Diagnostic Laboratory on Hepatobiliary Diseasedr. Yurniah Tanzil, M.Kes,Sp.PKBanjarmasin, 17 Agustus 2014

OUTLINEHepatitis BPemeriksaan Laboratorium dan ManfaatnyaPemeriksaan Serologis Pemeriksaan Molekular KESIMPULAN*

Penanda Infeksi Hepatitis B SEROLOGIVIROLOGIBIOKIMIAHISTOLOGI

Biokimia : AST & ALT; GGT & ALP; Albumin; PTSerologi : Antibodi : Anti HBc, Anti HBc IgM, Anti HBe, Anti HBsAntigen : HBsAg, HBeAgVirologi : HBV DNA *Penanda Infeksi Hepatitis B

Pemeriksaan serologi untuk Diagnosis infeksi HBV3 penanda HBV tersebut dapat membantu diagnosis infeksi HBV dan melihat status imunitas sejak tahun 1980an.Gerlich, 2013PANEL UJI SARING HEPATITIS B HBsAgAnti-HBsAnti-HBc

Prognostic or Monitoring TestsKrajden, 2005

Menilai responder dan relapserPrediksi HBsAg loss/ sustained virological response (SVR)Berkorelasi dengan cccDNA & HBV DNA intrahepatikMengetahui risiko kanker hepatoselularIdentifikasi true inactive carrier

HBsAg Kuantitatif

Goal utama terapi antivirus untuk Hepatitis B KronikGoal : Menurunkan replikasi HBV dan menginduksi terjadinya remisi aktivitas penyakit hatiTujuan : memperlambat atau mencegah komplikasiStrategi :Membuat hepatitis B kronik berada pada fase inactive HBV carrierSupresi HBV DNA sampai tidak terdeteksiMelalui : Pengobatan (Immunomodulator dan atau anti virus)APASL, 2012

Pemeriksaan Molekular - HBV DNA Manfaat pemeriksaan :Penentuan kapan memulai terapiPemantauan respon/ efikasi terapi Pemantauan setelah terapi dihentikanPertimbangan untuk menghentikan terapi (nucs)Penilaian risiko komplikasi sirosis atau HCC (APASL, 2012)*

HBV DNA digunakan dalam semua guidelines untuk mengoptimasi terapi antivirus.

HBV DNA digunakan dalam semua guidelines untuk mengoptimasi terapi antivirus.

HBV DNA digunakan dalam semua guidelines untuk mengoptimasi terapi antivirus.

*

*Real Time PCR quantification assaysReal-Time (Quantitative) PCR = Quantitative real-time PCR (q-PCR/Q-PCR) atau kinetic PCR.

Q-PCR mengamplifikasi dan (dalam waktu yang sama) mengkuantitasi suatu molekul DNA target.

Fitur Kunci: DNA diamplifikasi dan dikuantitasi secara real time pada setiap siklus amplifikasi.

Tujuan dasar Real-Time PCR adalah membedakan dan mengukur sekuens asam nukleat spesifik dalam sampel secara presisi meskipun hanya dalam kuantitas yang sangat sedikit.

Area Deteksi Real Time PCRArea Deteksi PCR KonvensionalReal Time PCR vs PCR Konvensional

Keunggulan dari Real Time PCREkstraksi Otomatis presisi tinggi and meminimalkan kontaminasiReal Time PCR : Deteksi pada fase eksponensial presisi tinggiAmplifikasi dan deteksi terjadi bersamaan dalam satu tabung PCR lebih cepat, lebih efisien dan meminimalkan kontaminasiLimit deteksi/sensitivitas analitik lebih rendah dan rentang linearitas yang lebih lebar dibandingkan dengan PCR konvensional. Meminimalkan keperluan mendilusi sampel dengan titer tinggi. Diagnosis & pemantauan terapi dapat dilakukan dengan satu jenis tes saja.

Rentang Linearitas yang jauh lebih baik dalam penentuan muatan virus HBVHasil Pemeriksaan HBV DNA

Titer ResultInterpretationTarget not detectedVirus tidak terdeteksi1,7.108 IU/mL

SPESIFIKASIHBV DNAReal Time PCRPCR KonvensionalMetode DeteksiFluoresensEIALimit Deteksi20 IU/ml60 IU/ml (300 kopi/ml)Batas Linearitas20-170.000.000 IU/ml60-38.000 IU/ml (300-20.000 kopi/ml)

Target amplifikasiCoverage genotype A-HDapat mengamplifikasi precore mutantLower sample volume input

Disamping keunggulan lain,adanya Amp Erase utk mencegah carry over contaminationfully automated dan closed systemKeunggulan dari HBV DNA Real Time PCR di Laboratorium Klinik Prodia

LAB. DIAGNOSTIK MOLEKULARRuang I :Preparasi RNARuang II :Preparasi DNARuang III :Amplifikasi dan Deteksi Manual / SemiotomatisRuang IV :Amplifikasi dan Deteksi OtomatisDirancang dengan sistem kerja satu arah, untuk mencegah terjadinya kontaminasi

LAB. DIAGNOSTIK MOLEKULAR

Tiap ruang dilengkapi ruangan buffer yang berguna untuk mengatur perbedaan tekanan ruang lab. dan di luar lab

Udara kotor akan masuk ke ruangan buffer & diresirkulasi setelah melalui penyaringan dengan HEPA filter

R. Preparasi : terdapat BSC untuk ekstraksi DNA/RNA sehingga mencegah terjadinya kontaminasi & menjamin keamanan/keselamatan bagi yang mengerjakan

SummaryPemeriksaan Lab. untuk Infeksi HBV :HBsAgAnti HBsAnti HBcAnti HBc IgMHBeAg Anti HBeHBsAg kuantitatifHBV DNA Real Time PCR

SummaryFollow-up menggunakan kuantifikasi real-time PCR sangat direkomendasikan karena sensitivitas, spesifisitas, keakuratan dan rentang dinamik yang luas. Pemeriksaan HBV DNA Real Time PCR di Lab Klinik Prodia memiliki rentang pemeriksaan yang luas, dapat mendeteksi semua genotipe HBV dan precore mutant.Hasil pemeriksaan HBV DNA Real Time PCR bersifat akurat dengan presisi yang baik sehingga membantu dalam proses pengambilan keputusan terapi, pemantauan efikasi terapi, serta keputusan untuk stop terapi.

OUTLINEHepatitis CPemeriksaan Laboratorium dan ManfaatnyaPemeriksaan Serologis Pemeriksaan Molekular KESIMPULAN*

Pemeriksaan Laboratorium pada Hepatitis C*Pemeriksaan serologis - Anti HCVPemeriksaan molekular- HCV-RNA- HCV genotyping- SNP IL28B (new)

Anti HCVPemeriksaan antibodi spesifik utk mengetahui paparan HCVMetode yang digunakan Enzyme immunoassay (EIA) atau Chemiluminescent immunoassay (CIA) generasi ke-3 atau ke-4 yg mendapat approval (APASL, 2012)Terdeteksi 7-8 minggu setelah terinfeksi HCVDapat ditemukan pada infeksi akut maupun kronisBiasanya menetap, hanya 6-10% yang akhirnya negatif *

Serologic Pattern of Acute HCV Infection With Progression to Chronic Infection

HCV RNA (APASL, 2012)Manfaat pemeriksaan :- Menentukan infeksi akut atau kronik- Menilai sampel-sampel anti HCV indeterminate- Memantau dan menilai respons thd terapi antiviral- Memberikan informasi mengenai durasi pengobatan yang optimal (biaya efektif dan efek samping minimal)- Indikator prognostik outcome terapi- Diagnosis pd pasien high risk atau pd pasien yg kemungkinan memiliki anti HCV negatif atau indeterminate

*

Pemeriksaan Virus Hepatitis CIndikasi pemeriksaan HCV RNAKonfirmasi infeksi HCVALT serum normal secara menetapTidak ada faktor risikoAnti HCV positifAntinuclear antibodies (ANA) positifSebelum memulai terapiRespon terapiPrediksi respon terapi sebelum dan selama terapi Konfirmasi respon setelah terapi selesai

HCV RNA Real Time PCRDirekomendasikan menggunakan metode Real Time PCR (RT-PCR)Kelebihan Metode RT-PCR : - Rentang pengukuran yang lebar - Sensitif dan spesifik - Ketelitian tinggi - Reproducible

*APASL, 2012

HCV RNA Real Time PCR

Metode:Real Time PCRSampel:Serum, Plasma EDTAStabilitas Sampel:2-8o C : 3 hari15-30 o C : 24 jam -70 o C : lebih lamaNilai rujukan:Virus tidak terdeteksiJadwal Kerja:1 minggu 1x (PRN)

*Interpretasi Pemeriksaan HCV(Ghany et.al, Hepatology 2009;49(4):1335-1374)

Metode Baru HCV RNA Real Time PCR*

SPESIFIKASIHCV RNAReal Time PCR (now)Real Time PCRPCR KonvensionalMetode DeteksiFluoresensFluoresensEIALimit Deteksi12 IU/mL12 IU/ml60 IU/ml (300 kopi/ml)Batas Linearitas12 1.108 IU/mL43-69.000.000 IU/ml60-38.000 IU/ml (300-20.000 kopi/ml)

HCV - Genotipe

HCV genotypingManfaat pemeriksaan :Membantu studi epidemiologiMenentukan durasi pengobatan dan menilai efikasi terapi antiviral

Pemeriksaan menggunakan metode LiPA (Line Probe Assay) dengan target 5UTR dan core specific oligonucleotides (daerah yg conserved)*APASL, 2012

*HCV-Genotyping v.2

Metode:Reverse HybridizationSampel:Serum/ plasmaStabilitas Sampel:2-8o C : 3 hari(-70)o C : 2 bulanNilai rujukan:-Jadwal Kerja:1 minggu 1x (PRN)

*Penentuan genotipe dengan akurat sangat penting secara klinis untuk memprediksi respon terapi, serta menentukan lama terapi antivirus keberhasilan terapiGenotipe 1 dan 4 lebih resisten terhadap terapi dengan pegylated alpha interferon dan ribavirin dibandingkan dengan genotipe 2 dan 3.

HCV-GenotypingSimmonds, Hepatology 2005; 42(4):962-974

Pasien hepatitis C genotipe 1b menunjukkan tingkat kekambuhan yang tinggi dan progresi ke arah hepatitis kronis aktif dan sirosis dibandingkan pasien dengan genotipe lainPerbedaan genotipe 6c 6i dan genotipe 1 ditunjukkan dalam hal sustained virological response (SVR) karena genotipe 6 memiliki SVR yang lebih baik dibandingkan genotipe 1

HCV-GenotypingAm J Clin Pathol 2007;128:300-304

Pemeriksaan Lab. untuk Infeksi HCV :Anti HCV HCV RNAHCV Genotyping

Real Time PCR :Rentang kuantifikasi yang luas, sensitif, spesifik, memiliki presisi tinggi dan bersifat reproducible.Pemeriksaan HCV RNA lebih cepat dan efisienMenggantikan pemeriksaan HCV RNA (konvensional PCR) baik kuantitatif maupun kualitatifSummary

Pemeriksaan HCV RNA (Viral load), HCV Genotipe bermanfaat pada individualized HCV therapy. Response-guided therapy berdasarkan respons virologis selama pengobatan dapat memberikan informasi mengenai durasi pengobatan yang optimal dan membantu memaksimalkan efektivitas biaya dan juga meminimalkan efek samping. Summary

Beberapa Pemeriksaan Laboratorium Untuk Faal HatiBeberapa pemeriksaan Untuk Faal Hati :

1. GOT / AST: lebih sensitif untuk deteksi kerusakan hati daripada untuk deteksi sumbatan saluran empedu2. GPT / ALT : meningkat pada kerusakan hati, namun enzim ini juga dihasilkan oleh sel lain seperti sel jantung, sel otot skelset, pankreas, tidak spesifik3. Gamma GT : untuk memastikan bahwa peningkatan ALP bukan akibat gangguan pada tulang, karena GGT tidak ditemukan di tulang, biasanya dilakukan bersamaan dengan pemeriksaan ALP4. Fosfatase Alkali : ketika saluran empedu terganggu maka ALP dalam darah akan meningkat. ALP meningkat pada kolestatik, peradangan hati, penyumbatan bilier, sumbatan batu sekunder.

5. CHE6. Bilirubin Total 7.Bilirubin Direk8. Protein Total9. Albumin10. Pre Albumin11.Protein Elektroforesis : pemeriksaan ini bermanfaat untuk skrining maupun evaluasi : hepatitis, sirosis, inflamasi kronik

Hepatitis adalah peradangan hati. Peradangan hati ini bisa disebabkan oleh berbagai hal seperti toksin/racun, obat2an (metabolisme obat di hati), penyakit hati, alkohol (Alcohol is one of the toxic substances filtered by the liver. The liver breaks it down to a form that can be eliminated by the body. Excessive alcohol intake causes the liver to become fatty and blocks the delivery of oxygen enriched blood to the liver. When there is too much alcohol for the liver to process, a chemical imbalance occurs. Balance can be restored when the drinking stops. Usually the liver is able to repair itself when mildly or moderately damaged, http://www.ehow.com/how-does_4571321_why-does-alcohol-damage-liver.html), infeksi bakteri (liver abcess : Bacteroides,Enterococcus,Escherichia coli,Klebsiella,Staphylococcus,Streptococcus, http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/000261.htm) dan virus.

Terdapat banyak cara untuk mengevaluasi hepatitis B pada pasien menggunakan metode pemeriksaan serologi, virologi, biokimia dan histologi.HBeAg dapat menggambarkan aktivitas replikasi HBV dam tidak adanya kontrol imun host. Akan tetapi penanda yang lebih bisa diandalkan untuk menggambarkan aktivitas infeksi (bukan peradangan dan penyakit) adalah level viremia. Secara normal, gold standard untuk mengukur jumlah virus infeksius adalah replikasi dalam sel yang rentan. Akan tetapi dibutuhkan proses inokulasi 100.000 atau lebih partikel virus untuk menegakkan infeksi di samping beberapa kendala yang lain.

Pemeriksaan pengganti yang sensitif dan kuantitatif adalah pemeriksaan HBV DNA dalam plasma atau serum. Mulai dari endogenous DNA polymerase reaction, nucleic acid hybridization (dot blot) menggunakan cloned HBV DNA sebagai labeled probes, PCR kualitatif, sampai real time PCR yang bisa memberikan performa yang bagus dengan limit deteksi mendekati 1 molekul DNA / reaction mix dam rentang dinamis yang luas sampai 10^7 atau lebih. Yang menjadi masalah adalah hasil kuantitatif dapat diperoleh dengan berbagai kit komersial dan itu menjadi masalah. Maka dari itu pada tahun 1991, WHO mempekenalkan standar internasional untuk HBV DNA yaitu IU. Jumlah molekul per IU tergantung dari pemeriksaannya akan tetapi biasanya 5 molekul berkaitan dengan 1IUPemeriksaan HCV RNA mengukur muatan partikel virus

Pasien imunosupresi contohnya pasien dialisa atau pasien HIV

Pemeriksaan HCV RNA (Viral load) merupakan indikator prognostik outcome terapi. Pemantauan viral load selama terapi telah terbukti bermanfaat pada individualized HCV therapy. Response-guided therapy berdasarkan respons virologis selama pengobatan dapat memberikan informasi mengenai durasi pengobatan yang optimal dan membantu memaksimalkan efektivitas biaya dan juga meminimalkan efek samping. Penelitian terbaru menunjukkan bahwa level HCV RNA setelah terapi peginterferon plus ribavirin selama 4 minggu dapat memprediksi tidak hanya outcome terapi tetapi juga perkembangan resistensi obat dengan penambahan inhibitor protease berikutnya pada treatment regimen.

*This highly sensitive test offers Roche's fully automated real-time PCR technology to achieve a broad dynamic range for the quantitative detection of hepatitis B virus (HBV) DNA in patient plasma and serum. The COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 can be used to measure HBV DNA levels at baseline and during treatment to aid in assessing response to treatment. The Test can detect genotypes A-H and pre-core mutants. It offers a broader dynamic range than previous generation tests, from as low as 20 IU/mL to as high as 1.7E+08 IU/mL, enabling physicians to improve viral load monitoring. The assay offers both serum and plasma specimen type and uses only a 650 l sample processing volume.Limit deteksi atau batas deteksi atau limit of detection (LOD) berbeda dengan rentang linearitas.Limit deteksi/batas deteksi/LOD adalah konsentrasi terendah dari analit yang dapat diukur oleh alat , yang dapat dibedakan dari pengukuran blanko sampel/limit of blank (LOB). LOB sendiri adalah konsentrasi tertinggi yang ditemukan saat pengukuran blanko sample (tanpa analit) yang dilakukan beberapa kali.Sedangkan rentang linearitas adalah rentang kadar analit dalam sampel dimana hasil pemeriksaan suatu metode dapat digunakan tanpa modifikasi misalnya untuk sampel yang kadarnya sangat tinggi karena alat /metode memilili rentang linearitas yang lebar maka sampel tersebut tidak membutuhkan pengenceran (hasil dapat dikeluarkan tanpa modifikasi) dan sampel dengan kadar analit yang sangat rendah masih bisa dideteksi dengan baik Antibodi HCV deteksi awal infeksi HCV*Antibodi dapat tidak terdeteksi pada window period (bbrp minggu infeksi awal), pasien yg mengalami imunosupresi, pada pasien dimana resolusi infeksi HCV terjadi lebih dari beberapa tahun.

Di HPsL akan diberikan catatan : disarankan utk mengulang pemeriksaan 1 bulan kemudian, utk tujuan konfirmasi dapat dilakukan px HCV-RNA (real time PCR) , utk hasil borderline misal utk AxsYM (S/CO 1-5) atau utk ADVIA 0.8 5 (baik hasil pos maupun borderline), Architect (tdk ada hasil borderline) krn hasil S/CO 1-5 yang dikonfirmasi ke ADVIA memberikan hasil >1 makan hasil yang dilaporkan adalah hasil positif Architect.

Sebenarnya di kit insert Architect dan AxSYm tdk ada hasil borderline*HCV RNA dapat dideteksi di dalam serum 1-2 minggu setelah paparan, meningkat secara progresif dan puncaknya sebelum perkembangan gejala. Infeksi akut terkait dengan fluktuasi level HCV RNA dan level HCV RNA yang rendah.

*Urutan pemeriksaan yang direkomendasikan utk identifikasi infeksi HCV yang sdg berlangsung menurut MMWR 2013 = Morbidity and Mortality weekly Report Current infection bisa akut atau kronik tgt clinical context*Pemeriksaan HCV RNA mengukur muatan partikel virusPasien imunosupresi contohnya pasien dialisa atau pasien HIVPemeriksaan HCV RNA (Viral load) merupakan indikator prognostik outcome terapi. Pemantauan viral load selama terapi telah terbukti bermanfaat pada individualized HCV therapy. Response-guided therapy berdasarkan respons virologis selama pengobatan dapat memberikan informasi mengenai durasi pengobatan yang optimal dan membantu memaksimalkan efektivitas biaya dan juga meminimalkan efek samping. Penelitian terbaru menunjukkan bahwa level HCV RNA setelah terapi peginterferon plus ribavirin selama 4 minggu dapat memprediksi tidak hanya outcome terapi tetapi juga perkembangan resistensi obat dengan penambahan inhibitor protease berikutnya pada treatment regimen.

*The first indication for using HCV RNA assays is to confirm HCV infection. This is particularly helpful for ruling out false positives in antibody-positive patients with persistently normal serum ALT and a lack of risk factors and in persons with antinuclear antibodies and for making certain the virus is present before initiating treatment. HCV RNA assays are also used to evaluate the effectiveness of treatment, to predict the likelihood of response before initiating therapy, and to confirm response (virus negativity) after therapy is completed.

Terdapat 6 genotipe :1, 2, 3 secara luas tersebar di Asia PacificGenotipe 4 (middle East) dan 6 (Southeast) Middle East dan Southeast region, beberapa subtipe genotip 6 banyak ditemukan di Asia Tenggara

Outcome penderita hepatitis C kronik yang lebih baik dapat dicapai dengan menggunakan pemeriksaan genotipe dan response-guided therapy oleh penentuan genotipe virus dan respons virologis selama pengobatan.

HCV genotypeBest pretreatment predictor of responseDetermines duration of therapyAll patients should have genotype determined prior to initiating therapy

Pasien dengan genotip HCV 2 atau 3 memiliki tingkat sustained virological response (SVR-Alphadidefinisikan sebagai tidak adanya RNA HCV pada minggu ke 24 setelah akhir pengobatan) yang relatif tinggi (70 sampai 80 %) dengan 24 minggu pengobatan, sedangkan mereka yang terinfeksi dengan genotip 1 memiliki tingkat SVR yang jauh lebih rendah meskipun sudah 48 minggu pengobatan.

*Banyak pemeriksaan baru yang dikembangkan di bidang hepatitis C salah satunya adalah IL28B - rs12979860, untuk meningkatkan pengelolaan hepatitis C kronik sehingga outcome pasien menjadi lebih baik Peran IL28B genotyping masih relevan dalam era DAA karena DAA memiliki harga yang lebih mahal dan risiko tinggi anemia serta efek samping lainnya. IL28B dapat dimanfaatkan untuk menentukan derajat pencapaian SVR pada pemberian terapi DAA. Pemeriksaan HCV RNA dengan metode real-time PCR memiliki rentang kuantifikasi yang luas, sensitif, spesifik, memiliki presisi tinggi dan bersifat reproducible.