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UNIVERSIDAD DE GRANADA
FACULTAD DE FARMACIA
DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGIA
EFECTO ANTIINFLAMATORIO INTESTINAL DE
PROBIÓTICOS EN EL MODELO DE COLITIS
EXPERIMENTAL INDUCIDA POR ÁCIDO
TRINITROBENCENOSULFÓNICO EN RATAS
TESIS DOCTORAL
Laura Perán Montero
2007
Editor: Editorial de la Universidad de GranadaAutor: Laura Perán MonteroD.L.: Gr. 866 - 2007ISBN: 978-84-338-4298-5
UNIVERSIDAD DE GRANADA
FACULTAD DE FARMACIA
DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGIA
EFECTO ANTIINFLAMATORIO INTESTINAL DE
PROBIÓTICOS EN EL MODELO DE COLITIS
EXPERIMENTAL INDUCIDA POR ÁCIDO
TRINITROBENCENOSULFÓNICO EN RATAS
Tesis doctoral para aspirar al Grado de Doctor en Farmacia que
presenta la Licenciada Dña. Laura Perán Montero
2007
Departamento de Farmacología
D. Antonio Zarzuelo Zurita, Profesor Catedrático y Director del Departamento de
Farmacología de la Universidad de Granada,
Certifica: Que el trabajo de Tesis Doctoral titulado: “Efecto antiinflamatorio intestinal de
probióticos en el modelo de colitis experimental inducido por ácido
trinitrobencenosulfónico en ratas” ha sido realizado por la Licenciada en Farmacia
Laura Perán Montero en los laboratorios de este departamento.
Y a los efectos legales se firma la siguiente constancia en Granada, a veintisiete de
Marzo de 2007.
Dr. Antonio Zarzuelo Zurita
Departamento de Farmacología
D. Antonio Zarzuelo Zurita, Profesor Catedrático, D. Julio Gálvez Peralta, Profesor
Titular, del Departamento de Farmacología de la Universidad de Granada, y D. Jordi Xaus Pey,
Director del Departamento de Biomedicina de Puleva Biotech, Granada, como directores
Certifican: Que la Tesis Doctoral titulada: “Efecto antiinflamatorio intestinal de probióticos en el
modelo de colitis experimental inducido por ácido trinitrobencenosulfónico en ratas”
presentada por la Licenciada en Farmacia Laura Perán Montero, ha sido llevada a
cabo bajo su dirección y reúne todos y cada uno de los requisitos necesarios para ser
defendida y optar al grado de Doctor.
Y a los efectos legales se firma la siguiente constancia en Granada, a veintisiete de
Marzo de 2007.
Dr. Antonio Zarzuelo Zurita Dr. Julio Gálvez Peralta
Dr. Jordi Xaus Pey
ÍNDICE
Índice
I
Introducción…………………………………………………………………...…………………..…1
1. Enfermedad inflamatoria intestinal…………………...……………………………………...…......3
1.1. Aspectos generales……………………………………………………………………...3
1.2. Epidemiología……...…………………………………………………..…………...…..5
1.3. Etiología…………………………………………………………………………...……6
1.3.1. Factores genéticos…………………………………………………………...7
1.3.2. Factores ambientales……………………………………………….………..9
1.3.2.1. Tabaco……………………………………………………………………10
1.3.2.2. Factores dietéticos……………..…………………………………………11
1.3.2.3. Fármacos…………………………………………………...…………….12
1.3.2.4. Estrés………………………………………………...…………………...13
1.3.2.5. Factores microbianos……….………………….…………………………13
Agentes infecciosos específicos…………………………………………13
Flora intestinal comensal…………………...……………………………14
2. Probióticos………………………………………………………………………..……………….17
2.1. Características y concepto de probiótico………………………………………...….....17
2.2. Efectos de los probióticos en la enfermedad inflamatoria intestinal en humanos…......20
2.2.1. Colitis ulcerosa………………………………………………….……….....20
2.2.2. Enfermedad de Crohn………………….………………………...…………24
2.2.3. Pouchitis crónica……………………………………………………...……27
2.3. Mecanismo de acción del efecto antiinflamatorio intestinal…………………………..29
2.3.1. Competición con bacterias patógenas…………………………….………..30
2.3.2. Mejora de la función de barrera intestinal………………………………….30
2.3.3. Producción de nutrientes importantes para la función intestinal…………...31
2.3.4. Modulación de la respuesta inmune de la mucosa del hospedador………...31
Objetivos…………………………………………….……………………………………………....33
Índice
II
Material y métodos………………………………………………………………………………....37
1. Ensayos in vivo…………………………………………………………………..………………..39
1.1. Preparación del probiótico……………………………………………………..………39
1.2. Animales de experimentación…………………………………………………………39
1.3. Inducción de la colitis experimental por TNBS y administración del probiótico…......40
2. Valoración del proceso inflamatorio intestinal……………………………..……………………..41
2.1. Determinación de la actividad mieloperoxidasa colónica……………………..………43
2.2. Determinación del contenido colónico de glutation total……………………….……..44
2.3. Determinación de los niveles colónicos de LTB4, TNF α, IL-1β e IL-10……..……...45
2.4. Determinación de la expresión de iNOS y COX-2 en tejido colónico…………...……45
2.5. Determinación del contenido de proteínas: método del acido bicinchonínico…...……46
2.6. Estudio histológico…………………………………………………………………….47
2.7. Determinación del pH y humedad del contenido colónico……………………………47
3. Estudios microbiológicos…………………………………………………………..……………...48
4. Cuantificación de AGCC en el contenido colónico por cromatografía de gases………………….49
5. Ensayos in vitro………………………………………………….………………………………...50
5.1. Determinación de la producción de glutation…………………………………….……50
5.2. Determinación de la producción de citocinas…………………………………….........50
6. Estudio estadístico………………………………………………………………………………...51
Resultados…………………………………………………...………………………………………53
1. Estudio comparativo de los efectos preventivos ejercidos por tres probióticos: Bifidobacterium
lactis, Lactobacillus acidophilus y Lactobacillus casei en el modelo de colitis experimental por
TNBS en ratas (RESUMEN)………………………...……………………………………………....55
A comparative study of the preventative effects exerted by three probiotics, Bifidobacterium lactis,
Lactobacillus casei and Lactobacillus acidophilus, in the TNBS model of rat
colitis…………………………………………………………………………………………………59
Índice
III
2. Efectos preventivos del probiótico Lactobacillus salivarius ssp. salivarius CECT 5713 en el
modelo de colitis experimental por TNBS en rata (RESUMEN)…………..………………………..69
Preventative effects of a probiotic, Lactobacillus salivarius ssp. Salivarius, in the TNBS model of rat
colitis……………………………………………………………………………………………........73
3. Efectos preventivos del probiótico Lactobacillus fermentum, capaz de liberar glutation en el
modelo de colitis experimental por TNBS en ratas (RESUMEN)………..………………………....81
Lactobacillus fermentum, a probiotic capable to release glutathione, prevents colonic inflammation
in the TNBS model of rat colitis……………………………………………………………………..85
4. Estudio comparativo de los efectos preventivos de dos probióticos Lactobacillus fermentum y
Lactobacillus reuteri en el modelo de colitis experimental por TNBS en ratas (RESUMEN) ……...95
A comparative study of the preventative effects exerted by two probiotics, Lactobacillus reuteri and
Lactobacillus fermentum, in the trinitrobenzenesulfonic acid model of rat
colitis…………………………………………………………………………………………………99
Discusión……………………………………………………………………….…………………..107
1.- Ensayo de los probióticos Bifidobacterium lactis, Lactobacillus acidophilus y Lactobacillus casei
en el modelo de colitis experimental por el acido trinitrobencenosulfónico (TNBS) en ratas……..115
2.- Ensayo de los probióticos Lactobacillus salivarius ssp. salivarius y Lactobacillus fermentum en
el modelo de colitis experimental por el acido trinitrobencenosulfónico (TNBS) en ratas………...120
3.- Estudio comparativo de los efectos preventivos ejercidos por los dos probióticos: Lactobacillus
fermentum y Lactobacillus reuteri en el modelo de colitis experimental por TNBS en
ratas…………………………………………………………………………………………………124
Conclusiones……………………………………………………………………….………………127
Bibliografía……………………………………………………………….………………………..131
Índice
IV
Anexos……………………………………………………………………………………………...165
Abreviaturas………………………………………………………………………………………...167
Índice de tablas……………………………………………………………………………………..169
Índice de figuras…………………………………………………………………………………….171
INTRODUCCIÓN
Introducción
3
1. ENFERMEDAD INFLAMATORIA CRÓNICA DEL INTESTINO.
1.1. ASPECTOS GENERALES.
La enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU) son enfermedades inflamatorias
intestinales (EII) de etiología desconocida y de curso crónico y recurrente, con períodos de
exacerbación de los síntomas seguidos de intervalos más o menos prolongados de remisión de los
mismos.
Aunque se ha progresado en la caracterización de la patogenia de estas enfermedades, su
causa primaria sigue siendo desconocida. La hipótesis genérica actual es que la EII engloba a un
grupo heterogéneo de enfermedades que tienen una manifestación final común: la presencia de
inflamación, y que varios factores genéticos, ambientales e inmunológicos están implicados en la
fisiopatología de estas enfermedades (Podolsky, 2002).
Tanto la EC como la CU se caracterizan por tratarse de trastornos inflamatorios del
intestino pero presentan diferencias en cuanto a lo que anatomía patológica y manifestaciones
clínicas se refiere (Tabla 1).
La EC puede afectar a cualquier segmento del tracto gastrointestinal, desde la boca hasta el
ano, si bien es más frecuente en la región ileocecal (Gassull y Cabre, 1994). La inflamación, de
carácter transmural, se propaga a través de toda la pared intestinal, favoreciendo la aparición de
perforaciones, estenosis y fístulas con órganos adyacentes (Gasche, 2000; Levine, 1994). Las
lesiones pueden ser focales (úlceras aftoides), segmentarias o difusas (Levine, 1994) y con
frecuencia afecta de forma discontinua y simultánea a distintas zonas del aparato digestivo,
separadas entre sí por segmentos intactos.
En contraste con la EC, la afectación de la CU se limita al colon, fundamentalmente a la
región distal (recto/ano), y se extiende progresivamente en dirección proximal. La inflamación afecta
predominantemente a las capas superficiales de la pared intestinal, normalmente mucosa y
submucosa, y se caracteriza por infiltración de neutrófilos, eosinófilos y células plasmáticas, con
Introducción
4
formación frecuente de abscesos de las criptas (Obrador y Riera, 1994; Stenson y McDermott,
1991), consistentes en un acúmulo de neutrófilos adyacentes a las criptas, la necrosis del epitelio, y
la presencia de edema y hemorragia. La mucosa tiene un aspecto granuloso, consecuencia de la
irregularidad de la inflamación, y con frecuencia aparecen pólipos inflamatorios (Geller, 1994). La
enfermedad suele manifestarse con diarrea, generalmente sanguinolenta, acompañada o no de
síntomas sistémicos: fiebre, malestar general, pérdida de peso, etc. (Sutherland, 1994).
Tabla 1. Características diferenciales entre la EC y la CU.
Enfermedad de Crohn (EC)
Desde la boca hasta el ano
Afectación discontinua
Transmural (afecta a todas las capas del intestino)
Diarrea pastosa
Fístulas y estenosis intestinal frecuentes
Anatomía patológica:
Granulomas
Agregados linfoides
Fibrosis
Colitis ulcerosa (CU)
Recto +/− colon
Afectación continua
Implica sólo la mucosa
Diarrea líquida con sangre, moco y pus
Fístulas y estenosis intestinal infrecuentes
Anatomía patológica:
Abscesos de criptas
Depleción de mucina
Distorsión glandular
En un 10-15% de los pacientes con EII es imposible poder establecer un diagnóstico
definitivo de CU o EC de colon. La presencia de granulomas constituye el único carácter
patognomónico de la EC frente a la CU, pero tan sólo se detectan en un 25% de las biopsias y no son
específicos de ésta, ya que se han observado también en enfermedades como la tuberculosis colónica
y la esquistosomiasis (Geboes, 1994).
En ambas entidades patológicas pueden aparecer complicaciones de tipo autoinmune que
afecten a órganos extraintestinales como las articulaciones, el ojo o la piel y que se presentan hasta
Introducción
5
en un 40% de los casos (Lichtman y Balfour Sartor, 1994). Entre las complicaciones no autoinmunes
cabe destacar la aparición de episodios tromboembólicos, anemia y osteoporosis (Gasche, 2000;
Szulc y Meunier, 2001). Además, el riesgo de cáncer se incrementa de modo acumulativo en los
pacientes de EII, siendo factores predisponentes la duración de la enfermedad, extensión de la
misma, complicaciones extraintestinales y aparición de la enfermedad a edades tempranas; el riesgo
de cáncer es superior en pacientes de CU que en EC (Pohl et al., 2000).
1.2. EPIDEMIOLOGÍA.
A pesar de que la incidencia y prevalencia de la EC y la CU comienzan a estabilizarse en
áreas de alta incidencia, son 2,2 y 1,4 millones de personas, en Europa y Estados Unidos
respectivamente, los que sufren estas enfermedades (Loftus, 2004).
En general, las tasas más altas de incidencia y prevalencia tanto para la EC como la CU se
han descrito en el norte de Europa, Reino Unido y Norteamérica, que son regiones geográficas
asociadas históricamente con la EII. Sin embargo, existe una incidencia y prevalencia crecientes en
otras áreas como el sur y centro de Europa, Asia, África y Latinoamérica, indicando que la EII es un
proceso dinámico (Loftus, 2004).
La frecuencia de la enfermedad se encuentra influenciada por una serie de factores
demográficos como son el género, la edad o las diferencias étnicas.
En la incidencia de la EII parece existir una leve diferencia entre géneros. En general, se
encuentra un ligero predominio de la EC en la mujer, aunque en ciertas áreas de baja incidencia es
más frecuente en el varón. Este predominio, especialmente entre mujeres en la adolescencia tardía y
la edad adulta temprana, sugiere que los factores hormonales pueden jugar un papel importante en la
expresión de la enfermedad. Por otra parte, si existe algún tipo de influencia del sexo en la CU,
parece ser que afecta al varón (Loftus et al., 2000).
Clásicamente se ha mostrado una distribución bimodal de la incidencia de la EII en cuanto
a la edad (es decir, un primer pico de incidencia aparece entre la segunda y tercera décadas de la
vida, seguido por un segundo pico menor en décadas posteriores). La EC y la CU normalmente son
diagnosticadas en la adolescencia tardía y la edad adulta temprana, aunque el diagnóstico puede
realizarse a todas las edades. Así, el pico de incidencia máximo para la EC se encuentra entre los 15-
Introducción
6
30 años, mientras que para la CU es, en general, de 5 a 10 años más tardío que el asociado a la EC
(Bjornsson y Johannsson, 2000; Loftus et al., 2000).
Teniendo en cuenta que hay que interpretar con mucha cautela los datos epidemiológicos de
que se dispone, parece claro que la EII es más frecuente en individuos de raza blanca. La EII es
inusual en los individuos de raza negra, así como en los hispanoamericanos y asiáticos, sin embargo
es previsible que con la progresiva culturización y adquisición de hábitos occidentales por parte de
estos grupos de población, las cifras de incidencia de EII se aproximen, en algunos casos, a las de los
individuos de raza blanca. Finalmente, numerosos estudios reflejan un aumento en el riesgo de
padecer EII en sujetos de etnia judía. La CU es tres veces y la EC hasta seis veces más frecuente en
judíos que en el resto de la población en sus mismas áreas (Roth et al., 1989).
1.3. ETIOLOGÍA.
La etiología de estas enfermedades continúa siendo desconocida, aunque se propone que se
trataría de una respuesta inmunitaria incontrolada frente a un estimulo no identificado en la
actualidad que se desarrolla en un individuo genéticamente predispuesto (Figura 1).
EII
GENETICOS AMBIENTALES INMUNOLOGICOS
TABACO DIETA
FARMACOS ESTILO DE VIDA
MICROORGANISMOS
Figura 1. Componentes implicados en la etiopatogénesis de la EII
Introducción
7
1.3.1. Factores genéticos.
Son muchas las evidencias de la contribución de los genes en la EII. Así, los familiares en
primer grado de individuos afectados por EII muestran un riesgo 25-50 y 10-20 veces mayor de
desarrollar EC y CU, respectivamente, comparados con la población general. Además, los parientes
afectados de una misma familia presentan proporciones de concordancia del 80% a edades similares
para el sitio específico de afectación, comportamiento y manifestaciones extraintestinales (Zheng et
al., 2003). Estudios realizados en gemelos muestran una concordancia de un 20-44% en univitelinos
y 3,8-6,5% en bivitelinos para la EC; el porcentaje de concordancia para la CU es de 6-16% y 3%,
respectivamente (Thompson et al., 1996).
Varios grupos de investigadores han identificado al menos 7 loci (inflammatory bowel
disease 1-7, IBD1-7) en los cromosomas que se relacionen con genes de susceptibilidad, centrándose
en las mutaciones de los genes NOD2/CARD15 (intracellular nucleotide oligomeration domain
2/caspase recruitment domain 15), del MHC-II (complejo mayor de histocompatibilidad-II), de
citocinas, de receptores de citocinas y de moléculas de adhesión (Duerr, 2003; Sartor, 2003; Zheng
et al., 2003) (Figura 2). Algunos loci han mostrado ser específicos para la CU (como IBD2) (Bonen
y Cho, 2003) o para EC (como IBD1) (Cho, 2001; 2003), mientras que otros confieren una
susceptibilidad común a ambas.
El gen NOD2/CARD15 se encuentra localizado en el cromosoma 16q12 (IBD1) (Hugot et
al., 1996), y tres de sus variantes confieren 15-20% de riesgo para la EC (Cho, 2001; Cho, 2003).
Además, la presencia de un alelo de riesgo NOD2 se asocia con el fenotipo fibrosante obstructivo de
la EC (Sartor, 2003), con la enfermedad ileal y con un debut temprano de la enfermedad (Cho, 2003;
Gasche et al., 2003).
Este gen se expresa principalmente en las células inmunitarias de la línea monocítica
(monocitos, macrófagos y células dendríticas), pero también, aunque en niveles bajos, en los
granulocitos y algunos linfocitos (Gutierrez et al., 2002; Ogura et al., 2001) tanto de la lámina
propia intestinal como de sangre periférica (Berrebi et al., 2003). Existen evidencias de su expresión,
en bajas cantidades, en células epiteliales, siendo fuertemente inducida por estímulos inflamatorios,
incluidos algunos componentes bacterianos (Berrebi et al., 2003, Rosenstiel et al., 2003). De hecho,
Introducción
8
su expresión epitelial es más marcada en las células de Paneth, células epiteliales intestinales con
funciones de defensa frente a patógenos entéricos (Lala et al., 2003).
La proteína NOD2/CARD15, es una proteína citosólica (Berrebi et al., 2003; Ogura et al.
2001) cuya activación por componentes bacterianos produce un cambio conformacional, haciendo
exponer ciertos dominios que se asociarían a proteínas quinasas específicas (Chamaillard et al.,
2003; Rosenstiel et al., 2003). Este complejo proteico, a su vez, activaría también al factor de
transcripción nuclear κB (nuclear factor κB, NFκB), factor que promueve la liberación de citocinas
proinflamatorias (Inohara et al., 1999; Inohara et al., 2002; Ogura et al., 2001).(Figura 2)
p50
p65 IκB
P
NUCLEO
IKKp50
p65 IκB
p50
p65
NOD2
CITOPLASMA
BACTERIAComponentebacteriano
Figura 2. Influencia de la proteína NOD2/CARD15 en la EII. Las bacterias o sus componentes
celulares penetran en macrófagos o células epiteliales y se unen a la proteína, que a su vez activa
al factor de transcripción NF-κB. p50/p65: forma activa del NF-κB; IκB: proteína inhibidora del
NF-κB; IKK: kinasa del IκB.
Introducción
9
Muy recientemente, han sido identificados dos nuevos genes asociados con la EC. El
primero de ellos se encuentra localizado en el cromosoma 5 y codifica para el transportador de
cationes orgánicos, OCTN, y sus mutaciones afectan a la capacidad de los transportadores para
bombear xenobióticos y aminoácidos a través de las membranas celulares (Peltekova et al., 2004).
En el cromosoma 10 se encuentra el segundo gen, el de un miembro de la familia de la guanilato
quinasa, DLG5, cuya mutación dificulta la capacidad de DLG5 para mantener la polaridad en la
célula epitelial (Stoll et al., 2004). Ambos genes pueden ser importantes en la permeabilidad
epitelial, y un fallo en su función podría provocar una exposición inapropiada del sistema
inmunitario de la mucosa a productos bacterianos.
1.3.2. Factores ambientales.
Es evidente la influencia de factores ambientales en el desarrollo de la EII dado el gran
incremento de la incidencia, tanto de la EC como de la CU, durante la segunda mitad del siglo XX
como consecuencia de profundos cambios en el estilo de vida en los países desarrollados. Este hecho
se ve reforzado por el aumento de estas patologías en los países en vías de desarrollo que han
adquirido hábitos occidentales. De acuerdo con la llamada “hipótesis de la higiene”, se ha producido
un cambio fundamental desde un estilo de vida “sucio” con una alta exposición a microbios, a un
estilo de vida “limpio” con una exposición baja a éstos (Wills-Karp et al., 2001). Cambios
ambientales tales como una mejor vivienda y nutrición, alimentos y agua más seguros, una mejora
en la higiene y la sanidad, y el uso extendido de antibióticos, han conducido a un descenso
progresivo de las enfermedades infecciosas, aunque a expensas de un aumento paralelo de las
enfermedades alérgicas y autoinmunes, incluidas la EC y CU, como resultado de un desarrollo
reducido del sistema inmunitario en edades tempranas (Bach, 2002).
El hecho de que se hayan observado cambios en la incidencia de la EII en las poblaciones
con idéntica etnia que viven en lugares diferentes, junto con la falta de concordancia absoluta
existente entre gemelos monozigóticos respecto a la enfermedad, refuerza la importancia de los
factores ambientales en la patogenia de la EII crónica.
Son numerosos los factores ambientales reconocidos como de riesgo para la EII: tabaco,
dieta, fármacos, el estrés y microorganismos (Danese et al., 2004).
Introducción
10
1.3.2.1. Tabaco.
El mejor ejemplo de la influencia del ambiente en la EII es el consumo de tabaco. El tabaco
presenta un llamativo efecto contrario en la EC y la CU, apoyando la idea de que son distintos
mecanismos los implicados en la patogénesis de cada forma de EII (Thomas et al., 1998a). Es un
importante factor de riesgo para la EC, aumentando la frecuencia de recidivas y la necesidad de
cirugía, y cuya interrupción en su consumo mejora el curso de la enfermedad (Rubin y Hanauer,
2000). Por el contrario, el hecho de que los pacientes de CU son con frecuencia no fumadores, y que
el dejar de fumar aumenta el riesgo de desarrollo de CU, sugiere su papel protector en esta
enfermedad (Bridger et al., 2002).
Los mecanismos de este efecto diferencial del tabaco en la EC y la CU aún no están claros,
aunque sí se ha comprobado que el tabaco afecta tanto a la inmunidad sistémica como a la de la
mucosa intestinal, alterando numerosas funciones inmunológicas tanto innatas como adquiridas
(Sopori, 2002): altera la relación entre células T colaboradoras (Th, helper) y T supresoras, reduce la
proliferación de células T, modula la apoptosis, y disminuye significativamente los niveles de
inmunoglobulinas en suero y mucosas. Además, provoca un incremento en la producción colónica
de moco (Cope et al., 1986), alteraciones en el flujo sanguíneo (Srivastava et al., 1990) y, al igual
que la nicotina, una reducción de la motilidad colónica (Coulie et al., 2001).
Es sabido que el consumo de tabaco puede generar aproximadamente unos 4.000
compuestos; cualquiera de ellos podría tener acciones biológicas responsables de su acción en la
genésis o el mantenimiento de enfermedad, aunque es probable que la nicotina sea el agente activo
más importante. A este respecto, la nicotina transdérmica muestra un efecto beneficioso en pacientes
con CU (Guslandi y Tittobello, 1996; Pullan et al., 1994). En distintos modelos experimentales de
colitis, se observa cómo tras la administración de nicotina el proceso inflamatorio mejora,
coincidiendo con una disminución local de la concentración de varias de las citocinas
proinflamatorias (Agrawal y Rhodes, 2003). Por otra parte, la nicotina podría ser perjudicial en la
EC a través de la contribución al estado de hipercoagulación presente en esta condición.
Introducción
11
1.3.2.2. Factores dietéticos.
Dado que la EII se trata de una patología digestiva, es lógica la posibilidad de que pudiera
haber productos de la dieta implicados en su patogenia. Sin embargo, son pocos los datos objetivos
contundentes, principalmente porque proporcionan sólo una evidencia indirecta de la posible
relación causa-efecto entre factores dietéticos específicos y EII. Se ha sugerido que, en la EC, ciertos
alimentos podrían actuar como antígenos, con un efecto desencadenante de la sintomatología. En
este sentido, se han utilizado con fines terapéuticos dietas de exclusión en las que los pacientes
evitan comer los alimentos supuestamente culpables. Esta maniobra terapéutica tiene efectos
positivos en un pequeño porcentaje de enfermos (Jones et al., 1985); sin embargo, no se ha
demostrado que, después de lograda la remisión de la enfermedad mediante este planteamiento, la
reintroducción de los alimentos excluidos induzca una recaída. No obstante, teniendo en cuenta que
la mayor incidencia de EII se puede asociar con los cambios en los hábitos de vida (incluidos los
dietéticos) que conlleva el bienestar económico de los países occidentales, y que el intestino es la
principal localización del proceso inflamatorio, sería muy probable que algunos nutrientes presentes
en la luz intestinal pudieran actuar como antígenos, o que incluso pudieran influir en los mecanismos
inmunitarios y reparadores de la mucosa intestinal. Un estudio en el cual se determinó el flujo de
sangre rectal y la proliferación de linfocitos tras la exposición a productos alimenticios específicos
demostró sensibilización a algunos antígenos dietéticos en pacientes con EC (Van Den Bogaerde et
al., 2002).
Estudios dirigidos a establecer una relación causal entre dieta y EII hacen frente a
dificultades importantes, como definir la verdadera composición de cada dieta. A pesar de todo ello,
se ha sugerido que el consumo de azúcar refinado puede ser un factor de riesgo para la EC, pero no
para la CU (Sonnenberg, 1988); el consumo de grasa ha sido asociado con la aparición de CU. El
consumo de fruta, vegetales y fibra parece descender el riesgo de EII (Reif et al., 1997). Además
esta relación entre dieta y EII está apoyada por el beneficio en la EC de dietas elementales tanto
como terapia primaria como adyuvante, aunque en algunos estudios este planteamiento fue menos
efectivo que las terapias convencionales, como esteroides o aminosalicilatos (Lochs et al., 1991).
Finalmente, algunas deficiencias nutricionales pueden estar ligadas a una disfunción del sistema
inmunitario, hecho que favorecería la aparición o incluso agravaría la EII.
Introducción
12
1.3.2.3. Fármacos.
Los anticonceptivos orales y los antiinflamatorios no esteroídicos (AINEs) son los dos
principales grupos de fármacos que han sido mejor estudiados acerca de la posible relación
etiológica entre su uso y el mayor riesgo de desarrollar la enfermedad.
En un meta-análisis realizado por Godet et al. (1995) parecía confirmarse una asociación
epidemiológica entre el uso de anticonceptivos orales y la EII, algo más intensa en la EC (riesgo
relativo de 1,44) que en la CU (riesgo relativo de 1,29). Las conclusiones de este estudio se vieron
reforzadas en un trabajo multicéntrico italiano publicado posteriormente (Corrao et al. 1998),
demostrando además que el riesgo era significativamente mayor en las pacientes que los continuaban
utilizando frente a las que ya habían abandonado su uso.
Ha sido motivo de controversia el hecho de si las mujeres que usan anticonceptivos orales
presentan una peor evolución clínica de la EII. Los anticonceptivos orales a bajas dosis no afectan
significativamente a la actividad clínica de la enfermedad, al menos en EC. Sin embargo,
considerando el estado de hipercoagulación presente en la EII activa, el uso concomitante de
anticonceptivos orales puede agravar el riesgo de procesos tromboembólicos, aunque son necesarios
datos definitivos relacionando estos factores (Alstead, 1999). Por otra parte, si bien se había sugerido
que los anticonceptivos podrían afectar a la evolución de la EII a través de estos mecanismos
trombogénicos, no se pueden descartar otros efectos inmunomoduladores, como algunos
relacionados con la supresión del factor de transcripción NFκB que están empezando a describirse
recientemente (Evans et al., 2001), y podrían variar según el tipo y dosificación del fármaco. Estos
efectos inmunomoduladores podrían producirse, además, con dosis inferiores o ser específicos de
determinadas formas moleculares.
La situación es menos ambigua en el caso de los AINEs, porque su uso está claramente
asociado con un mayor riesgo de EII. Pacientes de EII en remisión clínica pueden recaer tras la
administración de AINEs (Evans et al., 1997; Hanauer y Sandborn, 2001). Sin embargo,
recientemente se ha publicado un estudio retrospectivo en el cual se sugiere que, en general, los
inhibidores de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) son seguros en los pacientes con EII (Mahadevan et al.,
2002).
Introducción
13
1.3.2.4. Estrés.
Son importantes las evidencias que asocian el estrés y la enfermedad (CU), probablemente
relacionado con el deterioro de la respuesta inmunológica (Herbert y Cohen, 1993). A pesar de que
esta creencia es popular entre aquellos que padecen EC y CU, es más probable que el estrés module
las manifestaciones de la enfermedad más que ser un factor iniciador. Observaciones clínicas,
modelos experimentales de colitis, y estudios de interacciones neuroinmunológicas en animales de
laboratorio han demostrado que el estrés puede agravar el curso de la EII (Collins, 2001).
La duración del estrés puede también ser importante, ya que el riesgo de exacerbación de la
actividad clínica de la enfermedad parece estar asociado con un estado de estrés prolongado
(Levenstein et al., 2000). Esta relación presenta semejanzas con los “cotton-top tamarins”, primates
que viven en la jungla tropical de Sudamérica y que desarrollan colitis espontánea tipo CU sólo
cuando se mantienen en cautividad en climas más fríos a largo plazo (Maunder et al., 2000). Aún
son desconocidos los mecanismos específicos que expliquen la exacerbación de la enfermedad
inducida por estrés, aunque probablemente esté implicada una compleja interacción entre factores
nerviosos, endocrinos e inmunes (Hart y Kamm, 2002).
1.3.2.5. Factores microbianos.
Durante muchos años se ha tratado de establecer una relación entre un agente infeccioso
específico y la EII sin obtener resultados concluyentes. Sin embargo, actualmente es cada vez mas
importante el papel que se le atribuye a la flora intestinal comensal en el desarrollo de estas
patologías.
Agentes infecciosos específicos
Los agentes infecciosos específicos de tipo microbiano que se han propuesto como
responsables de la EC y la CU son muy variables: Listeria monocytogenes, Chlamydia tracomatis,
Escherichia coli, Mycobacterium paratuberculosis. El papel etiológico de éste último en la EC ha
sido centro de gran controversia, ya que esta bacteria es el agente causante de la enfermedad de
Johne, una ileítis granulomatosa crónica en rumiantes que se asemeja mucho a la EC. M.
paratuberculosis fue inicialmente aislado de varios tejidos con EC (Chiodini et al., 1984), sin
Introducción
14
embargo en estudios posteriores se intentó cultivar este microorganismo, buscar secuencias
específicas de ADN en tejidos intestinales o medir anticuerpos en suero frente al mismo, alcanzando
resultados conflictivos o no concluyentes. Además, distintos ensayos han determinado una falta de
efecto terapéutico de la terapia antituberculosa en pacientes con EC (Thomas et al., 1998b).
Una etiología viral también ha sido propuesta como la causa de EII, en particular para la
EC. La presencia de partículas semejantes a paramixovirus en granolumas endoteliales de EC
sugiere que esta enfermedad podría ser debida a una vasculitis crónica causada por la persistencia
del virus del sarampión en la mucosa (Wakefield et al., 1993). Como apoyo a esta hipótesis, algunos
datos epidemiológicos y serológicos establecieron una asociación entre el sarampión perinatal y la
predisposición a la EC (Ekbom et al., 1996). Sin embargo estas observaciones preliminares no
fueron confirmadas por estudios posteriores (Fisher et al., 1997). El descenso progresivo de la
infección por el virus del sarampión en las últimas décadas con el incremento de EC durante el
mismo período de tiempo, habla en contra de un papel etiológico del sarampión en la EC.
La hipótesis de que la vacunación del sarampión, más que la propia infección, puede ser un
factor de riesgo para la EC también fue sugerida, pero de nuevo estudios posteriores no logran
confirmar esta asociación (Ghosh et al., 2001).
Flora intestinal comensal
Antes del nacimiento, el tracto gastrointestinal es estéril, y durante el nacimiento se produce
la primera exposición microbiana por la flora fecal y vaginal de la madre. Durante los meses después
del nacimiento, se establece una flora comensal estable (Fanaro et al., 2003). La diversa microflora
intestinal establece una relación simbiótica con las células epiteliales de la mucosa. Las células
bacterianas se benefician en el intestino de un constante fluido de nutrientes, de la temperatura
estable y de un nicho para vivir. De igual manera, el hospedador se beneficia de las bacterias por su
capacidad de sintetizar vitamina K, obtener energía de los nutrientes no absorbidos en forma de
ácidos grasos de cadena corta (AGCC), inhibir el crecimiento de patógenos y mantener la integridad
y homeostasis inmunológica en la mucosa. De hecho, hay estudios en animales libres de gérmenes
que revelan que la ausencia de microflora intestinal provoca alteraciones significativas en la
estructura y función intestinal, como reducción de villi, criptas poco profundas, bajo recuento de
Introducción
15
leucocitos (Sharma et al., 1995; Szentkuti et al., 1990), reducción del número y densidad de las
placas de Peyer (Maeda et al., 2001) y una disminución de la estimulación de la migración de
complejos motores (Husebye et al., 2001).
En su convivencia con las bacterias, los vertebrados desarrollan receptores de
reconocimiento de indicadores específicos de bacterias, hongos y virus que no se encuentran en
eucariotas (lipopolisacaridos, peptidoglucano, dipéptido muramilo, flagelinas…). Estos receptores
incluyen los TLR (toll-like receptor) y los NOD (dominios de oligomerización de unión de
nucleótidos), que son imprescindibles para el inicio de la respuesta inmunitaria innata y cuya
activación genera unas cascadas de señalización que acaban en la producción de citocinas
proinflamatorias. Las cascadas de señalización del TLR proporcionan un enlace entre la respuesta
inmunológica innata y adaptativa, ya que la primera acaba en maduración de células dendríticas, las
cuales activan la respuesta inmunológica adaptativa (Medzhitov, 2001). Aunque la estimulación de
estos receptores se traduzca en una producción de citocinas proinflamatorias, son también esenciales
en la adaptación de las bacterias intestinales y el mantenimiento de la homeostasis (Sansonetti 2004).
Una de las características mas importantes de la flora comensal es su incapacidad de atravesar la
barrera epitelial, y si alguna de las bacterias penetra, son fagocitadas rápidamente por la respuesta
inmunológica innata de la mucosa del individuo sano (Macpherson et al., 2000). El objetivo de la
respuesta inmunológica de la mucosa es mantener la tolerancia a estas bacterias intestinales,
resultando lo contrario en efectos perjudiciales para el hospedador.
En la actualidad se sabe que las bacterias intestinales influyen en el inicio y perpetuación de
la EII. La teoría actual sobre el desarrollo de la EII comprende una respuesta inmunitaria exacerbada
hacia la microflora comensal en individuos genéticamente susceptibles (Bamias et al., 2005),
hipótesis sustentada por distintas observaciones: la mayor inflamación se produce en áreas con
mayor densidad de bacterias intestinales, el uso de antibióticos mejora la inflamación intestinal
crónica, y la desviación quirúrgica del flujo fecal puede prevenir la recurrencia de la enfermedad de
Crohn. En pacientes con EII se ha observado que las bacterias adherentes con capacidad de penetrar
en la mucosa, como Bacteroides ssp, Escherichia coli y Enterobacterium, son mas abundantes en
comparación con los sujetos sanos (Swidsinski et al., 2002; Seksik et al., 2003) (Figura 3). El
sobrecrecimiento bacteriano y la disbiosis se asocian también con el desarrollo de pouchitis,
Introducción
16
consistente en la inflamación del íleo como consecuencia de una colectomia en pacientes con colitis
ulcerosa (CU) (Ruseler-van Embden et al., 1994).
DietaEstrésAntibióticosF. GenéticosProbióticosPrebióticosInfecciónHigiene
Bacteroides spp.Enterococcus faecalisEnterobacter cloacaeHelicobacter ssp. intestinalFusobactreium spp.E.Coli invasivo/adherenteEubacterium y Peptostreptococcus spp.
Lactobacillus spp.Bifidobacterium spp.Streptococcus salivariusSaccharomyces boulardiiClostridium butyricumRuminococciE. Coli Nissle 1917
Figura 3. Balance microbiano y disbiosis. En la enfermedad inflamatoria intestinal, las bacterias
luminales desencadenan una respuesta inmunológica anormal. El equilibrio entre las bacterias
beneficiosas y las agresivas regula la homeostasis en la inflamación crónica, influenciado éste por
diferentes factores genéticos y ambientales (Ewaschuk y Dieleman, 2006)
La hipótesis de que la flora normal de algún modo funcione como un modulador de la
“inflamación fisiológica” ha sido consolidada por las observaciones de Duchmann et al. (1995;
1999) que han demostrado que las células mononucleares de la mucosa de pacientes con EII, pero no
de la sangre periférica, proliferan cuando son expuestas a bacterias intestinales autólogas. Por el
contrario, células de mucosa no afectada de estos mismos pacientes o de pacientes en remisión no
proliferan frente a la flora EII autóloga. Esto indica que existe una pérdida de tolerancia durante la
inflamación (Duchmann et al., 1995).
Introducción
17
Probablemente el hecho más convincente es que en la mayoría de los modelos animales de
EII la inflamación intestinal no se desarrolla cuando son mantenidos en un ambiente libre de
gérmenes, como fue demostrado inicialmente en ratas transgénicas HLA-B27 (Taurog et al., 1994).
Esta observación ha conducido al ampliamente aceptado paradigma “no bacteria, no colitis”. La
causa de una respuesta “anormal” a bacterias intestinales “normales” en la EII no está clara, pero el
descubrimiento reciente de que la EC está asociada genéticamente con mutaciones del gen NOD2,
cuyo producto son proteínas reconocedoras de bacterias, apunta a una relación entre la inflamación
intestinal y el reconocimiento bacteriano (Girardin et al., 2003).
Por tanto, la asociación entre la microflora intestinal y el desarrollo de la EII ha conducido
a la abundancia de estudios que investigan el potencial terapéutico de la alteración de bacterias
luminales con el uso de probióticos.
2. PROBIOTICOS EN LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINA L
2.1. CARACTERÍSTICAS Y CONCEPTO DE PROBIOTICO
En los últimos años, la progresiva comprensión de las estrechas relaciones entre nutrición y
salud ha permitido conocer el papel de ciertos alimentos (o de algunos de sus componentes) en la
mejora de la salud y/o en la reducción del riesgo de enfermedad de los consumidores, más allá de los
efectos atribuibles a su valor estrictamente nutritivo. Esto ha favorecido el desarrollo de alimentos
con un valor añadido para el consumidor, conocidos, en general, como “alimentos funcionales”.
En Europa, el término “alimento funcional” no está claramente delimitado por una
definición legal. No obstante, Goldberg (1994) ha propuesto un concepto ampliamente aceptada
hasta la fecha. Para este autor sería cualquier alimento que tenga un impacto positivo, y diferenciado
de su valor nutritivo, sobre la salud de un individuo. Se trataría de un alimento natural, o
desarrollado a partir de ingredientes naturales, que se consumiría como parte de la dieta y que
desempeñaría una función concreta en procesos tales como la mejora de los mecanismos biológicos
de defensa frente a agentes nocivos, la prevención de enfermedades o el retraso del envejecimiento.
En este contexto, los alimentos que contienen microorganismos probióticos pueden considerarse
como alimentos funcionales.
Introducción
18
La modulación de la microbiota intestinal para mejorar la salud se ha efectuado
empíricamente desde tiempos ancestrales, existiendo noticias del empleo de leche fermentada para el
tratamiento de infecciones gastrointestinales ya en el año 76 a. C. No obstante, no fue hasta el siglo
XX cuando se empezó a sugerir que la Humanidad no sólo había hecho uso inadvertido de una
multitud de microorganismos para la elaboración y/o conservación de numerosos alimentos, sino que
además existían algunas bacterias que ejercían efectos beneficiosos para la salud de los
hospedadores que las consumían. En 1906, Cohendy tras administrar leche fermentada por
Lactobacillus bulgaricus (actualmente Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus) a pacientes con
alteraciones en sus “fermentaciones intestinales”, observó una notable mejoría tras 8-12 días de
tratamiento. Paralelamente, Tissier no sólo había descubierto la existencia de bifidobacterias en el
tracto intestinal de lactantes alimentados exclusivamente con leche materna, sino que había
demostrado los beneficios clínicos derivados de la modulación de la microbiota intestinal de niños
con infecciones intestinales.
Un año después, el premio Nobel Elie Metchnikoff publicó un libro con una gran influencia
en la comunidad científica: Prolongation of Life, en él que postulaba que el consumo de las bacterias
que intervenían en la fermentación del yogur contribuían al mantenimiento de la salud mediante la
supresión de las “fermentaciones de tipo putrefactivo” de la microbiota intestinal y que ésta era la
causa de la longevidad de los campesinos búlgaros, grandes consumidores de yogur. En 1909, Isaac
Carasso fundó su primer establecimiento de yogures (Danone) en Barcelona, contribuyendo
decisivamente al prestigio de un producto que durante varias décadas sólo se podía adquirir en
farmacias y que se empleaba para prevenir o aliviar trastornos tan diversos como diarrea,
estreñimiento, dispepsia, colitis mucosa, colitis ulcerativa crónica, disbiosis por antibioterapia,
cistitis o dermatitis. Desde entonces, se han descrito y comercializado numerosas bacterias con
propiedades probióticas.
Posiblemente, el término “probiótico” fue empleado por primera vez por Vergio en 1954,
cuando comparaba los efectos adversos (“antibiotika”) que los antibióticos ejercían sobre la
microbiota intestinal con las acciones beneficiosas (“probiotika”) ejercidas por otros factores que no
pudo determinar. Una década más tarde, Lilly y Stillwell (1965) se referían a los probióticos como
microorganismos que promovían el crecimiento de otros microorganismos. Fuller (1989) redefinió
probióticos como “aquellos suplementos alimenticios integrados por microorganismos vivos que
Introducción
19
afectan beneficiosamente al hospedador que los consume mediante la mejora de su equilibrio
microbiano intestinal”. Más recientemente, la OMS los ha definido como “organismos vivos que
ingeridos a dosis definidas ejercen efectos beneficiosos para la salud”. Esta última definición es más
amplia y tiene en cuenta los resultados de recientes investigaciones que demuestran la existencia de
efectos probióticos que no se restringen al ámbito intestinal (http://www.who.int/foodsafety). Más
recientemente, se ha propuesto que las bacterias inactivadas o alguno de sus componentes celulares
también pueden ejercer ciertos efectos beneficiosos, aunque no al nivel de las células vivas (Isolauri
et al., 2002; Ouwehand y Salminen, 1998).
Entre los microorganismos considerados como probióticos, las bacterias lácticas y las
bifidobacterias ocupan el lugar más destacado, pero también se utilizan con este fin bacterias que
pertenecen a otros géneros, como Escherichia coli y Bacillus cereus, y levaduras, principalmente
Saccharomyces cerevisiae (Shortt, 1998; Vaughan et al., 2002). Dentro de las bacterias lácticas, se
incluyen los géneros Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Enterococcus,
Streptococcus, Vagococcus, Weissela, Oenococcus, Atopobium, Alloicoccus, Aerococcus,
Tetragenoccus y Carnobacterium (Holzapfel y Wood, 1995; Schleifer y Ludwig, 1995); las cuales
son bacilos o cocos Gram-positivos, generalmente catalasa negativos, no esporulados, inmóviles, y
productores de ácido láctico como principal producto final de su metabolismo. El género
Bifidobacterium no está relacionado filogenéticamente con las bacterias lácticas pero comparte con
ellas diversas propiedades fisiológicas, bioquímicas y ecológicas (Aguirre y Collins, 1993).
Para que las cepas potencialmente probióticas puedan ejercer sus efectos beneficiosos
deben ser capaces de resistir las condiciones ambientales existentes durante el tránsito por el aparato
digestivo y de colonizar el tracto gastrointestinal. Para su estudio, se ha recurrido tanto a métodos in
vitro como a métodos in vivo, los cuales han sido contradictorios en algunas ocasiones (Mattila-
Sandholm et al., 1999). En cualquier caso, la capacidad de los probióticos para sobrevivir a las
condiciones gastrointestinales es una característica específica de cepa (Charteris et al., 1998a;
1998b; Xanthopoulos et al., 2000; Zárate et al., 2000; Zavaglia et al., 1998).
La concentración de probióticos viables que debe llegar al intestino para obtener un efecto
beneficioso es de aproximadamente ≥106 CFU/ml en el intestino delgado y ≥108 ufc/g en el colon
(Marteau y Shanahan, 2003). Para establecerse como habitante permanente del tracto
Introducción
20
gastrointestinal, deben adherirse a las células epiteliales intestinales o a la capa de mucus, siendo el
primer paso en la colonización, y que muchos autores lo consideran como un prerrequisito para
ejercer efectos beneficiosos en el hospedador.
Finalmente, cabe decir que la seguridad de los productos actuales es excelente, pero
teóricamente, los probióticos, al ser organismos vivos, pueden ser responsables de diversos efectos
secundarios en individuos susceptibles (VIH, trasplantados, post quirúrgicos…): infecciones por
desplazamiento bacteriano intestino-sangre; efectos metabólicos indeseables como desconjugación y
deshidroxilación de sales biliares, excesiva estimulación inmunitaria y transferencia de genes como
por ejemplo de resistencia a antibióticos.
2.2. EFECTOS DE LOS PROBIÓTICOS EN LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA
INTESTINAL EN HUMANOS
En la actualidad, el uso de probióticos se ha asociado con un gran número de efectos
beneficiosos en humanos, muchos de ellos establecidos de forma empírica, como la mejora de la
intolerancia a la lactosa, la modulación del sistema inmunitario, la reducción de la
hipercolesterolemia y la protección frente a enfermedades infecciosas, inflamatorias y alérgicas
(Gill, 2003). Sin embargo, no se debe asumir, que todos los probióticos posean las mismas
propiedades beneficiosas. De igual manera, cuando se adscribe un efecto beneficioso a una cepa,
este no se puede extrapolar a las restantes cepas de la misma especie. Incluso el efecto que una cepa
puede presentar depende de las condiciones de su empleo y, muy particularmente, de la dosis.
Los resultados obtenidos de varios estudios animales y diversos ensayos clínicos con
probióticos en la enfermedad inflamatoria intestinal son bastante prometedores. Estos estudios
muestran la capacidad de los probióticos de prevenir las recaídas de la enfermedad inflamatoria
intestinal, incluso algunos tienen actividad sobre la EII activa (Fedorak y Madsen, 2004; Sartor,
2004). Sin embargo aun hacen falta más ensayos que verifiquen su actividad.
2.2.1. Colitis ulcerosa.
El primer estudio que se realizó con un pequeño numero de pacientes evaluó la actividad de
E. coli Nissle 1917 en comparación con dosis bajas de mesalamina, mostrando que el cociente
Introducción
21
remisión/recaídas en el caso del probiótico fue del 16%/67% frente al 11%/73% de la mesalamina
(Kruis et al., 1997). Kruis et al. (2004), ampliaron estos estudios valorando la efectividad de una
preparación oral de E. coli Nissle 1917 frente a mesalamina en un estudio doble ciego aleatorizado
con 327 pacientes durante 12 meses, obteniendo como resultado que no había diferencias
significativas entre los dos grupos, siendo el valor de las recaídas del 36,4% para el probiótico, y del
33,9% para el caso de la mesalamina. Recientemente, Zocco et al. (2006), estudiaron la eficacia de
la asociación del probiótico L. rhamnosus GG con mesalamina en el mantenimiento de la remisión
de la colitis ulcerosa en comparación con mesalamina sola, no obteniendo diferencias en el número
de recaídas después de 6 y de 12 meses. Sin embargo, si se obtuvieron diferencias en el tiempo de
remisión (P<0,05). Otro estudio con una mezcla de probióticos denominado VSL#3* demostró que
15 de 20 pacientes no sufrieron recaídas durante 1 año (Venturi et al., 1999).
La eficacia del tratamiento probiótico en la colitis ulcerosa activa también se evaluó
mediante un estudio que demuestra la equivalencia entre E. coli Nissle 1917 y mesalamina en la
inducción de la remisión de la CU (Rembacken et al., 1999). Ishiwaka et al. (2003) probaron la
actividad de una leche fermentada con Bifidobacterium en el tratamiento de la colitis ulcerosa
durante 1 año, observándose después del mismo una exacerbación de los síntomas en sólo 3 de 11
pacientes tratados con la leche en comparación con 9 de 10 del grupo control (P=0,01). Sin embargo
no se observaron diferencias en el índice de la actividad endoscópica de la enfermedad. Después se
realizó otro estudio usando un placebo como control con la leche fermentada con Bifidobacterium
durante dos semanas en pacientes con colitis ulcerosa activa, en el que se redujo de manera
significativa tanto el daño histológico como el índice de la actividad endoscópica de la enfermedad
en comparación con el placebo (Kato et al., 2004).
*VSL#3: mezcla probiótica compuesta por: Lactobacillus casei, Lactubacillus plantarum,
Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Bifidobacterium longum,
Bifidobacterium breve y Bifidobacterium infantis.
Introducción
22
Tabla 2. Efectos de los probióticos en la inducción de la remisión de la colitis ulcerosa
Inducción de la remisión de colitis ulcerosa
Kato et al. 2004
DC, A, C
Leche fermentada
Bifidobacterium
Placebo
Reducción índice de actividad
de CU
Rembacken et al.
1999
DC, A, C
E. coli Nissle 1917
(1011 CFU)
Mesalamina
Tan efectivo como mesalamina
en la remisión de CU
Bibiloni et al.
2005
Abierto
VSL#3 (3,6*109 CFU)
Ninguno
77 % de remisión de CU
Ishikawa et al.
2003
A, C
Leche fermentada con
Lactobacillus y
Bifidobacterium
Placebo
Disminución de la exacerbación
de los síntomas (P<0,01)
Borody et al.
2003
Enema fecal
Enema fecal
Ninguno
100 % de remisión
DC: doble ciego; A: aleatorizado; C: controlado.
Introducción
23
Tabla 3. Efecto de los probióticos en el mantenimiento de la remisión de la colitis ulcerosa
Mantenimiento de la remisión de colitis ulcerosa
Kruis et al. 2004
DC, A, C
E. coli Nissle 1917
(2,5-25*109 CFU)
Mesalamina
Tan efectivo como mesalamina
en la remisión de CU
Zocco et al. 2006
Abierto
Lactobacillus GG
(1,8*1010 CFU)
Mesalamina
Mesalamina +
LGG
No hay diferencias en numero de
recaídas a los 12 meses, pero si en
el tiempo de remisión
Shanahan et al.
2006
DC, A, C
Lactobacillus salivarius o
Bifidobacterium infantis
(109 CFU)(52/grupo)
Placebo
No mejora el tiempo de remisión
Venturi et al.
1999
Abierto
VSL#3 (1*1012 CFU)
Ninguno
Remisión del 75%
DC: doble ciego; A: aleatorizado; C: controlado.
Introducción
24
2.2.2. Enfermedad de Crohn.
Existe un menor número de trabajos que describen el uso de probióticos en la prevención y
tratamiento de la enfermedad de Crohn. En un ensayo se probó la eficacia de Saccharomyces
boulardii en el mantenimiento de la remisión de la EC. A los 6 meses la incidencia de recaídas era
del 37,5 % en el grupo administrado solo con mesalamina, y del 6,3 % en el grupo tratado con la
mesalamina y el probiótico (Guslandi et al., 2000). En otro estudio, McCarthy et al., mostraron que
la administración oral de Lactobacillus salivarius UCC118 reducía de manera significativa el índice
de la enfermedad en pacientes con EC leve y moderada. Aunque estos resultados son prometedores,
es importante indicar la existencia de numerosos estudios en los que distintos probióticos no han
demostrado tener eficacia. Un estudio randomizado controlado por placebo con 98 pacientes mostró
que el probiótico L. johnsonii LA1 no previno la recurrencia de EC postoperatoria (Marteau et al.,
2006). De igual manera L. rhamnosus GG tampoco la previno, en pacientes con EC post-operatoria
y resección intestinal (Prantera et al., 2002).
Introducción
25
Tabla 4. Efectos de los probióticos en la inducción de la remisión de la enfermedad de Crohn
Inducción de la remisión de la Enfermedad de Crohn
Schultz et al.
2004
DC, A, C
Lactobacillus GG
(2*109 CFU)
Placebo
Sin diferencias en la capacidad
de remisión
McCarthy et al.
2001
Abierto
Lactobacillus salivarius
(1*1010 CFU)
Ninguno
Reducción de la actividad de
la enfermedad comparado con
niveles basales
Gupta et al. 2000
Abierto
Lactobacillus GG
(2*1010 CFU)
Ninguno
Mejora del IAEC en comparación con niveles
basales (P<0,05)
DC: doble ciego; A: aleatorizado; C: controlado; IAEC: índice de actividad de la enfermedad de Crohn
Introducción
26
Tabla 5. Efectos de los probióticos en el mantenimiento de la remisión de la enfermedad de Crohn
Mantenimiento de la remisión de la Enfermedad de Crohn
Prantera et al.
2002
DC, A, C
Lactobacillus GG
(1,2*1010 CFU)
Placebo
Sin diferencias significativas de
remisión
Campieri et al.
2000
A, C
VSL#3 (3*1011 CFU)
Mesalamina
Igual eficacia que mesalamina en
la prevención de recaídas
Marteau et al.
2006
DC, A, C
L. .johnsonii LA1
(2*109 CFU)
Placebo
Sin diferencias en las recaídas
Malchow et al.
1997
DC, A, C
E. coli Nissle 1917
(5*1010 CFU)
Placebo
Sin diferencias en remisión de los
síntomas
Bousvaros et al.
2005
DC, A, C
Lactobacillus GG
(2*1010 CFU)
Placebo
Sin diferencias en el tiempo de
recaídas
Guslandi et al.
2000
A, C 6
meses
Saccharomyces boulardii
(1 g/d) + mesalamina (2g)
Mesalamina
Prolongación de la remisión significativa
(P<0,05)
DC: doble ciego; A: aleatorizado; C: controlado.
Introducción
27
2.2.3. Pouchitis crónica.
Es en esta patología donde los probióticos han demostrado un beneficio indiscutible al
comprobarse en distintos estudios que éstos son capaces de mantener la remisión inducida con
antibióticos en pacientes con pouchitis crónica tras resección del colon debido a una colitis ulcerosa
refractaria. En este sentido, Gionchetti et al. (2000), han completado los ensayos usando la mezcla
probiótica VSL#3 en pacientes con pouchitis crónica recurrente, la cual redujo la incidencia de
recaídas tras 9 meses a un 15%, frente al 100% del grupo placebo. Otro estudio con los mismos
grupos también demostró que tras un año, solo desarrollaron pouchitis un 10% frente a un 40% del
grupo placebo después de la cirugía por colitis ulcerosa (Gionchetti et al., 2003). También se llevó a
cabo un estudio doble ciego, aleatorizado, usando un placebo como control, en 20 pacientes tratados
con L. rhamnosus GG vs. placebo durante 3 meses (Kuisma et al., 2003). Sin embargo, en contraste
al estudio con la mezcla VSL#3, no se observaron diferencias significativas en la pouchitis crónica
durante el tratamiento con L. rhamnosus GG.
Introducción
28
Tabla 6. Efectos de los probióticos en la pouchitis crónica
Inducción de la remisión de la pouchitis
Kuisma et al.
2003
DC, A, C
Lactobacillus GG
(1*1010 CFU)
Placebo
Sin diferencias en el IAP
Laake et al.
2004
Abierto
Leche fermentada con
L. acidophilus y Bifido-
bacterium lactis (500 mL)
Ninguno
Mejora del IAP, pero sin
diferencias en la histología
Gionchetti et al.
2000
DC, A, C
VSL#3 (6g)
Placebo
Aumento del tiempo de remisión
(P< 0,001)
Mimura et al.
2004
DC, A, C
VSL#3 (6g)
Placebo
Aumento del tiempo de remisión
(P< 0,001)
Gionchetti et al.
2003
DC, A, C
VSL#3 (1*1011 CFU)
Placebo
Aumento del tiempo de remisión
(P< 0,05)
DC: doble ciego; A: aleatorizado; C: controlado; IAP: índice de actividad de la pouchitis
Introducción
29
2.3. MECANISMO DE ACCION DEL EFECTO ANTIINFLAMATORI O INTESTINAL
Clásicamente se ha atribuido el efecto de los probióticos a su capacidad de modificar la
composición de la microflora intestinal de potencialmente dañina, a beneficiosa para el hospedador.
Sin embargo el mejor conocimiento de la biología de estos microorganismos ha permitido establecer
diferentes mecanismos de acción posibles para ejercer sus efectos beneficiosos (Figura 4)
1.- Competición con bacterias nocivas por:
a) desplazamiento de su sitio de unión al epitelio y
b) inhibición de su crecimiento y/o promoción de su muerte mediante la
producción de compuestos antibacterianos o reducción del pH;
2.- Mejora de la función de barrera intestinal;
3.- Producción de nutrientes importantes para la función intestinal y
4.- Modulación de la respuesta inmune de la mucosa del hospedador.
1a
1bPatógeno
Probiótico3
24
AGCC
Bacteriocinas
Citocinas
Figura 4. Diferentes mecanismos de acción ejercidos por las bacterias probióticas.
Introducción
30
2.2.1. Competición con bacterias patógenas.
Los probióticos son bacterias sin capacidad patógena, capaces de prevenir la adherencia,
establecimiento, replicación y/o la acción de las bacterias patógenas. Los mecanismos posibles
pueden implicar modificación del pH, mediante producción de ácidos grasos de cadena corta como
consecuencia de su capacidad fermentativa sobre la fibra dietética; o producción de compuestos
antibacterianos como peroxido de hidrogeno o bacteriocininas (Jack et al., 1995; Liévin et al., 2000).
El desplazamiento de bacterias nocivas no necesariamente implica actividad bacteriostática
o bactericida, sino que también puede ser consecuencia de la competición física por unirse al
epitelio, consumiendo también los sustratos disponibles para las bacterias patógenas.
Hay diversos estudios que demuestran el efecto competitivo ejercido por los probióticos,
por ejemplo, estudios in vitro e in vivo han demostrado que B. infantis inhibe el crecimiento de
Bacteroides vulgatus (Shiba et al., 2003). La mezcla probiótica VSL#3 es capaz de inhibir la
invasión de Salmonella dublin en células T-84 (Madsen et al., 2001). Lactobacillus salivarius ssp
salivarius UCC118 inhibe el crecimiento de numerosos patógenos como Listeria monocytogenes o
Sthaphilococcus aureus meticilin resistentes, efecto derivado de su factor antimicrobiano ABP118
(Dunne et al., 1999). En otro estudio Escherichia coli Nissle 1917 fue capaz de reducir al adhesión
del patógeno Escherichia coli enteroinvasivo en un 97 %, sugiriendo un posible mecanismo en el
mantenimiento de la remision de la colitis ulcerosa (Malchow, 1997; Rembacken et al., 1999).
2.2.2. Mejora de la función de barrera intestinal.
La monocapa epitelial y el revestimiento de moco que la recubre, junto con las uniones
estrechas (del inglés tight junction) que mantienen unidos a los enterocitos, forman una barrera física
que previene a los patógenos potenciales y a antígenos luminales de pasar libremente a la lámina
propia. Por otro lado, la inmunoglobulina (Ig) A, además de bloquear sus uniones al epitelio,
previene su internalización, y también es capaz de aglutinar bacterias y virus en unos grandes
complejos que son atrapados en la barrera de moco y eliminados en las heces.
En la EII, la integridad de la barrera epitelial está comprometida, lo que permite el paso de
antígenos luminales a la lámina propia, y contribuye a la perpetuación del proceso inflamatorio
Introducción
31
(Plevy, 2002). Así, se ha demostrado la existencia de una permeabilidad intestinal incrementada en
pacientes con EC (Teahon et al., 1992), y se ha descrito como un factor temprano predisponente a la
patogénesis de esta enfermedad.
Los probióticos podrían normalizar la permeabilidad intestinal incrementada mejorando las
funciones de barrera intestinal, y secundariamente la respuesta inflamatoria intestinal. Son diferentes
los procesos que pueden intervenir en dicha actividad: a) Se ha demostrado que la incubación con L.
plantarum 299v aumenta los niveles de expresión de mRNA de las proteínas MUC2 y MUC3 en
células HT-29 (Mack et al., 1999), y b) L. casei o Clostridium butyricum aumentan de forma muy
marcada la proliferación de las células epiteliales intestinales (hasta 200% en el colon) en ratas
mejorando así la protección del tejido intestinal (Ichikawa et al., 1999).
2.2.3. Producción de nutrientes importantes para la función intestinal.
Los ácidos grasos de cadena corta, AGCC, (principalmente acetato, propionato y butirato)
son los productos finales de la descomposición de los carbohidratos de la dieta por parte de las
bacterias anaerobias en el intestino grueso. Son la principal fuente de energía para los colonocitos
regulando su desarrollo y diferenciación (Cummings, 1981). Además, y en íntima relación con las
propiedades normalizadoras de la función de barrera intestinal, tienen efectos tróficos sobre el
epitelio intestinal, lo que es de gran importancia para la recuperación de la inflamación y para la
reducción del riesgo de translocación bacteriana durante la alteración de la barrera intestinal (Urao et
al., 1999). En concreto, el butirato, tiene la capacidad de inducir enzimas (por ejemplo
transglutaminasas) que promueven la restitución de la mucosa (D’ Argenio et al., 1999)
Se ha postulado que la deficiencia en la cantidad de estos AGCC puede estar relacionada
con la aparición de colitis (Roediger, 1980); como consecuencia, la administración de preparaciones
probióticas que contienen Bifidobacterium, Enterococcus o Lactobacillus, que aumentan la cantidad
total de AGCC, contrarrestarían la aparición de estas enfermedades (Sakata et al., 1999)
2.2.4. Modulación de la respuesta inmunitaria de la mucosa del hospedador.
Los efectos antiinflamatorios de los probióticos en la enfermedad de Crohn y colitis
ulcerosa pueden incluir señales que ejercen sobre el sistema inmunológico del epitelio intestinal,
Introducción
32
incluyendo la producción de anticuerpos (Ig A, capaz de promover la barrera inmunológica) (Kaila
et al., 1992; Rinne et al., 2005), el aumento del número de fagocitos (Shu y Gill, 2002) y células
natural killer (Gill et al., 2001; Gill et al., 2001; Ogawa et al., 2006; Sheih et al., 2001), modulación
de las vías de señalización del NF-κB (Jijon et al., 2004; Petrof et al., 2004; Tien et al., 2006) y la
inducción de la apoptosis de células T (Di Marzio et al., 2001). Además, algunos probióticos como
Escherichia coli no patógeno o Lactobacillus sakei, tienen la capacidad de aumentar la producción
de citocinas antiinflamatorias tales como IL-10 y TGF-β, y de reducir la producción de citocinas
proinflamatorias por ejemplo TNF-α, IFN-γ o IL-8 (Haller et al., 2000; Maassen et al., 2000;
Madsen et al., 1999; Morita et al., 2002).
Lammers et al. 2005, administró una mezcla probiótica a pacientes con anastomosis ileo-
anal mostrando una reducción de los niveles de mRNA de IL-1β, IL-8 y IFN-γ, y del número de
células polimorfonucleares en comparación con los pacientes que recibieron el placebo. Ulisse et al.
(2001), describió una reducción de la expresión de las citocinas IFN-γ y IL-1α, y de la actividad
iNOS en biopsias de pacientes con pouchitis tratados con probióticos. Por último, en explantes de la
mucosa iliaca de pacientes con enfermedad de Crohn, el tratamiento con Lactobacillus casei y con
Lactobacillus bulgaricus redujo la liberación de TNF-α y el número de células CD4 (Borruel et al.,
2002).
OBJETIVOS
Objetivos
35
La enfermedad inflamatoria intestinal es una de las patologías con una alta prevalencia en
los últimos años. Aunque no se conoce exactamente su etiología, es cada vez mayor la evidencia de
que en su inicio y progresión intervienen antígenos de la dieta, posiblemente producidos por
bacterias. Una hipótesis bastante aceptable para la prevención y el tratamiento de estas enfermedades
podría ser la modificación de la flora bacteriana con el objeto de interferir en la producción de estos
agentes antigénicos.
Los probióticos, definidos como agentes nutricionales vivos, que consumidos en cantidades
adecuadas, ejercen un efecto beneficioso para el hospedador, podrían constituir una estrategia
terapéutica muy atrayente ya que modifican el equilibrio hacia bacterias carentes de este potencial
antigénico. Sin embargo, no todos los probióticos han manifestado efectos beneficiosos en los
diversos modelos experimentales y en humanos. En esta variabilidad del efecto pueden intervenir
diferentes factores:
- Especie y/o cepa probiótica ensayada, ya que aunque todos los probióticos tienen una capacidad
innata de adherirse al epitelio, no todos modifican la respuesta inmune
- Dosis usada
- Tipo de patología
- Momento en el cual se inicia el tratamiento, de hecho han mostrado ser mas eficaces en el
tratamiento de la colitis ulcerosa que en la enfermedad de Crohn, y mas activos en el
mantenimiento de la remisión que en el tratamiento de la enfermedad aguda
El objetivo general de esta Tesis Doctoral es ratificar que el efecto antiinflamatorio
intestinal depende de la cepa/especie seleccionada y encontrar un probiótico con características
ideales para el tratamiento de estas patologías. Para llevarlo a cabo, se plantearon los siguientes
objetivos concretos:
1. Comparar el efecto antiinflamatorio intestinal de Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus
y Bifidobacterium lactis, probióticos con actividad demostrada en estudios previos
Objetivos
36
2. Estudiar el efecto antiinflamatorio de Lactobacillus salivarius ssp. salivarius y Lactobacillus
fermentum. Éstos, fueron aislados en la empresa Puleva Biotech, y su actividad antiinflamatoria
intestinal ha sido estudiada por primera vez en esta Tesis.
3. Comparar la eficacia del probiótico con el mejor perfil antiinflamatorio de todos los anteriores
con Lactobacillus reuteri, probiótico ampliamente utilizado tanto en modelos de colitis
experimental como en humanos
MATERIAL Y MÉTODOS
Material y métodos
39
1. ENSAYOS IN VIVO .
Estos estudios se realizaron de acuerdo con las directivas de la Convención para la
protección de los animales vertebrados usados en experimentación y con otros fines científicos
establecidas por la Unión Europea (85/ETS123; 86/609/EEC).
1.1. Preparación del probiótico
Los probióticos utilizados fueron: Lactobacillus salivarius ssp. salivarius, Lactobacillus
fermentum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus y Bifidobacterium
lactis
Los probióticos fueron suministrados por Puleva Biotech (Granada, España). Se hicieron
crecer normalmente en medio MSR a 37º C en condiciones anaerobias usando el sistema Anaerogen
(Oxoid, Basingstoke, UK), se suspendieron en leche desnatada (5.108 CFU/mL) y se almacenaron a
–80º C hasta su uso.
1.2. Animales de experimentación.
Los animales utilizados en este estudio fueron ratas albinas hembra de la cepa Wistar de
180-200 g de peso, suministradas por el Servicio de Animales de Laboratorio de la Universidad de
Granada. Los animales se mantuvieron en el estabulario del laboratorio al menos 7 días antes de
iniciar los experimentos, a una temperatura de 22±2 º C y con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas.
Las ratas fueron alojadas en cubetas de makrolon con lecho de viruta, dispuestas en estante de acero
inoxidable, alimentadas con la correspondiente dieta para roedores, y agua corriente ad libitum.
Material y métodos
40
1.3. Inducción de la colitis experimental por TNBS y administración del probiótico
La colitis se indujo utilizando el método descrito por Morris et al. (1989) con algunas
modificaciones incorporadas por nuestro grupo de investigación. Los animales fueron sometidos a
un período de ayuno de 24 horas, después del cual fueron anestesiados ligeramente con halotano y se
procedió a la administración rectal de 0,25 ml de una solución de 10 mg de ácido
trinitrobencenosulfónico (TNBS) en etanol al 50 % (v/v). La instilación se realizó introduciendo un
catéter de teflón (2 mm de grosor) 8 cm desde el ano, manteniendo a los animales en posición supina
hasta la recuperación de la anestesia. La solución de TNBS se preparó a partir de un liofilizado de la
solución comercial de origen consistente en una solución acuosa al 5 % p/v. Dado que se han
descrito variaciones en la respuesta en función del lote comercial de TNBS (Yamada et al., 1992),
todos los experimentos se realizaron con TNBS de un mismo lote.
Los animales se distribuyeron de modo aleatorio en diferentes grupos, uno control sano y
los demás sometidos a inflamación intestinal (Figura 5):
- Grupo control sano: se les administró por vía rectal 0,25 ml de solución salina isotónica de
ClNa (0,9 %), y recibieron 0.5 ml de leche desnatada (vehiculo) mediante sonda gastroesofágica.
- Grupo control colítico: se les indujo la colitis con TNBS y también recibieron 0.5 ml de
leche desnatada mediante sonda gastroesofágica.
- Grupo tratado con probióticos: se les administró por vía oral el probiótico correspondiente a
cada grupo a una concentración de 5.108 vehiculizado en leche desnatada durante los catorce días
previos a la inducción del proceso inflamatorio intestinal con TNBS, así como durante los siete días
posteriores mediante sonda gastroesofágica.
Material y métodos
41
CONTROL NO COLITICO
CONTROLCOLITICO
PROBIOTICO
14 días 7 días
TNBS
TNBS
Figura 5. Diseño experimental
2. VALORACIÓN DEL PROCESO INFLAMATORIO INTESTINAL.
Durante el desarrollo de estas experiencias se controló diariamente el peso y el consumo de
agua y comida de los animales, así como la aparición de diarrea por visualización de restos
perianales (Bell et al., 1995). Todos los animales fueron sacrificados a los siete días de la
administración del agente inflamatorio intestinal
Una vez sacrificados los animales, se les extrajo el colon en su totalidad, observándose la
existencia o no de adhesiones entre el intestino grueso y los órganos adyacentes. Seguidamente se
procedió a la limpieza de los distintos segmentos intestinales, retirando los restos de grasa y las
adhesiones mesentéricas, sobre una placa Petri con hielo.
El colon se abrió longitudinalmente y se extrajeron los contenidos colónicos, que fueron
pesados y procesados para las determinaciones microbiologicas y de AGCC posteriores.
Material y métodos
42
El colon se lavó con solución salina isotónica y se determinó su longitud bajo una tensión
constante de 2 g, así como su peso. Tras abrirlo longitudinalmente, un observador ajeno al desarrollo
del experimento valoró el daño macroscópico de acuerdo con el criterio descrito por Bell et al.
(1995) (Tabla 7) poniéndose de manifiesto la presencia o no de las distintas características del
proceso inflamatorio.
Tabla 7. Escala de valoración del índice de daño macroscópico (IDM) en el modelo de colitis
experimental por TNBS en ratas
0 puntos Colon normal
1 punto Hiperemia localizada, sin ulceras
2 puntos Ulceración sin hiperemia ni engrosamiento en la pared intestinal
3 puntos Ulceración con un punto de inflamación
4 puntos Dos o mas sitios de ulceración e inflamación
5 puntos Zonas grandes de daño, inflamación y ulceración con una
extensión mayor de 1 cm
6-10 puntos Zonas grandes de daño tisular con una extensión mayor de 2 cm,
añadiéndose 1 punto (hasta 10) por cada cm adicional de extensión
Para la realización de los correspondientes estudios histológicos, se obtuvieron muestras de
colon (0,5 cm de longitud) de la zona proximal inmediatamente adyacente al daño.
Por último, el colon se dividió en distintos fragmentos longitudinales que, a excepción de
uno, fueron congelados inmediatamente a –80º C para la realización posterior de las determinaciones
bioquímicas.. El segmento destinado a la determinación de glutation total, se congeló en 1 ml de
Material y métodos
43
ácido tricloroacético (TCA) (Fluka, Madrid) al 5 % (p/v), con objeto de inhibir su degradación por la
γ-glutamil transpeptidasa (Anderson, 1985). El fragmento no congelado fue procesado en el
momento de su obtención para la determinación de la producción de LTB4 y de citocinas (IL-1β y
TNFα). Todas las determinaciones se realizaron en las dos semanas siguientes al sacrificio de los
animales.
2.1 Determinación de la actividad mieloperoxidasa colónica.
La determinación de la actividad mieloperoxidasa colónica (MPO) se realizó por el método
descrito por Krawisz et al. (1984). Esta enzima se utiliza como marcador de la infiltración de
neutrófilos, aunque no es una enzima estrictamente específica de estos fagocitos.
Los fragmentos de colon fueron dispuestos sobre una placa Petri enfriada con hielo y
picados con tijeras durante aproximadamente 15 segundos. A continuación, se homogeneizaron en
tampón de bromuro de hexadeciltrimetilamonio (HTAB) al 0,5% (p/v) en tampón fosfato salino (50
mM, pH 6,0), con una dilución final de 1:20 (p/v) en un homogeneizador Heidolph hasta obtener un
aspecto uniforme. El HTAB actúa como detergente, lo cual facilita la liberación del enzima MPO de
los gránulos azurófilos de los neutrófilos, donde se encuentra almacenada. Seguidamente, el
homogenado se sonicó durante 10 segundos y se sometió a un triple proceso de congelación-
descongelación que facilitó la ruptura de estructuras celulares, y en consecuencia la liberación de la
enzima. Tras la última descongelación se centrifugó el homogenado a 7000 G durante 10 minutos a
4º C y se procedió a la determinación de la actividad MPO siguiendo la cinética de la reacción frente
al agua oxigenada. Para ello, en una placa de 96 pocillos se añadieron 50 µL del sobrenadante a 150
µL del reactivo de coloración preparado de forma extemporánea, y compuesto por clorhidrato de o-
dianisidina (0,167 mg/mL) y peróxido de hidrógeno al 0,066% en tampón fosfato (50 mM, pH 6,0).
El incremento de absorbancia se determinó a 450 nm en un espectofotómetro Microplate Reader
(Bio-Rad). La actividad MPO se calculó por interpolación en una curva patrón, realizada con
mieloperoxidasa procedente de neutrófilos humanos. Una unidad de MPO (U) se define como la
cantidad necesaria para degradar 1 mmol/minuto de peróxido de hidrógeno a 25º C. Los resultados
se expresan como U/g tejido fresco.
Material y métodos
44
2.2. Determinación del contenido colónico de glutation total.
La determinación del contenido colónico de glutation total se realizó de acuerdo con el
método de la reducción cíclica del DTNB-GSSG (Akerboom y Sies, 1981).
Se basa en la oxidación del glutatión reducido (GSH) presente en una muestra a su forma
oxidada (GSSG) mediante incubación con el ácido 5,5'-ditiobisnitrobenzoico (DTNB), el cual es
reducido y adquiere una coloración amarillenta que puede ser determinada
espectrofotométricamente. El GSSG generado es reducido por acción de la enzima glutatión
reductasa (GSSGrd) en presencia de nicotinamida adenín dinucleótido fosfato (NADPH). El GSH
resultante se oxida de nuevo, dando lugar a un ciclo continuo en el cual la velocidad de reducción
del DTNB (con el consiguiente incremento de la absorbancia) es proporcional a la cantidad total de
glutatión.
Para efectuar esta determinación se utilizaron los fragmentos de colon congelados en
solución de TCA al 5% (p/v). Se picaron con tijeras durante 15 segundos aproximadamente sobre
una placa Petri con hielo y posteriormente se homogeneizaron en la solución de TCA en una
proporción 1:20 (p/v) en un homogeneizador automático Heidolph. A continuación, se centrifugó el
homogenado a 2000 G durante 5 minutos a 4º C y se recogió el sobrenadante, para someterlo a una
segunda centrifugación a 10000 G durante 5 minutos a 4º C. Para la determinación del glutation total
se mezclaron, por este orden, 20 µL de sobrenadante, 5 µL de tampón fosfato salino con ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) (PBS-EDTA) (solución acuosa de fosfato sódico 143 mM y
EDTA 6,3 mM, pH 7,5), 140 µL de solución de β-NADPH (0,298 mM) en PBS-EDTA y 20 µL de
DTNB (6 mM) en PBS-EDTA, en una placa de 96 pocillos, que se incubó a 30ºC durante 5 minutos.
Tras adicionar 15 µL de solución de GSSGrd (Boehringer-Mannheim, Barcelona) (266 UI/mL) en
PBS-EDTA, se agitó y se registró el incremento de absorbancia a 412 nm en un dispositivo
Microplate Reader (Bio-Rad). La concentración de glutation se calculó por interpolación en la curva
patrón realizada con GSH. Los resultados se expresan como nanomoles de glutation total/g de tejido
fresco.
Material y métodos
45
2.3 Determinación de los niveles colónicos de LTB4, TNFα, IL-1β e IL-10
Para la determinación de estos parámetros bioquímicos se realizó un procedimiento simple
de extracción de forma inmediata (<1 h) a la obtención del órgano (McCafferty et al., 1992). Los
fragmentos de colon se pican con unas tijeras sobre una placa Petri con hielo durante 15 segundos y
se incuban en tampón fosfato sódico 10 (mM, pH=7,4) en proporción 1:5 (p/v) a 37º C durante 20
minutos con agitación constante.
A continuación se centrifugan las muestras a 9000 G durante 30 segundos a 4º C y se
congela el sobrenadante obtenido a –80º C. Para la determinación de la concentración de LTB4 y
TNFα se utilizaron kits comerciales de enzimoinmunoensayo suministrados por Amersham
Pharmacia Biotech (Little Chalfont, Reino Unido). Los resultados se expresan como ng/g tejido
fresco en el caso del LTB4 y como pg/g tejido fresco en el caso del TNFα. IL-1β e IL-10 se
expresaron como pg/mg de proteina.
2.4. Determinación de la expresión de iNOS y COX-2 en tejido colónico.
La determinación de la expresión de iNOS y COX-2 se realizó mediante Western blot. Para
ello, los fragmentos colónicos fueron descongelados, picados y homogeneizados en proporción 1:5
(p/v) durante 1 minuto en PBS con dodecil sulfato sódico (sodium dodecyl sulfate, SDS) al 0,1%,
desoxicolato sódico al 0,1% y Tritón X-100 al 1%, conteniendo inhibidores de proteasas (aprotinina,
1,10-fenantrolina, iodoacetamida, fluoruro de fenilmetilsulfonilo). Seguidamente, los homogenados
fueron centrifugados a 10000 G durante 10 minutos. Tras determinar el contenido en proteínas por el
método del BCA, los sobrenadantes (100 µg) fueron hervidos durante 5 minutos en tampón de carga
Laemli 5x (Tris-HCl 0,2 M, pH 6,8, SDS 5%, 2-mercaptoetanol 8,8% (v/v), glicerol 37,5%, azul de
bromofenol 60 µg/mL) y sometidos a electroforesis en un gel desnaturalizante de poliacrilamida
(SDS-PAGE) al 6%. Como indicadores de peso molecular, se utilizó una mezcla de proteínas
previamente marcadas con un colorante (BioRad, Hercules, CA, EEUU). Las proteínas fueron
transferidas a una membrana de nitrocelulosa (PROTAN©, Schlecher & Schuell, Germany), la cual
posteriormente fue bloqueada durante al menos 1 hora a temperatura ambiente con leche desnatada
al 5% (p/v) en tampón Tris salino (tris buffer saline, TBS) conteniendo Tween-20 al 0,1% (v/v)
Material y métodos
46
(TBS-T). Transcurrido el bloqueo, las membranas se sometieron a tres lavados con TBS-T durante 5
minutos, y fueron expuestas a las correspondientes diluciones de anticuerpo incorporado en
albúmina de suero bovino al 5% (p/v) en TBS-T. Las incubaciones con dichas diluciones de
anticuerpo primario, 1:2000 frente a iNOS (Transduction Laboratories, Becton Sickinson
Biosciences, Madrid, España) y 1:1000 frente a COX-2 (Cayman Chemical Company, Montigny le
Bretonneux, France), se realizaron durante toda una noche a 4º C. Un anticuerpo primario frente a β-
actina se empleó como control de carga.
Tras tres lavados de 5 minutos con TBS-T, las membranas fueron incubadas con anticuerpo
conjugado con peroxidasa IgG anti-conejo (1:3000) durante 1 hora. Las bandas resultantes fueron
detectadas por quimioluminiscencia (NEM Life Science Products, Zaventem, Bélgica) y
cuantificadas por densitometría mediante el programa informático Scion Image (Scion Corporation,
U.S.A.).
2.5. Determinación del contenido de proteínas: Método del Ácido bicinchonínico (BCA).
Se siguió la técnica descrita por Smith et al. (1985). Este método se utiliza cuando en el
tampón de homogeneización puede haber agentes detergentes o de otro tipo que presentan
reacciones de interferencia con el reactivo azul Coomassie del método convencional de Bradford. El
fundamento de la técnica se basa en la capacidad de las proteínas para reducir el Cu2+ a Cu1+, de
forma que el Cu1+ reacciona con el ácido bicinchonínico formando un complejo púrpura con un
máximo de absorbancia a 562 nm.
En este método se emplea un colorante que se obtiene mezclando dos reactivos A y B en
proporción 50:1 (v/v). El reactivo A consiste en una disolución acuosa de ácido bicinchonínico (25,8
mM) en forma de sal sódica (ácido 4,4’-dicarboxi-2,2’-biquinolínico), Na2CO3·H2O (0,16 M),
tartrato sódico-potásico (5,7 mM), NaOH (0,1 M) y NaHCO3 (0,11 M) (pH 11,25). El reactivo B es
una disolución acuosa al 40% de CuSO4·5H2O. Ambos reactivos son estables a temperatura
ambiente de forma indefinida. Para realizar la determinación, se añadieron a 2 µL del homogenado
200 µL del reactivo de coloración y, tras incubar a 37ºC durante 30 minutos, se procedió a la lectura
Material y métodos
47
espectrofotométrica a 560 nm. El cálculo del contenido de proteínas se realizó por interpolación en
una curva patrón de albúmina sérica bovina fracción V.
2.6. Estudio histológico.
Las muestras destinadas para el estudio histológico se fijaron en una solución tamponada de
formaldehído (al 4% en tampón fosfato, pH 7,2) durante tres días. Después se deshidrataron con
alcohol a concentraciones crecientes hasta alcohol absoluto y se incluyeron en parafina.
Con ayuda de un microtomo se obtuvieron cortes de 3-5 µm de grosor que fueron
posteriormente teñidos con hematoxilina-eosina para su evaluación histológica mediante
microscopía óptica. Los cortes histológicos se evaluaron según el criterio establecido por Stucchi et
al. (2000) (Tabla 8).
2.7. Determinación del pH y humedad del contenido colónico
Los valores de pH del contenido colónico se midieron usando un medidor de pH GLP21-21
(Crisol, Barcelona, Spain), después de su suspensión en agua (1:5 p/v). El contenido de agua de las
heces se calculo por diferencia entre el peso de las mismas frescas (inmediatamente después de su
extracción) y secas (mantenidas en una estufa a 65º C durante 24 horas).
Material y métodos
48
Tabla 8. Escala de valoración del daño histológico en el modelo de colitis experimental por TNBS
en ratas.
Epitelio de la mucosa
Ulceración: ninguna (0); leve (1); moderada (2); intensa transmural (3)
Criptas
Actividad mitótica en: tercio inferior (0); tercio medio leve (1); tercio medio leve (1);
tercio medio moderada (2); tercio superior (3)
Infiltrado leucocitario
Depleción de moco
Lamina propia
Infiltrado plasmocítico
Infiltrado leucocitario
Vascularización
Deposición de fibrina: ninguna (0); mucosa (1); submucosa (2); transmural (3)
Submucosa
Infiltrado leucocitario
Edema
3. ESTUDIOS MICROBIOLÓGICOS
Las muestras del contenido luminal se pesaron, se homogeneizaron, se resuspendieron a
una concentración de 50-100 mg/mL en agua de peptona estéril, y se hicieron diluciones seriadas
1/10 (de 10-1 a 10-5). Se inocularon en una placa Petri 100µL de las diluciones 10-4 y 10-5 en medio
especifico para Lactobacillus (medio MSR, Oxoid) o Bifidobacterium (medio MSR suplementado
Material y métodos
49
con 0.5 mg/L de dicloxacilina, 1g/L de LiCl, y 0.5 g/L de L-cisteína) y se incubaron en cámaras de
anaerobiosis durante 24-48 horas a 37º C. En algunos ensayos también se determinaron coliformes y
enterobacterias usando placas de contaje especificas petrifilm (3M, St. Paul, MN). Después de la
incubación, el recuento final de colonias se expresó como log10 unidades formadoras de colonias/
gramo de material.
4. CUANTIFICACIÓN DE AGCC EN EL CONTENIDO INTESTINA L POR
CROMATOGRAFÍA DE GASES.
Los AGCC son los principales productos derivados de la fermentación de la fibra por la
flora bacteriana intestinal, principalmente acético, propiónico y butírico. Por este motivo, y en
algunos ensayos procedimos a su determinación en los contenidos colónicos de los animales
utilizados en nuestros estudios.
Los contenidos colónicos se homogeneizaron inmediatamente tras su obtención en una
solución de NaHCO3 (150 mM, pH 7,8) en atmósfera de argón y en una proporción 1:5 (p/v). Las
muestras se incubaron durante 24 horas a 37º C con agitación constante. Transcurrido ese tiempo, las
muestras se congelaron a –80º C hasta su procesamiento.
Tras descongelar los homogenados, los AGCC generados como consecuencia de su
incubación previa durante 24 horas, se extrajeron con acetato de etilo. Para ello, a una alícuota de 1
mL de homogenado fecal se le adicionaron 50 µL del estándar interno, acido 2-metilvalérico
(100mM), y una gota de acido sulfúrico (=10uL). Se agitó bien y se centrifugó a 10000 G durante 5
minutos a 4º C. Se recogió el sobrenadante (0.5 mL), y se le adicionaron 0.3 mL de acetato de etilo.
Se agitó suavemente evitando la formación de micelas, y se volvió a centrifugar a 14000 RPM
durante 5 minutos a 4º C para separar una fase inferior acuosa y otra superior de acetato de etilo
donde se encuentran los AGCC. Se recogió la capa superior y tras deshidratarla con sulfato sódico
anhidro se centrifugó por última vez a 10000 G durante 5 minutos a 4º C. Se recogió el extracto
orgánico exento de agua, y se pasó a un vial cromatográfico sellado y mantenido a –80º C hasta su
análisis. Se empleó un cromatógrafo de gases (Varian CP-3800) equipado con una ID CPWAX
52CB de 60 m de longitud y 0,25 mm de diámetro interno, y un detector FID (Varian, Lake Forest,
Material y métodos
50
CA). El helio fue el gas usado como transportador y mezclador de la muestra con un flujo de 1.5
mL/min. La temperatura de inyección fue 250º C. Las concentraciones de butirato, acetato y
propionato se calcularon automáticamente mediante el área de los picos usando el programa
Chromatography Workstation (versión 5.5), que estaba conectado on-line al detector FID
5. ENSAYOS IN VITRO
5.1. Determinación de la producción endógena de glutation y γ-Glu-Cys por los probióticos
Para la determinación de glutation, los probióticos se cultivaron en medio MSR a 37º C
durante 24 horas y se inocularon en tubos Falcon de 50 mL que contenían medio MSR. Se incubaron
durante 24 horas, y se cogió una muestra de 1 mL en la que se midió el contenido de glutation. Las
células se lavaron con agua destilada y se suspendieron en 300 µL de TCA al 7,5 %. La mezcla se
centrifugó a 10500 G durante 2 minutos y 10 µL del sobrenadante se mezcló con 300 µL de agua
miliQ en un nuevo tubo. 20 µL de esta solución se mezcló con 340 µL de de tampón fosfato 0,6 M
(pH 7,8), y 340 µL de Tris (carboxietilo) fosfina HCl (TCEP) en HCl 20 mM. La muestra se
mantuvo en oscuridad durante 15 minutos, se le añadió 800 µL de orto-ptalaldehido 12 mM en
acetato sódico 50 mM, y se mantuvo a 4º C durante 15 minutos. Las muestras se analizaron por
HPLC usando una columna Spherisorb S3 ODS a 0,8 ml/min en modo isocrático usando como fase
móvil acetato sodico (pH 7,7)/acetonitrilo (96:4).
5.2. Determinación de la producción de citocinas
Para la determinación de la producción de citocinas se obtuvieron macrófagos de medula
ósea de ratón, según el método descrito por Comalada et al., (2003). Se estimularon con 100 ng/mL
de LPS en presencia y ausencia del probiótico a una concentración de 106 CFU/mL durante 2 horas.
Pasado este tiempo, se lavaron con medio de cultivo para eliminar las bacterias no adheridas y
seguidamente se cultivaron en nuevo medio de cultivo durante 12 horas. La producción de TNF-α,
IL-12 e IL-10 se cuantificó por ELISA (CytoSetsTM; Biosource Internacional, Nivelles, Belgium) en
los sobrenadantes celulares según las instrucciones del fabricante.
Material y métodos
51
6. ESTUDIO ESTADÍSTICO.
Todos los resultados están expresados como la media aritmética ± error estándar de la
media, excepto los datos no paramétricos (índice de daño macroscópico y microscópico, valoración
de las características de las heces), que se expresan como mediana (rango). La significancia
estadística de las diferencias entre las medias se determinó realizando un análisis de varianza de una
vía (ANOVA). Los datos no paramétricos se evaluaron mediante el test de Mann-Whitney. Las
diferencias entre porcentajes se analizaron con el test de χ2. El umbral de significación se estableció
en p<0,05. El programa estadístico utilizado fue SIGMA STAT.
RESULTADOS
1. Estudio comparativo de los efectos preventivos ejercidos por tres probióticos: Bifidobacterium lactis,
Lactobacillus acidophilus y Lactobacillus casei en el modelo de colitis experimental por TNBS en ratas
B. lactis-L. casei-L. acidophilus
57
RESUMEN
OBJETIVO
Los probióticos constituirían una posible terapia para el tratamiento de la EII, sin embargo
el efecto y mecanismo de acción de los mismos difiere de unas cepas a otras, y además depende de
las características del hospedador; por esta razón, el objetivo del presente estudio fue probar los
efectos preventivos de diversos probióticos Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, y
Bidifobacterium lactis en el modelo de colitis experimental por TNBS en ratas, modelo de
inflamación intestinal con características histológicas y bioquímicas similares a la EII humana. La
selección de estos probióticos se basó en anteriores estudios que muestran la eficacia de los mismos.
RESULTADOS
Los resultados obtenidos en este estudio revelaron el efecto antiinflamatorio intestinal
ejercido por los tres probióticos. Desde el punto de vista macroscópico todos los probióticos
redujeron de manera significativa el cociente colónico peso/longitud (B. lactis: 156.7 ± 15.8 mg/cm;
L. acidophilus: 148.6 ± 15.8 mg/cm; L. casei: 189.8 ± 22.2 mg/cm; p<0.01 vs. Control: 249.7 ± 26.1
mg/cm), sin embargo solo las ratas tratadas con Bifidobacterium lactis, mostraron una menor
incidencia de diarrea en comparación con el grupo control.
El análisis bioquímico mostró que solo el tratamiento con Lactobacillus acidophilus redujo
la producción de MPO (77.4 ± 9.0 U MPO/g vs. Grupo Control: 133.5 ± 15.7 U MPO/g; p<0.01);
sin embargo, todos los probióticos restauraron los niveles colónicos de glutation, reducidos a
consecuencia del estrés oxidativo producido en el colon por el proceso inflamatorio (B. lactis: 1454
± 63 nmol/g; L. acidophilus: 1357 ± 78 nmol/g; L. casei: 1428 ± 65 nmol/g; p<0.05 vs. Control:
1075 ± 100 nmol/g). El grupo de ratas tratadas con Bifidobacterium lactis, experimentaron una
reducción de los niveles colónicos de TNFα (45.5 ± 7.9 pg/mg prot vs. Grupo control: 68.4 ± 10.3
pg/mg prot; p<0.05), así como una reducción en la expresión colónica de iNOS y COX-2; la
administración del probiótico Lactobacillus acidophilus redujo los niveles colónicos de LTB4 (66.2
± 16.2 pg/mg prot vs. Grupo control: 136.3 ± 35.4 pg/mg prot; p<0.05) y la expresión de iNOS; por
B. lactis-L. casei-L. acidophilus
58
ultimo, el tratamiento con Lactobacillus casei se asoció a una disminución en la expresión colónica
de COX-2. Finalmente, ninguno de los probióticos modificó los niveles de lactobacilos ni
bifidobacterias, sin embargo B. lactis aumento de manera significativa la relación
Bifidobacterium/patógeno y L. acidophilus y L. casei lo hicieron sobre la relación
Lactobacillus/patógeno
CONCLUSIÓN
Los tres probióticos ensayados mostraron cierta actividad antiinflamatoria intestinal en el
modelo de colitis experimental por TNBS en rata, siendo el perfil antiinflamatorio de cada
probiótico diferente, pudiendo ser considerados para su futuro desarrollo en el tratamiento de la
enfermedad inflamatoria intestinal en seres humanos.
ORIGINAL ARTICLE
A comparative study of the preventative effects exertedby three probiotics, Bifidobacterium lactis, Lactobacilluscasei and Lactobacillus acidophilus, in the TNBS model ofrat colitisL. Peran
1, D. Camuesco
1, M. Comalada
1, E. Bailon
1, A. Henriksson
2, J. Xaus
3, A. Zarzuelo
1and
J. Galvez1
1 Department of Pharmacology, University of Granada, Granada, Spain
2 DSM Food Specialties, Moorebank, Australia
3 Department of Immunology and Animal Sciences, Puleva Biotech SA, Granada, Spain
Introduction
Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic disease of
the digestive tract, and usually refers to two related con-
ditions, namely ulcerative colitis and Crohn’s disease,
which are characterized by chronic and spontaneously
relapsing inflammation. Although the aetiology of IBD
remains unknown, there is increasing experimental evi-
dence to support that abnormal regulation of the mucosal
immune system against enteric bacteria is a key event
underlying inflammatory mechanisms that lead to intesti-
nal injury in these intestinal conditions (Fiocchi 1998;
Keywords
cyclo-oxygenase 2, eicosanoid, experimental
colitis, inducible nitric oxide synthase,
probiotic, pro-inflammatory cytokine, rat.
Correspondence
Julio Galvez, Department of Pharmacology,
School of Pharmacy, University of Granada,
Campus Universitario ‘La Cartuja’ s ⁄ n, 18071
Granada (Spain). E-mail: [email protected]
2006 ⁄ 1217: received 28 August 2006, revised
18 December 2006 and accepted 20
December 2006
doi:10.1111/j.1365-2672.2007.03302.x
Abstract
Aims: The intestinal anti-inflammatory effects of three probiotics with
immunomodulatory properties, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus and
Bifidobacterium lactis, were evaluated and compared in the trinitrobenzene-
sulphonic acid (TNBS) model of rat colitis.
Methods and Results: Colitis was induced in rats by intracolonic administra-
tion of 10 mg of TNBS dissolved in 0Æ25 ml of 50% ethanol. Each probiotic
was administered orally (5 · 108 CFU suspended in 0Æ5 ml of skimmed milk)
for 3 weeks, starting 2 weeks before the administration of TNBS. Colonic dam-
age was evaluated histologically and biochemically 1 week after TNBS instilla-
tion. The results obtained revealed that all probiotics assayed showed intestinal
anti-inflammatory effects, macroscopically evidenced by a significant reduction
in the colonic weight ⁄ length ratio. Only B. lactis showed a lower incidence of
diarrhoea in comparison with untreated rats. Biochemically, all probiotics
restored colonic glutathione levels, depleted as a consequence of the oxidative
stress of the inflammatory process. Bifidobacterium lactis treatment reduced
colonic tumour necrosis factor (TNF)-a production, and inducible nitric oxide
synthase (iNOS) and cyclo-oxygenase-2 (COX-2) expression; L. acidophilus
administration reduced colonic leukotriene B4 production and iNOS expression
and L. casei intake was associated with a decrease in colonic COX-2 expression.
Conclusion: The three probiotics assayed have shown intestinal anti-inflamma-
tory activity in the TNBS model of rat colitis, although each probiotic shows
its own anti-inflammatory profile.
Significance and Impact of the Study: These probiotics could be considered as
potential adjuvants in the treatment of inflammatory bowel disease, although
more studies are required in order to demonstrate their efficacy in humans.
Journal of Applied Microbiology ISSN 1364-5072
ª 2007 The Authors
Journal compilation ª 2007 The Society for Applied Microbiology, Journal of Applied Microbiology 1
Guarner 2005). Among the different factors that may
contribute to this aberrant immune response, an imbal-
ance between aggressive and protective micro-organisms
within the gut lumen can play an important role. In con-
sequence, a possible therapeutic approach in IBD therapy
is the administration to these patients of probiotic micro-
organisms (Sartor 2004), defined as live microbial feed
supplements that beneficially affect the host by improv-
ing its intestinal microbial balance (Macfarlane and
Cummings 2002).
In fact, it has been reported that the administration of
a mixture of bifidobacteria and lactobacilli (Venturi et al.
1999) or Escherichia coli (Nissle 1917) (Rembacken et al.
1999) prevents the relapse of ulcerative colitis, the latter
being as effective as low-dose 5-amionosalicylic. More-
over, there are reports on successful induction and main-
tenance of the remission of chronic pouchitis and
ulcerative colitis after oral bacteriotherapy, being the most
convincing evidence of the clinical efficacy of probiotics
in clinical IBD (Gionchetti et al. 2003; Mimura et al.
2004; Furrie et al. 2005). However, treatments of Crohn’s
disease with probiotic preparations have reported con-
flicting results (Prantera et al. 2002; Bousvaros et al.
2005).
Although the results obtained after probiotic treatment
in both human IBD and experimental colitis are promis-
ing, it is clear that all probiotics are not equally beneficial;
each may have individual mechanisms of action, and the
host characteristics may determine which probiotic spe-
cies and even strain may be optimal. In fact, several stud-
ies have shown that not all probiotics exert constant
intestinal anti-inflammatory effects in experimental mod-
els of intestinal inflammation (Shibolet et al. 2002). For
this reason, it would be interesting to compare different
probiotics in the same experimental model, in order to
establish the best profile in a given setting and to further
understand this new concept for the therapy of IBD. The
aim of the present study was to test the preventative
effects of different probiotics, two lactobacilli, Lactobacillus
casei and Lactobacillus acidophilus, and one bidifobacteria,
Bifidobacterium lactis, in the trinitrobenzenesulphonic acid
(TNBS) model of rat colitis, a well-established model of
intestinal inflammation that has some histological and
biochemical features of the human disease (Jurjus et al.
2004). The selection of these probiotic strains was based
on previous in vitro and in vivo studies that would sup-
port their potential beneficial effect in these intestinal
conditions: L. casei has been described to downregulate
proinflammatory cytokines, such as IL-6 and IFN-c
in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated lamina propria
mononuclear cells (Matsumoto et al. 2005); L. acidophilus
treatment to mice has been shown to stimulate regulatory
cytokine, like IL-10 and transforming growth factor
(TGF)-b, in the colon of mice (Chen et al. 2005); and
finally, B. lactis has been reported to ameliorate bacterial
translocation (Eizaguirre et al. 2002) and to modulate
intestinal immune functions (Roller et al. 2004; Ruiz
et al. 2005). In addition, previous studies have also demo-
nstrated the intestinal anti-inflammatory activity of
L. acidophilus and L. casei in experimental models of
colitis (Chen et al. 2005; Llopis et al. 2005).
Materials and methods
This study was carried out in accordance with the ‘Guide
for the Care and Use of Laboratory Animals’, as promul-
gated by the National Institute of Health.
Reagents
All chemicals were obtained from Sigma Chemical
(Madrid, Spain), unless otherwise stated.
Preparation and administration of the probiotics
Probiotic strains L. casei (LAFTI� L26), L. acidophilus
(LAFTI� L10) and B. lactis (Bifidobacterium animalis lactis
LAFTI� B94) were provided by DSM Food Specialties
(The Netherlands). Lactobacilli strains were cultured in
MRS media at 37�C in anaerobic conditions using the
Anaerogen system (Oxoid, Basingstoke, UK). Bifidobacte-
rium lactis was grown in de Man Rogosa Sharpe (MRS)
media supplemented with 0Æ5-mg l)1 dicloxacilin, 1-g l)1
LiCl and 0Æ5 g l)1 l-cysteine hydrochloride and incubated
under anaerobic conditions. For probiotic treatment, bac-
teria was suspended in skimmed milk at the final concen-
tration of 109 colony-forming units (CFU) per ml and
stored at -80�C until usage. Freezing in milk and storage
at -80�C of probiotic samples did not modify their viabil-
ity, at least up to six months (data not shown).
Experimental design
Female Wistar rats (180–200 g) were obtained from the
Laboratory Animal Service of the University of Granada
(Granada, Spain) and maintained in standard conditions.
The rats were randomly assigned to five groups (n = 10);
two of them (noncolitic and control groups) received no
probiotic treatment and the remaining groups (treated
groups) received orally every probiotic (5 · 108 CFU sus-
pended in 0Æ5 ml of skimmed milk) daily for 3 weeks.
Both noncolitic and control groups received orally the
vehicle used to administer the probiotic (0Æ5-ml daily).
Two weeks after starting the experiment, the rats were
fasted overnight and those from the control and treated
groups were rendered colitic by the method originally
Probiotics in TNBS rat colitis L. Peran et al.
2 Journal compilation ª 2007 The Society for Applied Microbiology, Journal of Applied Microbiology
ª 2007 The Authors
described by Morris et al. (1989). Briefly, they were
anaesthetized with halothane and given 10 mg of TNBS
dissolved in 0Æ25 ml of 50% ethanol (v ⁄ v) by means of a
Teflon cannula inserted 8 cm through the anus. Rats
from the noncolitic group were administered intracoloni-
cally 0Æ25 ml of phosphate buffered saline instead of
TNBS. All rats were killed with an overdose of halothane
1 week after induction of colitis.
Histological and biochemical assessment of colonic
damage
The body weight, water and food intake, and the presence
of diarrhoea (as detected by perianal fur soiling), were
recorded daily throughout the experiment. Once the rats
were sacrificed, the colon was removed aseptically and the
existence of adhesions between the colon and adjacent
organs stated. Then, it was placed on an ice-cold plate,
longitudinally opened and the luminal contents were col-
lected for the microbiological studies (see later). After-
wards, the colonic segment was cleaned of fat and
mesentery, blotted on filter paper; each specimen was
weighed and its length measured under a constant load
(2 g). The colon was scored for macroscopically visible
damage on a 0–10 scale by two observers unaware of the
treatment, according to the criteria described by Bell
et al. (1995), which takes into account the extent and the
severity of colonic damage. The colon was subsequently
divided into four segments for biochemical determina-
tions. Two fragments were directly frozen at -80�C, and
the latter used for myeloperoxidase (MPO) activity and
inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclo-oxyge-
nase-2 (COX-2) expressions, as these enzymatic activities
were not modified by the freezing procedure. Another
sample was weighed and frozen in 1 ml of 50-g l)1 tri-
chloroacetic acid for total glutathione content determina-
tions. The remaining sample was immediately processed
for the measurement of colonic tumour necrosis factor
(TNF)-a and LTB4 levels. All biochemical measurements
were completed within 1 week from the time of sample
collection and were performed in duplicate.
MPO activity, as a marker of neutrophil infiltration,
was measured according to the technique described by
Krawisz et al. (1984); the results were expressed as MPO
units per gram of wet tissue; one unit of MPO activity
was defined as that degrading 1-lmol hydrogen peroxide
per minute at 25�C. Glutathione (reduced and oxidized)
concentrations, as markers of the colonic oxidative status,
were assayed by HPLC with fluorimetric detection of
oxidized and reduced glutathione, according to the
method proposed by Martin and White (1991); the
results were expressed as nmol of glutathione per mg wet
tissue. Colonic samples for TNFa and LTB4 determina-
tions were immediately weighed, minced on an ice-cold
plate and suspended in a tube with 10-mmol l)1 sodium
phosphate buffer (pH 7Æ4) (1 : 5 w ⁄ v). The tubes were
placed in a shaking water bath (37�C) for 20 min and
centrifuged at 9000 g for 30 s at 4�C; the supernatants
were frozen at -80�C until assay. TNFa was quantified by
enzyme-linked immunoabsorbent assay (Amersham Phar-
macia Biotech, Buckinghamshire, UK), and the results
were expressed as pg mg)1 protein. LTB4 was determined
by enzyme-immunoassay (Amersham Pharmacia Biotech,
Buckinghamshire, UK) and the results expressed as
pg mg)1 protein.
The colonic expression of iNOS and COX-2 was
analyzed by western blotting as previously described
(Camuesco et al. 2004). The dilutions of each primary anti-
body were 1 : 2000 for iNOS (Transduction Laboratories,
Becton Dickinson Biosciences, Madrid, Spain) and 1 : 1000
for COX-2 (Cayman Chemical Company, Montigny le
Bretonneux, France), and incubated overnight at 4�C fol-
lowed by peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG antibody
(1 : 3000) for 1 h. Control of protein loading and transfer
was conducted by the detection of the b-actin levels.
Microbiological studies
Luminal content samples were weighed, homogenized and
serially diluted in sterile peptone water. Serial 10-fold
dilutions of homogenates were plated on MRS media
(Oxoid, Madrid, Spain) for Lactobacillus or MRS media
supplemented with 0Æ5-mg l)1 dicloxacilin, 1-g l)1 LiCl
and 0Æ5-g l)1 l-cysteine hydrochloride for Bifidobacterium
and incubated under anaerobic conditions in an anae-
robic chamber for 24 h (lactobacilli) or 48 h (bifidobacte-
rias). Although MRS media is not selective for
lactobacilli, their growth at 37�C and for only 24 h limits
the growth of other potential lactic acid bacteria. How-
ever, it is impossible to eliminate the possibility that other
lactic acid bacteria will be able to grow in these condi-
tions. Coliforms and entherobacteria were also deter-
mined by using specific Count Plates Petrifilm (3M,
St. Paul, MN, USA). After incubation, the final count of
colonies was reported as log10 CFU per gram of material.
Statistics
All results are expressed as the mean ± SEM. The differ-
ences between means were tested for statistical signifi-
cance using a one-way analysis of variance (anova) and
post hoc least significance tests. Nonparametric data
(score) are expressed as the median (range) and were
analyzed using the Mann–Whitney U-test. Differences
between proportions were analyzed with the chi-squared
test. All statistical analyses were carried out with the
L. Peran et al. Probiotics in TNBS rat colitis
ª 2007 The Authors
Journal compilation ª 2007 The Society for Applied Microbiology, Journal of Applied Microbiology 3
Statgraphics 5.0 software package (STSC, Maryland,
USA), with statistical significance set at P < 0Æ05.
Results
The administration of probiotics for 2 weeks before colitis
induction did not affect weight evolution compared with
untreated rats. The intracolonic administration of TNBS
resulted in an intestinal inflammatory status in the rats
characterized by anorexia, loss of weight and diarrhoea,
which gradually increased with time during the 7 days after
instillation (not shown). These parameters were not signifi-
cantly modified by any probiotic treatment, with the
exception of the group treated with B. lactis, which showed
an amelioration in the diarrhoeic process, and resulting
after 7 days in a significantly lower incidence of diarrhoea
when compared with TNBS control rats (P < 0Æ05, Fig. 1).
Furthermore, at 1 week after TNBS treatment, the animals
that were treated with probiotics had fewer signs of mucos-
al inflammation. This beneficial effect was evidenced mac-
roscopically by a significant reduction of the colonic
weight ⁄ length ratio in all probiotic treated groups
(Table 1). However, only the group of colitic rats treated
with L. acidophilus showed a significantly lower colonic
damage score than that of TNBS control rats (P < 0Æ05).
Animals treated with L. acidophilus had a significant
decrease in the extent of colonic necrosis and ⁄or inflamma-
tion induced by the administration of TNBS. Furthermore,
this group of rats also showed a significant reduction in the
incidence of adhesions of the colon to adjacent organs
(intestinal loops, stomach, etc.) in comparison with
untreated colitic control rats (P < 0Æ05, Fig. 1).
The biochemical analysis of the colonic specimens con-
firms the intestinal anti-inflammatory effect exerted by
the different probiotics, although their effects on the dif-
ferent biochemical parameters assayed were not homo-
geneous among groups. Thus, colonic MPO activity was
only reduced after treatment with L. acidophilus, which
indicates reduced neutrophil infiltration of the inflamed
tissue after this probiotic treatment (Fig. 2). The treat-
ment of colitic rats with any probiotic showed a signifi-
cant increase in colonic glutathione content (Fig. 3),
which is depleted in colitic rats as a consequence of the
colonic oxidative stress induced by the inflammatory pro-
cess, as previously reported in this model of experimental
colitis (Galvez et al. 2003). The colonic inflammation
induced by TNBS was also characterized by increased lev-
els of colonic TNFa and LTB4 (Figs 4 and 5). When
B. lactis was administered to colitic rats, a significant
reduction in colonic TNFa production was observed,
whereas L. acidophilus administration significantly
reduced colonic LTB4 production in the inflamed colon
in comparison with untreated colitic rats (Figs 4 and 5).
100
80
60
40
20
Perc
en
tag
e
0Diarrhoea Adhesions
*
*
Figure 1 Effects of probiotic treatment (5 · 108 CFU per rat per day)
on the incidence of diarrhoea and of adhesions of the colon to
adjacent organs in trinitrobenzenesulphonic acid (TNBS) experimental
colitis in rats. *P < 0Æ05 vs TNBS control group. ( ) TNBS-control;
( ) B. lactis; (h) L. acidophilus; ( ) L. casei.
Table 1 Effects of probiotic treatment on macroscopic damage score,
extent of the inflammatory lesion along the colon and changes in
colon weight in trinitrobenzenesulphonic acid (TNBS) experimental
colitis in rats
Group
Damage
score
(0–10)
Extent of
damage
(cm)
Colon
weight
(mg cm)1)
Noncolitic 0 0 71Æ0 ± 2Æ5
TNBS control 6Æ5 (5Æ5–8Æ5) 3Æ5 ± 0Æ3 249Æ7 ± 26Æ1
Bifidobacterium lactis 6 (4–7) 2Æ8 ± 0Æ3 156Æ7 ± 15Æ8�
Lactobacillus acidophilus 5Æ5 (4–7)* 2Æ5 ± 0Æ3* 148Æ6 ± 15Æ8�
Lactobacillus casei 6 (4–7Æ5) 2Æ7 ± 0Æ4 189Æ8 ± 22Æ2�
Damage score for each rat was assigned according to the criteria des-
cribed previously by Bell et al. (1995); data are expressed as median
(range) (n = 10). Extent of damage and colon weight data are
expressed as mean ± SEM (n = 10).
*P < 0Æ05.
�P < 0Æ01 vs TNBS control.
All colitic groups differ significantly from noncolitic group (P < 0Æ01,
not shown).
150
180
120
90
60
30
MP
O a
ctivity
(U g
–1 tis
sue)
0
**
Figure 2 Effects of probiotic treatment on colonic myeloperoxidase
(MPO) activity in TNBS experimental colitis in rats. One unit of MPO
activity was defined as that degrading 1-lmol hydrogen peroxide per
min at 25�C. Data are expressed as mean ± SEM (n = 10). All groups
differ from noncolitic group (P < 0Æ01; not shown). **P < 0Æ01 vs
trinitrobenzenesulphonic acid (TNBS) control group. (h) non-colitic;
( ) TNBS-control; ( ) B. lactis; ( ) L. acidophilus; ( ) L. casei.
Probiotics in TNBS rat colitis L. Peran et al.
4 Journal compilation ª 2007 The Society for Applied Microbiology, Journal of Applied Microbiology
ª 2007 The Authors
Finally, the inflammatory process in the colonic tissue
was also associated with higher expression of both iNOS
and COX-2 (Fig. 6), in comparison with noncolitic ani-
mals. The treatment of colitic rats with Bifidobacterium
lactis resulted in a significant reduction of the expression
of both induced enzymes; Lactobacillus casei was able to
significantly reduce COX-2 expression, whereas L. acido-
philus only reduced iNOS expression (Fig. 6).
Effects of probiotic administration on colonic bacterial
profile
TNBS colitis resulted in a significant reduction in faecal
lactobacilli count in comparison with normal rats
(P < 0Æ05), which was returned to normal values in probi-
otic-treated colitic rats (Fig. 7a). No statistical differences
were observed in bifidobacteria counts among three groups
(P > 0Æ1; Fig. 7a) nor in the amount of other faecal potential
1200
1600
#
800
400
0
Glu
tath
ion
e
(nm
ol g
–1 tis
sue)
* * *
Figure 3 Effects of probiotic treatment on colonic glutathione (GSH)
content in trinitrobenzenesulphonic acid (TNBS) experimental colitis in
rats. Data are expressed as mean ± SEM (n = 10). #P < 0Æ01 vs nonco-
litic group; *P < 0Æ05 vs TNBS control group. (h) non-colitic;
( ) TNBS-control; ( ) B. lactis; ( ) L. acidophilus; ( ) L. casei.
100
80
60
40
20
0
*
TN
Fα
(pg m
g–1 p
rote
in)
Figure 4 Effects of probiotic treatment on colonic tumour necrosis
factor (TNF)-a levels in trinitrobenzenesulphonic acid (TNBS) experi-
mental colitis in rats. Data are expressed as mean ± SEM (n = 10). All
groups differ from noncolitic group (P < 0Æ01; not shown). *P < 0Æ05
vs TNBS control group. (h) non-colitic; ( ) TNBS-control; ( ) B. lactis;
( ) L. acidophilus; ( ) L. casei.
Non-
colitic TNBS-control B. lactis L. casei L. acidophilus
COX-2
iNOS
a-actin
Figure 6 Effects of probiotic treatment (5 · 108 CFU per rat per day)
on colonic inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclo-oxygenase-
2 (COX-2) expression in trinitrobenzenesulphonic acid (TNBS) experi-
mental colitis in rats. iNOS and COX-2 expression were analysed by
western blot using colonic homogenates as described in materials and
methods. One hundred and fifty micrograms of protein were load in
each lane. Only two representative samples of each experimental
group (n = 10) were represented in this figure, but all of them were
analysed. a-actin expression was used as control for loading and
transfer.
160
120
80
40
LTB
4
(pg
mg
–1 t
issu
e)
0
*
Figure 5 Effects of probiotic treatment on colonic leukotriene B4
(LTB4) levels in trinitrobenzenesulphonic acid (TNBS) experimental coli-
tis in rats. Data are expressed as mean ± SEM (n = 10). All groups
differ from noncolitic group (P < 0Æ01; not shown). *P < 0Æ05 vs TNBS
control group. (h) non-colitic; ( ) TNBS-control; ( ) B. lactis;
( ) L. acidophilus; ( ) L. casei.
10
(a)
(b)
8
6
4
2
Bacte
ria levels
(CF
U log
10 g
–1 lum
inal
conte
nt)
0
1
0·8
0·6
0·4
0·2
0
1
0·8
0·6
0·4
0·2
0
Lactobacilli
Lacto
bacill
i/path
ogen
ratio
Bifid
obacte
ria/p
ath
ogen
ratio
Bifidobacteria
#
#
# ##
**
Figure 7 Effects of probiotic treatment (5 · 108 CFU per rat per day)
on (a) bacteria levels (lactobacillus and bifidobacteria) and on (b) lacto-
bacilli ⁄ pathogen ratio or bifidobacteria ⁄ pathogen ratio in trinitroben-
zenesulphonic acid (TNBS) experimental colitis in rats. The values are
represented as the mean ± SEM (n = 10). *P < 0Æ05 vs TNBS control
group; #P < 0Æ01 vs noncolitic group. (h) non-colitic; ( ) TNBS-
control; ( ) B. lactis; ( ) L. acidophilus; ( ) L. casei.
L. Peran et al. Probiotics in TNBS rat colitis
ª 2007 The Authors
Journal compilation ª 2007 The Society for Applied Microbiology, Journal of Applied Microbiology 5
pathogenic bacteria, such as entherobacteria or coliform
bacteria (data not shown). However, when the ratio of
lactobacilli ⁄pathogen or bifidobacteria ⁄pathogen was eval-
uated, the inflammatory process did result in a significant
decrease in comparison with normal rats. The administra-
tion of probiotic resulted, in all cases, in a normalization of
their corresponding ratio, that is B. lactis restored bifido-
bacteria ⁄pathogen ratio, whereas both lactobacilli signifi-
cantly increased lactobacilli ⁄pathogen ratio (Fig. 7b).
Discussion
The results obtained in the present study support previ-
ous studies describing the efficacy of probiotic therapy in
the treatment of intestinal conditions, like inflammation
and diarrhoea (Doron and Gorbach 2006). However,
these studies have also reported that not all probiotics are
equally beneficial, and these differences can be derived
from different mechanisms of action among micro-organ-
isms. For this reason, it is interesting to evaluate and
compare the effects of different probiotics in the same
experimental conditions in order to establish which
micro-organisms can show the best profile as anti-inflam-
matory agents, or even to know if different probiotics
may act synergistically to downregulate the intestinal
inflammation by acting on different targets in the inflam-
matory response.
In this study, we have described the preventative intes-
tinal anti-inflammatory activity of three probiotics B. lactis,
L. casei and L. acidophilus, in the TNBS model of rat
colitis. The results obtained confirm previous studies
performed with these micro-organisms in different experi-
mental models of colitis. The beneficial effect exerted by
B. lactis was initially observed by a significant reduction
in the number of rats with diarrhoea in comparison with
the colitic untreated group, suggesting the preservation of
the barrier integrity in the colon. This may be of interest
as a barrier disruption by inflammation leads to increased
stimulation by luminal antigens, such as food antigens,
bacterial toxins and micro-organisms, of the different
types of cells in the lamina propria, including immune
cells (Heyman et al. 1994). In fact, a previous study has
reported the ability of B. lactis in preserving the integrity
of intestinal mucosa in a murine short bowel model and
preventing bacterial translocation (Eizaguirre et al. 2002).
In addition, a recent study has proposed that B. lactis
promotes the activation of the TLR2 system in epithelial
cells (Ruiz et al. 2005), which may contribute to the pre-
servation of the barrier integrity in the colon (Cario et al.
2004). The evaluation of the colonic specimens from co-
litic rats treated with this probiotic showed a significant
decrease in the weight ⁄ length ratio, an index of colonic
oedema, which increased significantly as a consequence of
the inflammatory process. This beneficial effect was also
associated with a restoration in colonic glutathione con-
tent, which is depleted as a result of the intense oxidative
stress that takes place after TNBS administration (Galvez
et al. 2001). This is an important mechanism for tissue
damage during chronic intestinal inflammation. In fact,
previous studies have shown that the antioxidant and ⁄or
radical scavenging properties of different compounds,
including flavonoids and 5-aminosalicylic acid (5-ASA)
derivatives, may contribute to their beneficial effects in
these intestinal conditions (Grisham 1994; Camuesco et
al. 2004). When the different inflammatory mediators
were evaluated, B. lactis was able to significantly reduce
colonic TNFa production, a cytokine that has been repor-
ted to play a key role in intestinal inflammation (Rutge-
erts et al. 2004). This effect can be attributed to the
existence of a cross talk between bacteria and mucosal
cells, being able to downregulate the degree of activation
of intestinal immune cells, as it has been also proposed to
occur with B. lactis, either alone (Ruiz et al. 2005) or in
combination with other probiotics or prebiotics (Roller et
al. 2004). The intestinal anti-inflammatory effect of this
probiotic was also associated with a reduced expression of
iNOS and COX-2, which are induced in intestinal epithe-
lium during active intestinal inflammation (Kimura et al.
1997; Singer et al. 1998). It is interesting to note that this
effect may be associated with the aforementioned ability
of this probiotic to preserve glutathione content and to
exert antioxidant properties given the relationship previ-
ously established between oxidative stress and upregula-
tion of iNOS and COX-2 expression (Hecker et al. 1996;
Lu and Wahl 2005). The final consequence of these inter-
ventions would be the downregulation of the production
important proinflammatory mediators in IBD, i.e. reactive
nitrogen metabolites and prostaglandins, which have been
reported to play a key role in the pathophysiology of
these intestinal conditions (Fiocchi 1998).
Previous reports have shown that L. acidophilus can
exert immunomodulator properties (Galdeano and Perdigon
2004; Haghighi et al. 2005) that make this probiotic
bacteria suitable for the treatment of pathologies with an
altered immune response, including IBD. In fact, the
inoculation of this probiotic in mice inhibits murine coli-
tis induced by Citrobacter rodentium infection (Chen
et al. 2005). The present study reveals that L. acidophilus
partially prevents TNBS-induced colonic damage in rats,
as is evidenced both macroscopically, by a significant
decrease in the colonic damaged area and in the weight ⁄
length ratio, and biochemically, by a significant reduction
in MPO activity, in comparison with untreated control
rats. The decrease in this enzyme activity reveals a lower
infiltration of neutrophils in the inflamed intestine, prob-
ably derived from the reduction in the colonic production
Probiotics in TNBS rat colitis L. Peran et al.
6 Journal compilation ª 2007 The Society for Applied Microbiology, Journal of Applied Microbiology
ª 2007 The Authors
of the chemotactic eicosanoid LTB4 observed in the rats
treated with L. acidophilus. The inhibitory effect on neu-
trophil activity can result in an attenuation of the colonic
oxidative stress, as observed by the partial restoration in
colonic glutathione content elicited after the treatment of
colitic rats with this probiotic treatment. Consequently,
an inhibitory effect on LTB4 synthesis and ⁄or release
could be considered as a mechanism involved in the
beneficial effect exerted by the probiotic L. acidophilus in
this model of experimental colitis, similar to what has
been previously proposed for different drugs used in the
treatment of IBD, like sulphasalazine and 5-ASA (Travis
and Jewel 1994), or for dietary manipulations, like x-3
polyunsaturated fatty acids (Camuesco et al. 2005a) or
prebiotics (Camuesco et al. 2005b). Finally, the intestinal
anti-inflammatory effect showed by this probiotic was
associated with a reduced expression of iNOS expression,
which would result in a lower NO production, thus
avoiding the deleterious effect of this free radical when
produced in large amounts (Grisham 1994).
The third probiotic used was L. casei, a probiotic that
has been reported to attenuate mucosal injury and
inflammatory response in the TNBS experimental model
of rat colitis, and the effect associated with a partial pre-
vention in bacterial translocation to mesenteric lymph
nodes, spleen and liver (Llopis et al. 2005). The results
obtained in the present study confirm the beneficial effect
of this probiotic in this experimental model of rat colitis.
This was evidenced macroscopically by a significant
reduction in the colonic weight ⁄ length ratio, and bio-
chemically by significant amelioration of the glutathione
depletion. The effect was associated with a significant
reduction in COX-2 expression, probably derived from
the amelioration in the colonic oxidative stress that takes
place in this intestinal condition. However, when the
efficacy of L. casei is compared with the other two probi-
otics assayed in the present study, it shows a modest
intestinal anti-inflammatory effect.
A common feature in the three probiotics assayed is
their ability to modify colonic microflora, which was
altered as a consequence of the inflammatory process
induced by TNBS, similar to that described previously
(Peran et al. 2005). In fact, the probiotic treatment
resulted in a restoration in the ratio between pathogenic
bacteria and bifidobacteria (B. lactis) or lactobacilli
(L. acidophilus and L. casei). This effect can definitively
contribute to the beneficial effect exerted by these probi-
otics in this model of experimental colitis. In fact, it has
been previously described that the increase in Lactobacillus
sp. or Bifidobacteria sp. levels reduces the concentration
of adherent and translocated bacteria and attenuates the
colitis in IL-10 gene-deficient mice (Madsen et al. 1999),
thus preventing the pathogenic effect of other species
that may play an important role in the generation of
the exacerbated immune response in intestinal inflam-
mation, as proposed, both in experimental models (Gar-
cia-Lafuente et al., 1997) and in humans (Cummings
et al. 2003).
In conclusion, the three probiotics assayed (B. lactis,
L. acidophilus and L. casei) have shown intestinal anti-
inflammatory activity in the TNBS model of rat colitis.
However, each probiotic shows its own anti-inflammatory
profile, confirming previous observations that not all the
probiotics present the same efficacy as anti-inflammatory
agents, and do not share the same mechanisms of action
in exerting the beneficial effect.
Acknowledgements
This study was supported by DSM Food Specialties, the
Spanish Ministry of Science and Technology (SAF2005-
03199) and by Instituto de Salud ‘Carlos III’ (PI021732),
with funds from the European Union, and by Junta de
Andalucia (CTS 164). Monica Comalada is a recipient of
Juan de la Cierva Program from the Spanish Ministry of
Science and Technology.
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2. Efectos preventivos del probiótico Lactobacillus salivarius ssp. salivarius en el modelo de colitis
experimental por TNBS en rata
L. salivarius ssp. salivarius
71
RESUMEN
OBJETIVO
Los probióticos ensayados anteriormente mostraron solamente un efecto beneficioso
moderado, por lo que decidimos ensayar otros probióticos con propiedades añadidas cuya selección
atendió a diferentes criterios como su capacidad para regular la respuesta inmunológica en la mucosa
intestinal mediante la producción de citocinas. En este sentido, varias especies de Lactobacillus
tienen la capacidad de afectar a la producción del factor de necrosis tumoral α (TNFα), citocina
proinflamatoria con un papel relevante en la patogénesis de la EII.
El objetivo del presente estudio fue ensayar el efecto preventivo de Lactobacillus salivarius
ssp. salivarius en el modelo de colitis experimental por TNBS en ratas. La selección de
Lactobacillus salivarius ssp. salivarius se basó en su capacidad de reducir la producción de citocinas
proinflamatorias, de adherirse a las células de la mucosa intestinal e inhibir el crecimiento de
bacterias patógenas.
RESULTADOS
El tratamiento con Lactobacillus salivarius ssp. salivarius, mejoró la respuesta inflamatoria
en comparación con las ratas colíticas no tratadas. Se observó un descenso significativo del grado de
necrosis y/o inflamación (2,3 ± 0,4 cm vs. 3,4 ± 0,3 cm del grupo control, P<0.01) y del cociente
peso/longitud (143.3 ± 11.8 mg/cm vs. 209.7 ± 17.0 mg/cm P<0.01), aumentados en las ratas
colíticas como consecuencia de la administración del TNBS. El análisis histológico mostró una
recuperación muy evidente del daño colónico, presentando una menor infiltración de neutrófilos en
comparación con las ratas colíticas no tratadas. La reducción de la infiltración leucocitaria también
se puso de manifiesto por una disminución en la actividad colónica de MPO (105,3 ± 26,0 U/g vs.
180,6 ± 21,9 U/g, P<0.05). El tratamiento con Lactobacillus salivarius también logro restaurar de
manera significativa los niveles colónicos de glutation (1252 ± 42 nmol/g vs. 1087 ± 51 nmol/g,
P<0.05), que se depleciona a causa del estrés oxidativo provocado por el proceso inflamatorio.
Además, el tratamiento probiótico redujo también de manera significativa los niveles de TNFα
L. salivarius ssp. salivarius
72
colónico (509,4 ± 68,2 pg/g vs. 782,9 ± 60,1 pg/g, P<0.01) y la expresión colónica de la iNOS en
comparación con los animales colíticos no tratados. Finalmente, los animales tratados mostraron un
mayor recuento de Lactobacillus en el contenido colónico, sin existir diferencias en el recuento de
Bifidobacterium.
CONCLUSIÓN
El tratamiento con el probiótico Lactobacillus salivarius ssp. salivarius CECT5713 facilita
la recuperación del tejido inflamado en el modelo de colitis experimental por TNBS en rata, efecto
asociado a la inhibición en la producción de algunos de los mediadores implicados en la respuesta
inflamatoria intestinal, tales como citocinas, incluyendo TNFα, y NO. Este efecto beneficioso se
podría atribuir a su efecto sobre la respuesta inmunitaria alterada característica de la enfermedad
inflamatoria intestinal.
• BRIEF REPORTS •Preventative effects of a probiotic, Lactobacillus salivarius ssp.salivarius, in the TNBS model of rat colitisLaura Peran, Desiree Camuesco, Monica Comalada, Ana Nieto, Angel Concha, Maria Paz Diaz-Ropero, Monica Olivares,Jordi Xaus, Antonio Zarzuelo, Julio Galvez
ELSEVIER
PO Box 2345, Beijing 100023, China World J Gastroenterol 2005;11(33):5185-5192www.wjgnet.com World Journal of Gastroenterology ISSN [email protected] © 2005 The WJG Press and Elsevier Inc. All rights reserved.
Laura Peran, Desiree Camuesco, Monica Comalada, AntonioZarzuelo, Julio Galvez, Department of Pharmacology, School ofPharmacy, University of Granada, SpainAna Nieto, Health and Progress Foundation, Granada, SpainAngel Concha, Department of Pathology, Hospital Universitario“Virgen de las Nieves”, Granada, SpainMaria Paz Diaz-Ropero, Monica Olivares, Jordi Xaus, Departmentof Immunology and Animal Sciences, Puleva Biotech, S.A. Granada,SpainSupported by the Spanish Ministry of Science and Technology,No. SAF2002-02592 and by Instituto de Salud ‘Carlos III’, No.PI021732, with Funds from the European Union, and by Junta deAndalucia (CTS 164). Monica Comalada is a recipient of Juan de laCierva Program from Spanish Ministry of Science and Technology.Laura Peran is a Recipient From Puleva Foundation SpainCorrespondence to: Julio Galvez, PhD, Department of Pharmacology,School of Pharmacy, University of Granada, Campus Universitario‘La Cartuja’ s/n, Granada 18071, Spain. [email protected]: +34-958-243889 Fax: +34-958-248964Received: 2004-11-23 Accepted: 2005-02-28
AbstractAbstractAbstractAbstractAbstractAIM: To investigate the intestinal anti-inflammatory effectand mechanism of a probiotic Lactobacillus salivarius ssp.salivarius CECT5713 in the TNBS model of rat colitis.METHODS: Female Wistar rats (180-200 g) were usedin this study. A group of rats were administered orally theprobiotic L. salivarius ssp. salivarius (5×108 CFU suspendedin 0.5 mL of skimmed milk) daily for 3 wk. Two additionalgroups were used for reference, a non-colitic and a controlcolitic without probiotic treatment, which received orallythe vehicle used to administer the probiotic. Two weeksafter starting the experiment, the rats were rendered coliticby intracolonic administration of 10 mg of TNBS dissolvedin 0.25 mL of 500 mL/L ethanol. One week after colitisinduction, all animals were killed and colonic damage wasevaluated both histologically and biochemically. Thebiochemical studies performed in colonic homogenatesinclude determination of myeloperoxidase (MPO) activity,glutathione (GSH) content, leukotriene B4 (LTB4) and tumornecrosis factor α (TNF-α) levels, as well as inducible nitricoxide synthase (iNOS) expression. In addition, the luminalcontents obtained from colonic samples were used formicrobiological studies, in order to determine Lactobacilliand Bifidobacteria counts.RESULTS: Treatment of colitic rats with L. salivarius ssp.salivarius resulted in amelioration of the inflammatoryresponse in colitic rats, when compared with the corresponding
control group without probiotic treatment. This anti-inflammatory effect was evidenced macroscopically bya significant reduction in the extent of colonic necrosisand/or inflammation induced by the administration ofTNBS/ethanol (2.3±0.4 cm vs 3.4±0.3 cm in control group,P<0.01) and histologically by improvement of the colonicarchitecture associated with a reduction in the neutrophilinfiltrate in comparison with non-treated colitic rats. Thelatter was confirmed biochemically by a significant reductionof colonic MPO activity (105.3±26.0 U/g vs 180.6±21.9 U/g,P<0.05), a marker of neutrophil infiltration. The beneficialeffect was associated with an increase of the colonic GSHcontent (1 252±42 nmol/g vs 1 087±51 nmol/g, P<0.05),which is depleted in colitic rats, as a consequence of theoxidative stress induced by the inflammatory process. Inaddition, the treatment of colitic rats with L. salivariusresulted in a significant reduction of colonic TNF-α levels(509.4±68.2 pg/g vs 782.9±60.1 pg/g, P<0.01) and in alower colonic iNOS expression, when compared to TNBScontrol animals without probiotic administration. Finally,treated colitic rats showed higher counts of Lactobacillispecies in colonic contents than control colitic rats, whereasno differences were observed in Bifidobacteria counts.CONCLUSION: Administration of the probiotic L. salivariusssp. salivarius CECT5713 facilitates the recovery of theinflamed tissue in the TNBS model of rat colitis, an effectassociated with amelioration of the production of someof the mediators involved in the inflammatory responsein the intestine, such as cytokines, including TNF-α andNO. This beneficial effect could be ascribed to its effecton the altered immune response that occurs in thisinflammatory condition.© 2005 The WJG Press and Elsevier Inc. All rights reserved.
Key words: Lactobacillus salivarius ssp. salivarius; TNBSrat colitis; Probiotic; Tumor necrosis factor α; Nitric oxidePeran L, Camuesco D, Comalada M, Nieto A, Concha A, Diaz-Ropero MP, Olivares M, Xaus J, Zarzuelo A, Galvez J.Preventative effects of a probiotic, Lactobacillus salivariusssp. salivarius, in the TNBS model of rat colitis. World JGastroenterol 2005; 11(33): 5185-5192http://www.wjgnet.com/1007-9327/11/5185.asp
INTRODUCTIONINTRODUCTIONINTRODUCTIONINTRODUCTIONINTRODUCTIONInflammatory bowel disease (IBD) is a chronic disease of
5186 ISSN 1007-9327 CN 14-1219/ R World J Gastroenterol September 7, 2005 Volume 11 Number 33
the digestive tract, and usually refers to two related conditions,namely ulcerative colitis and Crohn’s disease, characterizedby chronic and spontaneously relapsing inflammation.Although the etiology of IBD remains unknown, there isincreasing experimental evidence to support a role forluminal bacteria in the initiation and progression of theseintestinal conditions; probably related to an imbalance in theintestinal microflora, relative predominance of aggressivebacteria and insufficient amount of protective species[1,2].This could justify the remission achieved in intestinal inflam-mation, after treatment with antibiotics such as metronidazoleor ciprofloxacin[3], or the fact that germ-free animals mayfail to develop experimental intestinal inflammation[4]. Inconsequence, a possible therapeutic approach in IBDtherapy is the administration to these patients of probioticmicroorganisms, defined as viable nutritional agentsconferring benefits to the health of the human host. Infact, it has been reported that administration of a mixtureof Bifidobacterium and Lactobacillus[5] or of non-pathogenicviable Escherichia coli[6] prolongs remission in ulcerative colitis.Moreover, there are reports on successful induction andmaintenance of remission of chronic pouchitis after oralbacteriotherapy[7,8]. However, treatments of Crohn’s diseasewith probiotic preparations reported conflicting results[9-12].
Different mechanisms have been proposed to participatein the therapeutic effects exerted by probiotic microorganisms.First, probiotic microorganisms may exert their actionthrough a modulation of the intestinal bowel flora, whichmay result from competitive metabolic interactions withpotential pathogens, production of anti-microbial peptides,or inhibition of epithelial adherence and translocation bypathogens[5,13]; second, probiotics have been proposed tomodulate the host defenses by influencing the intestinalimmune system[14,15]; and third, these microorganisms havebeen reported to positively affect the intestinal barrierfunction[16,17]. However, the detailed mechanisms by whichthese bacteria mediate their effects are not fully understood.
Although the results obtained after probiotic treatmentin both human IBD and experimental colitis are promising,new studies are required in order to further understand thisnew concept for the therapy of IBD, even if we considerthe fact that many studies have shown that not all bacterialspecies have equal activities in reducing intestinalinflammation[18,19]. Hence, the selection of new probioticstrains for the treatment of IBD can be based on theirability to regulate the immune response of the intestinalmucosa. This can be the case of Lactobacilli strains, whichwere able to downregulate the production of tumor necrosisfactor α (TNF-α). In fact, previous ex vivo experimentshave reported the ability of L. casei and of L. bulgaricus todownregulate TNF-α production in colonic explants frompatients with Crohn’s disease[20], thus supporting their futuredevelopment for IBD therapy. This may be of specialrelevance, since several studies have attributed a key role inthe pathogenesis of IBD to this pro-inflammatory cytokine,as evidenced by the increased production of TNF-α in theintestinal mucosa from IBD patients[21,22] as well as by anumber of clinical studies using anti-TNF-α mAb therapythat have clearly shown a beneficial effect in these patients[23].
The aim of the present study was to test the preventative
effects of a L. salivarius ssp. salivarius strain in the trinitrob-enzenesulfonic acid (TNBS) model of rat colitis, a well-established model of intestinal inflammation with someresemblance to human IBD[24]. The selection of thislactobacilli strain was based on previous in vitro studies thatshowed its ability to adhere to human intestinal cells, toinhibit pathogenic bacterial growth (unpublished results) andto reduce the production of inflammatory cytokines byimmune cells. Special attention was paid to its effects onthe production of some of the mediators involved in theinflammatory response, such as TNFα, leukotriene B4(LTB4) and nitric oxide (NO). In addition, the correlationamong the intestinal anti-inflammatory effect of L. salivariusssp. salivarius and modifications on colonic flora induced bythis probiotic was also studied.
MAMAMAMAMATERIALS AND METHODSTERIALS AND METHODSTERIALS AND METHODSTERIALS AND METHODSTERIALS AND METHODSThis study was carried out in accordance with the ‘Guidefor the Care and Use of Laboratory Animals’ as promulgatedby the National Institute of Health.ReagentsAll chemicals were obtained from Sigma Chemical (Madrid,Spain), unless otherwise stated. Glutathione (GSH) reductasewas provided by Boehringer Mannheim (Barcelona, Spain).In vitro modulation of cytokine production by bacteriaPuleva Biotech’s lactic acid bacteria collection was screenedfor Lactobacilli bacteria with the ability to reduce theproduction of inflammatory cytokines by activatedmacrophages. For this purpose, rodent bone marrow-derived macrophages, obtained as previously described[25],were stimulated with 100 ng/mL LPS, in the presence orabsence of 106 CFU/mL of each bacteria for 2 h. Then,cells were washed with culture media to eliminate non-attached bacteria, and cultured with new media for 12 h.TNF-α, IL-12, and IL-10 production was evaluated by ELISAin cell supernatants (CytoSetsTM, Biosource International,Nivelles, Belgium) following manufacturer’s instructions.Preparation and administration of the probioticL. salivarius ssp. salivarius CECT5713 was provided by PulevaBiotech (Granada, Spain) and it was normally grown in MRSmedia at 37 in anaerobic conditions using the AnaeroGensystem (Oxoid, Basingstoke, UK). For probiotic treatment,bacteria was suspended in skimmed milk (109 CFU/mL)and stored at -80 until usage.Experimental designFemale Wistar rats (180-200 g) were obtained from theLaboratory Animal Service of the University of Granada(Granada, Spain) and maintained in standard conditions.The rats were randomly assigned to three groups (n = 10);two of them (non-colitic and control groups) received noprobiotic treatment and the other (treated group) receivedorally the probiotic (5×108 CFU suspended in 0.5 mL ofskimmed milk) daily for 3 wk. Both non-colitic and controlgroups received orally the vehicle used to administer theprobiotic (0.5 mL daily). Two weeks after starting the
Peran L et al. L. salivarius ssp. salivarius in TNBS rat colitis 5187
experiment, the rats were fasted overnight and those fromthe control and treated groups were rendered colitic by themethod originally described by Morris et al.[26]. Briefly, theywere anesthetized with halothane and given 10 mg of TNBSdissolved in 0.25 mL of 500 mL/L ethanol by means of aTeflon cannula inserted 8 cm through the anus. Rats fromthe non-colitic group were administered intracolonically0.25 mL of PBS instead of TNBS. All rats were killed withan overdose of halothane, 1 wk after induction of colitis.Assessment of colonic damageThe body weight, water and food intake were recorded dailythroughout the experiment. Once the rats were killed, thecolon was removed aseptically and placed on an ice-coldplate, longitudinally opened and luminal contents werecollected for the microbiological studies (see below). Afterwards,the colonic segment was cleaned of fat and mesentery,blotted on filter paper; each specimen was weighed and itslength measured under a constant load (2 g). The colon wasscored for macroscopically visible damage on a 0-10 scaleby two observers unaware of the treatment, according tothe criteria described by Bell et al.[27] (Table 1), which takesinto account the extent as well as the severity of colonicdamage. Representative whole gut specimens were takenfrom a region of the inflamed colon corresponding to theadjacent segment to the gross macroscopic damage and werefixed in 4% buffered formaldehyde. Cross-sections wereselected and embedded in paraffin. Equivalent colonicsegments were also obtained from the non-colitic group.Full-thickness sections of 5 µm were obtained at differentlevels and stained with hematoxylin and eosin. The histologicaldamage was evaluated by two pathologist observers (ANand AC), who were blinded to the experimental groups,according to the criteria described previously by Stucchiet al.[28] (Table 2). The colon was subsequently divided intofour segments for biochemical determinations. Twofragments were frozen at -80 for myeloperoxidase (MPO)activity and inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression,and another sample was weighed and frozen in 1 mL of50 g/L trichloroacetic acid for total GSH content determinations.The remaining sample was immediately processed for themeasurement of TNF-α and LTB4 levels. All biochemicalmeasurements were completed within 1 wk from the timeof sample collection and were performed in duplicate.
MPO activity was measured according to the techniquedescribed by Krawisz et al.[29]; the results were expressed as MPOunits per gram of wet tissue; one unit of MPO activity wasdefined as that degrading 1 µmol hydrogen peroxide/minat 25 . Total GSH content was quantified with therecycling assay described by Anderson[30], and the resultswere expressed as nanomole per gram of wet tissue. Colonicsamples for TNF-α and LTB4 determinations wereimmediately weighed, minced on an ice-cold plate andsuspended in a tube with 10 mmol/L sodium phosphatebuffer (pH 7.4) (1:5 w/v). The tubes were placed in ashaking water bath (37 ) for 20 min and centrifuged at9 000 r/min for 30 s at 4 ; the supernatants were frozenat -80 until assay. TNF-α was quantified by ELISA(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK) andthe results were expressed as picogram per gram of wet
tissue. LTB4 was determined by enzyme immunoassay(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK) andthe results expressed as nanogram per gram of wet tissue.
iNOS expression was analyzed by Western blotting aspreviously described[31]. Control of protein loading andtransfer was conducted by detection of the β-actin levels.
Table 1 Criteria for assessment of macroscopic colonic damage
Score Criteria0 No damage1 Hyperemia, no ulcers2 Linear ulcer with no significant inflammation3 Linear ulcer with inflammation at one site4 Two or more sites of ulceration/inflammation5 Two or more major sites of ulceration and inflammation or
one site of ulceration/inflammation, extending >1 cm along thelength of the colon6-10 If damage covers >2 cm along the length of the colon, the scoreis increased by one, for each additional centimeter of involvement
Table 2 Criteria for assessment of microscopic colonic damage
Mucosal epitheliumUlceration: none (0); mild - surface (1); moderate(2); extensive-full thickness (3)
CryptsMitotic activity: lower third (0); mild mid-third(1); moderate mid-third (2); upper third (3)Mucus depletion: none (0); mild (1); moderate (2); severe (3)
Lamina propriaMononuclear infiltrate: none (0); mild (1); moderate (2); severe (3)Granulocyte infiltrate: none (0); mild (1); moderate (2); severe (3)Vascularity: none (0); mild (1); moderate (2); severe (3)
SubmucosalMononuclear infiltrate: none (0); mild (1); moderate (2); severe (3)Granulocyte infiltrate: none (0); mild (1); moderate (2); severe (3)Edema: none (0); mild (1); moderate (2); severe (3)
Maximum score: 27. Modified from Stucchi et al.[28].
Microbiological studiesLuminal content samples were weighed, homogenized, andserially diluted in sterile peptone water. Serial 10-folddilutions of homogenates were plated on specific mediafor Lactobacillus (MRS media, Oxoid) or Bifidobacterium (MRSmedia supplemented with 0.5 mg/L dicloxacillin, 1 g/L LiCland 0.5 g/L L-cysteine hydrochloride) and incubated underanaerobic conditions in an anaerobic chamber for 24-48 hat 37 . Coliforms and enterobacteria were also determinedby using specific Count Plates Petrifilm (3M, St. Paul, MN).After incubation, the final count of colonies was reportedas log10 colony forming units per gram of material.Statistical analysisAll results are expressed as mean±SE. Differences betweenmeans were tested for statistical significance using a one-way analysis of variance (ANOVA) and post hoc leastsignificance tests. Non-parametric data (score) are expressedas the median (range) and were analyzed using the Mann-Whitney U-test. Differences between proportions wereanalyzed with the χ2 test. All statistical analyses were carried
out with the Statgraphics 5.0 software package (STSC, MD),with statistical significance set at P<0.05.
RESULRESULRESULRESULRESULTSTSTSTSTSMore than 30 lactic acid bacterial strains with the ability toadhere to human intestinal cell lines and to inhibit pathogenicbacterial growth in vitro belonging to the own Puleva Biotechcollection were screened for their ability to modulate theproduction of inflammatory cytokines in LPS-stimulatedmacrophages. The results obtained were highly diverse,including bacteria with the ability to enhance or to reduceinflammatory cytokine production (TNF-α and IL-12)modifying or not the expression of the anti-inflammatorycytokine IL-10 (data not shown).
Among all the screened bacteria, L. salivarius ssp. salivarius(CECT5713) showed the best TNF-α/IL-10 and IL-12/IL-10 ratio (Figure 1), since it was able not only to reducethe LPS-induced TNF-α and IL-12 production, but also toincrease the levels of IL-10. For these reasons, we decidedto use this strain to test its ability to prevent the inflammatoryresponse in the in vivo assay of experimental colitis.
Figure 1 Production of inflammatory cytokines by bone marrow-derivedmacrophages (BMDM). TNF-α, IL-12, and IL-10 production was analyzed byELISA in the supernatants of BMDM stimulated or not with LPS (100 ng/mL) andincubated with 106 CFU/mL of L. salivarius ssp. salivarius (CECT5713) (blackbars) or in absence of bacteria (gray bars). The results are the mean of threeassays±SE of the ratio between the pro-inflammatory cytokines (TNF-α and IL-12) and IL-10.
L. salivarius ssp. salivarius administration for 2 wk did notinduce any symptoms of diarrhea or affected weight evolution.However, once the colitis was induced, the probiotic-treatedrats showed an overall lower impact of TNBS-inducedcolonic damage compared to the TNBS control group. Theanti-inflammatory effect was evidenced macroscopically bya significantly lower colonic damage score than that of controlrats (P<0.05), with a significant reduction in the extent of colonicnecrosis and/or inflammation induced by the administrationof TNBS/ethanol (Table 3). This anti-inflammatory effectwas also associated with a significant reduction in the colonicweight/length ratio between both colitic groups, an indexof colonic edema, which increased significantly as a consequenceof the inflammatory process (Table 3). The histological studiesconfirmed the intestinal anti-inflammatory effect exerted byL. salivarius (Figure 2). Histological assessment of colonicsamples from the TNBS control group revealed severetransmural disruption of the normal architecture of thecolon, extensive ulceration and inflammation involving allthe intestinal layers of the colon, giving a score value of18.9±1.1 (mean±SE). Colonic samples were characterizedby severe edema, interstitial micro-hemorrhages and diffuseleukocyte infiltration, mainly composed of neutrophils inthe mucosa layer and, to a lesser extent, lymphocytes in thesubmucosa. Most of the rats showed epithelial ulcerationof the mucosa affecting over 75% of the surface. Theinflammatory process was associated with crypt hyperplasiaand dilation, and moderate goblet cell depletion. However,histological analysis of the colonic specimens from ratstreated with the probiotic revealed a more pronouncedrecovery in the intestinal architecture than controls, with ascore of 11.2±2.4 (mean±SE) (P<0.01 vs TNBS controlgroup). Thus, most of the samples (7 of 10) showed almostcomplete restoration of the epithelial cell layer, in contrastto the extensive ulceration observed in non-treated animals;in fact, the zones with ulceration were surrounded by tissuein process of re-epithelization. Moreover, the transmuralinvolvement of the lesions was reduced. The goblet celldepletion was less severe and thus they appeared replenishedwith their mucin content, and no dilated crypts were observed.The improvement in colonic histology was accompaniedby a reduction in the inflammatory infiltrate, which was
Figure 2 Histological sections of colonic mucosa from colitic rats 1 wk afterTNBS instillation stained with hematoxylin and eosin. A: Non-colitic groupshowing the normal histology of the rat colon (original magnification ×20);B: TNBS control group showing complete destruction of the mucosa, whichhas been substituted by inflammatory granulation tissue. There is evident edema
and intense diffuse transmural inflammatory infiltrate (original magnification ×100);C: L. salivarius ssp. salivarius treated group showing amelioration of theinflammatory process and ‘restoration’ of the mucosal tissue with presence ofmucin replenished goblet cells (original magnification ×100).
A CB
TNF/IL-10 IL 12/IL 10 TNF/IL-10 IL 12/IL 10
20
5
0
Non stimulated LPS stimulated
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slight to moderate with a patchy distribution, althoughneutrophils were the predominant cell type.
The lower leukocyte infiltration was also assessedbiochemically by the reduction in colonic MPO activity, amarker of neutrophil infiltration that was enhanced in theTNBS control group (Table 4). In addition, probiotic-treatedcolitic rats showed a significant increase in colonic GSHcontent, which is depleted in colitic rats as a consequenceof the colonic oxidative stress induced by the inflammatoryprocess, as previously reported in this model of experimentalcolitis [32] (Table 4). Finally, the colonic inflammationinduced by TNBS was characterized by increased levelsof colonic TNF-α and LTB4 (Table 4) as well as by highercolonic iNOS expression (Figure 3) in comparison withnon-colitic animals. Treatment of colitic rats with L.salivarius resulted in a significant reduction of colonic TNF-αlevels (Table 4), that did not show any statistical differenceswith normal rats. No significant modification was observedon colonic LTB4 levels. Finally, lower colonic iNOS expressionwas also seen in colitic animals that received the bacterialsuspension, when compared to TNBS control animals(Figure 3).
Figure 3 Effects of L. salivarius ssp. salivarius treatment (5×108 CFU/rat·d)on colonic nitric oxide synthase (NOS) expression in TNBS experimental colitisin rats.
Effects of L. salivarius administration on colonic bacterialprofileTNBS colitis resulted in a significant reduction in fecallactobacilli count in comparison with normal rats (P<0.05).Probiotic-treated colitic rats showed higher counts ofLactobacilli species in colonic contents than control coliticrats, without showing statistical differences with both non-colitic and colitic control groups (Figure 4). No statisticaldifferences were observed in Bifidobacteria counts amongthree groups (P>0.1, Figure 4) nor in the amount of otherfecal potential pathogenic bacteria such as enterobacteriaor coliform bacteria (data not shown).
DISCUSSIONDISCUSSIONDISCUSSIONDISCUSSIONDISCUSSIONThe results obtained in the present study reveal the efficacyof probiotic therapy with a L. salivarius ssp. salivarius strainin intestinal inflammation, incorporating a new microorganismto the probiotics that have been reported to attenuate thedevelopment of colonic injury in experimental and humanIBD[33]. Thus, oral administration of the probiotic facilitatedrecovery from TNBS-induced colonic damage, as it wasevidenced histologically, with a significant reduction inthe extent and severity of inflamed tissue. This beneficialeffect was also stated biochemically by a decrease in colonicMPO activity, a marker of neutrophil infiltration that hasbeen previously described to be upregulated in experimentalcolitis[29], and is widely used to detect and follow intestinalinflammatory processes. In consequence, a reduction in theactivity of this enzyme can be interpreted as a manifestationof the anti-inflammatory activity of a given compound[34].The ability of the probiotic to reduce granulocyte infiltration,showed by MPO activity reduction, was confirmedhistologically, since the level of leukocyte infiltrate in thecolonic mucosa was lower in treated colitic animals than in
Table 4 Myeloperoxidase (MPO) activity, total GSH content, TNF-α and LTB4 levels in colon specimens from non-colitic rats, TNBS controlcolitic rats and TNBS colitic rats treated with L. salivarius ssp. salivarius (5×108 CFU/rat·d)
Group (n= 10) MPO activity (units MPO/g) GSH (nmol/g) LTB4 (ng/g) TNF-α (pg/g)Non-colitic 23.4±7.2 1 540±41 2.9±0.4 441.5±39.1TNBS control 180.6±21.9d 1 087±51d 6.5±0.9d 782.9±60.1dTNBS probiotic 105.3±26.0a,d 1 252±42a,d 6.9±0.8d 509.4±68.2b
Data are expressed as mean±SE. aP<0.05, bP<0.01 vs TNBS control group; dP<0.01 vs non-colitic group.
Table 3 Effects of L. salivarius ssp. salivarius (5×108 CFU/rat·d)treatment on macroscopic damage score, extent of the inflamma-tory lesion along the colon and changes in colon weight in TNBSexperimental colitis in rats
Group (n = 10) Damage score Extent of damage Colon weight (0-10) (cm) (mg/cm)Non-colitic 0 0 63.3±2.5TNBS control 6.5 (5-8) 3.4±0.3 209.7±17.0TNBS probiotic 5 (3-7)a 2.3±0.4b 143.3±11.8b
Damage score for each rat was assigned according to the criteria described inTable 1 and data are expressed as median (range). Extent of damage and colonweight data are expressed as mean±SE. aP<0.05, bP<0.01 vs TNBS control. Allcolitic groups differ significantly from non-colitic group.
Figure 4 Effects of L. salivarius ssp. salivarius (5×108 CFU/rat·day) treatmenton bacteria levels (Lactobacillus and Bifidobacteria) in TNBS experimentalcolitis in rats. bP<0.01 vs non-colitic group.
Non-colitic TNBS-control TNBS-probiotic
iNOS
β-actin
Non-colitic TNBS-control TNBS-probiotic
Bacte
ria le
vels
(CFU
log 10
/g lum
inal c
onten
t)
b1086420
Lactobacillus Bifidobacteria
b b
Peran L et al. L. salivarius ssp. salivarius in TNBS rat colitis 5189
the corresponding TNBS control groups. The inhibitoryeffect on the infiltration of inflammatory cells into thecolonic mucosa might account for the beneficial effect ofthis probiotic against tissue injury, because margination andextravasation of circulating granulocytes contribute markedlyto the colonic injury in this model of IBD[35]. These resultsare in agreement with other studies, that describe the attenuationexerted by several probiotics in leukocyte-endothelial celladhesion in this experimental model of rat colitis[36]. Thiseffect can justify the inhibition of the synthesis and/or releaseof different mediators that participate in the inflammatoryprocess, such as NO, since probiotic treatment of colitic ratswas associated with a reduction in colonic iNOS expression.Moreover, this can also explain the improvement in thecolonic oxidative stress in colitic rats after probiotic treatment,as evidenced by a partial restoration of the GSH depletionthat took place as a consequence of the TNBS colonicdamage.
During the last decade, it has become increasingly evidentthat chronic colonic inflammation, both in human IBD andin experimental colitis, is associated with enhanced NOproduction, mainly via iNOS activity[37-39], as well as withincreased release of reactive oxygen metabolites, includingsuperoxide[40-42]. The simultaneous overproduction of NOand superoxide can yield the highly toxic radical, peroxynitritein the inflamed intestine[43], which have been demonstratedto produce widespread colonic injury[44]. It is important tonote that neutrophils are thought to be important sourceof both NO [45,46] and reactive oxygen metabolites [47].Considering the above, the effect exerted by L. salivariusssp. salivarius in decreasing the neutrophil infiltration thatoccurs in response to TNBS, may preserve the colonicmucosa from oxidative insult. In fact, beneficial effects havepreviously been reported either after NOS inhibition[37,38]or by antioxidant therapy[31,42] in different experimentalmodels of intestinal inflammation.
Probiotic treatment could attenuate neutrophil infiltrationvia inhibition of different mediators with chemotacticactivity. The results obtained in the present study revealedthat probiotic treatment did not significantly modify colonicLTB4 levels, an eicosanoid with chemotactic activity involvedin the pathogenesis of IBD[1]. In consequence, the inhibitoryeffect of leukocyte infiltration exerted by the probiotic shouldbe related to the downregulation of other pro-inflammatorymediators, given the ability of this lactobacilli strain tomodulate the immune response as demonstrated by the in vitrostudies. In fact, the intestinal anti-inflammatory activityexerted by L. salivarius ssp. salivarius was also characterized bydownregulation of colonic TNF-α. This may be relevant sinceTNF-α acts as a potent chemoattractant, thus contributingto the recruitment of neutrophil in the inflamed colonicmucosa and initiating the inflammatory pathogenic cascadethat definitively perpetuates colonic inflammation[48]. Theimportant role attributed to TNF-α in intestinal inflammationis strongly supported by the fact that different drugs capableof interfering with the activity of this mediator are beingdeveloped for IBD therapy [23]. The ability of probioticbacteria to downregulate TNF-α production has beenreported previously for other lactobacilli strains such asL. casei and of L. bulgaricus, when they were cultured with
inflamed mucosa from patients with Crohn’s disease[20]. Thiseffect was attributed to the existence of a cross talk betweenbacteria and mucosal cells, being able to downregulate thedegree of activation of intestinal immune cells[20]. This hasalso been demonstrated in the present study for L. salivariusssp. salivarius since it was able to modify the cytokine profilein macrophages, reducing the amount of inflammatorycytokines (TNF-α and IL-12), while increasing the amountof the anti-inflammatory cytokine IL-10. The high diversityof immuno-modulatory action of probiotics observed inthe screening of the bacteria are in concordance with previousworks showing both the ability of some lactic bacteria topromote TNF-α production[49] while others such as L.rhamnosus GG (LGG) reduced it[50]. LGG, a probiotic thatalso reduces the ratio TNF-α/IL-10, has been reported toexert intestinal anti-inflammatory effects both in human[12]and in experimental intestinal inflammation[51]. This effectof some probiotics on the immune response may be ofspecial relevance because it would promote a possible shiftfrom a TH1-mediated immune response toward a TH2/TH3profile, similarly to that proposed to occur with LactobacillusGG[15]. It is important to note that replacing the bacteriaresponsible for the constant antigenic drive leading to TH1cellular activation with probiotic species that preferentiallyinduce protective immune responses may alter the normalcourse of these relapsing intestinal conditions. In addition,probiotics like Bifidobacterium longum or L. bulgaricus havebeen shown to inhibit the IL-8 secretion in intestinal epithelia,when stimulated by the pro-inflammatory cytokine TNF-α,thus reducing the activity of other pro-inflammatory cytokineswith chemotactic activity[52].
However, the participation of the modification in theimmune response in the intestinal anti-inflammatory effectexerted by this probiotic does not exclude mechanismsproposed for other probiotics, mainly due to a role inpreventing the imbalance in the intestinal microflora, giventhe relative predominance of aggressive bacteria andinsufficient amount of protective species that has been reportedin these intestinal conditions[1,2]. Previous studies havesuggested that in TNBS-induced colitis, specific strains fromcolonic microflora invades the colonic wall after disruptionof the epithelium and the presence of bacteria within thewall participates in the transmural inflammation[53]. In fact,the present study reveals that the colonic damage inducedby TNBS was associated with a significant reduction oflactobacilli count in the colonic lumen, which wascounteracted after the probiotic treatment, since probiotic-treated rats showed no statistical differences from non-coliticrats in the lactobacilli content.
In conclusion, administration of the probiotic L. salivariusssp. salivarius CECT5713 facilitates the recovery of theinflamed tissue in the TNBS model of rat colitis, an effectassociated with amelioration of the production of some ofthe mediators involved in the inflammatory response ofthe intestine, such as cytokines, including TNF-α, and NO.This beneficial effect could be ascribed to its effect on thealtered immune response characteristic of this inflammatorycondition, which would attenuate the exacerbated immuneresponse evoked by the colonic instillation of the haptenTNBS in the rats.
5190 ISSN 1007-9327 CN 14-1219/ R World J Gastroenterol September 7, 2005 Volume 11 Number 33
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3. Efectos preventivos del probiótico Lactobacillus fermentum, capaz de liberar glutation en el modelo
de colitis experimental por TNBS en ratas
L. fermentum
83
RESUMEN
OBJETIVO
El desequilibrio entre la formación de especies reactivas de oxigeno y de compuestos
antioxidantes juega un papel muy importante en la patogénesis y mantenimiento de la EII, por tanto
una estrategia terapéutica podría ser su capacidad de contrarrestar la producción de especies
reactivas de oxigeno mediante la restauración de los niveles de productos antioxidantes como el
glutation, antioxidante endógeno al que se le atribuye un papel esencial en el mantenimiento de la
integridad de la mucosa y por tanto en la patogénesis de la enfermedad inflamatoria intestinal.
El objetivo de este estudio fue probar los efectos preventivos del probiótico Lactobacillus
fermentum, capaz de producir glutation, en el modelo de colitis experimental por TNBS en ratas.
RESULTADOS
Los ensayos in vitro ratificaron la capacidad de Lactobacillus fermentum de producir
glutation (1.4 ± 0,3 mM en medio de cultivo), y su precursor γ-Glu-Cys per se (2.3 ± 0,2 mM en
medio de cultivo) frente a valores basales.
El tratamiento con Lactobacillus fermentum mejoró la respuesta inflamatoria en las ratas
colíticas evidenciado mediante la longitud del daño (2.6 ± 0.5 cm vs. 4.0±0.3 cm P<0.01) y la
medida del peso /longitud (149.7 ± 13.0 mg/cm vs. 226.5 ± 17.6 mg/cm P<0.01) y bioquímicamente
mediante una reducción significativa de la actividad MPO (193.7 ± 25.9 U MPO/g vs. 313.0 ± 6.1 U
MPO/g P<0.01); un aumento del glutation, agotado en el colon como consecuencia del proceso
inflamatorio (1614 ± 85 nmol/g vs. 1331 ± 62 nmol/g P<0.05); reducción de los niveles de la
citocina proinflamatoria TNFα (469.5 ± 67.6 pg/g vs. 680.9 ± 52.8 pg/g P<0.05); y finalmente una
reducción de la expresión de la iNOS en comparación con el grupo control.
Los estudios de los AGCC en el contenido colónico, muestran el aumento significativo de
los mismos en las ratas tratadas con el probiótico con respecto al grupo control (Acetato: 13.3 ± 1.9
mg/g heces vs. 6.2 ± 1.6 mg/g heces P<0.05; Butirato: 2.6 ± 0.7 mg/g heces vs. 0.8 ± 0.2 mg/g
L. fermentum
84
heces; Propionato: 5.3 ± 0.7 mg/g heces vs. 2.7 ± 0.6 mg/g heces). Finalmente, los animales tratados
mostraron un mayor recuento de Lactobacillus en el contenido colónico, sin existir diferencias en el
recuento de Bifidobacterium.
CONCLUSIÓN
La administración del probiótico Lactobacillus fermentum mejora la recuperación de la
colitis inducida por TNBS en rata, atribuido a un aumento en los niveles colónicos de glutation, y a
una reducción de la producción de ciertos mediadores implicados en la respuesta inflamatoria
intestinal tales como TNFα y oxido nítrico. Este efecto beneficioso también se podría atribuir a un
aumento en los niveles colónicos de AGCC, así como a un mayor recuento de Lactobacillus en el
contenido colónico.
Int J Colorectal Dis (2006) 21: 737–746DOI 10.1007/s00384-005-0773-y ORIGINAL ARTICLE
Laura PeranDesiree CamuescoMonica ComaladaAna NietoAngel ConchaJosé Luis AdrioMónica OlivaresJordi XausAntonio ZarzueloJulio Galvez
Accepted: 5 April 2005Published online: 29 July 2005# Springer-Verlag 2005
Lactobacillus fermentum, a probiotic capable
to release glutathione, prevents colonic
inflammation in the TNBS model of rat colitis
Abstract Background and aims:Inflammatory bowel disease is asso-ciated with intestinal oxidative stress.In the present study we test thepreventative effect of Lactobacillusfermentum, a probiotic that producesper se glutathione, in the trinitroben-zenesulphonic acid (TNBS) modelof rat colitis. Methods: Colitis wasinduced in rats by intracolonic ad-ministration of 10 mg of TNBSdissolved in 0.25 ml of 50% ethanol.L. fermentum was administered orally(5×108 CFU suspended in 0.5 ml ofskim milk) to a group of rats for 3weeks, starting 2 weeks before colitisinduction. Colonic damage was eval-uated both histologically and bio-chemically, and the colonic luminalcontents were used for bacterialstudies as well as for short chainfatty acid (SCFA) production.Results: L. fermentum treatmentresulted in an amelioration of theinflammatory response in colitic ratsas evidenced histologically and by asignificant reduction of colonic MPOactivity (P<0.05). The probiotic par-tially counteracted the colonic gluta-thione depletion induced by theinflammatory process. In addition,probiotic-treated colitic rats showedsignificant lower colonic tumour ne-crosis factor (TNF)α levels (P<0.01)and inducible nitric oxide synthase(iNOS) expression when compared tonon-treated rats. Finally, the probioticinduced growth of Lactobacilli spe-cies and production of SCFA in
colonic contents in comparisonwith control colitic rats.Conclusion: Administration of theprobiotic L. fermentum facilitatesthe recovery of the inflamed tissuein the TNBS model of rat colitis, aneffect associated with increased levelsof glutathione as well as with ame-lioration of the production of someof the mediators involved in theinflammatory response of the intes-tine, such as TNFα and NO.
Keywords Lactobacillus fermentum .
TNBS experimental rat colitis .
Glutathione . Oxidative stress
L. Peran . D. Camuesco .
M. Comalada . A. Zarzuelo .
J. Galvez (*)Department of Pharmacology,School of Pharmacy,University of Granada,Campus Universitario La Cartuja s/n,18071 Granada, Spaine-mail: [email protected].: +34-95-8243889Fax: +34-95-8248964
A. NietoHealth and Progress Foundation,Granada, Spain
A. ConchaDepartment of Pathology, HospitalUniversitario Virgen de las Nieves,Granada, Spain
J. L. Adrio . M. Olivares . J. XausDepartment of Immunology andAnimal Sciences, Puleva Biotech, S.A.,Granada, Spain
Introduction
Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic disease ofthe digestive tract, and usually refers to two related con-ditions, ulcerative colitis and Crohn’s disease, which arecharacterised by chhronic and spontaneously relapsing in-flammation. Although the aetiology of IBD remains un-known, there is increasing experimental evidence to supporta role for luminal bacteria in the initiation and progressionof these intestinal conditions, probably related to an im-balance in the intestinal microflora, relative predomi-nance of aggressive bacteria and insufficient amount ofprotective species [1, 2]. This could justify the remissionachieved in intestinal inflammation after treatment withantibiotics such as metronidazole or ciprofloxacin [3], orthe fact that germ-free animals may fail to develop ex-perimental intestinal inflammation [4]. A possible ther-apeutic approach in IBD therapy is the administration ofprobiotic microorganisms, defined as viable nutritionalagents conferring benefits to the health of human host. Infact, it has been reported that administration of a mixtureof Bifidobacterium and Lactobacillus [5] or of non-path-ogenic viable Escherichia coli [6] prolongs remission inulcerative colitis. Moreover, there are reports of success-ful induction and maintenance of remission of chronicpouchitis after oral bacteriotherapy [7, 8].
Different mechanisms have been proposed to participatein the therapeutic effects exerted by probiotic microorgan-isms. Firstly, these microorganisms could exert their ac-tion through a modulation of the intestinal bowel flora,which may result from competitive metabolic interactionswith potential pathogens, production of anti-microbial pep-tides, or inhibition of epithelial adherence and translocationby pathogens [5, 9]; secondly, probiotics have been pro-posed to modulate the host defenses by influencing theintestinal immune system [10, 11]; and thirdly, these mi-croorganisms have been reported to positively affect theintestinal barrier function [12, 13]. Moreover, an interestingapproach in IBD treatment is the administration of pro-biotics capable of delivering in the intestinal lumen com-pounds that have been reported to exert beneficial effectsin these intestinal conditions. Thus, the use of geneticallymodified Lactococcus lactis able to promote the deliveryof either the anti-inflammatory cytokine mIL-10 [14] ortrefoil factors [15] in the intestine cures or prevents exper-imental enterocolitis in mice. In addition, nitric oxide re-leased by Lactobacillus farciminis improves experimentalcolitis in rats [16].
It is well reported that IBD is characterised by an un-balanced formation of reactive oxygen species and anti-oxidant micronutrients, and this may be important in thepathogenesis and/or perpetuation of the tissue injury inIBD [17, 18], which may provide a rationale for therapeuticmodulation of these intestinal conditions with antioxidants.Thus, antioxidant therapy has been shown to be beneficial
in experimental models of colitis [19–21], having beenproposed that the beneficial effects exerted by 5-aminsa-lycilic derivates in human IBD are derived from their an-tioxidant properties [22]. In addition, glutathione, the majorcomponent of the endogenous nonprotein sulfhydryl pool,is an endogenous antioxidant that is essential in maintain-ing mucosal integrity; and some experimental data confirmthis important role. Firstly, the inflammatory status in ex-perimental colitis is associated with its depletion [17, 18];secondly, when the sulfhydryl blocker iodoacetamide isadministered intracolonically to rats, they develop colonicinflammation [23]; and thirdly, glutathione supplemen-tation improves colonic damage in experimental colitis[24, 25]. Considering all of the above, a probiotic strainable to directly produce or promote the intestinal releaseof glutathione could have potential use in the treatmentof IBD.
The aim of the present study was to test the preventativeeffects of a Lactobacillus fermentum strain in the trini-trobenzenesulphonic acid (TNBS) model of rat colitis, awell-established model of intestinal inflammation withsome resemblance to human IBD [26]. The selection ofthis lactobacilli strain was based on its capacity to pro-duce glutathione, an uncommon feature amongst lactoba-cilli strains. Special attention was paid to its effects afteroral administration to colitic rats on the colonic glutathi-one levels and on the production of some of the mediatorsinvolved in the inflammatory response, such as tumournecrosis factor α (TNFα), leukotriene B4 (LTB4) and ni-tric oxide (NO). In addition, the correlation between theintestinal anti-inflammatory effect of L. fermentum andthe modifications induced on colonic flora and on SCFAproduction in the luminal contents was also studied.
Materials and methods
This study was carried out in accordance with the ‘Guidefor the Care and Use of Laboratory Animals’, as promul-gated by the National Institute of Health, and was approvedby the Animal Research and Ethic Committee of the Uni-versity of Granada (Spain).
Reagents
All chemicals were obtained from Sigma (Madrid, Spain),unless otherwise stated. Glutathione reductase was pro-vided by Boehringer Mannheim (Barcelona, Spain).
Glutathione production in bacteria
Puleva Biotech lactic acid bacterial collection was screenedfor Lactobacilli bacteria with the ability to produce glu-
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tathione. Cultures were grown in MRS medium at 37°C for24 h and used to inoculate 50-ml Falcon tubes containingMRS medium. Cells were incubated for 24 h and 1-mlsamples were taken to analyse glutathione content. Cellswere washed with distilled water, suspended in 300 μl ofTCA 7.5% (w/v) and disrupted by stirring. The mixturewas centrifuged (at 10,500 g for 2 min) and 100 μl fromthe supernatant was transferred to a new tube containing300 μl of MilliQ water. A portion (20 μl) from this so-lution was mixed with 340 μl of 0.6 M phosphate buffer(pH 7.8) and 340 μl of 1.25 mM Tris (carboxyethyl)phosphine HCl (TCEP) in 20 mM HCl. The sample wasplaced in the dark for 15 min, and then 800 μl of 12 mMortho-pthalaldehyde in 50 mM sodium acetate was addedand samples were placed at 4°C for 15 min. Samples wereanalysed by HPLC using a Spherisorb S3 ODS columnat 0.8 ml/min in isocratic mode using 50 mM sodiumacetate (pH 7.7)/acetonitrile (96:4) as mobile phase.
Preparation and administration of the probiotic
L. fermentum 5716, a human breast milk derived strain[27], was obtained from Puleva Biotech (Granada, Spain)and was normally growth in MRS media at 37°C underanaerobic conditions using the Anaerogen system (Oxoid,Basingstoke, UK). For probiotic treatment, bacteria wassuspended in skim milk (109 CFU/ml) and stored at −80°Cuntil usage.
Experimental design
Female Wistar rats (180–200 g) were obtained from theLaboratory Animal Service of the University of Granada(Granada, Spain) and maintained under standard condi-tions. The rats were randomly assigned to three groups(n=10); two of them (non-colitic and control groups) re-ceived no probiotic treatment and the other (treated group)received the probiotic orally (5×108 CFU suspended in0.5 ml of skim milk), daily for 3 weeks. Both non-coliticand control groups were given daily administration of thevehicle used to administer the probiotic (0.5 ml of skimmilk). Two weeks after the treatment was started, the ratswere fasted overnight and those from the control andtreated groups were rendered colitic by the method orig-inally described by Morris et al. [28]. Briefly, they wereanaesthetised with halothane and given 10 mg of TNBSdissolved in 0.25 ml of 50% ethanol (v/v) by means ofa Teflon cannula inserted 8 cm through the anus. Ratsfrom the non-colitic group were administered intracolon-ically with 0.25 ml of phosphate-buffered saline insteadof TNBS. All rats were killed with an overdose of halo-thane 1 week after induction of colitis.
Assessment of colonic damage
Body weight, water and food intake were recorded dailythroughout the experiment. After the rats were sacrificed,the colon was removed aseptically and placed on an ice-cold plate, and longitudinally opened; then the luminalcontents were collected for microbiological studies and forSCFA quantification (see below). Afterwards, the colonicsegment was cleaned of fat and mesentery, blotted on filterpaper; each specimen was weighed and its length measuredunder a constant load (2 g). The colon was scored formacroscopically visible damage on a 0–10 scale by twoobservers who were unaware of the treatment, according tothe criteria described by Bell et al. [29] and Camuesco et al.[30], which take into account the extent as well as theseverity of colonic damage. Representative whole gut spec-imens were taken from a region of the inflamed coloncorresponding to the adjacent segment to the gross mac-roscopic damage and were fixed in 4% buffered formal-dehyde. Cross-sections were selected and embedded inparaffin. Equivalent colonic segments were also obtainedfrom the non-colitic group. Full-thickness sections of 5 μmwere taken at different levels and stained with haematox-ylin and eosin. The histological damage was evaluated on a0–27 scale by two pathologist observers (A.N. and A.C.),who were blinded to the experimental groups, accordingto the criteria described previously [30]. The colon wassubsequently divided into four segments for biochemicaldeterminations. Two fragments were frozen at −80°C formyeloperoxidase (MPO) activity and inducible nitric oxidesynthase (iNOS) expression, and another sample wasweighed and frozen in 1 ml of 50 g/l trichloroacetic acidfor total glutathione content determination. The remainingsample was immediately processed for the measurement ofTNFα and leukotriene B4 (LTB4) levels. All biochemicalmeasurements were performed in duplicate and completedwithin 1 week of sample collection.
MPO activity was measured according to the techniquedescribed by Krawisz et al. [31]; the results were expressedas MPO units per gram of wet tissue; 1 unit of MPOactivity was defined as that degrading 1 μmol hydrogenperoxide/min at 25°C. Total glutathione content was quan-tified with the recycling assay described by Anderson [32],and the results were expressed as nmol/g wet tissue. Co-lonic samples for TNFα and LTB4 determinations wereimmediately weighed, minced on an ice-cold plate andsuspended in a tube with 10 mM sodium phosphate buffer(pH 7.4) (1:5 w/v). The tubes were placed in a shakingwater bath (37°C) for 20 min and centrifuged at 9,000 g for30 s at 4°C; the supernatants were frozen at −80°C untilassay. TNFα was quantified by enzyme-linked immunoab-sorbent assay (Amersham Pharmacia Biotech, Bucking-hamshire, UK) and the results were expressed as pg/g wettissue. LTB4 was determined by enzyme immunoassay
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(Amersham Pharmacia Biotech) and the results expressedas ng/g wet tissue. iNOS expression was analysed byWestern blotting as previously described [20], and controlof protein loading and transfer was conducted by detectionof the β-actin levels.
Microbiological studies
Luminal content samples were homogenised in peptonephysiological saline (100 mg faeces/ml). Tenfold serialdilutions were made in the same medium and aliquots of0.1 ml of the appropriate dilution were spread onto thefollowing agar media: MRS agar for lactobacilli, MRSagar supplemented with 0.5 mg/l dicloxacillin, 1 g/l LiCland 0.5 g/l L-cysteine hydrochloride for Bifidobacterium;reinforced clostridial containing 20 μg/ml de polymyxinfor Clostridium. All media were obtained from Oxoid(Basingstoke, UK), whereas antibiotics and other supple-ments were obtained from Sigma (St. Louis, MO). Cultureplates were incubated in absence of oxygen at 37°C for24–48 h. Similarly, 1 ml of suitable dilution was spreadonto specific Count Plates Petrifilm (3M, St. Paul, MN)for coliforms, for total aerobes and for Enterobacteria-ceae. Plates were incubated at 37°C for 24 h. After theincubation, the specific colonies grown on the selectiveculture media were counted and the number of viable mi-croorganism per gram faecal (CFU/g) was calculated. Themean and standard error per group were calculated fromthe log values of the CFU/g.
SCFA quantification in colonic contents
To quantify the SCFA concentration in the colonic lumi-nal contents, samples were homogenised with 150 mMNaHCO3 (pH 7.8) (1:5, wt/v) in an argon atmosphere.Samples were incubated for 24 h at 37°C and stored at−80°C until the extraction. To extract the SCFAs, 50 μl ofthe internal standard 2-methylvaleric acid (100 mM), 10μl of sulphuric acid and 0.3 ml of ethyl acetate wereadded to 1 ml of the homogenate and then centrifuged at10,000 g for 5 min at 4°C. The supernatants were de-hydrated with sodium sulphate anhydrous and centrifuged10,000 g for 5 min at 4°C. Later, 0.5 ml of the sample wassplitless inoculated into a gas chromatograph (Varian CP-3800) equipped with an ID (CPWAX 52CB 60 m×0.25mm), and connected to a FID detector (Varian, Lake Forest,CA). Helium was used as the carrier and the make-up gas,with a flow rate of 1.5 ml/min. Injection temperature was250°C. Acetate, propionate and butyrate concentrationswere automatically calculated from the areas of peaks usingthe Star Chromatography WorkStation program (version5.5), which was on-line connected to the FID detector.
Statistics
All results are expressed as the mean±SEM. Differencesbetween means were tested for statistical significance usinga one-way analysis of variance (ANOVA) and post-hocleast significance tests. Non-parametric data (score) areexpressed as the median (range) and were analysed usingthe Mann–Whitney U-test. Differences between propor-
Fig. 1 HPLC analysis of gluta-thione and γ-Glu-Cys dipeptideproduction by L. fermentum5716
Table 1 Effects of L. fermentum (5×108 CFU/rat·day) treatment on macroscopic damage score, extent of the inflammatory lesion along thecolon and changes in colon weight in TNBS experimental colitis in rats
Group (n=10) Damage score (0–10) Extent of damage (cm) Colon weight (mg/cm)
Non-colitic 0 0 60.4±2.8
TNBS control 7 (6–9) 4.0±0.3 226.5±17.6
TNBS probiotic 5.5 (2–7)* 2.6±0.5** 149.7±13.0**
Damage score for each rat was assigned according to the criteria described in Table 1 and data are expressed as median (range). Extent ofdamage and colon weight data are expressed as mean±SEM*P<0.05, **P<0.01 vs TNBS control. All colitic groups differ significantly from non-colitic group (P<0.01, not shown)
740
tions were analysed with the chi-square test. All statisticalanalyses were carried out with the Statgraphics 5.0 soft-ware package (STSC, Maryland), with statistical signifi-cance set at P<0.05.
Results
Intestinal anti-inflammatory activity of L. fermentumadministration in rats with TNBS-induced colitis
More than 50 strains of lactic acid bacteria belonging toPuleva Biotech’s collection were screened for their abil-ity to produce glutathione. The results confirmed that theability to produce glutathione is not a common feature inthe lactobacilli group, although it has been reported inother prokaryotic microorganism [33, 34]. In fact, the pro-duction of glutathione was detectable in the strain L.fermentum 5716, which, in addition to its ability to produceglutathione (1.4±0.3 mM in culture media), was also ableto generate the antioxidant dipeptide γ-Glu-Cys (2.3±0.2mM in culture media) (Fig. 1). For this reason, we decidedto use this strain to test its ability to prevent the in-flammatory response in the in vivo assay of experimentalcolitis.
L. fermentum 5716 administration for 2 weeks failed toinduce any symptoms of diarrhoea or effect in the weightevolution (data not shown). However, once colitis wasinduced, the probiotic-treated rats showed an overall lowerimpact of TNBS-induced colonic damage compared to theTNBS control group. The anti-inflammatory effect wasevidenced macroscopically by a significantly lower colonicdamage score than that of control rats (P<0.05), with asignificant reduction of the extent of colonic necrosis and/or inflammation (Table 1). This anti-inflammatory effectwas also associated with a significant reduction of thecolonic weight/length ratio between both colitic groups, anindex of colonic oedema that is increased significantly as aconsequence of the inflammatory process (Table 1). Thehistological studies confirmed the intestinal anti-inflam-matory effect exerted by L. fermentum (Fig. 2). Histolog-ical assessment of colonic samples from the TNBS controlgroup revealed severe transmural disruption of the normalarchitecture of the colon, extensive ulceration and inflam-mation involving all the intestinal layers of the colon,giving a score value of 21.6±2.3 (mean±SEM). Colonicsamples were characterised by severe oedema, interstitialmicrohaemorrhages and diffuse leucocyte infiltration,mainly composed of neutrophils in the mucosa layer and,to a lesser extent, lymphocytes in the submucosa. Most ofthe rats showed epithelial ulceration of the mucosa af-fecting over 75% of the surface. The inflammatory processwas associated with crypt hyperplasia and dilation, and
Fig. 2 Histological sections of colonic mucosa from colitic rats 1week after TNBS instillation stained with haematoxylin and eosin. aNon-colitic group showing the normal histology of the rat colon(original magnification ×20). b TNBS control group showing com-plete destruction of the mucosa, which has been substituted by in-flammatory granulation tissue. There is evident edema and intensediffuse transmural inflammatory infiltrate (original magnification×100). cL. fermentum-treated group showing amelioration in theinflammatory process and ‘restoration’ of the mucosal tissue withthe presence of mucin-replenished goblet cells (original magnifica-tion ×100)
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moderate to severe goblet cell depletion. However, histo-logical analysis of the colonic specimens from rats treatedwith the probiotic revealed a more pronounced recoveryof the intestinal architecture than controls, with a score of9.4±1.9 (mean±SEM) (P<0.01 vs TNBS control group).Thus, most of the samples (nine of ten) showed almostcomplete restoration of the epithelial cell layer, in contrastto the extensive ulceration observed in non-treated ani-mals; in fact, the zones with ulceration were surroundedby tissue in process of re-epithelisation. Moreover, thetransmural involvement of the lesions was reduced. Thegoblet cell depletion was less severe and thus they ap-peared replenished with their mucin content, and no di-lated crypts were observed. The improvement in colonichistology was accompanied by a reduction in the inflam-matory infiltrate, which was slight to moderate with apatchy distribution, although neutrophils were the pre-dominant cell type.
The lower leucocyte infiltration was also assessedbiochemically by the reduction of colonic MPO activity,a marker of neutrophil infiltration that was enhanced inthe TNBS control group (Table 2). In addition, probiotic-treated colitic rats showed a significant increase of colonicglutathione content, which is depleted in colitic rats as aconsequence of the colonic oxidative stress induced bythe inflammatory process, as previously reported in thismodel of experimental colitis [35] (Table 2). Finally, thecolonic inflammation induced by TNBS was characterisedby increased levels of colonic TNFα and LTB4 (Table 2)as well as by a greater colonic iNOS expression (Fig. 3) incomparison with non-colitic animals. Treatment of coliticrats with L. fermentum resulted in a significant reductionof colonic TNFα levels (Table 2), but no significant mod-ification of colonic LTB4 levels was obtained between both
colitic groups (Table 2). Finally, a lower colonic iNOSexpression was also observed in colitic animals that re-ceived the bacteria suspension when compared to TNBScontrol animals (Fig. 3).
Effects of L. fermentum administration on colonicbacterial profile
TNBS colitis resulted in a significant reduction of faecallactobacilli count in comparison with normal rats (P=0.003). Probiotic-treated colitic rats showed significantlyhigher counts of Lactobacilli species in colonic contents incomparison with control colitic rats (P=0.039), withoutshowing statistical differences with non-colitic controlgroup (Fig. 4). No statistical differences were observed inBifidobacteria counts amongst three groups (P>0.1; Fig. 4)or in the amount of other faecal potential pathogenic bac-teria such as entherobacteria or coliforms (data not shown).
Effects of L. fermentum administration on SCFAproduction
When the colonic contents from TNBS control rats wereincubated for 24 h, a reduction of the levels of SCFA was
Table 2 Myeloperoxidase (MPO) activity, total glutathione (GSH) content, TNFα and LTB4 levels in colon specimens from non-coliticrats, TNBS control colitic rats and TNBS colitic rats treated with L. fermentum (5×108 CFU/rat·day)
Group MPO activity (units MPO/g) GSH (nmol/g) LTB4 (ng/g) TNFα (pg/g)
Non-colitic (n=10) 8.3±1.8 1,937±37 3.7±0.4 331.6±25.7
TNBS control (n=10) 313.0±6.1## 1,331±62## 14.6±1.7## 680.9±52.8#
TNBS probiotic (n=10) 193.7±25.9##,** 1,614±85#,* 13.2±1.6## 469.5±67.6*,#
Data are expressed as mean±SEM*P<0.05, **P<0.01 vs TNBS control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs non-colitic group
Fig. 3 Effects of L. fermentum treatment (5×108 CFU/rat·day) oncolonic nitric oxide synthase (NOS) expression in TNBS experi-mental colitis in rats
Fig. 4 Effects of L. fermentum (5×108 CFU/rat·day) treatment onbacteria levels (Lactobacillus and Bifidobacteria) in TNBS experi-mental colitis in rats. *P<0.05 vs TNBS control; #P<0.01 vs non-colitic group
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observed compared to non-colitic rats (P<0.01, Table 3),similar to that described previously in this model of ex-perimental colitis [36]. However, the intestinal contentsobtained from the colitic treated rats showed greater ace-tate, butyrate and propionate production than those fromTNBS control rats without probiotic treatment (P<0.01,Table 3).
Discussion
IBD is characterised by the abnormal production of freeradicals with resultant oxidant-induced tissue injury andreduced antioxidant defenses [17, 18]. For this reason, an-tioxidant therapy can constitute an interesting approach inthe downregulation of this inflammatory condition. In fact,the beneficial effects exerted by the 5-aminosalicylic de-rivatives in the treatment of IBD have been partially at-tributed to their antioxidant and free radical scavengerproperties [22]. Moreover, several antioxidant compounds,such as flavonoids or vitamin E, have been reported toexert anti-inflammatory activity in experimental models ofrat colitis [19–21], which was associated with restorationof glutathione colonic mucosal levels. Glutathione is asulfhydryl-derived compound that actively participates inthe antioxidant mechanisms of the intestinal mucosa, pre-serving it from oxidant-induced tissue damage. Differentstudies have reported diminished glutathione content inthese intestinal conditions, both in humans [37] and inexperimental models of rat colitis [19–21], and that glu-tathione supplementation results in beneficial effects inexperimental colitis [24, 25]. All these facts prompted usto evaluate the intestinal anti-inflammatory effect of theprobiotic L. fermentum, a microorganism that has beendemonstrated in vitro to produce antioxidant compounds,such as glutathione and its precursor the dipeptide γ-Glu-Cys, in the TNBS model of rat colitis.
The results obtained in the present study reveal theefficacy of L. fermentum in this experimental model ofcolitis, thus incorporating a new microorganism to theprobiotics that have been reported to attenuate the devel-opment of colonic injury in experimental and human IBD[38]. This beneficial effect was histologically evidencedwith a significant reduction of the extent and severity ofinflamed tissue achieved after probiotic treatment in com-
parison with non-treated colitic rats. The anti-inflammatoryeffect was also stated biochemically, since its administra-tion to colitic rats resulted in a significant inhibition ofcolonic MPO activity, a marker of neutrophil infiltrationpreviously described to be upregulated in experimentalcolitis [31], and widely used to detect and follow intestinalinflammatory processes. In consequence, a reduction of theactivity of this enzyme can be interpreted as a manifesta-tion of the anti-inflammatory activity of a given compound[39]. The ability of the probiotic to reduce granulocyteinfiltration was confirmed histologically since the level ofleucocyte infiltrate in the colonic mucosa was lower intreated colitic animals than in the corresponding TNBScontrol groups. This may account for the beneficial effectshowed by this probiotic because margination and extra-vasation of circulating granulocytes contributes markedlyto the colonic injury in this model of IBD [40]. Theseresults are in agreement with other studies that describe theattenuation exerted by several probiotics in leucocyte–endothelial cell adhesion in this experimental model of ratcolitis [16]. The inhibitory effect on leucocyte infiltrationmay be the consequence of the preventative effect exertedby the probiotic against the free radical derived oxidativeinjury that takes place after TNBS instillation in the colonictissue [25, 41], since the intestinal anti-inflammatory effectwas associated with a restoration of the colonic glutathionelevels in comparison with non-treated colitic rats. Theproduction of γ-Glu-Cys, precursor of glutathione, by thisLactobacilli strain may play a key role, since it has beendescribed to be more efficiently uptaken than glutathionein the intestine. Although γ-Glu-Cys can be also substratefor other enzymes, like gamma-glutamylcyclotransferase,glutathione synthesis is increased in animal cells becauseof its higher affinity for the enzyme glutathione synthetase[42]. The free radical scavenger properties attributed toboth compounds, γ-Glu-Cys and glutathione, produced bythis probiotic seem to be crucial in its anti-inflammatoryeffect. In fact, it has been proposed that free radical gen-eration in the inflamed tissue constitutes an early signal thatpromotes the infiltration of neutrophils into colonic tissue,which in turn produce a large amount of free radicals thatactively participate in the perpetuation of the inflammatoryresponse [43]. For this reason, the rapid neutralisation ofthese reactive oxygen species would result in the inhibi-tion of neutrophil infiltration, as observed in the present
Table 3 Effects of L. fermentum (5×108 CFU/rat·day) treatment on short chain fatty acid production in colonic contents in TNBSexperimental colitis in rats
Group Acetate (mg/g faeces) Propionate (mg/g faeces) Butyrate (mg/g faeces)
Non-colitic (n=8) 25.3±2.9 11.5±1.0 6.3±1.1
TNBS control (n=9) 6.2±1.6 2.7±0.6 0.8±0.2
TNBS probiotic (n=10) 13.3±1.9* 5.3±0.7** 2.6±0.7**
Data are expressed as mean±SEM*P<0.05, **P<0.01 vs TNBS control. All colitic groups differ significantly from non-colitic group (P<0.01, not shown)
743
study. The inhibitory effect of the probiotic on the produc-tion and/or release of others mediators with chemotacticproperties, like LTB4, can be ruled out because the pro-biotic treatment was not associated with a significant mod-ification of the colonic levels of this eicosanoid incomparison with non-treated colitic rats.
Moreover, this inhibitory effect on neutrophil infiltrationattributed to the probiotic may also justify the inhibition ofthe synthesis and/or release of NO, another mediator thatparticipates in the inflammatory process, since probiotictreatment of colitic rats was associated with a reduction incolonic iNOS expression. During the last decade, it hasbecome increasingly clear that chronic colonic inflamma-tion, both in human IBD and in experimental colitis, isassociated with enhanced NO production, mainly via iNOSactivity [44–46]. The simultaneous overproduction of NOand reactive oxygen metabolites, like superoxide anion,can yield the highly toxic radical peroxynitrite in the in-flamed intestine [17]. Since neutrophils have been alsoconsidered as an important source of NO [47, 48], theeffect exerted by L. fermentum in decreasing the neutro-phil infiltration may in turn contribute to preserve colonicmucosa from peroxynitrite insult.
The present study also reveals that probiotic treatmentpromotes the downregulation of TNFα, a pro-inflamma-tory mediator that has been proposed to play a key role incolonic inflammation [49]; in fact, different drugs capableof interfering with the activity of this mediator are beingdeveloped for IBD therapy [50]. The ability of probioticbacteria to downregulate TNFα production has been re-ported previously for other lactobacilli strains such as L.casei and of L. bulgaricus when they were cultured withinflamed mucosa from patients with Crohn’s disease [51].This effect was attributed to the existence of a cross-talkbetween bacteria and mucosal cells, being able to down-regulate the degree of activation of intestinal immune cells[51]. The results obtained in the present study show that, inthe case of L. fermentum, this relationship between bacteriaand mucosal cells may be driven by SCFA, mainly bu-tyrate. In fact, when colonic contents were incubated for24 h, SCFA production was increased in probiotic-treatedcolitic rats in comparison with the corresponding controlrats without probiotic treatment. Thus, the inhibitory ef-fect of probiotic administration on cytokine productionmay be related to the ability of SCFA to interfere withtranscription factors. Nuclear factor-kappa B (NF-κB) is atranscription factor that, in combination with others, playsa central role in regulating the expression of genes en-coding numerous cytokines in immune and inflammatory
responses [52]. Thus, it has been previously reported thatbutyrate decreases TNFα production by intestinal biopsiesand by isolated lamina propria mononuclear cells via in-hibition of NF-κB activation and IκBα degradation [53].The inhibitory effect of butyrate on NF-κB activation inHT-29 cells, probably derived from its ability to inhibitdeacetylases, has also been reported [54]. However, theamelioration of the colonic oxidative stress observed afterprobiotic treatment to colitic rats may also account for itseffect on cytokine production, since NF-κB is a redox-sensitive transcription factor activated by oxidant stress inthe inflamed intestinal mucosa [55].
However, the participation of the modification in theimmune response in the intestinal anti-inflammatory effectexerted by this probiotic does not exclude mechanismsproposed by other probiotics, mainly a role in preventionin the imbalance in the intestinal microflora, given therelative predominance of aggressive bacteria and insuffi-cient amount of protective species that has been reportedto occur in these intestinal conditions [1, 2]. Previousstudies have suggested that in TNBS-induced colitis, spe-cific strains from colonic microflora invades the colonicwall after disruption of the epithelium and the presence ofbacteria within the wall contributes to the transmural in-flammation [56]. In fact, the present study reveals that thecolonic damage induced by TNBS was associated with asignificant reduction of lactobacilli count in the coloniclumen, which was counteracted after probiotic treatmentwithout showing statistical differences with non-coliticrats.
In conclusion, administration of the probiotic L. fer-mentum 5716 facilitates the recovery of the inflamed tissuein the TNBS model of rat colitis, an effect associated withamelioration of the production of some of the mediatorsinvolved in the inflammatory response of the intestine,including TNFα and NO. This beneficial effect could beascribed to its ability to prevent oxidative stress that occursin this inflammatory condition, through the increased pro-duction of glutathione, which might attenuate the exacer-bated immune response evoked by the colonic instillationof the hapten TNBS in the rats.
Acknowledgements This study was supported by the SpanishMinistry of Science and Technology (SAF2002-02592) and byInstituto de Salud ‘Carlos III’ (PI021732), with funds from theEuropean Union, and by Junta de Andalucia (CTS 164). MònicaComalada is a recipient of Juan de la Cierva Program from SpanishMinistry of Science and Technology. Laura Perán is a recipient fromPuleva Foundation (Spain).
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746
4. Estudio comparativo de los efectos preventivos de dos probióticos Lactobacillus fermentum y
Lactobacillus reuteri en el modelo de colitis experimental por TNBS en ratas
L. fermentum vs. L. reuteri
97
RESUMEN
OBJETIVO
El probiótico con mejor perfil antiinflamatorio de todos los ensayados fue Lactobacillus
fermentum, por lo que lo quisimos comparar con Lactobacillus reuteri en el modelo de colitis
experimental por TNBS en ratas. La selección de Lactobacillus reuteri se realizó atendiendo a los
estudios anteriores que muestran su gran eficacia.
RESULTADOS
El tratamiento con Lactobacillus fermentum y Lactobacillus reuteri durante las dos
semanas anteriores a la inducción de la colitis no afectó al peso corporal en comparación con el
grupo control, sin embargo una semana después de la inducción del daño, ambos probióticos
normalizaron levemente el peso de los animales.
La actividad antiinflamatoria intestinal de Lactobacillus fermentum se manifestó mediante
una reducción significativa de la incidencia de diarrea (20% vs. 80%, P<0,05), del cociente
peso/longitud y del índice de daño macroscópico en comparación con el grupo control, mostrando
Lactobacillus reuteri solo una tendencia. Desde el punto de vista bioquímico, únicamente
Lactobacillus fermentum redujo significativamente la MPO y aumentó los niveles de glutation, que
se depleciona en el colon como consecuencia del proceso inflamatorio; sin embargo, ambos
mostraron diferencias significativas sobre la producción de la citocina proinflamatoria TNF-α
(P<0,05), pero no sobre la producción de IL-1β, IL-10 y LTB4 en comparación con el grupo control.
Finalmente, Lactobacillus fermentum y Lactobacillus reuteri redujeron de manera significativa la
expresión de la iNOS, pero solo Lactobacillus fermentum lo hizo también sobre la expresión de la
ciclooxigenasa-2.
Los estudios microbiológicos del contenido colónico mostraron que tanto Lactobacillus
fermentum como Lactobacillus reuteri aumentaron el crecimiento de Lactobacillus en el lumen
intestinal en comparación con las ratas no tratadas, sin embargo solo Lactobacillus fermentum
aumento la producción de ácidos grasos de cadena corta.
L. fermentum vs. L. reuteri
98
CONCLUSIÓN
Lactobacillus fermentum, probiótico con características inmunomoduladoras beneficiosas
en la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), es más eficaz que L. reuteri, cuya eficacia sobre la
colitis tanto en humanos como en modelos experimentales ha sido ampliamente demostrada.
A comparative study of the preventative effects exerted by two probiotics,
Lactobacillus reuteri and Lactobacillus fermentum, in the
trinitrobenzenesulfonic acid model of rat colitis
Laura Peran1, Saleta Sierra2, Monica Comalada1, Federico Lara-Villoslada2, Elvira Bailon1, Ana Nieto3,
Angel Concha4, Monica Olivares2, Antonio Zarzuelo1, Jordi Xaus2 and Julio Galvez1*1Department of Pharmacology, University of Granada, Campus Universitario ‘La Cartuja’ s/n, 18071 Granada, Spain2Department of Immunology and Animal Sciences, Puleva Biotech SA, Granada, Spain3Andalusian Stem Cell Bank, Health and Progress Foundation, Granada, Spain4Department of Pathology, Hospital Universitario ‘Virgen de las Nieves’, Granada, Spain
(Received 18 April 2006 – Revised 23 August 2006 – Accepted 19 September 2006)
The intestinal anti-inflammatory effects of two probiotics isolated from breast milk, Lactobacillus reuteri and L. fermentum, were evaluated and
compared in the trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) model of rat colitis. Colitis was induced in rats by intracolonic administration of 10mg
TNBS dissolved in 50% ethanol (0·25ml). Either L. reuteri or L. fermentum was daily administered orally (5 £ 108 colony-forming units sus-
pended in 0·5ml skimmed milk) to each group of rats (n 10) for 3 weeks, starting 2 weeks before colitis induction. Colonic damage was evaluated
histologically and biochemically, and the colonic luminal contents were used for bacterial studies and for SCFA production. Both probiotics
showed intestinal anti-inflammatory effects in this model of experimental colitis, as evidenced histologically and by a significant reduction of colo-
nic myeloperoxidase activity (P,0·05). L. fermentum significantly counteracted the colonic glutathione depletion induced by the inflammatory
process. In addition, both probiotics lowered colonic TNFa levels (P,0·01) and inducible NO synthase expression when compared with non-trea-
ted rats; however, the decrease in colonic cyclo-oxygenase-2 expression was only achieved with L. fermentum administration. Finally, the two
probiotics induced the growth of Lactobacilli species in comparison with control colitic rats, but the production of SCFA in colonic contents
was only increased when L. fermentum was given. In conclusion, L. fermentum can exert beneficial immunomodulatory properties in inflammatory
bowel disease, being more effective than L. reuteri, a probiotic with reputed efficacy in promoting beneficial effects on human health.
Probiotics: Inflammatory bowel diseases: Immunomodulation: Anti-inflammatory activity
Several studies have proposed that breast-feeding protects
against many immune-mediated diseases, including those
related to inflammatory bowel diseases (IBD) such as ulcera-
tive colitis and Crohn’s disease (Klement et al. 2004). These
observations confirm previous studies in which breast-milk
feeding limited the development of colitis in IL-10 knock-
out mice. This finding was explained by a change in the intes-
tinal flora of the developing mice from pathogenic bacteria to
non-adherent bacteria, promoted by milk oligosaccharides that
stimulate Bifidobacterium and Lactobacillus growth (Kunz
et al. 2000). In addition, the presence of lactic bacteria in
breast milk could also account for its preventative effect
against intestinal inflammation (Martin et al. 2003).
In fact, the administration of probiotic micro-organisms has
been proposed to promote a balanced colonic microbial
environment and thus probably help in both prevention and
control of IBD. Previous studies have reported that the
administration of a mixture of bifidobacteria and lactobacilli
(Venturi et al. 1999) or Escherichia coli Nissle 1917
(Rembacken et al. 1999) prevents the relapse of ulcerative
colitis, showing the latter to have an equivalent effect to mesa-
lazine in maintaining remission. The studies performed both in
human subjects and in animal models of intestinal inflam-
mation have provided some clues about the different mechan-
isms involved in the therapeutic effects exerted by probiotic
micro-organisms. First, probiotics could suppress the growth
or epithelial binding and invasion of enteric pathogenic bac-
teria, maybe due to their ability to decrease luminal pH via
production of SCFA (Sakata et al. 2003), promote the
secretion of bactericidal proteins (Boris et al. 2001; Collado
et al. 2005) and/or stimulate mucin production (Mack et al.
1999). Second, probiotics have been reported to exert immu-
noregulatory activities, either by inducing protective cyto-
kines, such as IL-10 and transforming growth factor-b, or
by suppressing pro-inflammatory cytokines, such as TNFa,
in the intestinal mucosa (Borruel et al. 2002; Schultz et al.
*Corresponding author: Dr Julio Galvez, fax þ34 958248964, email [email protected]
Abbreviations: COX-2, cyclo-oxygenase-2; IBD, inflammatory bowel disease; iNOS, inducible NO synthase; LTB4, leukotriene B4; MPO, myeloperoxidase; TNBS,
trinitrobenzenesulfonic acid.
British Journal of Nutrition (2007), 97, 96–103 DOI: 10.1017/S0007114507257770
q The Authors 2007
2003; Pathmakanthan et al. 2004; Chen et al. 2005). And
third, these micro-organisms positively affect the intestinal
barrier function by decreasing mucosal permeability
(Madsen et al. 2001). However, the detailed mechanisms by
which these bacteria mediate their effects are not fully
understood.
The aim of the present study was to compare the preven-
tative effects of Lactobacillus fermentum CECT5716
and L. reuteri ATCC55730, two hetero-fermentative bacteria
found in breast milk (Martin et al. 2005; BioGaia, 2006), in
the trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) model of rat colitis.
This is a well-established model of intestinal inflammation
with some resemblance to human IBD (Jurjus et al. 2004).
The selection of the probiotics was based on previous in
vitro and in vivo studies that make them suitable candidates
for the treatment of these intestinal conditions. In a previous
study, we have reported that L. fermentum CECT5716
showed intestinal anti-inflammatory activity in the TNBS
model of rat colitis (Peran et al. 2006). That effect was attrib-
uted, at least partially, to its ability to release glutathione and
the antioxidant dipeptide g-Glu-Cys, thus counteracting the
damaging effects derived from the intestinal oxidative stress
generated (Grisham et al. 1991), similarly to what occurs in
human IBD (Grisham, 1994). This effect was also associated
with a reduction in TNFa production and in inducible NO
synthase (iNOS) expression in the inflamed tissue (Peran
et al. 2006). On the other hand, different strains of L. reuteri
have been described to show beneficial effects in several
experimental models of colitis, both in mice (IL-10 and
CD4þT cell-induced colitis in the severe combined immuno-
deficient mouse) (Madsen et al. 1999; Moller et al. 2005),
and in rats (acetic acid- and methothrexate-induced) (Mao
et al. 1996; Holma et al. 2001). In vitro studies have shown
that L. reuteri DSM12246 is able to down regulate the stimu-
lated production of the pro-inflammatory cytokines IL-12 and
TNFa in dendritic cells while inducing the anti-inflammatory
cytokine IL-10 (Christensen et al. 2002). Similarly, another
strain of L. reuteri inhibited mRNA up regulation, cellular
accumulation and secretion of the chemokine IL-8 induced
by TNFa in intestinal epithelial cells (Ma et al. 2004).
Materials and methods
The present study was carried out in accordance with the
‘Guide for the Care and Use of Laboratory Animals’ as pro-
mulgated by the National Institute of Health (Bethesda, MD,
USA).
Reagents
All chemicals were obtained from Sigma Chemicals (Madrid,
Spain), unless otherwise stated.
Preparation and administration of the probiotics
L. fermentum CECT5716 was provided by Puleva Biotech
(Granada, Spain), L. reuteri ATCC55730 was obtained from
a commercial dairy product licensed by BioGaia AB (Stock-
holm, Sweden). Lactobacilli strains were normally grown in
De Man–Rogosa–Sharpe (MRS) media at 378C in anaerobic
conditions using the Anaerogen system (Oxoid Ltd,
Basingstoke, Hants, UK). For probiotic treatment, bacteria
were suspended in skimmed milk (109 colony-forming units/
ml) and stored at 2808C until usage.
Experimental design
Female Wistar rats (180–200 g) were obtained from the Lab-
oratory Animal Service of the University of Granada (Gran-
ada, Spain), maintained in standard conditions and fed the
Panlab A04 diet (Panlab, Barcelona, Spain) ad libitum. The
composition of the diet was: 17·2% protein, 2·7% fat,
59·7% carbohydrates, 3·9% fibre (mainly cellulose), 4·4%
minerals and 12% humidity. The rats were randomly assigned
to four groups (n 10); two of them (non-colitic and control
groups) did not receive probiotic treatment and the remaining
groups (treated groups) received orally each probiotic (5 £ 108
colony-forming units suspended in 0·5ml skimmed milk) daily
for 3 weeks. Both non-colitic and control groups received
orally the vehicle used to administer the probiotic (0·5ml
daily). At 2 weeks after starting the experiment, the rats
were fasted overnight and those from the control and treated
groups were rendered colitic by the method originally
described by Morris et al. (1989). Briefly, they were anaesthe-
tised with halothane and given 10mg TNBS dissolved in
0·25ml ethanol (50%, v/v) by means of a Teflon cannula
inserted 8 cm through the anus. Rats from the non-colitic
group were administered intracolonically 0·25ml PBS instead
of TNBS. All rats were killed with an overdose of halothane 1
week after induction of colitis. After killing, the following tis-
sues were quickly removed and weighed: spleen, thymus, kid-
neys, liver and soleus muscle. Also the colon was obtained for
the assessment of colonic damage.
Assessment of colonic damage
The body weight, water and food intake, as well as stool con-
sistency, were recorded daily throughout the experiment. Once
the rats were killed, the colon was removed aseptically and
placed on an ice-cold plate, longitudinally opened and the
luminal contents were collected for the measurements of
faecal moisture, pH and microbiological and SCFA production
studies (see later). Afterwards, the colonic segment was
cleaned of fat and mesentery, blotted on filter paper; each spe-
cimen was weighed and its length measured under a constant
load (2 g). The colon was scored for macroscopically visible
damage on a 0–10 scale by two observers unaware of the
treatment, according to the criteria described by Bell et al.
(1995), which takes into account the extent as well as the
severity of colonic damage. Representative whole gut speci-
mens were taken from a region of the inflamed colon corre-
sponding to the adjacent segment to the gross macroscopic
damage and were fixed in 4% buffered formaldehyde.
Cross-sections were selected and embedded in paraffin. Equiv-
alent colonic segments were also obtained from the non-colitic
group. Full-thickness sections of 5mm were taken at different
levels and stained with haematoxylin and eosin. The histologi-
cal damage was evaluated on a 0–27 scale by two pathologist
observers (A. N. and A. C.), who were blinded to the exper-
imental groups, according to the criteria described previously
(Camuesco et al. 2005). The colon was subsequently divided
into four segments for biochemical determinations. Two
Preventative effects of probiotics 97
fragments were frozen at 2808C for myeloperoxidase (MPO)
activity and iNOS and cyclo-oxygenase-2 (COX-2) ex-
pressions, and another sample was weighed and frozen in
1ml TCA (50 g/l) for total glutathione content determinations.
The remaining sample was immediately processed for the
measurement of colonic TNFa, IL-1b, IL-10 and leukotriene
B4 (LTB4) levels. All biochemical measurements were com-
pleted within 1 week from the time of sample collection and
were performed in duplicate.
MPO activity was measured according to the technique
described by Krawisz et al. (1984). The results are expressed
as MPO units per g wet tissue; one unit MPO activity was
defined as that degrading 1mmol H2O2/min at 258C. Gluta-
thione (reduced and oxidised) concentrations were assayed
by HPLC with fluorimetric detection of oxidised and reduced
glutathione, according to the method proposed by Martin
&White (1991); the results are expressed as nmol gluta-
thione/mg wet tissue. Colonic samples for cytokine and
LTB4 determinations were immediately weighed, minced on
an ice-cold plate and suspended in a tube with 10mM-
sodium phosphate buffer (pH 7·4) (1:5, w/v). The tubes
were placed in a shaking water-bath (378C) for 20min and
centrifuged at 9000 g for 30 s at 48C; the supernatant fractions
were frozen at 2808C until assay. TNFa, IL-1b and IL-10
were quantified by ELISA (Amersham Pharmacia Biotech,
Amersham, Bucks, UK) and the results were expressed as
pg/mg protein; the detection limits were 31–2500 pg/ml for
TNFa, 25·6–2500 pg/ml for IL-1b and 16–500 pg/ml for
IL-10. LTB4 was determined by enzyme immunoassay (Amer-
sham Pharmacia Biotech) and the results expressed as pg/mg
protein; the detection limits were 6·2–800 pg/ml.
The colonic expression of iNOS and COX-2 was analysed
by Western blotting as previously described (Camuesco et al.
2004). The dilutions of each primary antibody were 1:2000 for
iNOS (Transduction Laboratories, Becton Dickinson Bio-
sciences, Madrid, Spain) and 1:1000 for COX-2 (Cayman
Chemical Company, Montigny le Bretonneux, France), and
incubated overnight at 48C followed by peroxidase-conjugated
anti-rabbit IgG antibody (1:3000) for 1 h. Control of protein
loading and transfer was conducted by detection of the
b-actin levels.
pH, moisture and short-chain fatty acid quantification in
colonic contents
The pH values in the colonic contents were measured using a
GLP21-21 pH-meter (Crison, Barcelona, Spain) after their
suspension in water (1:5, w/v). The water content of the lumi-
nal stools was calculated by weight differences between fresh
(immediately after collection) and dried (kept during 24 h at
658C) samples.
To quantify the SCFA concentrations in the colonic luminal
contents, the samples were homogenised with 150mM-
NaHCO3 (pH 7·8) (1:5, w/v) in an Ar atmosphere. Samples
were incubated for 24 h at 378C and stored at 2808C until
the extraction. To extract the SCFA, 50ml of the internal stan-
dard 2-methylvaleric acid (100mM), 10ml sulfuric acid and
0·3ml ethyl acetate were added to 1ml of the homogenate
and, then, centrifuged at 10 000 g for 5min at 48C. The super-
natant fractions were dehydrated with sodium sulfate anhy-
drous and centrifuged at 10 000 g for 5min at 48C. Later,
0·5ml of the sample was splitless inoculated into a gas chro-
matograph (Varian CP-3800) equipped with an ID (CPWAX
52CB 60m £ 0·25mm), and connected to a FID detector
(Varian, Lake Forest, CA, USA). The carrier and the make-
up gas was He, with a flow rate of 1·5ml/min. The injection
temperature was 2508C. Acetate, propionate and butyrate con-
centrations were automatically calculated from the areas of
peaks using the Star Chromatography WorkStation program
(version 5.5; Varian Inc., Palo Alto, CA, USA), which was
on-line connected to the FID detector.
Microbiological studies
Luminal content samples were weighed, homogenised and
serially diluted in sterile peptone water. Serial 10-fold
dilutions of homogenates were plated on specific media for
Lactobacillus (MRS media, Oxoid) or Bifidobacterium (MRS
media supplemented with dicloxacilin (0·5mg/l), LiCl (1 g/l)
and L-cysteine hydrochloride (0·5 g/l)) and incubated under
anaerobic conditions in an anaerobic chamber for 24–48 h at
378C. Coliforms and enterobacteria were also determined by
using specific Count Plates Petrifilm (3M, St Paul, MN,
Canada). After incubation, the final count of colonies was
reported as log10 colony-forming units per g material.
Statistics
All results are expressed as means with their standard errors.
Differences between means were tested for statistical signifi-
cance using a one-way ANOVA and post hoc least signifi-
cance tests. Non-parametric data (scores) are expressed as
medians and ranges and were analysed using the Mann–Whit-
ney U test. Differences between proportions were analysed
with the x2 test. All statistical analyses were carried out
with the Statgraphics 5.0 software package (STSC, Rockville,
MD, USA), with statistical significance set at P,0·05.
Results
Effects of probiotic administration on body and tissue weight
in colitic rats
The administration of probiotics for 2 weeks before colitis
induction did not affect rat weight gain compared with
untreated rats (data not shown). The intracolonic adminis-
tration of TNBS resulted in an intestinal inflammatory status
in the rats characterised by anorexia, loss of weight and diar-
rhoea, which gradually increased. Thus, 1 week after colitis
induction, body weight was reduced by 4·5 (SEM 1·9) % in
the TNBS-treated rats, whereas in saline-treated rats it was
increased by 4·8 (SEM 0·7) % (P,0·01). Although none of
the probiotics were able to inhibit the anorexia and the loss
of weight in the acute phase of the inflammation (data not
shown), both lactobacilli restored the animals’ weight at the
end of the study, since it was increased by 0·6 (SEM 2·5)
and by 0·88 (SEM 2·6) % in the colitic rats that received L. fer-
mentum or L. reuteri, respectively, without showing statistical
differences with control groups.
The anorexia and the inflammatory response caused an
important modification in the weight of some tissues such as
muscle, thymus, spleen, while liver and kidneys did not
L. Peran et al.98
show any significant changes (Table 1). Soleus muscle weight
was reduced in colitic rats in comparison with non-colitic rats,
although the statistical differences were only obtained in the
rats treated with L. reuteri. Moreover, the inflammatory pro-
cess provoked a reduction in thymus weight and an increase
in spleen weight. None of the probiotics were able to counter-
act the increase in spleen weight, and only L. fermentum was
able to partially restore the thymus weight.
Effects of probiotic administration on colonic inflammation
L. fermentum administration showed an amelioration of the
diarrhoeic process, resulting in a significantly lower incidence
of diarrhoea (20%) after 7 d when compared with untreated
control rats (80%; P,0·05) (Table 2). The macroscopic
evaluation of the colonic segments 1 week after colitis induc-
tion revealed the preventative effect exerted by probiotics.
This was evidenced by a significant reduction of the colonic
weight:length ratio (P,0·01) in both cases (Table 2), as
well as by a significantly lower colonic damage score in com-
parison with control colitic rats, derived from a decrease in the
extent of colonic necrosis and the presence of intestinal adhe-
sions induced by the administration of TNBS (Table 2). How-
ever, only the group of colitic rats treated with L. fermentum
showed significant reduction in these inflammatory parameters
in comparison with untreated colitic control rats; L. reuteri
showed only a tendency to decrease them (P¼0·07; Table 2).
The histological studies revealed that L. fermentum was
more efficient in promoting the recovery of colonic tissue
than L. reuteri. Histological assessment of colonic samples
from the TNBS control group showed severe transmural dis-
ruption of the normal architecture of the colon, extensive
ulceration and inflammation involving all the intestinal
layers of the colon, giving a score value of 15·9 (SEM 2·5).
The histological analysis of the colonic specimens from rats
treated with L. fermentum revealed a more pronounced recov-
ery of the intestinal architecture than controls, with a score of
9·4 (SEM 1·9) (P,0·05 v. TNBS control group). Thus, most of
the samples (eight out of ten) showed almost complete restor-
ation of the epithelial cell layer, in contrast to the extensive
ulceration observed in non-treated animals. The improvement
in colonic histology was accompanied by a reduction in the
inflammatory infiltrate, which was slight to moderate with a
patchy distribution, although neutrophils were the predomi-
nant cell type. The colonic specimens from colitic rats treated
with L. reuteri also showed a higher recovery than the
intestinal segments from control colitic rats, and they were
assigned a score value of 10·8 (SEM 2·5), lower than in the
control group, but without showing statistical differences
(P¼0·14). Thus, four out of ten samples showed evident res-
toration of the epithelial cell layer, while in the rest of the
samples the epithelial ulceration of the mucosa affected over
40–50% of the surface, lower than in most of the specimens
from control colitic rats. Similarly, the goblet cell depletion
was also attenuated in this group, and the presence of mucin
content was evident, together with an absence of dilated
crypts. Finally, the inflammatory infiltrate was also attenuated,
being moderate with a patchy distribution.
The biochemical analysis of the colonic specimens con-
firmed the intestinal anti-inflammatory effect exerted by
the probiotics, although again some differences were
observed in their effects on the different parameters assayed.
Colonic MPO activity was reduced after treatment with L.
reuteri or L. fermentum by approximately 40% although
only L. fermentum treatment reached significance (Table
3). Since colonic MPO activity is considered as a biochemi-
cal marker of neutrophil infiltration (Krawisz et al. 1984),
these results confirm the lower leucocyte infiltration into
the inflamed tissue after probiotic treatment observed in
the histological studies. Furthermore, treatment of colitic
rats with the probiotics showed an increase in colonic gluta-
thione content (Table 3), depleted in colitic rats as a conse-
quence of the colonic oxidative stress caused by the TNBS-
induced inflammatory process (Galvez et al. 2003). How-
ever, although both probiotics restored the values observed
in non-colitic rats, only the group of rats treated with L. fer-
mentum showed statistical differences in comparison with
control colitic rats (P,0·01). The colonic inflammation
induced by TNBS was also characterised by increased
levels of colonic TNFa (Table 3), IL-1b (339·5 (SEM
43·9) v. 28·4 (SEM 3·4) pg/mg protein in the non-colitic
group; P,0·01) and LTB4 (146·6 (SEM 33·1) v. 9·8 (SEM
2·5) pg/mg protein in the non-colitic group; P,0·01), and
a reduction in IL-10 production (5·1 (SEM 1·2) v. 18·3
(SEM 3·1) pg/mg protein in the non-colitic group;
P,0·01). Only TNFa production was significantly reduced
after treatment with either L. reuteri or L. fermentum
(Table 3). No statistical differences were observed in the
other pro-inflammatory mediators assayed (data not shown).
Finally, the inflammatory process in the colonic tissue was
also characterised by higher expression of both iNOS and
COX-2 in comparison with non-colitic animals (data not
Table 1. Effects of probiotic treatment on tissue weights in trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) experimental colitis in rats
(Mean values with their standard errors for ten rats per group)
Muscle
(mg/g rat)
Liver
(mg/g rat)
Kidneys
(mg/g rat)
Spleen
(mg/g rat)
Thymus
(mg/g rat)
Group Mean SEM Mean SEM Mean SEM Mean SEM Mean SEM
Non-colitic 6·6 0·1 31·3 1·3 5·9 0·1 2·2 0·2 1·9 0·1
TNBS control 6·3 0·2 31·9 1·1 6·2 0·1 3·0* 0·2 0·9* 0·1
Lactobacillus reuteri 6·0* 0·1 35·1 1·3 5·9 0·2 3·3* 0·4 0·9* 0·1
L. fermentum 6·5‡ 0·1 34·9 1·1 6·1 0·2 2·9* 0·2 1·2*†‡ 0·1
*Mean value was significantly different from that of the non-colitic group (P,0·05).
†Mean value was significantly different from that of the TNBS control group (P,0·05).
‡Mean value was significantly different from that of the L. reuteri group (P,0·05).
Preventative effects of probiotics 99
shown). Treatment of colitic rats with L. fermentum resulted in
a significant reduction of the expression of both inducible
enzymes in eight out of ten rats, whereas L. reuteri was
only able to significantly reduce iNOS expression, and this
was achieved in seven out of ten rats.
Effects of probiotic administration on colonic short-chain fatty
acid production and bacterial profile
No clear differences were observed in the pH values of
the colonic contents among the different groups of rats
(Table 4). Moreover, although a tendency to increase the
faecal water content was observed in all the colitic rats,
only those treated with L. reuteri showed a significant differ-
ence in the faecal moisture (Table 4).
When the colonic contents from colitic control rats were
evaluated for SCFA production, no significant reduction in
any of their levels was observed compared with non-colitic
rats (Table 4). However, a significant reduction in all the ana-
lysed SCFA was observed in the L. reuteri-treated group in
comparison with all the other experimental groups (colitic or
not). In contrast, colitic rats treated with L. fermentum
showed similar values to those observed in non-colitic rats
(Table 4).
TNBS colitis also resulted in a significant reduction in colonic
lactobacilli and bifidobacteria counts (P,0·05; Fig. 1), together
with an increase in coliforms and enterobacteria (P,0·05; data
not shown) in comparison with normal rats. Probiotic-treated
colitic rats showed higher counts of lactobacilli and bifidobac-
teria species in the colonic contents than in control colitic rats,
without showing statistical differences with the non-colitic con-
trol group (Fig. 1 (A)). No statistical differences were observed
in the amount of faecal potential pathogenic bacteria such as
enterobacteria or coliforms among the three colitic groups
(data not shown). As expected, when the lactobacilli:pathogen
ratio was evaluated, the inflammatory process did result in a
significant decrease in comparison with normal rats; the
administration of L. fermentum or L. reuteri resulted in the nor-
malisation of this ratio (Fig. 1 (B)).
Discussion
The results obtained in the present study are supportive of the
helpfulness of the dietary incorporation of probiotics in IBD
therapy (Sartor, 2004). Furthermore, they confirm the intesti-
nal anti-inflammatory activity previously shown by this
strain of L. fermentum (CECT5716) (Peran et al. 2006) as
well as by other strains of L. reuteri (Mao et al. 1996;
Madsen et al. 1999; Holma et al. 2001; Moller et al. 2005),
although the present study is the first that describes the effi-
cacy of L. reuteri ATCC55730 in the TNBS model of rat
colitis.
Both probiotics ameliorated some of the clinical manifes-
tations of this colitis experimental model such as anorexia
or diarrhoea and the macroscopic colonic damage; however,
L. fermentum treatment seemed to be more effective. In fact,
this probiotic significantly attenuated the incidence of diar-
rhoea and adhesions, increased thymus weight and reduced
the colonic weight:length ratio as well as the damage score
and extension. On the contrary, L. reuteri treatment did not
show significant modifications on most of these parameters;
only the colonic weight:length ratio was significantly reduced
in comparison with untreated colitic rats.
The reduction in the diarrhoeic process exerted by L. fer-
mentum can be a consequence of an improvement of the gut
epithelial cell barrier function, thus contributing to its intesti-
nal anti-inflammatory effect, as has been proposed to
occur with other probiotics (Gionchetti et al. 2005). In fact,
Table 2. Effects of probiotic treatment on diarrhoea, adhesions, damage score, extent of the inflammatory lesion along the colon
and changes in colon weight in trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) experimental colitis in rats
(Percentages, medians and ranges, and mean values with their standard errors for ten rats per group)
Damage score
(0–10)§
Extent of
damage (cm)
Weight/length
(mg/cm)
Group Diarrhoea (%) Adhesions (%) Median Range Mean SEM Mean SEM
Non-colitic 0 0 0 0 0 0 71·0 2·5
TNBS control 80* 80* 7* 6–8·5 3·6* 0·3 249·7* 22·1
Lactobacillus reuteri 50* 50* 6* 4–8 2·8* 0·3 175·9* 11·9
L. fermentum 20† 10*†‡ 5·5*‡ 4–6·5 2·4*† 0·3 145·7*†‡ 7·6
* Percentage or mean value was significantly different from that of the non-colitic group (P,0·05).
†Percentage or mean value was significantly different from that of the TNBS control group (P,0·05).
‡Percentage or mean value was significantly different from that of the L. reuteri group (P,0·05).
§Damage score for each rat was assigned according to the criteria described previously by Bell et al. (1995).
Table 3. Effects of probiotic treatment on colonic myeloperoxidase
(MPO) activity, glutathione content and tumour necrosis factor a levels
in trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) experimental colitis in rats
(Mean values with their standard errors for ten rats per group)
MPO activity
(units/g)§
Glutathione
(nmol/g)
TNFa
(pg/mg
protein)
Group Mean SEM Mean SEM Mean SEM
Non-colitic 80 12 1479 51 17·8 2·4
TNBS control 1325* 144 1093* 85 74·0* 9·6
Lactobacillus
reuteri
989* 206 1351 135 42·0*† 7·0
L. fermentum 882*†‡ 114 1490† 112 53·1*† 11·0
*Mean value was significantly different from that of the non-colitic group (P,0·05).
†Mean value was significantly different from that of the TNBS control group
(P,0·05).
‡Mean value was significantly different from that of the L. reuteri group (P,0·05).
§One unit of MPO activity was defined as that degrading 1mmol H2O2/min at 258C.
L. Peran et al.100
microscopic evaluation showed that the restoration in the
epithelial lining was more evident in the rats administered
L. fermentum (80% of the samples showed complete restor-
ation) than in those that received L. reuteri (40%). This
may be interesting since a barrier disruption leads to increased
stimulation by luminal antigens. In this regard, mucosal
inflammation can be considered a self-perpetuating process
in which the disruption of the epithelial layer plays a central
role (Heyman et al. 1994).
L. fermentum and L. reuteri were able to reduce neutrophil
infiltration in the inflamed colon, as was observed in the
microscopic analysis, although only L. fermentum treatment
significantly decreased colonic MPO activity. The inhibition
of neutrophil infiltration can account for their intestinal anti-
inflammatory effect, given the important role attributed to
these cells in the inflammatory process.
L. fermentum treatment of TNBS colitic rats counteracted
the depletion of colonic glutathione levels that took place in
control colitic animals. This activity may play a crucial role
in the intestinal anti-inflammatory effect of the probiotic
because a situation of intense oxidative insult is an important
mechanism for tissue damage during chronic intestinal inflam-
mation and thus a common feature in human IBD (Grisham,
1994) as well as in the different experimental models of rat
colitis, including the TNBS (Galvez et al. 2003) and the dex-
tran sodium sulfate (Camuesco et al. 2004) models. The effect
exerted by this probiotic could be due to its ability to release
glutathione and the antioxidant dipeptide g-Glu-Cys (Peran
et al. 2006).
When other pro-inflammatory mediators were evaluated,
L. fermentum and L. reuteri were able to significantly reduce
colonic TNFa production. This may be relevant since this cyto-
kine plays a key role in intestinal inflammation, and different
drugs capable of interfering with the activity of this mediator
are being developed for IBD therapy (Rutgeerts et al. 2004).
Previous in vitro studies have also shown the ability of different
probiotic, including L. casei, L. bulgaricus, L. fermentum or
L. salivarius ssp. salivarius, to down regulate TNFa production
(Borruel et al. 2002; Peran et al. 2005, 2006).
A common feature of both probiotics assayed is their ability
to modify colonic microflora, which was altered as a conse-
quence of the TNBS-induced inflammatory process (Peran
et al. 2006). In this regard, the probiotic treatment restored
the pathogenic bacteria:lactobacilli ratio. This effect could
definitively contribute to the beneficial effect exerted by
these probiotics in the TNBS model of experimental colitis.
In fact, it has been previously described that the increase in
Lactobacillus sp. levels reduces the concentration of adherent
and translocated bacteria and attenuates the colitis in IL-10
gene-deficient mice (Madsen et al. 1999). This could prevent
the pathogenic effect of other species that may contribute to
the generation of an exacerbated immune response in intesti-
nal inflammation, as proposed both in experimental models
(Garcia-Lafuente et al. 1997) and in human subjects
(Cummings et al. 2003).
Table 4. Effects of probiotic treatment on faecal pH and moisture, and on colonic short-chain fatty acid production in trinitrobenzenesulfonic acid
(TNBS) experimental colitis in rats
(Mean values and standard deviations for ten rats per group)
Faecal pH
Faecal
moisture (%)§
Total SCFA
(mg/l)
Acetate
(mg/l)
Propionate
(mg/l)
Butyrate
(mg/l)
Group Mean SD Mean SD Mean SD Mean SD Mean SD Mean SD
Non-colitic 7·05 0·06 68·9 3·5 10 388 3655 6922 2917 2335 708 1130 267
TNBS control 7·26 0·04 72·2 1·4 7662 1290 4978 847 1858 322 825 177
Lactobacillus reuteri 7·32 0·06 78·5* 1·1 2821*† 75 1822*† 44 556*† 40 299*† 20
L. fermentum 7·31 0·03 76·1 1·1 9659‡ 2298 6830‡ 1888 2896‡ 908 1028‡ 279
*Mean value was significantly different from that of the non-colitic group (P,0·05).
†Mean value was significantly different from that of the TNBS control group (P,0·05).
‡Mean value was significantly different from that of the L. reuteri group (P,0·05).
§ Faecal moisture was expressed as the proportion in water content expressed in %.
10(A)
Bacte
ria levels
(lo
g10
CFU
/g lu
min
al
co
nte
nt)
0
2
4
6
8
Lactobacilli Bifidobacteria
Lactobacilli Bifidobacteria
††
* **
(B)
Lacto
bacilli
:path
og
en
rati
o
0
0·2
0·4
0·6
0·8
1·0
†
**
Fig. 1. Effects of probiotic treatment (5 £ 108 colony-forming units
(CFU) /rat·per d) on (A) bacteria levels (lactobacilli and bifidobacteria) and
on (B) lactobacilli:pathogen ratio in trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)
experimental colitis in rats. (A), Non-colitic group; (B),TNBS control group;
(B), Lactobacillus reuteri-treated group; (B), L. fermentum-treated group.
Values are means, with their standard errors represented by vertical bars.
*Mean value was significantly different from that of the TNBS control
group (P,0·05). †Mean value was significantly different from that of the
non-colitic group (P,0·01).
Preventative effects of probiotics 101
However, the colonic SCFA content profiles shown by the
two probiotics were different. Thus, L. fermentum was able
to significantly counteract the decrease in colonic SCFA pro-
duction observed in TNBS colitic rats, whereas L. reuteri
treatment reduced even more the SCFA production despite
its effect on colonic microbiota. The effect of L. fermentum
on butyrate production is very interesting since it has been
proposed that the inflammatory process results in an alteration
of the intestinal epithelial cell function, including colonic
SCFA utilisation, mainly butyrate, which is considered the
most important SCFA for colonocyte metabolism (Mortensen
& Clausen, 1996; Rodriguez-Cabezas et al. 2002).
In conclusion, L. fermentum and L. reuteri have shown
intestinal anti-inflammatory activity in the TNBS model of
rat colitis. However, each probiotic shows its own anti-inflam-
matory profile, confirming that not all probiotics present the
same efficacy as anti-inflammatory agents, and do not share
the same mechanisms of action. Of note, L. fermentum can
be considered more effective than L. reuteri, a probiotic
with reputed efficacy in promoting beneficial effects on
human health (Valeur et al. 2004). Both probiotics can be
found in breast milk, and although the doses administered to
rats in the present study are higher than those probably incor-
porated in the infant by breast milk, the present results suggest
that the colonisation of these probiotics in the colonic lumen
would result in beneficial preventative effects in these intesti-
nal conditions, probably derived from their immunomodula-
tory properties. Human clinical studies will be required in
order to confirm these results.
Acknowledgements
The present study was supported by the Spanish Ministry of
Science and Technology (SAF2005-03 199) and by Instituto
de Salud ‘Carlos III’ (PI021732), with funds from the Euro-
pean Union, and by Junta de Andalucia (CTS 164). M. C. is
a recipient of Juan de la Cierva Programme from Spanish
Ministry of Science and Technology; L. P. is a recipient
from Puleva Foundation (Spain); E. B. is a recipient from
the Spanish Ministry of Education and Science.
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Preventative effects of probiotics 103
DISCUSIÓN
Discusión
109
Durante los últimos años se ha puesto de manifiesto un incremento gradual de la incidencia
de patologías intestinales relacionadas con procesos inflamatorios (Loftus, 2004), lo que justificaría
el importante esfuerzo que se viene realizando por parte de la comunidad científica para la búsqueda
de nuevos fármacos eficaces en el tratamiento de la EII y la prevención de las recidivas que la
caracterizan. En la actualidad, prácticamente todos los fármacos utilizados presentan importantes
reacciones adversas, hecho que adquiere una especial relevancia dado que el tratamiento
farmacológico en la mayoría de pacientes se realiza durante un prolongado período de tiempo (Enns
y Sutherland, 1998; Stein y Hanauer, 2000), por lo que resulta de gran interés el establecimiento de
nuevas estrategias terapéuticas que, dotadas de actividad frente a estas patologías, presenten menos
efectos secundarios (Kho et al., 2001).
Aunque la causa de la EII es todavía desconocida, es un hecho bien aceptado que en su
iniciación y progresión intervienen las bacterias del lumen intestinal, probablemente provocado por
un desequilibrio entre las bacterias potencialmente patógenas y las protectoras (Fiocchi, 1998;
Shanahan, 2000). Por lo tanto, una alternativa terapéutica sería el uso de microorganismos
probióticos. De hecho, hay diversos estudios que avalan la eficacia de los mismos en la EII en
humanos.
Uno de los primeros estudios en colitis ulcerosa se realizó con un pequeño numero de
pacientes donde se evaluó la actividad de Escherichia coli Nissle 1917 en comparación con dosis
bajas de mesalamina (500 mg tres veces al día), mostrando que el número de recaídas era menor en
el caso del grupo tratado con el probiótico (Kruis et al., 1997). Esto se vio posteriormente ratificado
con otro estudio realizado con la mezcla de probióticos VSL#3* (Venturi et al., 1999).
Recientemente, Zocco et al. (2006), estudiaron la eficacia de la asociación del probiótico
Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) con mesalamina en el mantenimiento de la remisión de la
colitis ulcerosa en comparación con mesalamina sola, no obteniendo diferencias en el número de
recaídas después de 6 y de 12 meses; sin embargo, sí que fue capaz de prolongar significativamente
el tiempo de remisión (P<0,05).
*VSL#3: mezcla probiótica compuesta por: Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum,
Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Bifidobacterium longum,
Bifidobacterium breve y Bifidobacterium infantis.
Discusión
110
Existe un menor número de estudios que describen el uso de probióticos en la prevención y
tratamiento de la enfermedad de Crohn. En un ensayo se probó la eficacia de Saccharomyces
boulardii en el mantenimiento de la remisión de la EC. A los 6 meses la incidencia de recaídas era
mucho menor en el grupo tratado con mesalamina y el probiótico en comparación con el grupo
tratado con mesalamina sola (Guslandi et al., 2000). En otro estudio, McCarthy et al. (2001),
mostraron que la administración oral de Lactobacillus salivarius UCC118 reducía de manera
significativa el índice de la enfermedad en pacientes con EC leve y moderada.
No obstante, es en la pouchitis donde los probióticos han demostrado un beneficio
indiscutible; se ha comprobado en distintos estudios que son capaces de mantener la remisión
inducida con antibióticos en pacientes con pouchitis crónica tras resección del colon debido a una
colitis ulcerosa refractaria. En este sentido, Gionchetti et al. (2000), han realizado un estudio usando
la mezcla probiótica VSL#3 en pacientes con pouchitis crónica recurrente, la cual redujo el numero
de recaídas tras 9 meses a un 15% frente al 100% del grupo placebo. Otro estudio con los mismos
grupos también demostró que tras un año, solo desarrollaron pouchitis un 10% frente a un 40% del
grupo placebo después de la cirugía por colitis ulcerosa (Gionchetti et al., 2003).
Además de estos estudios en humanos, se han realizado otros ensayos en modelos
experimentales de inflamación intestinal que ratifican estos efectos beneficiosos (Tabla 9).
Para explicar el efecto antiinflamatorio intestinal ejercido por los probióticos sobre estas
patologías intestinales, se ha propuesto la participación de distintos mecanismos, entre los cuales se
incluyen la competición con bacterias nocivas por el sitio de fijación al epitelio, la inhibición de su
crecimiento y/o la promoción de su muerte mediante la producción de compuestos antibacterianos o
reducción del pH. Recientemente se le está dando una gran importancia a la modulación de la
respuesta inmunitaria de la mucosa del hospedador por parte de los probióticos, hecho que ha sido
ratificado en distintos ensayos in vitro. De hecho, Lactobacillus casei y Lactobacillus bulgaricus son
capaces de modular la respuesta inmunitaria mediante la reducción de los niveles de TNFα en
explantes intestinales de individuos con enfermedad de Crohn (Borruel et al., 2002). Lactobacillus
plantarum 299v también revirtió la producción de citocinas proinflamatorias por parte de E. coli
enteropatógena en la mucosa colónica de pacientes con colitis ulcerosa, induciendo la producción de
Discusión
111
Tabla 9. Efectos beneficiosos de algunos probióticos en modelos experimentales de inflamación
intestinal
Probiótico Modelo Eficacia Cita bibliográfica
RATAS
L. reuteri Acido acético
Reducción de la MPO y de la
permeabilidad de la mucosa
Fabia et al., 1993
L. reuteri Metotrexato
Recuperación del peso animal,
Reducción de la permeabilidad y MPO
Mao et al., 1996
LGG/ VSL#3 Iodoacetamida Reducción del peso colónico, MPO,
PGE2 y NOS
Shibolet et al., 2002
L. plantarum
NCIMB8826
TNBS Inhibición de la traslocación bacteriana a
los nódulos linfáticos mesentéricos y bazo
Pavan et al., 2003
L. rhamnosus GG +
Antibióticos
Ratas transgénicas
HLA-B27
Reducción del score histológico, MPO,
IL-1β, TNF-α. Aumento de IL-10
Dieleman et al., 2003
RATONES
L. reuteri IL-10 KO Reducción de la adherencia a la mucosa
y la traslocación bacteriana
Madsen et al., 1999
L. salivarius ssp.
Salivarius UCC118
IL-10 KO Reducción de la prevalencia de cáncer
de colon. Reducción de
Coliformes y Enterococos
O’Mahony et al., 2001
VSL#3 IL-10 KO Normalización de la función colónica,
y la integridad de la barrera mucosa.
Reducción del TNFα y del INFγ
Madsen et al., 2001
Ag. solubles
E coli cepa Laves
DSS Reducción de IL-1β, TNF-α e INFγ Konrad et al., 2003
Ag solubles B. breve,
B. longum
DSS + Bacteroides
vulgatus
Reducción de la densidad de
Bacteroides vulgatus
Setoyama et al., 2003
Discusión
112
la citocina antiinflamatoria IL-10 por células T y macrófagos de la misma, mostrando así su posible
efecto antiinflamatorio intestinal (Pathmakanthan et al., 2004).
Aunque estos resultados son prometedores, es importante indicar la existencia de algunos
estudios en los que los probióticos no han demostrado tener eficacia tanto en ensayos clínicos como
en modelos experimentales. Esto sugiere que la eficacia de los mismos puede variar dependiendo de
diferentes factores:
- Especie y cepa probiótica
- Dosis
- Momento de comienzo del tratamiento
- Características del hospedador
- Características del modelo
Por esta razón, es interesante evaluar y comparar los efectos beneficiosos de diferentes
probióticos en el mismo modelo experimental y con la misma dosis, y así establecer qué probióticos
muestran el mejor perfil antiinflamatorio, datos que incluso podrían predecir una actuación sinérgica
tras su asociación. Con este objetivo la presente tesis se ha desarrollado en tres apartados:
1.- Valoración del efecto antiinflamatorio intestinal de Lactobacillus casei, Lactobacillus
acidophilus, y Bifidobacterium lactis, probióticos con eficacia demostrada en estudios anteriores.
Estos resultados nos permitirán ratificar las afirmaciones anteriores, estableciendo sus características
diferenciales en el modelo de colitis experimental seleccionado.
2.- Ensayo de la actividad de los probióticos Lactobacillus salivarius ssp. salivarius y Lactobacillus
fermentum, probióticos ensayados por primera vez en un modelo de colitis experimental y que en
estudios in vitro presentaron propiedades añadidas que podían conferirle propiedades
antiinflamatorias, como la modificación de la relación citocinas antiinflamatorias/citocinas
proinflamatorias y la liberación de glutation respectivamente
3.- Estudio comparativo de los efectos preventivos ejercidos por los dos probióticos: Lactobacillus
fermentum y Lactobacillus reuteri, siendo este último un probiótico con elevada eficacia demostrada
tanto en humanos como en modelos experimentales de enfermedad inflamatoria intestinal.
Discusión
113
Para llevar a cabo nuestros estudios, el modelo experimental utilizado ha sido el del ácido
trinitrobenecenosulfónico (TNBS), uno de los más utilizados para conocer los mecanismos
involucrados en el proceso inflamatorio intestinal, así como para valorar inicialmente nuevos
tratamientos potencialmente útiles en la EII en humanos. Su amplio uso se debe a su gran similitud
con las características de la EII en humanos, su fácil reproducción y su bajo coste. Este modelo
consiste en la administración intracolónica de una solución de TNBS en etanol al 50%. El etanol da
lugar a la ruptura de la barrera intestinal facilitando el acceso del TNBS a la mucosa, donde éste
actúa como hapteno (Morris et al., 1989) siendo el responsable de la instauración del proceso
inflamatorio (Elson et al., 1995). Se ha postulado que el TNBS, además de actuar como hapteno,
ejerce un efecto citotóxico directo sobre el epitelio colónico, como consecuencia de su capacidad
para generar especies reactivas derivadas del oxígeno tras su metabolismo por parte de los
colonocitos (Grisham et al., 1991), así como por producir una disminución de los niveles colónicos
de glutation (Ardite et al., 2000). Estos hechos facilitarían la desorganización de la citoarquitectura
colónica, el aumento de la permeabilidad intestinal y la entrada de productos luminales,
promoviendo la activación del sistema inmunológico intestinal con la consecuente hiperproducción
de diferentes mediadores proinflamatorios (Figura 6) (Yamada et al., 1992). En cualquier caso, la
presencia de la flora bacteriana colónica es determinante en la colitis crónica (Garcia-Lafuente et al.,
1998), de manera que, cuando el TNBS/etanol es administrado a animales libres de gérmenes (o bajo
tratamiento antibacteriano), la respuesta inflamatoria obtenida es cuantitativamente inferior.
Como consecuencia del daño colónico inducido por el TNBS tiene lugar la activación e
infiltración de neutrófilos y monocitos (inicialmente), así como linfocitos (posteriormente) en la
lámina propia, que contribuyen de forma clave al daño y cronicidad de proceso inflamatorio (Palmen
et al., 1995; Yamada et al., 1992). El proceso inflamatorio intestinal generado se mantiene entre 3 y
8 semanas (dependiendo de la dosis del TNBS), lo que supone un periodo de tiempo adecuado para
la realización de estudios farmacológicos (Raban et al., 1996). Concretamente, este modelo presenta
una gran similitud con la enfermedad de Crohn en humanos, tanto con relación a las modificaciones
histomorfológicas, como al perfil de citocinas que se genera en el colon de los animales de
experimentación. Así, en distintos estudios con TNBS se ha demostrado que existe un predominio de
células T con predominio Th1, que se caracterizan por la producción de grandes cantidades de INF-γ
y pequeñas cantidades de IL-4 (Elson et al., 1996; Neurath et al., 1995); este tipo de respuesta esta
Discusión
114
promovida por una hipersecreción de IL-12 que actúa como un potente inductor del desarrollo de
células del tipo Th1, productoras de INF-γ (Trinchieri, 1994), al igual que ocurre en la EC (Breese et
al., 1993; Fuss et al., 1996; Monteleone et al., 1997; Parronchi et al., 1997). Del mismo modo la
colitis por TNBS reproduce otras características de esta enfermedad como la fibrosis y la formación
de adherencias mesentéricas, obstrucción intestinal e impacto fecal (Morris et al., 1989; Sánchez de
Medina et al., 1996)
TNBS
IFNγ
IL-12
Th1
TNFαIL-1 βNO
MPO
Neutrófilo
Macrófago
Célula presentadora de antígenos
Figura 6. La administración del TNBS por vía intracolónica origina un proceso colítico
caracterizado por la liberación de numerosos mediadores proinflamatorios, así como la inducción
de ciertas enzimas.
Discusión
115
El modelo descrito inicialmente por Morris et al. (1989) consiste en la inducción del daño
colónico mediante la administración de una dosis única de 30 mg de TNBS en etanol al 50% (v/v).
En el presente estudio la dosis administrada se ha reducido a 10 mg, con el objeto que el proceso
inflamatorio inducido sea mas fácil de modular mediante el correspondiente tratamiento, tal y como
ha sido propuesto anteriormente (Allgayer et al., 1989; Veljaca et al., 1995). De hecho, y en
comparación con resultados previos de nuestro grupo de investigación y con los obtenidos por otros
autores, la administración de esta dosis de TNBS (10 mg) desarrolló un daño colónico
cualitativamente similar al inducido con 30 mg, aunque cuantitativamente menor (Camuesco et al.,
2005; Morris et al., 1989).
1.- Ensayo de los probióticos Bifidobacterium lactis, Lactobacillus acidophilus y Lactobacillus
casei en el modelo de colitis experimental por el acido trinitrobencenosulfónico (TNBS) en
ratas.
La selección de estos tres probióticos se realizó atendiendo a los estudios anteriores que
muestran su eficacia en distintos modelos de inflamación intestinal.
En este sentido, Bifidobacterium lactis ejerce un efecto protector sobre la permeabilidad
intestinal (y en consecuencia, un efecto beneficioso sobre la EII) al reducir la traslocación bacteriana
a los nódulos linfáticos mesentéricos en un modelo de resección del 80% del intestino delgado, tanto
en ratas Wistar como en ratones (Eizaguirre et al., 2002; Garcia-Urkia et al., 2002).
Estas observaciones son confirmadas en nuestro estudio, ya que B. lactis ejerce un efecto
beneficioso que se observó inicialmente por una reducción significativa de la incidencia de diarrea
en las ratas tratadas en comparación con el grupo colítico sin tratamiento, sugiriendo así la
preservación de la integridad de la mucosa colónica. Ésto es de gran importancia ya que la alteración
de esta barrera conlleva un incremento en el trasporte de antígenos luminales, toxinas bacterianas y
microorganismos hacia la lámina propia, estimulando los distintos tipos celulares de la misma,
incluyendo las células inmunes, provocando así la inflamación del tejido (Heyman et al., 1994). El
análisis macroscópico del colon de las ratas tratadas con este probiótico mostró una reducción
significativa del cociente peso/longitud, indicador de edema colónico, que se encuentra aumentado
en el grupo colítico sin tratamiento probiótico como consecuencia del proceso inflamatorio. Éste
efecto beneficioso se asoció con una restauración del contenido colónico de glutation cuyo
Discusión
116
agotamiento constituye un mecanismo importante de daño tisular en la enfermedad inflamatoria
intestinal. De hecho, estudios previos han mostrado que compuestos con propiedades antioxidantes,
como los derivados del ácido 5 aminosalicílico o los flavonoides, contribuyen de manera beneficiosa
en la remisión de éstas patologías intestinales (Camuesco et al., 2004; Grishman 1994). El análisis
bioquímico mostró que B. lactis es capaz de disminuir de manera significativa la producción de
TNFα colónica, citocina con un papel clave en la inflamación intestinal (Rutgeerts et al., 2004). Por
último, el efecto antiinflamatorio de este probiótico también se acompañó por una reducción de la
expresión de la iNOS, inducida en el epitelio durante la inflamación intestinal activa (Kimura et al.,
1997; Singer et al., 1998). Este efecto puede estar asociado con su capacidad de reducir los niveles
de TNFα, citocina que promueve la expresión de la iNOS mediante la activación del NF-κB; o de
preservar los niveles de glutation. ya que existe una relación directa entre el estrés oxidativo y la
regulación de la expresión de iNOS (Hecker et al., 1996; Lu y Wahl 2005). Por tanto, como
consecuencia del tratamiento probiótico, se inhibe la producción de mediadores proinflamatorios
importantes derivados del NO, como el peroxinitrito, agente que juega un papel muy importante en
la patogénesis de la enfermedad (Fiocchi 1998)
El siguiente probiótico utilizado fue Lactobacillus acidophilus. Chen et al., (2005),
pusieron de manifiesto su actividad inmunomoduladora inhibiendo la producción de citocinas
antiinflamatorias como IL-6, IL-12, y TNF-α y estimulando la de citocinas antiinflamatorias como
IL-10 en un modelo de colitis por Citrobacter rodentium, modelo específico de ratones con
hiperproliferación de células epiteliales. Además, demostraron un efecto protector sobre la mucosa
colónica al aumentar la secreción intestinal de IgA y limitando la infección por bacterias entéricas en
el mismo modelo (Chen et al., 2005). También, cabe destacar que L. acidophilus forma parte de la
mezcla probiótica VSL#3 con gran actividad en distintos modelos de inflamación intestinal.
En el presente estudio Lactobacillus acidophilus previene la colitis inducida por TNBS en
ratas, evidenciado macroscópicamente, por una reducción significativa del daño colónico, y del
cociente peso/longitud; y bioquímicamente por una disminución de la MPO en comparación con las
ratas colíticas no tratadas. Esta bajada en la actividad enzimática muestra la menor infiltración de
neutrófilos, probablemente derivado de una reducción en la producción colónica de LTB4,
eicosanoide con capacidad quimiotáctica. Este efecto también se puede relacionar con la atenuación
del estrés oxidativo en el colon, ya que el tratamiento con este probiótico recupera de manera
Discusión
117
significativa los niveles colónicos de glutation. El efecto inhibidor sobre la síntesis y/o liberación del
LTB4 puede considerarse un mecanismo de acción bastante característico del efecto antiinflamatorio
intestinal ejercido por L. acidophilus, siendo de gran interés ya que se ha descrito para diferentes
fármacos para el tratamiento de la EII como sulfasalazina o 5-ASA (Travis y Jewel 1994).
Finalmente, el efecto antiinflamatorio ejercido por este probiótico también se asoció a una menor
expresión de la iNOS, posiblemente derivado de la restauración de los niveles de glutation o de la
reducción de los niveles de LTB4
Por último, estudiamos la actividad antiinflamatoria de Lactobacillus casei,
microorganismo que también forma parte de la mezcla probiótica VSL#3. Éste ha mostrado su
eficacia en varios modelos experimentales, mediados por diferentes mecanismos de acción. Se ha
demostrado que Lactobacillus casei DN-114001 es capaz de reducir la permeabilidad intestinal
alterada como consecuencia del proceso inflamatorio inducido por el TNBS en ratas, disminuyendo
así la traslocación bacteriana a los nódulos linfáticos mesentéricos, al hígado y al bazo (Llopis et al.,
2005). Su efecto antiinflamatorio ha sido apoyado también por su capacidad de aumentar los niveles
de IgA (inmunoglobulina capaz de promover la barrera inmunológica) en la mucosa colónica en un
modelo de colitis por DSS en ratones BALB-c (Kokesova et al., 2006). La misma cepa también ha
inhibido la adhesión e invasión de Escherichia coli enteropatógena en células epiteliales Caco-2,
hecho que se puso de manifiesto en un estudio in vitro incubándose el probiótico, a la vez, antes y
después del patógeno (Ingrassia et al., 2005). L. casei shirota ha demostrado su actividad
antiinflamatoria ejerciendo un efecto inmunomodulador al inhibir la producción de citocinas
proinflamatorias: IFNγ e IL-6 en células mononucleares de la lámina propia del intestino grueso
estimuladas con LPS (Matsumoto et al., 2005). Finalmente, L. casei inmunitas es capaz de inhibir la
migración de leucocitos al epitelio colónico al inhibir su adherencia al endotelio vascular, como
consecuencia de la inhibición de la ICAM-1 (molécula de adhesión intercelular-1), en un modelo de
colitis experimental por TNBS en ratas (Angulo et al., 2006).
Los resultados obtenidos del tratamiento con el tercer probiótico, Lactobacillus casei
LAFTI L26, muestran su efecto beneficioso desde el punto de vista macroscópico mediante la
reducción significativa del cociente peso/longitud; y bioquímico por una recuperación de los niveles
de glutation. Su actividad beneficiosa también se asoció a una reducción de la expresión de la COX-
2, enzima que cataliza la conversión del acido araquidónico dando lugar a las prostaglandinas PGE2
Discusión
118
y PGI2, que se encuentran implicadas en procesos patológicos del tracto gastrointestinal, y es
inducida en macrófagos, fibroblastos y células vasculares, endoteliales y de músculo liso por varias
citocinas, endotoxinas, factores de crecimiento o promotores de tumores (Smith y Langenbach,
2001)
Una característica interesante que nos gustaría destacar es que solo los probióticos del
género Lactobacillus fueron capaces de modificar la flora colónica, mejorando el cociente
Lactobacillus/Bacterias patógenas. Este efecto contribuye de manera significativa al efecto
beneficioso ejercido por los probióticos en este modelo de colitis experimental. De hecho, se ha
demostrado que el aumento en la concentración de Lactobacillus sp. reduce la adherencia y
traslocación de bacterias patógenas en ratones IL-10 KO (Madsen et al., 1999), previniendo así sus
efectos perjudiciales sobre la respuesta inmunitaria exacerbada en la inflamación intestinal, según lo
propuesto tanto en modelos experimentales (Garcia-Lafuente et al., 1997) como en humanos
(Cummings et al., 2003).
Para poder comparar en conjunto los probióticos, realizamos la Tabla 10. Analizando estos
resultados, podemos observar que si bien los tres probióticos presentan actividad antiinflamatoria
(evidenciado por la relación peso/longitud y la restauración de los niveles de glutation), tienen
marcadas diferencias en su comportamiento desde el punto de vista macroscópico, bioquímico y
microbiológico. En este sentido, podemos destacar que:
- B. lactis, es el único probiótico capaz de modular la producción de TNFα , modulando de
manera beneficiosa la respuesta inmune alterada en la inflamación.
- Solamente L. acidophilus, inhibió los niveles de LTB4, eicosanoide quimiotáctico que juega un
papel muy importante en los estadios iniciales del proceso inflamatorio. La menor infiltración
leucocitaria derivada de esta inhibición viene avalada por la disminución en los niveles de la
actividad MPO. Otro mecanismo importante es el efecto sobre el cociente
Lactobacillus/patógeno.
- Por último, Lactobacillus casei, ademas de disminuir el cociente Lactobacillus/Patógeno, redujo
la producción enzimática de la COX-2, probablemente derivado de la reducción del estrés
oxidativo como consecuencia del tratamiento probiótico, ejerciendo un efecto positivo sobre la
inflamación intestinal.
Discusión
119
Tabla 10. Resumen de resultados del tratamiento con B. lactis, L. acidophilus, L. casei y en el
modelo de colitis experimental por TNBS en ratas.
B. lactis L. acidophilus L. casei
IDM +
Longitud daño +
Peso/longitud ++ ++ ++
MPO ++
Glutation + + +
TNFα +
LTB 4 +
iNOS + +
COX-2 +
Lactobacillus:
Patógeno
+ +
+: p<0,05 vs. control; ++: p<0,01 vs. control.
Discusión
120
2.- Ensayo de los probióticos Lactobacillus salivarius ssp. salivarius y Lactobacillus fermentum
en el modelo de colitis experimental por el acido trinitrobencenosulfónico (TNBS) en ratas.
El segundo objetivo planteó la búsqueda de otros probióticos con características idóneas
para el tratamiento de la EII. Surgió una colaboración con Puleva Biotech, empresa que aisló un gran
número de probióticos de diferentes fuentes, incluída la leche materna. De esta colección de
probióticos, se seleccionaron dos, que poseían características añadidas determinadas en estudios in
vitro:
Lactobacillus salivarius ssp. salivarius es capaz de modificar el perfil de citocinas
proinflamatorias/citocinas antiinflamatorias, reduciendo los niveles de citocinas proinflamatorias
liberadas por macrófagos (TNFα e IL-12), y aumentando los niveles de la citocina antiinflamatoria
IL-10.
El segundo probiótico fue Lactobacillus fermentum, que procede de la leche materna,
produce compuestos antioxidantes como el glutation y su precursor, el dipéptido γ-Glu-Cys.
Los resultados obtenidos en el presente estudio revelan que el tratamiento con ambos
probióticos mostró una clara eficacia en este modelo de colitis experimental. La administración oral
de los mismos facilitó la recuperación del tejido, evidenciado histológicamente, por una reducción
significativa del tamaño y severidad del tejido inflamado, mostrando las zonas ulceradas un proceso
de reepitelización; y macroscópicamente, mediante la disminución del tamaño de la lesión y del
cociente peso/longitud.
Este efecto beneficioso además se constató desde el punto de vista bioquímico por una
menor actividad MPO. Ambos probióticos fueron capaces de reducir los niveles de esta enzima,
hecho confirmado histológicamente mediante una disminución de la infiltración leucocitaria en los
grupos tratados con los probióticos en comparación con el grupo control, lo que demuestra su efecto
beneficioso, ya que la extravasación de leucocitos contribuye de forma muy marcada al daño
colónico en este modelo de inflamación intestinal (Ajuebor et al., 2004).
Sin embargo, el mecanismo por el que estos probióticos inhiben la migración leucocitaria
puede diferir en función de las características descritas in vitro para estas bacterias.
Discusión
121
Así, el efecto inhibidor de Lactobacillus fermentum sobre la infiltración leucocitaria puede
ser consecuencia del efecto preventivo ejercido contra los radicales libres derivados del daño
oxidativo provocado por el TNBS, mediante la producción de glutation y de su precursor γ-Glu-Cys
(Ardite et al., 2000; Grishman et al., 1991). Este dipéptido tiene un papel muy importante, de hecho,
diversos estudios han descrito que es un antioxidante aún más efectivo que el glutation en el
intestino. Aunque γ-Glu-Cys puede ser también el sustrato de otras enzimas, como γ-
glutamilciclotransferasa, la síntesis de glutation esta aumentada en las células animales debido a su
alta afinidad por la glutation sintetasa (Wu et al., 2004). Las propiedades antioxidantes de estos dos
compuestos (glutation y γ-Glu-Cys), parecen ser cruciales para el efecto beneficioso de este
probiótico. De hecho, se ha propuesto que la generación de radicales libres en el tejido inflamado
constituye una señal temprana que promueve la infiltración de neutrófilos en el tejido colónico, que
a su vez produce una gran cantidad de radicales libres que participan de manera activa en la
perpetuación de la respuesta inflamatoria (Guo et al., 1999). Por esta razón, la neutralización de
estas especies reactivas del oxigeno llevaría consigo la inhibición de la infiltración de neutrófilos,
hecho observado en este estudio.
En relación con la actividad antiinflamatoria ejercida por Lactobacillus salivarius ssp.
salivarius, se caracterizó por una reducción muy marcada de los niveles de TNFα, mediador muy
importante, ya que actúa como un potente quimioatrayente, contribuyendo así al reclutamiento de
neutrófilos en la mucosa. Este hecho concuerda con los estudios in vitro que demuestran que L.
salivarius es capaz de reducir los niveles de las citocinas proinflamatorias liberadas por macrófagos
(TNFα y IL-12) y aumentar los de la citocina antiinflamatoria IL-10. Hay una gran diversidad en las
características inmunomoduladoras de las cepas de Lactobacillus ya que hay trabajos previos que
indican que ciertas cepas de Lactobacillus tienen la capacidad de aumentar los niveles de TNFα
(Miettinen et al., 1996), sin embargo otras, como Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) lo reducen
(Pena y Versalovic, 2003). LGG también reduce el cociente TNFα/IL-10, y ha demostrado ejercer un
efecto antiinflamatorio tanto en humanos (Schultz et al., 2004) como en modelos experimentales
(Dieleman et al., 2003). Estos efectos sobre la respuesta inmunitaria tienen especial relevancia ya
que podría promover el cambio de una respuesta inmunitaria mediada por Th1 a una respuesta
inmunitaria mediada por Th2/Th3, según lo propuesto para Lactobacillus GG (Schultz et al., 2003).
Discusión
122
Finalmente, es muy interesante destacar la capacidad de Lactobacillus fermentum de
modificar la flora colónica, aumentando de manera significativa los niveles de Lactobacillus.
Sabiendo que los Lactobacillus son los responsables de la fermentación de la fibra dando lugar a la
producción de los ácidos grasos de cadena corta, decidimos medir su producción colónica. De hecho,
se comprobó que se encontraba incrementada en las ratas colíticas tratadas con Lactobacillus
fermentum en comparación con el grupo control sin tratamiento probiótico. Ésto nos hizo pensar que
el efecto inhibidor del tratamiento probiótico sobre la producción de citocinas se podía deber a la
actividad de los AGCC sobre distintos factores de transcripción, como el factor nuclear-κB (NFκB),
el cual, juega un importante papel en la regulación de la expresión de genes que codifican numerosas
citocinas en la inflamación (Schottelius y Baldwin, 1999). De hecho, se ha publicado que el butirato
reduce la producción de TNFα en células mononucleares de la lamina propia de biopsias intestinales
mediante la inhibición de la activación del NFκB y de la degradación del IκBα (Segain et al., 2000).
También se ha señalado el efecto del butirato sobre el NFκB en células HT-29, probablemente
derivado de su capacidad de inhibir deacetilasas (Inan et al., 2000). Finalmente hay que destacar que
la reducción del estrés oxidativo colónico puede reducir la producción de citocinas, ya que el NFκB
es un factor de transcripción que se activa por el estrés oxidativo en la inflamación intestinal (Rogler
et al., 1998).
De este estudio podemos deducir (Tabla 11) que ambos probióticos muestran actividad
antiinflamatoria. Aunque existen ciertas diferencias, como en cuanto a su capacidad
inmunomoduladora, ya que Lactobacillus salivarius baja de manera más marcada los niveles de
TNFα en comparación con Lactobacillus fermentum. Por otro lado, solamente L. fermentum es
capaz de aumentar de forma significativa los niveles de Lactobacillus en el colon, y en consecuencia
los niveles de ácidos grasos de cadena corta, sustratos del colonocito, ejerciendo un efecto
beneficioso en su recuperación.
Discusión
123
Tabla 11. Comparación del efecto antiinflamatorio de Lactobacillus salivarius ssp. salivarius y
Lactobacillus fermentum en el modelo de colitis experimental por TNBS en ratas.
L. salivarius L. fermentum
IDM + +
Long daño ++ ++
Peso/longitud ++ ++
MPO + ++
Glutation + +
TNFα ++ +
iNOS + +
Lactobacillus +
+: p<0,05 vs. control; ++: p<0,01 vs. control.
Analizando los resultados, L. fermentum aporta una serie de características que lo hacen un
probiótico ideal para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal, bien solo o asociado, ya
que es uno de los pocos capaces de generar compuestos antioxidantes per se. Además, de todos los
probióticos ensayados, es el único que incrementó el recuento de bacterias saprofitas beneficiosas.
Discusión
124
3.- Estudio comparativo de los efectos preventivos ejercidos por los dos probióticos:
Lactobacillus fermentum y Lactobacillus reuteri en el modelo de colitis experimental por TNBS
en ratas.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el estudio de la eficacia de los anteriores
probióticos, decidimos comparar la actividad antiinflamatoria de Lactobacillus fermentum y de
Lactobacillus reuteri, probiótico con eficacia sobradamente demostrada en anteriores estudios
(Holma et al. 2001; Madsen et al. 1999; Mao et al. 1996; Moller et al. 2005), sin embargo éste es el
primero que la describe en este modelo de colitis experimental.
Los dos probióticos redujeron algunos de los parámetros clínicos característicos de este
modelo de colitis experimental como la anorexia, diarrea, y parámetros macroscópicos; sin embargo,
el tratamiento con Lactobacillus fermentum resultó, de nuevo, ser mas efectivo. De hecho, este
probiótico disminuyó la incidencia de diarrea y adhesiones, el cociente peso/longitud así como la
extensión y el índice de daño macroscópico. Y por el contrario, el tratamiento con Lactobacillus
reuteri sólo modificó el cociente peso/longitud en comparación con las ratas colíticas no tratadas.
Desde el punto de vista bioquímico, únicamente Lactobacillus fermentum redujo la
actividad enzimática MPO, y contrarrestó la reducción de los niveles de glutation como
consecuencia de la colitis. Sin embargo, si disminuyeron de manera significativa los niveles de
TNFα ambos probióticos
Finalmente, el estudio microbiológico mostró que tanto Lactobacillus fermentum como
Lactobacillus reuteri restauraron el cociente Lactobacilli/Bacterias patógenas, contribuyendo al
efecto beneficioso ejercido por los dos probióticos. Es interesante destacar que Lactobacillus
fermentum es capaz de aumentar la producción de AGCC, especialmente butirato, que es la fuente de
energía fundamental del colonocito. Sin embargo, diversos autores han propuesto que la EII podría
ser consecuencia de una falta de butirato en el colon o de una alteración de la utilización del mismo
por parte del colonocito (Mortensen y Clausen, 1996; Rodríguez-Cabezas et al. 2002).
Discusión
125
Tabla 12. Resumen de resultados del tratamiento con L. fermentum y L. reuteri en el modelo de
colitis experimental por TNBS en ratas.
L. fermentum L. reuteri
IDM *
Longitud daño +
Peso/longitud +* +
MPO +*
Glutation +
TNFα + +
Acetato *
Butirato *
Propionato *
Lactobacillus +
Bifidobacterium + +
Lactobacillus:
Patogeno
+ +
+: p<0,05 vs. control; *: p<0,05 vs. Lactobacillus reuteri.
Basándonos en la Tabla 12, y comparando los resultados de este estudio, ambos probióticos
tienen en común la capacidad de reducir el edema colónico evidenciado por el cociente
peso/longitud; la reducción de los niveles de la citocina proinflamatoria TNFα, mostrando por tanto
Discusión
126
ambos un efecto modulador de la respuesta inmunitaria; y el cociente Lactobacillus/Patógeno,
parámetro clave para su actividad antiinflamatoria intestinal. Sin embargo, Lactobacillus fermentum
posee propiedades añadidas como la producción de glutation, que podría explicar la menor
infiltración de neutrófilos evidenciado por unos reducción de los niveles de MPO. Por tanto, nuestro
probiótico es mas eficaz que L. reuteri, probiótico con eficacia más que demostrada sobre la salud
humana (Valeur et al., 2004).
También cabe destacar que estos probióticos se encuentran en la leche materna, aunque las
dosis administradas a las ratas en este estudio probablemente son mucho mayores a las presentes en
la misma. Sin embargo, estos resultados sugieren que la colonización de estos probióticos en el
lumen colónico, podría resultar en efectos beneficiosos para estos sujetos, probablemente derivados
de sus propiedades inmunomoduladoras.
Finalmente, en este estudio hemos ratificado el gran potencial terapéutico de Lactobacillus
fermentum sobre estas patologías intestinales, superando incluso a probióticos como Lactobacillus
reuteri, que ha demostrado su eficacia en distintas patologías en un gran número de estudios.
Lactobacillus fermentum, además de ser uno de los pocos que es capaz de producir glutation per se,
posee actividad inmunomoduladora y es capaz de preservar la función de barrera intestinal al
aumentar los niveles de lactobacilos y bifidobacterias. No obstante, hay que hacer más estudios tanto
experimentales como en humanos para poder confirmar estos resultados.
CONCLUSIONES
Conclusiones
129
1. Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus y Bifidobacterium lactis muestran actividad
antiinflamatoria intestinal en el modelo de colitis experimental por TNBS en ratas, siendo su
eficacia diferente tanto desde el punto de vista cualitativo como cuantitativo.
2. El tratamiento con Lactobacillus salivarius ssp. salivarius también muestra eficacia
antiinflamatoria en el mismo modelo. Ésta se basa en su capacidad de modular la respuesta
inmune, evidenciada por una disminución significativa de la citocina TNFα.
3. Lactobacillus fermentum mostró un claro efecto beneficioso en esta colitis experimental debido
a su capacidad de generar sustancias antioxidantes. Además, este probiótico fue el único de
todos los ensayados que elevó la población de lactobacilos y bifidobacterias, lo que repercutió
en un aumento de los niveles de ácidos grasos de cadena corta, especialmente butirato.
4. Por ultimo, Lactobacillus fermentum puede ser una especie con un gran interés en el tratamiento
de la enfermedad inflamatoria intestinal utilizándose bien solo o asociado ya que es uno de los
pocos probióticos capaces de generar sustancias antioxidantes.
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Bibliografía
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ANEXOS
Abreviaturas
167
ABREVIATURAS
Ag. Antígeno
AGCC Ácido graso de cadena corta
AINE Antiinflamatorio no esteroídico
BCA Ácido bicinchoninico
CARD Dominio de recruimiento de caspasas (Caspase recruitment domain)
CFU Unidad formadora de colonias
CMH-II Complejo mayor de histocompatibilidad de clase II
COX-2 Ciclooxigenasa-2
CU Colitis ulcerosa
DSS Sulfato de dextrano sódico
EC Enfermedad de Crohn
EDTA Ácido etilendiaminotetraácetico (ethylenediaminetetraacetic acid)
EII Enfermedad inflamatoria intestinal
E. coli Escherichia coli
FID Detector de ionización de llama (Flame ionization detector)
GSH Glutation reducido
GSSG Glutation oxidado
HPLC Cromatografía líquida de alta definición (High Performance Liquid
Chromatography)
IAEC Índice de actividad de la Enfermedad de Crohn
IAP Índice de actividad de la pouchitis
IBD Inflammatory bowel disease
IDM Índice de daño macroscópico
Ig Inmunoglobulina
I κB Subunidad inhibidora κB
I κK I κB kinasa
IL Interleucina
Abreviaturas
168
IFN-γ Interferon-γ
iNOS Óxido nítrico sintasa inducible
LGG Lactobacillus rhamnosus GG
LPS Lipopolisacarido
LTB4 Leucotrieno B4
MPO Mieloperoxidasa
NADPH Nicotinamida adenin dinucleotido fosfato reducido
NF-κB Factor de transcripción nuclear κB
NO Óxido nítrico
NOD Dominio intracelular de oligomerización de nucleótidos
(intracellular nucleotide oligomeration domain)
NOS Óxido nítrico sintasa
PBS Tampon fosfato salino (Phosphate buffer saline)
PGE2 Prostaglandina E2
SDS Dodecil sulfato sódico (sodium dodecyl sulfate)
SDS-PAGE Electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida
TBS Tampón tris salino (Tris buffer saline)
TCA Ácido tricloroacético
TGF-β Factor de crecimiento transformante-β
Th Célula T colaboradora (T helper)
TLR Receptor tipo Toll (Toll like receptor)
TNBS Ácido trinitrobencenosulfónico
TNF-α Factor de necrosis tumoral α
Tablas
169
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Características diferenciales entre la EC y la CU…………………………………………...4
Tabla 2. Efectos de los probióticos en la inducción de la remisión de la colitis ulcerosa………….22
Tabla 3. Efecto de los probióticos en el mantenimiento de la remisión de la colitis ulcerosa……..23
Tabla 4. Efectos de los probióticos en la inducción de la remisión de la enfermedad de Crohn…....25
Tabla 5. Efectos de los probióticos en el mantenimiento de la remisión de la enfermedad de
Crohn…………………………………………………………………………………….…………..26
Tabla 6. Efectos de los probióticos en la pouchitis crónica………………………………………...28
Tabla 7. Escala de valoración del índice de daño macroscópico (IDM) en el modelo de colitis
experimental por TNBS en ratas……………………………………………………………………..42
Tabla 8. Escala de valoración del daño histológico en el modelo de colitis experimental por TNBS
en ratas……………………………………………………………………………………………….48
Tabla 9. Efectos beneficiosos de los probióticos en modelos experimentales de inflamación
intestinal……………………………………………………………………………………………111
Tabla 10. Resumen de resultados del tratamiento con B. lactis, L. acidophilu y, L. casei en el
modelo de colitis experimental por TNBS en ratas………………………………………………...119
Tabla 11. Comparación del efecto antiinflamatorio de Lactobacillus salivarius ssp. salivarius y
Lactobacillus fermentum en el modelo de colitis experimental por TNBS en ratas……………….123
Tabla 12. Resumen de resultados del tratamiento con L. fermentum y L. reuteri en el modelo de
colitis experimental por TNBS en ratas…………………………………………………………….125
Figuras
171
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Componentes implicados en la etiopatogénesis de la EII………………………………….6
Figura 2. Influencia de la proteína NOD2/CARD15 en la EII. Las bacterias o sus componentes
celulares penetran en macrófagos o células epiteliales y se unen a la proteína, que a su vez activa al
factor de transcripción NF-κB.………………………………………………………………………..8
Figura 3. Balance microbiano y disbiosis. En la enfermedad inflamatoria intestinal, las bacterias
luminales desencadenan una respuesta inmunológica anormal. El equilibrio entre las bacterias
beneficiosas y las agresivas regula la homeostasis en la inflamación crónica, influenciado éste por
diferentes factores genéticos y ambientales………………………………………………………….16
Figura 4. Diferentes mecanismos de acción ejercidos por las bacterias
probióticas……………………………………………………………………………………………29
Figura 5. Diseño experimental………………………………………………………………………41
Figura 6. La administración del TNBS por vía intracolónica origina un proceso colítico
caracterizado por la liberación de numerosos mediadores proinflamatorios, así como la inducción de
ciertas enzimas……………………………………………………………………………………...114
