LAB.GENETICA

PRACTICAS N.5 Y 6

“EXTRACCION Y PURIFICACION DE ADN DE CELULAS EUCARIOTES”

“CORRIMIENTO ELECTROFORETICO DE DNA”

CATEDRATICO:

DRA. KARINA TRUJILLO MURILLO

INTEGRANTES DEL EQUIPO:

AREVALO MONTERRUBIO RENE DE JESUS BARTOLO COELLO TRINIDAD VILLATORO ALVAREZ SANDY CAROLONA

5to. “A”

Tapachula, Chiapas a 08 de Octubre del 2009

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIAPAS

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

CAMPUS IV

INTRODUCCION

El ADN es un polímero de nucleótidos, es decir, un polinucleótido. Un polímero es un compuesto formado por muchas unidades simples conectadas entre sí, como si fuera un largo tren formado por vagones. En el ADN, cada vagón es un nucleótido, y cada nucleótido, a su vez, está formado por un azúcar (la desoxirribosa), una base nitrogenada (que puede ser adenina→A, timina→T, citosina→C o guanina→G) y un grupo fosfato que actúa como enganche de cada vagón con el siguiente. Lo que distingue a un vagón (nucleótido) de otro es, entonces, la base nitrogenada, y por ello la secuencia del ADN se especifica nombrando sólo la secuencia de sus bases. La disposición secuencial de estas cuatro bases a lo largo de la cadena (el ordenamiento de los cuatro tipos de vagones a lo largo de todo el tren) es la que codifica la información genética: por ejemplo, una secuencia de ADN puede ser ATGCTAGATCGC... En los organismos vivos, el ADN se presenta como una doble cadena de nucleótidos, en la que las dos hebras están unidas entre sí por unas conexiones denominadas puentes de hidrógeno.

Electroforesis

La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico. La separación puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte sólido (p. ej., electroforesis en papel o en acetato de celulosa), o bien a través de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolución (electroforesis libre). Dependiendo de la técnica que se use, la separación obedece en distinta medida a la carga eléctrica de las moléculas y a su masa.

La variante de uso más común para el análisis de mezclas de proteínas o de ácidos nucleícos utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los ácidos nucleícos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas se cargan al unirse con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular de la proteína. Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida.

La gran mayoría de macromoléculas están cargadas eléctricamente y, al igual que los electrolitos, se pueden clasificar en fuertes y débiles dependiendo de la constante de ionización de grupos ácidos y básicos. Por ejemplo los ácidos nucleicos son poliácidos fuertes.

Por lo general para caracterizar la molécula se determina la velocidad a la que esta se mueve en un campo eléctrico y se utiliza para determinar, en el caso de proteínas, la masa molecular o para detectar cambios de aminoácidos y separar cuantitativamente distintas especies moleculares; en el caso de ácidos nucleicos se determina su tamaño, medido en pares de bases.

Espectrofotometría

La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones químicas y biológicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.

El ADN extracelular es una novedad biológica, de la cual se desconoce su significado clínico y fisiopatológico. Se reportan aquí, los primeros resultados cuantitativos de los niveles de ADN presentes en muestras de patronamiento, detectados a través de la técnica de espectrofotometría UV-Visible, condicionando particularmente la respuesta espectral a 260 nm de una fuente de radiación ultravioleta, y utilizando fotomultiplicador como detector. Estos primeros resultados espectrales, permiten la cuantificación de los niveles de ADN libre en suero y orina humanos de personas sanas y enfermas, los cuales contribuirán a realizar las comparaciones para entender la biología del ADN libre en la salud y la enfermedad con miras a obtener ayudas diagnósticas pronosticas y terapéuticas en enfermedades tan complejas como el cáncer, infecciones crónicas, enfermedades autoinmunes etc.

OBJETIVOS

El alumno realizara la extracción y purificación de ADN de células eucariotas

El alumno realizara el corrimiento electroforético de ácidos nucleícos extraídos y purificados

de diferentes tipos de muestras

CUESTIONARIO

1.- Explica que es la paradoja del valor C

El valor C se defina como la cantidad de ADN por genoma haploide (un solo juego cromosómico) en estado de un cromatidio (en fase G1). En el caso de la especie humana con 2n=46 cromosomas, especie diploide (2n), con dos juegos de cromosomas, uno recibido del padre y otro de la madre, cada uno formado por 23 cromosomas, el valor C sería la cantidad de ADN correspondiente a un juego de 23 cromosomas en estado de un solo cromatidio (en fase G1 antes del periodo S de síntesis). Una forma mucho más sencilla de definir el valor C, en el caso de las especies diploides, con dos juegos cromosómicos, sería el contenido de ADN de un gameto de la especie. Un espermatozoide humano y un óvulo humano (gametos) contienen 23 cromosomas en estado de un cromatidio, el valor C sería la cantidad de ADN de los 23 cromatidios de un gameto humano.

2.- Describe el procedimiento químico y enzimático, para la determinación de la secuencia de nucleótidos en un gen

3.- ¿Qué es un vector?

Un vector génico es un agente que transfiere información genética, por algún medio, de un organismo a otro. Son utilizados en biotecnología para portar el ADN recombinante desde una célula donadora hasta la célula receptora en los que se inserta el gen que se quiere transferir. A continuación se infecta la célula hospedadora con ese vector recombinante, obteniéndose la célula transgénica

Un vector con el que los científicos experimentan son los plásmidos, con los que es posible insertar genes foráneos al núcleo de una célula. Otros vectores génicos son los bacteriófagos y cósmidos. También se puede considerar vectores genéticos a los virus, puesto que en el curso de su ciclo insertan información genética en las células que invaden.

Los vectores deben llevar, además del gen protagonista, otros genes llamados marcadores, que puedan identificar a las células que sean resistentes al antibiótico marcado o que emitan luz, según los casos, serán las portadoras del ADN recombinante. La probabilidad de fracaso en la formanción del transgénico es muy alta, debido al descontrol en la inserción de ADN foráneo, de manera que la célula puede desorganizarse y morir.

4.- Esquematiza el proceso de clonación

5.- ¿Cómo realizaría la extracción y purificación de ADN en una muestra de tejido animal?

Utilizando el kit S de QuickGene para extracción de ADN en tejidos junto con la serie de Sistemas Automáticos de Aislamiento de Ácido Nucleico QuickGene se podrá aislar y también purificar ADN genómico de muestras en tejidos con muy alta calidad y rendimiento. Adicionalmente, se pueden extraer 8 muestras lisadas de tejidos simultáneamente, en sólo 13

minutos. El ADN genómico, de alta calidad, purificado se puede utilizar para aplicaciones con PCR , digestión con enzimas de restricción, Southern Blotting, y otras aplicaciones. QuickGene utiliza la técnica de filtración a presión, utilizando la técnica de filtración a presión se puede usar con gran éxito una nueva instrumentación, compacta y automatizada para la purificación rápida de ácido nucleico.

6.- ¿Cuál es la función del glicerol utilizado en el buffer de carga?

Darle densidad a la muestra de ADN para que se vaya al fondo del pósito de la agarosa

7.- Investigar las características y propiedades químicas del bromuro de etidio

El bromuro de etidio (BrEt) es un agente intercalante usado comúnmente como marcador de ácidos nucleicos en laboratorios de biología molecular para procesos como la electroforesis en gel de agarosa. Cuando se expone esta sustancia a luz ultravioleta, emite una luz roja-anaranjada, que se intensifica unas 20 veces después de haberse unido a una cadena de ADN. Este efecto es debido al aumento de la hidrofobia del medio, y no a la rigidificación del anillo bencénico, no estando éste entre pares de bases del ADN. Como el bromuro de etidio se intercala en el ADN, esta sustancia tiene un poderoso efecto mutágeno y, posiblemente puede ser cancerígeno o teratógeno.

El bromuro de etidio tiene una referencia CAS 1239-45-8, y una fórmula C21H20BrN3. Como la mayoría de los compuestos fluorescentes, es una sustancia aromática. La mayor parte de la molécula es una estructura tricíclica con grupos amino-benceno en cada lado de una molécula piridínica(seis átomos, conteniendo nitrógeno y un anillo aromático). Esta estructura dibenzopiridínica es conocida con el nombre de fenantridina.

8.- Explica porque se utiliza la luz UV para observar el corrimiento electroforético de ADN

Porque la luz UV hace visibles las bandas de ADN en el corrimiento electroforético.

9.- ¿Por qué se prefiere usar el gel de agarosa para la separación de ADN en vez de acrilamida?

Como los ácidos nucleicos son moléculas grandes (más de unos centenares de bases), la matriz empleada es agarosa purificada y la acrilamida es utilizada para el corrimiento de proteínas ya que son moléculas más pequeñas.

10.-En base a los resultados obtenidos, ¿Qué cambios realizarías en el procedimiento de la practica?

Dejar reposar al ADN con alcohol al 100% por 30min. A -20°C, para precipitar mas ADN, esto se ocuparía en casos donde la muestra fuera muy pequeña.

RESULTADOS

Mediante la utilización de este método de extracción y purificación se, obtendrá ADN de gran pureza. La cuantificación en el espectrofotómetro fue de 1.84280 lo que significa que si aceptable la pureza de nuestro ADN.

Mediante la visualización en el gel de agarosa, podemos observar ADN en el carril 6 que fue nuestra muestra (C2) demostrando la presencia de ADN.

ELECTROFORESIS DE DNA GENÓMICO EXTRAÍDO A PARTIR DE MUESTRAS DE SANGRE PERIFÉRICA

Carril 1: Marcador de PM

Carril 2: 3mL muestra MAVB

Carril 3: 3mL muestra 4

Carril 4: 3mL muestra F.A

Carril 5: 3mL muestra SIN NOMBRE

Carril 6: 3mL muestra C2

Carril 7: 3mL muestra FRNX

Carril 8: 3mL muestra C-A

Carril 9: ----------------------

Carril 10: 3mL muestra NOE

Carril 11: 3mL muestra FG

Carril 12: 3mL Marcador PM

DISCUSION

Para obtener ADN puro hay que tomar en cuenta la separación de las proteínas, lípidos, carbohidratos (SEVAG). Y detener la acción de las ADN asas que son las proteínas que degradan o parten al ADN si queremos conservar la muestra por mucho tiempo.

CONCLUSIÓN

Se logro la extracción y purificación de ADN de células eucariotas obteniendo la muestra de sangre periférica. La extracción y purificación se llevo a cabo mediante la técnica TSNT.

Realizamos el corrimiento electroforético de ácidos nucleicos (muestra).

BIBLIOGRAFÍA.

Gerald karp. Biología celular y molecular. ED McGrawHill 1998. Pág. 727-730.

Biología Molecular y Herencia. Robert A. Wallace, Jack L. King, Gerald P. Sanders., 1a edición.

Editorial Trillas. México 1991: página 97, 98.

WEDGRAFIA.

http://www.xtec.es/~lvallmaj/palau/clonater.jpg

http://es.wikipedia.org/wiki/Bromuro_de_etidio