Inhibicin enzimtica

UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIAFACULTAD DE CIENCIAS Y FILOSOFA ALBERTO CAZORLA TALLERIDEPARTAMENTO DE CIENCIAS CELULARES Y MOLECULARESSECCIN BIOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR

INFORME DE LABORATORIO:Inmunologa

ALUMNAS:Sthefanie Cabrel RengifoGabriela Morn AtencioJane Vargas Quilla

PROFESOR:Ivn LozadaFECHA DE ENTREGA:17 de Noviembre

-2014-

ndice

I.RESULTADOS3II.DISCUSIN8III. CUESTIONARIO13IV. CONCLUSIONES18V. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA.19

I. RESULTADOSAGLUTINACINSe tom una muestra de sangre de tres alumnos del saln, las cuales fueron sometidas a las pruebas Tabla 1. Resultados de la aglutinacinPacienteABRh

Dulce AlarcnOO3+

Manuel VilchezOO3+

Gaby EspinozaOO4+

2+

Figura 1. Interpretacin de los resultados para la aglutinacin

ELISA

Figura 2. Resultados de la prueba de ELISA para Toxocara (de izquierda a derecha): Control positivo, control negativo y muestra problema. CITOMETRA DE FLUJOTabla 2. Resultados de la citometra de flujo para los casos 071, 070 y 069071070069

Beads192322972105

CD4224920152158

CD8310418622109

ClculosCaso 071T: 9000R1: 6147R2: 1923 beadsR3: 3104 CD8R4: 2249 CD4

Caso 070R2: 2297 beadsR3: 1862 CD8R4: 2015 CD4

Caso 069R2: 2105 beadsR3: 2109 CD8R4: 2158 CD4

AISLAMIENTO DE CELULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFERICA

Figura 4. Producto de la centrifugacin de una dilucin 1/10 de la muestra con las siguientes fases (de arriba abajo): Plasma, monocitos, granulocitos y glbulos rojos.

Figura 4. Vista de monocitos desde la Cmara de Newbauer (10X)

APOPTOSIS

Figura 5. Vista de monocitos desde la Cmara de Newbauer (40X) Figura 6. Vista de clulas vivas (verdes) y apoptticas (anaranjadas)

Recuento de monocitos y linfocitos

II. DISCUSINAGLUTINACIN La reaccin antgeno-anticuerpo es la piedra angular de la respuesta inmune.[10] En la combinacin de un anticuerpo con su antgeno especfico en los eritrocitos, el azcar terminal del antgeno se combina con el anticuerpo. [11] La reaccin se caracteriza por ser especfica (la unin dada es muy precisa y permite distinguir entre grupos qumicos con diferencias mnimas), rpida (la primera etapa es del orden de milsimas de segundo, y est limitada nicamente por difusin; la segunda etapa, que es ms larga, incluye todas las manifestaciones que se presentan como consecuencia de la interaccin tales como precipitacin, aglutinacin, neutralizacin, etc.), reversible (puesto que la reaccin se debe a fuerzas no covalentes y en consecuencia se ve afectada por factores como la temperatura, proporcin Ag Ab, el pH y la fuerza inica) y espontnea (no requiere energa adicional para efectuarse). [10]

Factores que pueden variar la reaccin Ag Ab

pH. No existe un pH exacto ptimo, pero se dice que entre 6-7.3 se detecta la mayora de los grupos sanguneos clnicamente significativos. Temperatura. Los anticuerpos eritrocitarios reaccionan dentro de un margen restringido de temperatura. (Ej: IgM 4 27C, IgG 37C).

Fuerza inica. Est directamente relacionada con el potencial z. En la solucin salina normal, los iones de Na+ y Cl- se renen alrededor de los antgenos y de los anticuerpos y neutralizan parcialmente cargas opuestas, esto impide la asociacin Ag - Ab, pero puede disminuirse de diferentes formas.

Tiempo de incubacin. El tiempo necesario para alcanzar el equilibrio vara para la mayora de los anticuerpos y de su medio de reaccin.

Exceso de anticuerpos. Podra inhibir la aglutinacin.

Estructura antignica. Los antgenos de grupo sanguneo son protenas o hidratos de carbono. Su especificidad antignica est determinada por una secuencia concreta de aminocidos o por una molcula constituida por 3 o 4 azcares. [10]

Existen varios mtodos in vitro para detectar reacciones de antgeno-anticuerpo, los ms utilizados en serologa de Banco de Sangre son: Aglutinacin y hemolisis. [11]. SISTEMA ABO

En 1900, Landsteiner descubri que los glbulos rojos pueden clasificarse en A, B y O, de acuerdo a la presencia o ausencia de antgenos reactivos en la superficie de los glbulos rojos.

Dichos antgenos son de mucha importancia en transfusin sangunea, trasplante de tejidos y enfermedad hemoltica del recin nacido.

Con respecto a los resultados obtenidos en el laboratorio, se observa una reaccin nula del antgeno A y B de parte de los 3 pacientes en evaluacin, es decir, no hubo formacin de un cogulo que muestre una respuesta positiva a la aglutinacin, con lo que se descarta que alguno de los tres pertenezca al grupo A, B o AB. Por descartes, perteneceran a grupo O.

Se someti tambin al reactivo anti Rh, donde se observ la formacin de un cogulo mas en distintas intensidades, siendo la reaccin en la paciente Gaby Espinoza, quien present ms discrepancias. Aun as, las cuatro pruebas se efectuaron (dos grupos realizaron pruebas de sangre de un mismo paciente: la Srta. Gaby Espinoza) y resultaron positivas, colocando a los tres pacientes como pertenecientes al grupo O+. No se puede dejar de mencionar, que la existencia de diferencias en las intensidades entre las muestras evaluadas por cada grupo, se pueden deber a la mera percepcin de cada observador. Lo importante es que dichos valores converjan dentro del rango perteneciente al resultado positivo.

Con esto, si hay aglutinacin igual o mayor a 2+ en el tubo de ensayo, la persoa es Rh positiva. Por otro lado, si la aglutinacin es igual a 1+ o negativa, se debe de continuar el estudio en busca de variantes dbiles o parciales del antgeno D (para Rh). [footnoteRef:1] [1: Srvase revisar la seccin de Anexos, donde encontrar una tabla con los criterios para evaluar una reaccin con antgeno D, para Rh.]

PRUEBA DE ELISA

Las tcnicas de deteccin de la reaccin antgeno-anticuerpo en su faz de Interaccin Primaria son muy especficas y sensibles, tal es el caso del Enzimoinmunoensayo (ELISA), una tcnica sencilla, que se puede automatizar y estandarizar, obtenindose resultados similares y mejores an. El desarrollo y aplicacin de la Enzimainmunoensayo en el diagnstico de muchos microorganismos ha sido el esfuerzo de aos de investigaciones. Desde 1990, se han realizado muchos avances en la tecnologa de las Enzimainmunoensayos, tanto en el ELISA Indirecto como en el de Competencia, brindando eficacia y aplicabilidad para diagnsticos en gran escala, permitiendo su automatizacin.Poder contar actualmente con reactivos biolgicos especficos y estables como los anticuerpos monoclonales incidi notablemente en varias reas de la ciencia. Teniendo un amplio campo de aplicacin, uno de ellos el de estandarizacin de los reactivos de diagnstico en medicina y bioqumica. Para efectos del presente trabajo se realizo un test de ELISA indirecto para la deteccin de Anticuerpos, con el propsito de conocer y aplicar como tcnica diagnstica, mediante el uso de un Anticuerpo Monoclonal. Es as que se realizo el test de ELISA indirecto que tiene su principio semejante al de la ELISA directa, slo que en este caso, un antgeno especfico est unido a una fase slida que puede ser un tubo, microplaca o perlas de vidrio; luego se aade el suero del paciente que posee los anticuerpos y despus se adiciona el conjugado constituido por un anti-anticuerpo IgG o IgM unido a una enzima; posteriormente se adiciona el sustrato especfico para la enzima, que lo va a modificar y produce un compuesto coloreado, cuya intensidad es proporcional a la concentracin de anticuerpo en el suero del paciente. Esta prueba se utiliza ampliamente; con la disponibilidad de los sistemas automatizados se puede efectuar en un periodo de 1 a 2 horas. Mediante esta tcnica se pueden sealar niveles de IgM e IgG con ensayos por separado para evitar los falsos positivos y negativos.

Tal como se puede apreciar en los resultados se pudo observar el posillo no coloreado de la muestra la cual es negativa, esto me indica que no hay anticuerpos para el antgeno de toxocara esto me evidencia que no hay presencia de la reaccin antgeno- anticuerpo porque no hubo cambio de color azul a amarillo.

Por otro lado, los controles positivo y negativo me confirman la veracidad aplicada en la prueba de ELISA analizado cualitativamente; es decir que nos basamos en la presencia de coloracin. Adems, tambin se puede analizar cuantitativamente la coloracin, a travs del espectrofotmetro realizando la lectura de absorbancia bajo una longitud de onda especifica (450nm 490nm) esta medicin es para la lectura si la coloracin es amarilla.CITOMETRA DE FLUJOLos linfocitos son un tipo de glbulos blancos. CD4, o tambin llamadas T helper, dirigen la respuesta contra infecciones, mientras que CD8 termina la respuesta inmune y destruye clulas cancerosas u otros invasores.El ratio CD4/CD8 indica que tan fuerte se encuentra el sistema inmune y ayuda a predecir qu tan susceptible est una persona de contraer una infeccin.Un ratio CD4/CD8 normal est alrededor de 2.0, con una valor igual o mayor de 400 hasta 1600/mm3 para CD4 y 200 a 800/mm3 para CD8 [3,4].Si el ratio es mayor a 2, significa que el nmero de CD4 est elevado, lo que se traduce en un buen estado del sistema inmune (ausencia de enfermedad). Valores excesivamente altos, son producto de enfermedades tumorales.Por el contrario, si es menor a 1, el nmero de CD4 es bajo y por lo tanto es probable que se est desarrollando alguna enfermedad autoinmune, neumona, influenza, infecciones virales, problemas en la mdula sea, anemia, esclerosis mltiple, entre otras condiciones del sistema nervioso. Tambin es comn encontrar un nmero disminuido en la maana y elevado en las tardes, causando errores en la lectura [3,5].Embarazos, ciertos medicamentos como corticoides y usos excesivos de alcohol pueden afectar los resultados.No est dems mencionar que los valores de referencia pueden variar en funcin al tipo de poblacin que se est evaluando, por lo que hay que tener en cuenta las variables: sexo, raza y edad. [7]Por ejemplo, se ha reportado un estudio comparativo entre individuos adultos chinos sanos provenientes de Shangai e individuos adultos caucsicos sanos. Se observ que los valores de linfocitos CD8 variaban con la edad y el gnero, mientras que los valores de linfocitos CD4 no mostraban diferencias significativas. Asmismo, se hall que los individuos chinos de Shangai posean 100 linfocitos CD4 menos en promedio que los caucsicos, lo que sugiere que los valores de referencia de linfocitos CD4 para el diagnstico y monitoreo de enfermedades como el SIDA deben de ser reajustados en funcin a la poblacin que se va a evaluar. [6] Sin embargo, en nios, se ha demostrado que los cambios afectados por la edad predominan ms sobre los influenciados por la raza. En el caso de la edad, en caso de que el paciente fuera nio, hay que considerar que las poblaciones de linfocitos absolutas y relativas variarn durante la infancia debido a la maduracin y expansin del sistema inmune. No solo estos valores pueden diferir entre nios y adultos, sino tambin entre nios de distintos grupos de edades.[footnoteRef:2] Se ha hallado que el ratio CD4/CD8 es independiente a la edad. Los valores de CD4 son mayores en nios que en adultos, por lo que an son necesarios estudios de las subpoblaciones de linfocitos con nios infectados con SIDA de esos mismos grupos de edades para poder establecer un patrn para el diagnstico de enfermedades del sistema inmunolgico. [7] [2: Revsese la tabla 5 en la seccin de Anexos.]

Caso 071En el caso del paciente 071, el ratio obtenido fue de 0.72. Esto indica que el paciente est afrontando alguna de las afecciones mencionadas en el prrafo anterior. Aunque los valores del nmero de eventos para CD4 y CD8 no correspondan a los rangos establecidos, se denota una predominancia de CD8 sobre CD4, hecho que indica la accin del sistema inmune en respuesta a un ataque. Caso 0.70Como se sabe las molculas CD4 Y CD8 son vitales durante la presentacin antignica y la posterior activacin del sistema inmune. La determinacin del nmero de clulas CD4 se sustenta en la utilizacin de la citometria de flujo y es un parmetro muy importante que sirve como marcador de deterioro del sistema inmune. De acuerdo a los valores obtenidos en los resultados, el nmero absoluto CD4 es 875.69 cel/ul, este valor obtenido se encuentra dentro del recuento normal de CD4. Este recuento nos determina la salud del paciente con respecto al sistema inmune, indicndonos que el paciente tiene la capacidad de combatir infecciones producidos por microorganismos evitando desarrollar una enfermedad oportunista. El nmero absoluto CD8 es 809.2 cel/ul este valor tambin se encuentra dentro del recuento normal, dicho valor complementa a lo mencionado anteriormente que el paciente est saludable en trminos clnicos debido a la variacin amplia de los valores absolutos de linfocitos. Otro punto importante, es la relacin CD4/CD8 dando como resultado 1.08 este valor obtenido est entre 0.9 y 1.9, lo que significa que hay de 1 a 2 clulas CD4 por cada clula CD8 en personas sanas. Caso 069En el caso del paciente 069, el ratio obtenido fue de 1.02, donde se observa que no existe mucha diferencia entre el conteo absoluto para CD4 y CD8. Si bien CD4 se puede incluir dentro del valor de referencia normal (400 < 1023.37 < 1600), CD8 sobrepasa en ligera medida el intervalo (1000.13 > 800). Sin embargo, el ratio casi igual a la unidad denota que no existe predominancia significativa entre estos dos tipos de clulas. Sin embargo, lo ideal sera encontrar un ratio mayor a 2, esto indicara un buen estado del sistema inmune al predominar las CD4. Claro est una predominancia mesurada.SEPARACIN DE CLULAS MONONUCLEARES Y APOPTOSISLas clulas no pueden vivir eternamente, cual ser vivo cumple con el ciclo de vida, teniendo como muerte dos posibilidades: la necrosis y la apoptosis.En el presente laboratorio tiene como objetivo evaluar especficamente la apoptosis celular y los cambios que le confieren a nivel celular.Con el tal objetivo se procede en primer lugar, a separar las clulas de inters: mononucleares. Con el uso del reactivo Histopaque, se logr la separacin de tales clulas al presentar la misma densidad. Con este conjunto de clulas, se evala dos tipos de apoptosis, una inducida por un agente qumico y la otra, por el simple hecho de encontrarse expuesta a cambio brusco en el ambiente durante el proceso de separacin.En general, durante el proceso de apoptosis, lo que ocurre tericamente es que las organelas se destruyen, las mitocondrias vierten su contenido al citoplasma lo que constituye una de las seales importantes al compromiso celular hacia la apoptosis. La forma celular se pierde por la destruccin del citoesqueleto y la clula se vuelve esfrica. Finalmente las clulas se retraen, condensan y fragmentan originando los llamados "cuerpos apoptticos" formados de organelas y cromatina rodeadas de membrana plasmtica que remarcablemente mantiene su integridad durante todo el proceso. Hay ausencia de tumefaccin (hinchazn) celular y de liberacin del contenido intracitoplasmtico, por lo tanto no hay inflamacin que si ocurre en necrosis. Los cuerpos apoptticos son fagocitados por macrfagos o clulas vecinas que en otras circunstancias carecen de esta propiedad.El efecto producido por el cambio brusco de ambiente, se da cuando el ndice apopttico en menor al 20%. El recuento de clulas mononucleares finales fue de 20.8 CMSP/ml, las cuales son consideradas como las sobrevivientes al proceso de separacin.A nivel visual, de ser el agente apopttico una sustancia qumica, se observan situaciones como las descritas en la Figura 6. en las cuales las clulas que an conservan el material gentico intacto, estn vivas, quedan diferenciadas por el color a causa del efecto de los reactivos de Naranja de acridina/bromuro de etidio. El naranja de acridina se intercala en el ADN de clulas viables dando una apariencia verde; mientras que el BrEt es captado slo en clulas no viables, intercalndose con el ADN dndole una apariencia naranja.A pesar de contar con esta clara diferenciacin, se puede adems afirmar los resultados, distinguiendo las formas amorfas de las clulas apoptticas; ya que el proceso de apoptosis no es inmediato, sino que comienza con la formacin de cuerpos apoptticos (manchas verdes difusas en la Figura 6.) producto de la deformacin celular sin perder an la membrana. Son diversos los factores que inducen la respuesta apopttica en una clula. Generalmente pueden identificarse dos tipos, segn el tipo de sensor que capta la seal: externas e internas. Para la prctica, el agente apopttico fue el etanol. La exposicin aguda a etanol de cultivos primarios, induce un proceso apopttico que involucra la activacin de la va de JNK. Las vas del JNK y p38 son activadas por variedad de estmulos externos como radicales libres, rayos UV, ceramida libre y citokinas; mientras que las vas de ERK pueden ser activadas por factores de crecimiento. Dicha respuesta es el paso inicial de la va apopttica que consta de tres fases: induccin, ejecucin y degradacin [8,9].III. CUESTIONARIO1. Sistemas de grupos sanguneosLa determinacin del grupo sanguneo es de gran importancia para determinar la compatibilidad de la misma con respecto a otros agentes extraos. Tal hecho resulta ser aplicado en procesos de transfusiones de sangre, por ejemplo. Los glbulos rojos, un tipo de clulas sanguneas, presentan protenas en la superficie de membrana o antgenos; los cuales son agentes propios, causantes del fino manejo de compatibilidad de la sangre. La diferente produccin de antgenos por parte de los glbulos rojos, se traduce en la incompatibilidad de la sangre ante antgenos extraos. Por ejemplo, bajo el sistema ABO: Sangre de tipo A, solo recibe sangre de tipo A y tipo O Sangre de tipo B, solo recibe sangre de tipo B y tipo O Sangre de tipo AB, puede recibir sangre de tipo A, B, AB y O Sangre de tipo O, solo recibe sangre de tipo O.La sangre de tipo O se le puede dar a alguien con cualquier tipo de sangre, por lo que se denomina universal.Bajo el sistema Rh, la clasificacin se da por ser: positivo o negativo. El ejemplo ms claro de incompatibilidad Rh se da durante el embarazo. Madres con sangre tipo Rh- que llevan en el vientre un beb con tipo de sangre Rh+, suelen seguir un tratamiento especial debido a tal incompatibilidad. Durante el embarazo, los glbulos rojos del feto pueden pasar al torrente sanguneo de la madre a travs de la placenta. Si la madre es Rh negativo, su sistema inmunitario trata a las clulas fetales Rh positivas como si fuesen una sustancia extraa y creaanticuerposcontra dichas clulas sanguneas fetales. Estos anticuerpos anti-Rh pueden pasar de nuevo a travs de la placenta hacia el feto y destruir los glbulos rojos circulantes de ste. Cuando los glbulos rojos se descomponen, producenbilirrubina, la cual hace que el beb se ponga amarillo (ictericia). El nivel de bilirrubina en el torrente sanguneo del beb puede variar desde leve hasta altamente peligroso. Debido a que toma tiempo para que la madre desarrolle anticuerpos, con frecuencia, los primeros bebs no se ven afectados, a menos que la madre haya tenido embarazos interrumpidos o abortos espontneos anteriormente que sensibilizaron su sistema inmunitario. Sin embargo, todos los hijos que ella tenga despus de esto que tambin sean Rh positivos pueden resultar afectados. Gracias al uso de inmunoglobulinas especiales, llamadas RhoGAM, este problema se ha vuelto infrecuente en los Estados Unidos y otros lugares que brindan acceso a buenos cuidados prenatales. Estos son dos de los sistemas de sangre ms conocidos, la Tabla 3. y Tabla 4. Muestra otros sistemas, que presentan diferentes eptopes.Tabla 3. Sistemas de grupo sanguneo humano[footnoteRef:3] [3: Tabla reconocida por HUGO Gene Nomenclature Committee (2012)]

Tabla 4. Lista de eptopes para los sistemas de grupo sanguneo humanoSystem nameEpitopeor carrier, notes

ABOCarbohydrate (N-Acetylgalactosamine,galactose). A, B and H antigens mainly elicitIgMantibody reactions, although anti-H is very rare, see theHh antigen system(Bombay phenotype, ISBT #18).

MNSGPA / GPB (glycophorinsA and B). Main antigens M, N, S, s.

PGlycolipid. Three antigens: P1, P, and Pk

RhProtein. C, c, D, E, e antigens (there is no "d" antigen; lowercase "d" indicates the absence of D).

LutheranProtein (member of theimmunoglobulin superfamily). Set of 21 antigens.

KellGlycoprotein. K1can causehemolytic disease of the newborn (anti-Kell), which can be severe.

LewisCarbohydrate (fucoseresidue). Main antigens Leaand Leb- associated with tissue ABH antigen secretion.

DuffyProtein (chemokine receptor). Main antigens Fyaand Fyb. Individuals lacking Duffy antigens altogether are immune tomalariacaused byPlasmodium vivaxandPlasmodium knowlesi.

KiddProtein (urea transporter). Main antigens Jkaand Jkb.

DiegoGlycoprotein (band 3, AE 1, or anion exchange). Positive blood is found only amongEast AsiansandNative Americans.

YtProtein (AChE,acetylcholinesterase).

XGGlycoprotein.

SciannaGlycoprotein.

DombrockGlycoprotein (fixed to cell membrane by GPI, orglycosyl-phosphatidyl-inositol).

ColtonAquaporin 1. Main antigens Co(a) and Co(b).

Landsteiner-WienerProtein (member of theimmunoglobulin superfamily).

ChidoC4A C4B (complement fractions).

HhCarbohydrate (fucoseresidue).

XKGlycoprotein.

GerbichGPC / GPD (GlycophorinsC and D).

CromerGlycoprotein (DAF orCD55, regulates complement fractions C3 and C5, attached to the membrane by GPI).

KnopsGlycoprotein (CR1 orCD35, immune complex receptor).

IndianGlycoprotein (CD44adhesion function?).

OkGlycoprotein (CD147).

RaphTransmembrane glycoprotein.

JMHProtein (fixed to cell membrane by GPI). Also known asSemaphorin 7Aor CD108.

IiBranched (I) / unbranched (i)polysaccharide.

GlobosideGlycolipid. Antigen P.

GILAquaporin 3.

Rh-associated glycoproteinRh-associated glycoprotein.

ForssmanGloboside alpha-1,3-N-acetylgalactosaminyltransferase 1 (GBGT1)

Langereis[4]ABCB6.Porphyrintransporter

Junior[4]ABCG2. Multi-drug transporter protein

2. Pasos de la apoptosisInduccin:La clula detecta una seal (extra o intracelular) de muerte mediante cualquiera de sus sensores. Los sensores externos interactan con protenas adaptadoras intracelulares quienes a su vez activan enzimas que van a preparar el proceso de ejecucin.a) Sensores externos:Entre los sensores externos mejor caracterizados estn las familias de receptores de membrana representados por Fas/CD95 (oncogen Fas/Celldeath protein # 95) y TNFR1 (tumornecrosisfactorreceptor1). Estas protenas atraviesan la membrana celular y transducen la seal de afuera hacia adentro mediante oligomerizacin (agrupacin de molculas similares) y sutiles cambios qumicos tipo fosforilacin (kinasin)/defosforilacin. Tienen un dominio extracelular que interactua con un ligando (la molcula seal), ejemplos bien estudiados de ligandos son Fas-L (Fas ligand) del linfocito T citotxico y TNF (tumornecrosisfactor). La protena Fas induce apoptosis, desencadenado por TNF y Fas-L, teniendo una gran importancia en el sistema inmunitario, en enfermedades autoinmunes, SIDA, transplante de medula sea.b) Sensores internos:Los sensores internos son activados por la acumulacin de radicales libres, presencia de citocromo c en citoplasma (normalmente confinada en mitocondrias), dao en el DNA, etc. A veces el dao se da directamente dentro de la clula o a veces los sensores son activados como respuesta al estrs.Un sistema incluye la superfamilia de protenas MAPKs (mitogen-activatedproteinkinases). Los estmulos activan un primer grupo de MAPKs que van a fosforilar otros miembros en cascada, resultando en la fosforilacin de factores de transcripcin como c-jun y ATF2 para expresar los genes de protenas efectoras. Dos subfamilias que responden a estrs han sido bien caracterizadas, una que incluye JNK/SAPK(c-junN-terminalkinase/stressactivatedproteinkinase) y al p38-MAPK y la otra subfamilia es de las ERKs (kinasasreguladas por sealesextracelulares). Las vas del JNK y p38 son activadas por variedad de estmulos externos como radicales libres, rayos UV, ceramida libre y citokinas; mientras que las vas de ERK pueden ser activadas por factores de crecimiento. La va de seales MAPK es ms compleja de lo que se piensa, y probablemente esta complejidad provee selectividad diferencial a cada tipo celular.Otros sistemas incluyen la vigilancia de dao en el material gentico mediante protenas como p53 y Rb (del gen del retinoblastoma) que deciden la reparacin del ADN si se puede, caso contrario se toma la va de apoptosis. Los factores de crecimiento y protooricogenes son reguladores positivos de la progresin del ciclo celular, mientras los genes supresores de tumores como p53 y Rb se oponen a la proliferacin celular incontrolada, a travs de la inhibicin de los protooncogenes.Ejecucin:La maquinaria de apoptosis es activada para la produccin de protenas ejecutoras que degradarn la estructura celular. Hay la activacin de proteasas especficas de apoptosis, la presencia de citocromo C en citoplasma y la presencia de miembros de la familia de protenas Bcl-2 que pueden tener actividad apopttica o contrariamente impedirn la apoptosis.a) Caspasas o la familia ICE:diferentes tipos de seales intermediarias convergen en la activacin de las caspasas (cysteine-containingaspartate-specific proteases), tambin llamadas protenas relacionadas a ICE (interleukin-1b-convertingenzyme). Estas son enzimas proteolticas que normalmente estn inactivas como precursores pro-caspasas, son ricas en cistena y cortan en aspartatos especficos. b) Citocromo c (cyto c):Esta protena es de las ms importantes en el proceso de transporte electrnico producido al interior de la mitocondria donde normalmente se encuentra. Cuando cyto c es secretado en el citoplasma se acopla a molculas adaptadoras como Apaf-1 (apoptosisactivatorfactor 1) que en presencia de ATP y dATP activa la procaspasa-9 quien a su turno cliva otras caspasas. El citocromo C puede ser liberado de las mitocondrias por radicales libres y por diferentes concentraciones de calcio o ceramida producto de la degradacin de la esfingomielina de membrana. La presencia de cyto c en citoplasma es una de las seales ms poderosas para desencadenar la apoptosis.c) La familia Bcl-2:Compuesta de varios miembros son protenas que sirven de reguladores positivos y negativos de la apoptosis una vez que se activa la maquinaria. Algunos aceleran el proceso (proapopttico) como Bax y Bik, otros hacen que se preserve la vida celular (antiapopttico) como Bcl-2 y Bcl-XL. Se cree que los proapotticos crean poros en la membrana mitocondrial y estorban la interaccin de procaspasas con protenas antiapoptticas. Por otro lado los antiapoptticos tratan de preservar la integridad de la mitocondria y taparan las fugas de material mitocondrial (incluyendo cyto c) al citoplasma. Tambin impediran la asociacin del adaptador Apaf-1 con procaspasa-9 inhibiendo de esa manera su activacin.Degradacin: En la apoptosis se produce una serie de alteraciones celulares como condensacin del ncleo y luego fragmentacin de su cromatina (material nuclear (ADN + protenas a nivel microscpico) y del propio ADN (a nivel molecular). Algunas caspasas corriente abajo en la cascada van a degradar protenas como actina, involucradas en la forma celular, otras digieren un complejo proteico que normalmente retiene una endonucleasa, que una vez liberada empieza a cortar el DNA de la cromatina nuclear. Hay igualmente la destruccin de la protena PARP (poly-ADP ribose polymerase) involucrada en la reparacin e integridad del ADN y su clivaje era usado hasta hace poco como un signo de apoptosis.

IV. CONCLUSIONES Los estudios de reacciones Ag-Ab permiten conocer la presencia y especificidad de un Anticuerpo por un Antgeno especifico o no especifico. La eficiencia de la interaccin Ag Ab est sujeta a variables como pH, temperatura, tiempo de incubacin, fuerza inica, estructura antignica, cantidad de anticuerpo. No todas las personas reaccionan a un anticuerpo de la misma forma. Se seala al grupo O+ (donante universal), como el grupo sanguneo ms frecuente (todos los pacientes de la muestra lo presentaron). Las tcnicas de enzimainmunoensayo tal es el caso como el ELISA indirecto es un mtodo de gran versatilidad, ya que es susceptible a ser modificado, dando origen a diversos tipos y variantes de inmunoensayo, adems es bastante utilizada en inmunolgica con el cual se puede llegar a dar diagnsticos microorganismo presentes en el organismo, por medio de los anfgenos. La tcnica de citometra de flujo nos permite mediante valores de referencia (cantidad de linfocitos CD4, CD8, CD3, ratio CD4/CD8) poder elaborar un diagnstico de la respuesta inmune del paciente en evaluacin. Sin embargo, estos valores de referencia normales pueden variar entre poblacin en base a la edad, sexo y raza.

V. ANEXOS

Tabla 5. Variacin de los Valores Referenciales. Influencia de la Edad. Marleke, W. et Al .J Pediatr 1997;130:388-93

Tabla 6. Aglutinacin Antgeno D (Rh)

V. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

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