOLAT RBSPA12 - + + +++ 78,29 a ISOLAT RBSPA14 + + + +++ 79.53 a ISOLAT RBNA8 + - + ++ 41,90 fgh ISOLAT RBNA3 - - + ++ 54,19 def

Keterangan : *untuk aktivitas enzim diamati berdasarkan zona bening (halo), indeks aktivitas enzim ditentukan berdasarkan nilai diameter koloni dibagi dengan nilai koloni tambah zona bening (halo). ** untuk produksi HCN : warna kertas saring , +++ merah bata, ++ coklat tua, + coklat muda, dan - kuning. Angka pada kolom daya hambat dengan huruf yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan Uji DMRT pada α = 0.05, DH (Daya Hambat Pertumbuhan Koloni Patogen).

Perbedaan efektivitas daya

penghambatan tersebut diduga berhubungan dengan kemampuan isolat rizobakteri tersebut dalam mensekresikan senyawa metabolit sekunder yang bersifat antimikrob, seperti antibiotik, hidrogen sianida (HCN) dan sintesis berbagai enzim degradasi dinding sel cendawan patogen seperti kitinase, selulase, lipase, dan protease. Senyawa antimikrob yang dihasilkan oleh Bacillus spp. antara lain kanosamine (Milner et al. 1996), zwitermisin (Silo-Suh et al. 1998), iturin (Bernal et al. 2002), mikosubtilins, basilomisin, fengimisin, mikobasilin,

mikoserein (Hornby 1993), dan bacitracin (Awais et al. 2007).

Isolat rizobakteri hasil isolasi dari daerah rizosfer tanaman cabai sehat secara efektif juga dapat menghambat patogen terbawa benih cabai selain P. capsici hasil uji secara in vitro (Syamsuddin et al. 2013). Mekanisme penghambatan secara langsung oleh rizobakteri dari kelompok Pseudomonas spp. antara lain dengan menghasilkan antibiotik pioluteorin, pirolnitrin, fenazines, dan fusarisidin (Beatty & Susan 2002), serta 2,4-diasetil floroglusinol (Dwivedi & Johri 2003). Hasil

431


uji in vitro menunjukkan dinding sel patogen P. capsici mengalami degradasi

Gambar 1. Contoh hasil analisis aktivitas enzim ekstraseluler yang disekresikan oleh isolat rizobakteri yang diuji. Hasil positif untuk aktivitas (a) selulase (b) kitinase, dan (c) protease

oleh enzim 1,3-glukanase, 1,4-glukanase dan lipase yang dihasilkan oleh strain P. flurescen (Diby 2005). Metabolit volatil HCN yang dihasilkan rizobakteri Pseudomonas spp. menghambat pertumbuhan (Diby 2004) dan HCN yang dihasilkan strain P. flurescens PG01 menghambat pertumbuhan koloni C. capsici (Sutariati 2006).

Hasil evaluasi terhadap karakter fisiologis isolat rizobakteri yang diperoleh menunjukkan bahwa ke-18 isolat rizobakteri yang diuji mempunyai kemampuan yang berbeda-beda dalam mensekresikan enzim ekstraseluler (kitinase, protease, atau selulase), dan produksi HCN. Enzim kitinase hanya disekresikan oleh 8 isolat (RB2NA1, RBSPA2, RBSPA1, RBNA4, RBKAB1, RBSPA19, RBSPA14, DAN RBNA8. Enzim protease disekresikan oleh hampir semua isolat yang diuji, kecuali rizobakteri RBNA13, RBKB1, dan RBKB5. Semua isolat rizobakteri yang diuji mampu mensekresikan enzim selulalse.

Rizobakteri yang mampu mensekresikan enzim kitinase ternyata tidak semuanya diikuti oleh kemampuan menghambat yang tinggi terhadap pertumbuhan koloni P. capsici secara in vitro. Isolat rizobakteri yang tidak mensekresikan enzim kitinase sekalipun ternyata memberikan daya penghambatan yang tinggi juga. Dari hasil penelitian ini diduga bahwa kitinase yang dihasilkan

rizobakteri tidak dominan perannya dalam mekanisme penghambatan pertumbuhan koloni patogen P. capsici. Dinding sel patogen P. capsici yang tidak mengandung kitin, sehingga kitinase tidak dapat mendegradasi dinding selnya. Hasil penelitian sebelumnya juga telah dilaporkan hal yang sama bahwa enzim kitinase tidak menunjukkan peran dalam penghambatan cendawan patogen C. capsici oleh isolat rizobakteri dari kelompok Bacillus spp., Pseudomonas spp., dan S. marsescen spp. (Sutariati 2006).

Rizobakteri kelompok Bacillus spp. yang mampu mensekresikan enzim ekstraseluler (protease atau selulase) menunjukkan kemampuan untuk menghambat pertumbuhan koloni P. capsici yang tinggi. Enzim ekstraseluler telah diketahui sebagai salah satu mekanisme rizobakteri yang berperan sebagai agens biokontrol dalam menghambat pertumbuhan patogen (Chernin & Chet 2002). Hasil penelitian Zang et al. (2004) melaporkan bahwa enzim ekstraseluler (protease dan selulase) yang disekresikan rizobakteri mampu mendegradasi dinding sel Sclerotium rolfsii sehingga perkembangan patogen tersebut menjadi terganggu. Egamberdiyeva (2005) juga melaporkan enzim ekstraseluler protease dan selulase yang dihasilkan strain Bacillus spp., dan P. aeruginosa bersifat antagonistik terhadap patogen.

a b c

432


Gambar 2. Kemampuan Isolat rizobakteri yang diuji untuk mensintesis senyawa siderofor, yang secara kualitatif

ditentukan berdasarkan nilai absorbansi pada panjang gelombang α 550 nm

Gambar 3. Contoh skoring produksi senyawa hidrogen sianida (HCN) oleh rizobakteri. Warna kertas berubah menjadi (a) merah bata (skor +++), (b) coklat tua (skor ++), (c) coklat muda (skor +), dan (d) kuning (skor -)

Siderofor merupakan senyawa pengkhelat besi yang disekresikan oleh mekroorganisme sebagai respon terhadap kekurangan zat besi (Fe). Dari hasil penelitian ini terbukti sebagian besar isolat rizobakteri yang diuji menghasilkan senyawa siderofor. Senyawa siderofor yang dihasilkan oleh mikroorganisme bakteri dan cendawan yang mempunyai kemampuan mengkhelat besi dalam kondisi kekurangan Fe (Dwivedi & Johri 2003). Produksi siderofor merupakan salah satu mekanisme rizobakteri dalam menekan patogen melalui kompetisi unsur hara Fe, sehingga mikroorganisme lain yang tidak menghsilkan senyawa siderofor tidak akan mendapatkan Fe untuk pertumbuhannya (Kazempour 2004).

Senyawa volatil HCN merupakan hasil metabolisme sekunder yang umumnya dihasilkan oleh bakteri P. fluorescens dan bersifat toksit terhadap patogen (Keel et al. 1990; Maurhover et al. 1994). Dari hasil penelitian ini beberapa isolate menunjukkan ternyata juga menghasilkan HCN dan diduga bersifat menghambat pertumbuhan cendawan patogen P. capsici. Hasil penelitian sebelumnya juga dilaporkan bahwa HCN yang dihasilkan rizobakteri Pseudomonas spp. menghambat pertumbuhan P. capsici (Diby 2004).

Siderofor merupakan senyawa pengkhelat besi yang disekresikan oleh mikroorganisme sebagai respon terhadap kekurangan zat besi. Dari hasil penelitian ini terbukti sebagian besar isolat

d c b a

433


rizobakteri dari kelompok Bacillus spp., dan Pseudomonas spp. yang diuji menghasilkan senyawa siderofor. Senyawa siderofor dihasilkan oleh mikroorganisme bakteri dan cendawan yang mempunyai kemampuan mengkhelat besi dalam kondisi lingkungan kekurangan Fe (Dwivedi & Johri 2003). Produksi siderofor merupakan salah satu mekanisme rizobakteri dalam menekan patogen melalui kompetisi terhadap unsur Fe, sehingga mikroorganisme lain yang tidak menghasilkan siderofor tidak akan mendapatkan Fe untuk pertumbuhannya (Kazempour 2004).

Dari hasil penelitian ini terdapat indikasi bahwa perbedaan efektivitas penghambatan rizobakteri terhadap cendawan patogen P. capsici berhubungan dengan kemampuan isolat rizobakteri dalam mensekresikan enzim ekstraseluler, khususnya protease dan selulase, dan menghasilkan HCN. Rizobakteri yang memperlihatkan kemampuannya mensekresikan enzim protease dan selulase dan juga menghasilkan HCN, efektivitas penghambatannya mencapai 60% lebih, kecuali, isolat rizobakteri RBNA8 dan RBNA3 efektivitasnya tetap di bawah 60% meskipun menghasilkan enzim selulase dan juga memproduksi HCN. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa efektivitas penghambatan rizobakteri terhadap patogen melibatkan banyak mekanisme. Sebagaimana telah dilaporkan sebelumnya, antagonisme antara rizobakteri dengan cendawan patogen tidak hanya melalui mekanisme parasitisme tetapi juga dapat terjadi melalui mekanisme antibiosis, kompetisi, dan induksi ketahanan (Zhang et al. 2004). Hasil evaluasi karakter fisiologis dan efektivitas daya hambat isolat rizobakteri terhadap patogen P. capsici dari 18 isolat, isolat rizobakteri RB1NA1, RB3SPA1, RBNA4, RBKB1, RBSPA19, RBSPA12, dan RBSPA14 sangat berpotensi sebagai agens biokontrol terhadap pengendalian penyakit terutama pada cabai yang disebabkan oleh patogen P. capsici karena menunjukkan kemampuan yang lebih baik

dalam menghambat pertumbuhan koloni dibandingkan isolat rizobakteri lainnya.

4. KESIMPULAN

Rizobakteri yang berasal dari isolat RB1NA1, RB3SPA1, RBNA4, RBKB1, RBSPA19, RBSPA12, dan RBSPA14 berpotensi sebagai agens biokontrol terhadap patogen P. capsici. Isolat rizobakteri RB2NA1, RBSPA2, RB2SPA1, RBNA4, RBKB1, RBSPA19, RBSPA14, DAN RBNA3 menghasilkan enzim kitinase. Sebagian besar isolat rizobakteri yang diuji

mampu mensekresikan enzim protease.

Diantara 18 isolat rizobakteri yang diuji,

hanya 7 isolat yang tidak mampu

mensekresikan enzim protease.

rizobakteri yang diuji mensekresikan

enzim selulase. Diantara 18 isolat

rizobakteri yang diuji, terdapat 8 isolat

memproduksi HCN dalam jumlah yang

tinggi, 4 isolat memproduksi HCN dalam

jumlah sedang, dan sisanya memproduksi

HCN dalam jumlah yang rendah.

Diantara 11 isolat yang memproduksi

siderofor, 4 isolat (RB2NA1, RBNA13,

RBNA8, dan RBKBI) menghasilkan

siderofor lebih tinggi (di atas 0.07 nilai

absorban α550nm).

UCAPAN TERIMAKASIH

Penelitian ini merupakan sebagian dari hasil penelitian Strategis Nasional Tahun Anggaran 2014, yang dibiayai oleh Direktorat Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat, Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Kementrian Pendidikan dan Kebudayaan Nomor 495.b/UN11/S/ LK-BOPT/2014 Tanggal 28 Mei 2014, atas bantuan dana tersebut penulis mengucapkan terima kasih. Beberapa isolat patogen dalam penelitian ini merupakan koleksi pribadi Dr Siti Hapsah dan Dr Endang Puji. Sedang beberapa lagi diperoleh dari Laboratorium Mikologi, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor. Penulis

434


juga mengucapkan terima kasih atas bantuannya, sehingga dapat terlaksananya penelitian ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada kepala dan seluruh staf Laboratorium Hama dan

Penyakit Tanaman Balitro Cimanggu Bogor atas bantuan fasilitas selama

penelitian dilaksanakan.

DAFTAR PUSTAKA

Awais, M., Shah, A.L., Hameed, A., Hasan F. 2007. Isolation, identification and optimization of bacitracin produced by Bacillus sp. Pak.J. Bot.

39(4):1303-1312. Baharum, S.N, Salleh, A.B., Razak, C.N.A., Basri, M.,

Rahman, M.B.A., Rahman, R.N.Z.R.A. 2003. Organic solvent tolerant lipase by Pseudomonas sp.strain S5: stability of enzym in organic solvent and physical factors affecting its production. Ann Microbiol.53:75-83.

Beatty, P.H., Susan, E.J. 2002. Paenibacillus polymixa

produce fusaricidin-type antifungal antibiotics active against Leptosphaeria maculans, the causative agents of blackleg disease of canola. Can Microbiol 48:159-169.

Bernald, G., Illanes, A., Ciampil, L. 2002. Isolation and partial purification of metabolite from a mutant strain of Bacillus sp. with antibiotic activity against plant pathogenic agents. Elect J. Biotech

5:12-20. Bullied, W.J., Buss, T.J., Vessey, J.K. 2002. Bacillus

cereus UW85 inoculation effects on growth, nodulation and N accumulation in grain legumes: Field studies. Can. J. Plant Sci., 82:291-298.

Chernin, L., Chet, L. 2002. Microbial enzymes in biocontrol of plant pathogens and pests, p. 171-

225. In R. G. Burns and R. P. Dick (ed.) Enzymes in the environment: activity, ecology and applications. Marcel Dekker, New York, N.Y.

Chernin, L., Ismailov, Z., Haran, S., Chet I. 1995. Chitinilytic Enterobacter agglomerans antagonistic to fungal pathogens. Applied and Enviromental Microbiology, 62 :1720-1726.

Coronel, L.M., Jonson, L.M. 1986. Isolation, screning

and characterization of cellulose-utilizing bacteria. The Philippine J. Sci. 115(3) : 223-232.

De Silva, A., Patterson, K., Rothrock, C., Moore J. 2000. Growth promotion of highbush blueberry by fungal and bacterial inoculants.Hort. Sci., 35:1228-1230.

Diby P, 2004. Phisiological, biochemical and moleculer

studies on the root rot (caused by Phytophthora capsici) suppression in black pepper (Piper

nigrum L.) by rhizosphere bacteria. [Disertasi]. University Calicut. India.

Diby, P., Saju K.A., Jisha, P.J., Sarma, Y.R., Kumar, A., Anandaraj, M. 2005. Mycolitic enzymes produced by Pseudomonas flurescens and Trichoderma spp. agaist Phytophthora capsici, the foot rot pathogen of black pepper (Piper nigrum L.). Divicion of Crop Protection, Indian

Institute of Spices Research, Marikkunnu P.O., Calicut, Kerala-673012, India.

Dwivedi, D., Johri, B.N., 2003. Antifungals from fluorescens pseudomonas: biosyntesis and regulation. Curr Sci 85:1693-1703.

Egamberdiyeva, D. 2005. Biological control of

phytopathogenic fungi with antagonistic bateria. Biocontrol of bacterial plant disease, 1st Simposium 2005. Centre of Agroecology, Taskent State University of Agriculture, University str.1, 700140 Tashkent, Uzbekistan.

Erwin, D.C., Ribeiro, O.K. 1996. Phytophthora: Diseses Worldwide. APS Press, St. Paul, Minnesota.

Frankowski. J., Lorito, M., Scala, F., Schmidt, R., Berg,

G., Bahl., H. 2001. Purification and properties of two chitinolytic enzymes of Serratia plymuthica HRO-C48. Arch. Microbiol. 176:421-426.

Gohel ,V., Megha, C., Vyas, P., Chhaptar, H.S. 2004. Strain improvment of chitinolityc enzyme producing isolat Pantoea dispersa for inhancing its biocontrol potential against fungal plant pathogens. Ann Microbiol. 54(3(:770-725.

Hornby, D. 1993. Biological Control of Soil-borne Plant Pathogens. Wallingford, UK: CAB International.

Huang, C.J, Chen, C.Y. 2004. Gene cloning and biochemical characterization of chitinase CH from Bacillus cereus 28-9. Ann Microbiol. 54(3(:289-297.

Kazempour, M.N. 2004. Biological control of

Rhizoktonia solani, the causal agent of rice sheath blight by antagonistics bacteria in greenhouse and field conditions, Plant Pathol J 3:88-96.

Keel, C., Wirthner, P., Oberhansll, T., Viosrd C, Burger U, Hass D, Defago G. 1990. Pseudomonas as antagonists to plant pathogens in the rhizospheer: Role of the antibiotic 2,4-

diacetylphloroglucinol in the suppression of black root rot of tobacco. Sybiosis. 9:327-341.

Kennedy, I.R., Choudhury, Atma., Kecskes, M.L. 2004. Non-symbiotic bacterial diazotrophs in crop-farming systems: can their potential for plant growth promotion be better exploited. Soil Biol. Biochem. 36(8):1229-1244.

Kim, D.S., Cook, R.J., Weller, D.M. 1997. Bacillus sp. L324-92 for biological control of three root

diseases of wheat grown with reduced tillage. Phytopathol., 87:551-558.

Kloepper, J.W., Ryu, C.M., Zhang, S.A. 2004. Induced systemic resistance and promotion of plant growth by Bacillus spp. Phytopathology 94 (11): 1259-1266.

Louws, F.J., Holmes, G.J., Ristaino, J.B. 2002. Phytophthora blight of pepper and cucurbits.

Vegetable Disease Information Note 27. Plant

435


Pathology Extension, North Carolina State University.

Kumar RS, Ayyadurai, N., Pandiraja, P., Reddy, A.V., Venkateswarlu, Y., Prakash, O, Sakthivel., N. 2007. Characterization of antifungal metabolite produced by a new strain Pseudomonas aeruginosa PUPa3 that exibits broad-spectrum antifungal activity and biofertilizing traits. Journal of Applied Microbiology, 98:145-154.

Lugtenberg, B.J., Chin-A-Woeng, T.F., Bloemberg, G.V. 2002. Microbe-plant interactions:

principles and mechanisms. Antonie van Leeuwenhoek, 81: 373-383.

Milner, J.L., Silo-Sub, L., Lee J.C., He H., Clardy, J., Handelsman, J. 1996. Production of kanosamine by Bacillus cereus UW85. Appl Environ. Microbiol. 62:3061-3065.

Munif, A. 2001. Studise on the importance of endophytic bacteria for the biological control of

the root-knot nematode Meloidogyne incognita on tomato [Dissertation]. Bonn, Germany: Institute for Plant Diseases, University of Bonn.

Nandakumar, R., Babu, S., Raguchander T., Samiyappan, R. 2007. Chitinolytic activity of native Pseudomonas flurescens strains. J. Agric. Sci. Technol. 9 :61-68.

Roberts, P.D., McGovern, R.J., Kucharek, T.A.,

Mitchell, D.J. 2000. Vegetable diseases caused by Phytophthora capsici in Florida. Plant Pathology Department, University of Florida, Gainesville. .

Silo-Suh, L., Stabb, E.V., Raffel, S.J., Handelsman, S.J. 1998. Target range of zwittermicin A, and amino polyol antibiotic from Bacillus cereus. Curr Microbiol 37:6-11.

Sutariati, G.A.K. 2006. Perlakuan benih dengan agens biokontrol untuk pengendalian penyakit

antraknosa dan peningkatan hasil serta mutu

benih cabai. [Disertasi]. SekolahPascasarjana,

Institut Pertanian Bogor, Bogor. Syamsuddin, Ilyas, S,, Manohara, D., Sudarsono. 2007.

Efektivitas daya hambat minyak nabati terhadap pertumbuhan koloni beberapa patogen terbawa benih cabai secara in vitro. Agrista, 11 (2) : 81-91.

Syamsuddin. 2010. Perlakuan Benih Secara Hayati untuk Pengendalian Busuk Phytophthora (Phytophthora capsici Leonian) dan

Peningkatan Hasil serta Mutu benih Cabai Merah (Capsicum annuum L.). Penelitian Disertasi Program Doktor (S3) di IPB, Bogor.

Vidhyasekaran, P., Kamala, N., Ramanathan, A., Rajappan, A., Paranidhran, V., Velahzahan, R. 2001. Induction systemic resistance by Pseudomonas flurescens Pf1 against Xanthomonas oryzae pv. oryzae in rice leaves.

Phytoparasitica. (29):155-166. Yamaguchi, I. 1996. Pesticides of microbial origin and

applications of moleculer biology. Crop protection agents from nature: natural products and analogues. The Royal Society Chemestry, London, United Kingdom :27-49.

Zang, Y. 2004. Biocontrol of sclerotium stem rot of canola by bacterial antagonists and study of

biocontrol mechanisms involved [Thesis]. Winnipeg, Canada: Departement of Plant Science, University of Manitoba.

Zehnder, G.W., Murphy, J.F., Sikora, E.J. 2001. Application of rhizobacteria for induced resistance. Europ. J. Plant Pathol., 107 (1) : 39-50.

Documents

KARAKTERISASI FISOLOGIS DAN UJI KEMAMPUAN ISOLAT ...fkptpi.unsyiah.ac.id/images/PDF PROSIDING/PDF/pdf proteksi tanaman/425... · Isolasi difokuskan pada tiga kelompok rizobakteri