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Esporas y su importancia
Esther Vega, Ph.D.Microbiología Aplicada
Organismos formadores deEsporas
• Bacillus• Clostridium• Desulfotomaculum• Sporolactobacillus• Alicyclobacillus• Thermoactinomyces• Sporosarcina
Inducción de la esporulación• Laboratorio- Limitación de nutrientes
– Se termina uno o más nutrientes durante elcrecimiento celular (C o N)
– Cambio de las células de un medio rico auno pobre
– Adición de un inhibidor de la síntesis de losnucléotidos de guanina
• Naturaleza
El proceso de esporulación puede tomar 8 horas.
Inducción de la esporulación
• ¿Cúal es la señal intracelular para lainiciación de la esporulación?– No es cAMP o GMP– ¿Nucléotidos de guanidina?
• La represión por carbono puede regular laesporulación
• Podría ser modulada de alguna forma por ladensidad celular
• Secreción de moléculas pequeñas al medio
Fenómenos asociados a laesporulación
• Síntesis de enzimas de degradación(amilasas, proteasas)
• Síntesis de antibíoticos• Síntesis de toxinas protéicas contra
insectos, animales o humanos• Desarrollo de motilidad• Desarrollo de competencia genética
Cambios morfológicos,bioquímicos y fisiológicos
durante esporulación
Vea figura diagrama entregado
Regulación de la expresióngenética durante esporulación
• Mutantes spo• Asporogenia puede ser causada por
mutaciones en uno o más de 75 locus
Estructura
Estructura- Exosporio
• No tiene similitud deestructura en celulavegetativa
• Varia en tamanoentre las especies
• Varios de suscomponentes noestan biencaracterizados
Estructura- “Coat” de laespora
• No tiene similitud de estructura en célulavegetativa
• Varía en complejidad entre las especies• Proteínas con enlaces S-S
– Contribuye a la resistencia a radiación• AA de composición inusual• Protege a la corteza de enzimas líticas• Barrera contra químicos como agentes
oxidantes• No role significativo en la resistencia de la
espora a calor o radiación
Estructura- “outer foresporemembrane”
• Membrana funcional• Función en la extrema
impermeabilidad de laespora a moléculaspequeñas
• Composición protéicadiferente a “innerforespore membrane”
Estructura- “inner foresporemembrane”
• Barrera de permeabilidada moléculas hidrofílicas ymayoría de moléculas de> 150 MW
• Contenido de fosfolípidossimilar a la célula
Estructura- corteza• Capa de peptidoglican• Similitudes y diferencias con
la pared celular– Acido diaminopimélico vs. Lisina– ~65% de los residuos de acido
murámico no tienen residuospeptídicos
– Muramic acid lactam vs. D-alanine
– Menor grado de “peptide cross-linking”
• Responsable de ladeshidratación del “core” amucha de la resistencia de laespora
Estructura- “germ cell wall”
• Estructura idéntica acélula vegetativa
Estructura – “Core”• DNA, ribosomas,
mayoría de las enzimas,DPA y cationesdivalentes
• SASP (10-20% de laproteína de la espora)
• Bajo contenido de agua– 0.4-1 g/g peso seco vs.
4 g/g célula vegetativa– Role en “spore
dormancy” y resistencia
Macromoléculas
• SASP – “small acid soluble proteins”– Principal responsable de la resistencia de
las espora• Provee resistencia a químicos a rompimiento
enzimático del DNA• Altera la fotoquímica del DNA
– Sintetizada en la “forespore” durante lafase III
Macromoléculas - SASP• Bacillus spp. – 3 tipos
de SASP– Tipo δ
• ~5% de la proteína de laespora, 75-100 aa
• Se degrada durante lagerminación por GPR-provee aa
• Codificada por un sólogene
• No se encuentra en lasesporas de Clostridium
– Tipo αβ• 3-5% de la proteína de
la espora,60-75 aa• Codificada por 7 genes• Se degrada durante la
germinación por GPR• Proteínas enlazadoras
de DNA (vivo, in-vitro)• Resistencia del DNA a
varios tratamientos
Moléculas pequeñas
• Los iones en el centro de la espora soninmóbiles
• El pH del centro es 1-1.5 unidades pordebajo que la célula vegetativa
• Hay pocos compuestos de energía
Tabla 3.3
“Dormancy”• No hay metabolismo
detectable– Bajo contenido de
agua– Pares de enzima-
sustrato• E.g. 3PGA-
Phosphoglyceratemutase (PGM), y SASP-GPR
• Estable por meses oaños pero degrada enlos primeros 15 a 30min de la germinación
Resistencia de la espora• Congelamiento y desecación
– SASP contribuye aestabilidad del DNA
• Presión– >resistencia presiones altas
que bajas; presiones bajaspromueven germinación
• δ-radiación– SASP no estan envueltas;
baja [] agua?; mecanismodesconocido
• Radiación UV– 7-50x más resistentes;
SASP• Químicos
– “spore coat”• Calor
– Saturación de DNA por αβSASP
– Mayor resistencia a calorseco que húmedo
– Baja cantidad de agua en elcentro (core)
Ciclo de esporulación ygerminación
Activación
• Requisitos para activación– Varia entre esporas de diferentes especies– pH bajo, químicos, calor subletal
• Reversible en algunas especies• Activación por calor
– Liberación de pequeñas cantidades deDPA (mayoría de las especies)
– Liberación de DPA – B. stearothermophilus
Germinación
• Ocurre durante los primeros 20-30 minluego de mezclar esporas congerminante
• Dormant spore Esporaactiva metabólicamente
Germinación• Excreción de minerales• Excreción de DPA
– Aumento en cantidadde agua
• Pérdida derefractibilidad,resistencia, “dormancy”
• Degradación de lacorteza– 2-3x en volúmen de
corteza– Enzímas líticas
• Reaccionesenzimáticas– Generación de ATP y
NADH de 3PGA– Degradación de SASP
por GPR y peptidasas– Catabolismo de aa– Iniciación de
catabolismo decompuestos exógenos
• Iniciación de la síntesisde RNA (mRNA?)
• Iniciación de la síntesisde proteínas
Germinantes• Germinante
– Específico por especie– Metabolismo de germinante no es requerido– Interacción con una proteína específica– Compuestos de interés
• Nucléosidos• aa• Azúcares• Sales• DPA• Aliquilaminas de cadenas largas
Crecimiento
• ~25 min luego de la iniciación de lagerminación de la espora hasta la primeradivisíon celular
• Requiere nutrientes exógenos (C,N)• ~90 min en medio rico• Se sintetizan aa, nucléotidos y otras
moléculas pequeñas• Comienza replicación DNA ~60 min luego
comienzo de germinación• Reparación DNA
Esporas en la industria dealimentos
• Formadores de esporas patógenos
C. botulinum
B. cereus
C. perfringes
C. butyricum
Alimentos enlatados de bajaacidez
• Definición del FDA yUSDA– pH>4.6 y aw>0.85– Excepciones: tomates, pH
4.7, alimentos ácidos• Procesamiento termal de
alimentos enlatados- U.S.Code of FederalRegulations (21 CFR,parts 108-114)– Llenado, equipo y
formulaciones– Reporte de desviaciones del
proceso o incidentes decontaminación
Alimentos enlatados de bajaacidez
• Esterilidad comercial– “Aplicación de calor que inactiva
microorganismos de significado para saludpública, al igual que microorganismos queno tengan significado para la salud públicapero capaces de reproducirse en elalimento bajo condiciones normales derefrigeración en almacenaje y distribución.”
Alimentos enlatados de bajaacidez
• Meta: esporas de C.botulinum
• Proceso 12D o“Botulinum cook”– “Tiempo requerido en
un proceso termal parala reducción de 12 logde esporas de C.botulinum
– Vegetales de bajaacidez y carnes nocuradas
• Tratamiento térmicomenor– Alimentos con carga
baja de esporas– Carnes curadas– Alimentos de Aw bajo– Alimentos con factores
antimicrobiales (e.g.sal)
Alimentos enlatados de bajaacidez
• Valor D: tiempo(min) necesariopara reduciruna poblaciónpor 1 log
• Medida de laresistencia deun organismo aunatemperaturaespecífica
Tabla 3.4
Alimentos enlatados de bajaacidez
• Valor z: aumento enla temperaturanecesario parareducir el valor Dpor 1 log
• Representa laresistencia relativade un organismo ainactivación adiferentestemperaturas
Formadores de esporasimportantes para la salud pública• C. botulinum- patógeno alimentario• C. perfringes- patógeno alimentario• B. cereus- patógeno alimentario• B. licheniformis- patógeno alimentario
esporádico• B. subtilis- patógeno alimentario esporádico• B. pumilus- patógeno alimentario esporádico• C. butyricum – toxina botulismo tipo E• C. barati- toxina botulismo tipo F• B. anthracis- ántrax intestinal
Daño alimentario por otrosformadores de esporas
• Tabla 3.6
HACCP yPrevención• La seguridad en el procesamiento térmico de
los alimentos de baja acidez es mejorada conla aplicación de HACCP
• HACCP: Control estricto en todos losaspectos de la seguridad en la producción dealimentos– Materia prima– Métodos de procesamiento– Ambiente en la planta– Personal– Almacenaje– Distribución
Bacillus thuringensis
Bacillus cereus
Clostridium
Bacillus anthracis
Clostridium butyricum
Bacillus cereus
Clostrium perfringes
Clostridium botulinum