Leo Schouls en Marga van Santen Infectieziekteonderzoek , Diagnostiek en Screening (IDS)

Centrum voor Infectieziektebestrijding (CIb) Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu (RIVM)

Innocent NDM? De genetische achtergrond van een NDM positieve, meropenem gevoelige E. coli

Van Infectieziekten-Surveillance Naar Respons

28 mei, 2013, RIVM, Bilthoven

Laura van Dommelen Stichting PAMM, Veldhoven

Beta-lactam antibiotica

Antibiotica voor behandeling van bacteriële infecties

• Eerste β-lactam antibiotica tegen Gram-positieve bacteriën

• Later breed spectrum β-lactam antibiotica ook tegen Gram-positieve bacteriën

β-lactam antibiotica remmen de celwand synthese

• Binding aan eiwit dat zorgt voor opbouw peptidoglycaanlaag

• Dit eiwit is DD-transpeptidase, een penicilline-bindend eiwit (PBP)

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 2

The never ending story: bacterium vs man

Gebruik van antibiotica selecteert ongevoelige varianten

• Voor β-lactam antibiotica zijn er 2 mechanismen

– Bacterie vormt gewijzigd PBP waardoor antibioticum niet (goed) meer kan binden

› Bijv. Methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)

– Bacterie vormt een enzym dat het β-lactam antibioticum afbreekt: β-lactamase

› Bijv. Carbapenem-resistente Escherichia coli

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 3

β-lactamase hydrolysis decarboxylation

CO2

Werking van beta-lactamase

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 4

β-lactam antibioticum (carbapenem)

β-lactamase

Beta-lactams

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 5

Beta-lactam versus beta-lactamase

Ontwikkeling van varianten van β-lactam antibiotica

• Redenen

– Breder spectrum, dus werkzaam tegen meer bacteriesoorten

– Resistentieontwikkeling

› Penicilline

Penicillinase

› Breed-spectrum β-lactams (bijv. cephalosporines)

Breed-spectrum β-lactamases

› Extended spectrum β-lactams (bijv. 3e generatie cephalosporines )

Extended spectrum β-lactamases (ESBL)

› Carbapenems

Carbapenemases

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 6

Penicilline-G

Beta-lactamase genen in Gram-negatieven

De meeste β-lactamase genen liggen op plasmiden

• Ze kunnen overdragen worden tussen bacteriën

– van hetzelfde species

– van verschillende species

– van verschillende genera

• Plasmiden bevatten vaak meerdere resistentiegenen:

– Overdracht kan multi-resistentie opleveren

• Er zijn allerlei genen die kunnen coderen voor carbapenemases:

– blaOXA, blaKPC, blaVIM, blaIMP, blaCMY, blaNDM etc.

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 7

Een bijzondere casus in Veldhoven

Bij PAMM materiaal van patiënte met klinisch recidiverende urineweg infectie

• Fosfomycine helpt wel, maar daarna komen klachten snel weer terug.

• Vervolgens heeft ze ciprofloxacine gehad (november 2012) en recent gentamicine tijdens opname (april 2013). Ze krijgt een rash op nitrofurantoine.

• Kweek: in 2011 had ze nog een ‘gewone’ E. coli in haar urinekweek. In oktober 2012 opnieuw kweek van E. coli in de Vitek.

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 8

Resistentiebepaling door PAMM

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 9

Vitek resultaten

• E. coli is ESBL

• Verificatie met Checkpoints chip: NDM-1 positief!

• Vitek MIC voor meropenem zeer laag

• Bevestiging met e-test voor imipenem en meropenem: gevoelig!

• Wel blaNDM-gen, maar geen resistentie?

blaNDM-1, New Dehli Metallo-β-lactamase

– Meestal buitenland anamnese

Contacten van patiënt

Buitenland-contacten

• Echtgenoot van patiënt heeft een oud-ijzer bedrijf met veel medewerkers die vaak naar de Balkan reizen

• In 2012, 1 dag een Indiër op bezoek geweest

• Vlak voor afname kweek, in Turkije op vakantie geweest

• Met echtgenoot naar Dominicaanse Republiek, Mexico, Turkije en landen binnen Europa geweest

Anders

• Komt dagelijks in woonwagenkamp (moeder woont daar)

• Heeft twee edel-papagaaien uit Nieuw Guinea

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 10

Onderzoek aan isolaat in het RIVM (BSR)

• Isolaat wordt in verdere verhaal Ec626 genoemd

• Confirmatie met NDM-specifieke PCR en e-test

– Inderdaad NDM-PCR+ en meropenem gevoelig

• Hypothese: het gen is beschadigd door mutaties

• Besloten om het hele blaNDM gen te sequencen:

– PCR met primers flankerend van het gen

– Sequentie bepalen van PCR product

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 11

Sequentie-analyse van het NDM gen

• Sequentie analyse toont aan dat het gaat om het blaNDM-5 gen

• Het blaNDM-5 in Ec626 is helemaal intact, geen mutaties

• Zijn de codes voor expressie veranderd?

– Sequentie rondom NDM gen bepalen

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 12

Year Number of

reported reports (2013) 82 (28) 262 (88) 283 (95) 388 (130) 460 (154) 698 (233)

bla NDM-1 2009 >330 C (Pro) G (Val) G (Asp) G (Asp) A (Met) C (Ala)

bla NDM-2 2011 6 G (Ala) G G G A C

bla NDM-3 2013 1 C G A (Asn) G A C

bla NDM-4 2012 2 C G G G C (Leu) C

bla NDM-5 2011 1 C T (Leu) G G C (Leu) C

bla NDM-6 2012 1 C G G G A T (Val)

bla NDM-7 2013 2 C G G A (Asn) C (Leu) C

Nucleotide (amino acid) position

Expressie van genen: transcriptie en translatie

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 13

mRNA Gen in DNA Eiwit Transcriptie

Gencode in DNA

overschrijven in mRNA

Translatie

Gencode in mRNA vertalen in eiwit

Transcriptie: gencode overschrijven in mRNA

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 14

Gen in DNA Transcriptie

Gen

mRNA

RNA polymerase

RNA polymerase bindt op specifieke plaats, de Promotor Twee herkenningssequenties: -10 sequentie, consensus TATAAT -35 sequentie, consensus TTGACA

RNA polymerase

mRNA

Translatie: gencode in mRNA vertalen in eiwit

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 15

mRNA

Ribosoom bindt op specifieke plaats aan mRNA De ribosoom bindingssequentie (RBS), consensus AGGAGG Het gen start met start codon meestal ATG, soms GTG of TTG

mRNA Translatie

soom

ribo

Eiwit

soom

ribo

Eiwit

De promotor-regio van blaNDM

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 16

TTTTGAAACTGTCGCACCTCATGTTTGAattcgccccatatttttgctacagtgaaccaaattaagatcatc

-35 -10 RBS ISAba125 blaNDM

Dortet, Nordmann en Poirel

De promotor-regio van blaNDM (2)

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 17

Normale NDM+ stam

Ec626

Ontstaanswijze van de Ec626

Een normaal NDM cluster

IS5 ISAba125 Promotor blaNDM bleMBL trpF

Ontstaan van Ec626 samenstelling

Deletie van het gebied met ISAba125 en promotor

Herstel van de keten

Resultaat:

• Samenstelling zonder promotor

• Gevoelige stam

Bevestiging door meten van de expressie van bleMBL

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 18

Gelijktijdige transcriptie van genen

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 19

mRNA Gen 2

Eiwit 1

Transcriptie

Code van 2 genen overschrijven in één mRNA

gebruik makend van dezelfde -35 en -10 signalen

Translatie

Gencodes in mRNA vertalen in 2 eiwitten

Gen 1 Eiwit 2

mRNA bleMBL

Carbapenemase

blaNDM

Bleomycine resistentie eiwit

Bleomycine-gevoeligheid

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 20

Zeocin (analoog van bleomycine) in papieren disk

25 µg 50 µg

0 µg

25 µg 50 µg

0 µg

NDM-PCR+, MICmeropenem >32 NDM-PCR+, MICmeropenem 0.02 Ec626

Hoe zit het in andere NDM+ stammen

• Enterobacteriaceae isolaten verzameld in het kader CPE-surveillance

– Daan Notermans zal hierover meer vertellen

• Van deze CPE’s waren er ca. 20 NDM-positief

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 21

MIC’s van NDM+ isolaten

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 22

EUCAST Clinical Breakpoint, valid from 2013-02-11

Carbapenems MIC breakpoint (mg/L)

S ≤ R >

Doripenem 1 4

Ertapenem 0.5 1

Imipenem 2 8

Meropenem 2 8

NDM gene Species MIC mero

blaNDM-1 Enterobacter aerogenes 12

blaNDM-1 Enterobacter cloacae 2

blaNDM-1 Escherichia coli 6

blaNDM-1 Escherichia coli >32

blaNDM-1 Escherichia coli >32

blaNDM-1 Klebsiella pneumoniae* 1

blaNDM-1 Klebsiella pneumoniae* 6

blaNDM-1 Klebsiella pneumoniae 1.5

blaNDM-1 Klebsiella pneumoniae 2

blaNDM-1 Klebsiella pneumoniae* 8

blaNDM-1 Klebsiella pneumoniae* >32

blaNDM-1 Klebsiella pneumoniae 16

blaNDM-1 Klebsiella pneumoniae 24

blaNDM-1 Klebsiella pneumoniae >32

blaNDM-1 Klebsiella pneumoniae >32

blaNDM-5 Escherichia coli* >32

blaNDM-5 Escherichia coli* 12

blaNDM-5 Escherichia coli 0.012

blaNDM-7 Enterobacter cloacae >32

blaNDM-7 Klebsiella pneumoniae >32

blaNDM-7 Klebsiella pneumoniae 2

Ec626

Veel lage MIC’s Hoe zit het met de NDM-genen in

deze isolaten?

NDM-regio in Nederlandse isolaten

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 23

NDM gene Species

blaNDM-1 Enterobacter aerogenes

blaNDM-1 Enterobacter cloacae

blaNDM-1 Escherichia coli

blaNDM-1 Escherichia coli

blaNDM-1 Escherichia coli

blaNDM-1 Klebsiella pneumoniae*

blaNDM-1 Klebsiella pneumoniae*

blaNDM-1 Klebsiella pneumoniae

blaNDM-1 Klebsiella pneumoniae

blaNDM-1 Klebsiella pneumoniae*

blaNDM-1 Klebsiella pneumoniae*

blaNDM-1 Klebsiella pneumoniae

blaNDM-1 Klebsiella pneumoniae

blaNDM-1 Klebsiella pneumoniae

blaNDM-1 Klebsiella pneumoniae

blaNDM-5 Escherichia coli*

blaNDM-5 Escherichia coli*

blaNDM-5 Escherichia coli

blaNDM-7 Enterobacter cloacae

blaNDM-7 Klebsiella pneumoniae

blaNDM-7 Klebsiella pneumoniae

IS elements ISAba125 Promoter blaNDM bleMBL trpF

ISSpu2

ISAba125

ISEc33

IS5D

NDM-regio’s in Nederlandse isolaten

• 3 NDM-varianten gevonden

– NDM-1, het merendeel

– NDM-5, het bijzondere E. coli isolaat en een andere E. coli

– Drie NDM-7 isolaten: één E. cloacae en twee K. pneumoniae

• Er is geen relatie tussen NDM-variant en MIC

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 24

2013 - PLoS ONE 8(4): e61322.doi:10.1371/journal.pone.0061322

Isolaten met incompleet bleMBL gen

• Twee isolaten met incompleet bleMBL gen

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 25

1000 µg

25 µg

100 µg

50 µg

1000 µg

25 µg

100 µg

50 µg

Conclusies

• In Ec626 is de promotor geïnactiveerd

– Toevallige bevinding, onduidelijk of dit vaker voorkomt

• Drie NDM-varianten gevonden

– Deze variatie is groter dan verwacht

• Aanzienlijke variatie in gebied rondom blaNDM gen

– Verschillende insertie elementen

– Deleties

› Andere sequencing-benadering is noodzakelijk

• Aanzienlijke variatie in MIC’s voor meropenem en veel MIC’s onder klinisch breekpunt (EUCAST)

– Onderzoeken wat oorzaak is

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 26

NDM gene Species MIC mero

blaNDM-1 Klebsiella pneumoniae* 1

blaNDM-1 Klebsiella pneumoniae* 6

blaNDM-1 Klebsiella pneumoniae* 8

blaNDM-1 Klebsiella pneumoniae* >32

blaNDM-5 Escherichia coli* >32

blaNDM-5 Escherichia coli* 12

Stelling

Het gebruik van uitsluitend PCR voor de identificatie van carbapenem resistentie kan leiden tot onjuiste behandeling van de patiënt.

Voorlopig blijft een fenotypische identificatie nog noodzakelijk.

NDM | 28 mei 2013

Leo Schouls 27