METODOS DE EXTRACCION DE DNA

• Método fenol-cloroformo

• Método del acetato de potasio

• Método del acetato de potasio modificado• Método de bromuro de cetil-trimetil amonio

ELECTROFORESIS

Capacidad de las macromoléculas para deslazar en Un campo eléctrico, con velocidad proporcional a su carga E inversamente a su tamaño.

TIPOS

Electroforesis de campo punzante .Electroforesis de frente móvil o libre

Electroforesis en gel

Electroforesis capilar

TIPOS Y PREPARACION DE GELES

• Gel de Silic• Gel de Poliacrilamida 

El gel de sílice es una forma granular y porosa de dióxido de silicio hecho a partir deSilicasódico.

se utiliza para reducir la humedad en espacioscerrados; normalmente hasta un 40%.

Proceso de preparación del gel dePoliacrilamida 

La preparación del gel de Poliacrilamida consiste fundamentalmente en disolver en agua una mezcla de Acrilamida y Bis-Acrilamida en una determinada proporción.

Gel de sílice

que es función del grado de reticulación deseado en el polímero, y añadir Urea, Amoniopersulfato (APS) y N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina (TEMED). La función de la Urea es servir de desnaturalizante, mientras que el APS y el TEMED actúan como catalizadores y la Bis-Acrilamida como co-monómero. Un ligero calentamiento hasta unos 45 ºC favorece la disolución y acelera el comienzo de la reacción de polimerización. A continuación se vierte mediante la jeringuilla la mezcla así preparada entre placas de vidrio con una separación prefijada y se deja polimerizar, obteniéndose un gel del espesor deseado. El TBE es un tampón habitual compuesto de TRIS, Ácido Bórico y EDTA.

PCR

El PCR es un método adecuado para separar ácidos nucleicos en una cantidad superior a la de la muestra original, tanto como método de clonación celular como para la detección

OBJETIVO

La amplificación propiamente dicha, para disponer de cantidad suficiente como para utilizarlo con fines diversos

APLICACIONES DEL PCR

• Clonación Celular de los Fragmentos de ADN • Detección de secuencias sin purificación previa• Secuenciación de ácidos nucleicos• Establecimiento de polimorfismo de secuencia• Rastreos de mutaciones• Tipado de ADN para transplantes• Diagnostico de enfermedades genéticas • Resolución de problemas forenses• Estudio Evolutivo• Detección de microorganismos infecciosos • Detección de Células Tumorales • Amplificación de DNA para su poder de clonación celular

Principio del PRC

No es una técnica analítica per. Se, es una metodología, resultante de la aplicación práctica de tres conceptos ya descritos.

Ciclo del PCRCada ciclo de una PRC, consta de tres etapas:

Desnaturalización:

calentamiento para la separación de las dos hebras del ADN mediante una incubación breve (30-120 s) a una temperatura entre 68 y 97 c que debe ser superior a la de fusión de la región de ADN que se requiere amplifica.

Elongación:

etapa de amplificación (72-75C, 1-3 min.) en la que el ADN polimerasa termoestable elonga los cebadores, empleando como molde ambas hebras originales. La replicación transcurren dirección 5¨`--3´ a partir del extremo 3´- OH de cada cebador, empleando como sustrato los cuatro dNTPs, hasta terminar la lectura del molde o hasta que comience una nueva etapa de desnaturalización

Templado:

o hibridación enfriamiento rápido por debajo de Tm de forma que se permite la hibridación de las hebras sencillas del ADN de interés con los oligos cebadores, con temperaturas de 37 a 65 C que se mantienen entre 10 y 120s.

ADN RECOMBINANTEADN RECOMBINANTE

. La tecnología del DNA recombinante . La tecnología del DNA recombinante ha hecho posible investigar más a fondo ha hecho posible investigar más a fondo la estructura y función de los genes, la estructura y función de los genes, especialmente de los genes eucarióticos especialmente de los genes eucarióticos que eran inaccesibles por otros que eran inaccesibles por otros métodos. Estas investigaciones métodos. Estas investigaciones permanentemente generan nuevos permanentemente generan nuevos interrogantes e inquietudes, muchos de interrogantes e inquietudes, muchos de los cuales tienen profundas implicancias los cuales tienen profundas implicancias éticas.éticas.

ADN RECOMBINANTEADN RECOMBINANTE

Transformación Transformación de bacterias y de bacterias y localización de localización de un segmento de un segmento de DNA de interés DNA de interés por medio de una por medio de una sonda radiactivasonda radiactiva

LA ENZIMA DE RESTRICCIÓN ECORI ESCINDE ESTE LA ENZIMA DE RESTRICCIÓN ECORI ESCINDE ESTE PLÁSMIDO EN LA SECUENCIA GAATTC, PLÁSMIDO EN LA SECUENCIA GAATTC, DEJANDOEXTREMOS "PEGAJOSOS" EXPUESTOS.DEJANDOEXTREMOS "PEGAJOSOS" EXPUESTOS.

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA

HIBRIDACIONHIBRIDACION

Hibridación in situ. Hibridación in situ. Cromosomas humanos Cromosomas humanos en metafase, en los en metafase, en los cuales se identifican cuales se identifican secuencias específicas secuencias específicas de nucleótidos de nucleótidos mediante la técnica de mediante la técnica de hibridación in situ de hibridación in situ de ácidos nucleicos.ácidos nucleicos.

APLICACIONES DEL APLICACIONES DEL ADN RECOMBINANTE ADN RECOMBINANTE Los test de referencia Los test de referencia

(Aislamiento viral y PCR) (Aislamiento viral y PCR) son los más sensibles e son los más sensibles e imprecindibles para la imprecindibles para la confirmación diagnostica de confirmación diagnostica de positivos y casos positivos y casos aislados. Tienen el aislados. Tienen el inconveniente de ser lentos inconveniente de ser lentos en la obtención de en la obtención de resultados y requieren de resultados y requieren de personal cualificado de personal cualificado de laboratorio y equipamiento laboratorio y equipamiento caro.caro.

ANTICUERPOSANTICUERPOS

Son proteínas que son Son proteínas que son producidas por el sistema producidas por el sistema inmunológico en respuesta a inmunológico en respuesta a moléculas externas que entran moléculas externas que entran en el cuerpo, estas moléculas en el cuerpo, estas moléculas externas son los llamados externas son los llamados antígenos y su reconocimiento antígenos y su reconocimiento molecular por el sistema molecular por el sistema inmunológico da como resultado inmunológico da como resultado la producción de anticuerpos la producción de anticuerpos que son capaces de unirse que son capaces de unirse específicamente a ese antígeno. específicamente a ese antígeno. Los anticuerpos son producidos Los anticuerpos son producidos por los linfocitos B y circulan a por los linfocitos B y circulan a través de la sangre donde se través de la sangre donde se unen a su antígeno específico, unen a su antígeno específico, permitiendo ser eliminados de la permitiendo ser eliminados de la circulación. en aplicaciones de circulación. en aplicaciones de investigación y diagnósticoinvestigación y diagnóstico

CLONACIONCLONACION

CLONACION CLONACION

Se define como la tecnología para producción de Se define como la tecnología para producción de individuos genéticamente idénticos. Es un individuos genéticamente idénticos. Es un sistema de reproducción en la que no participan sistema de reproducción en la que no participan ovocitos y espermatozoides en la formulación ovocitos y espermatozoides en la formulación genética, sino que la carga genética contenida genética, sino que la carga genética contenida en el ADN de los cromosomas es provista por en el ADN de los cromosomas es provista por células somáticas. Se han utilizado diferentes células somáticas. Se han utilizado diferentes tipos de células, de origen embrionario, fetal o tipos de células, de origen embrionario, fetal o diferenciado de animales adultos, que diferenciado de animales adultos, que transferidas a ovocitos enucleados producen un transferidas a ovocitos enucleados producen un nuevo individuo genéticamente idéntico a la nuevo individuo genéticamente idéntico a la célula donante. Este tema expone los métodos célula donante. Este tema expone los métodos básicos de la tecnología del DNA recombinante básicos de la tecnología del DNA recombinante que se utilizan para aislar, replicar y analizar Los que se utilizan para aislar, replicar y analizar Los tejidostejidos

CELULAS MADRECELULAS MADRE

VIRUSVIRUS

Bacteriófagoviralviralviral

sida

viral

INFECCION DE UNA CELULA ANIMAL POR UN INFECCION DE UNA CELULA ANIMAL POR UN RETROVIRUSRETROVIRUS