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Introducción

C lostridium difficile es una bacteria grampositiva, anaerobia estricta y formadora de esporas. La infección asociada a C. difficile (IACD) es una

de las principales infecciones asociadas a la atención de salud (IAAS) en el mundo1. El cuadro clínico de las IACD puede ir desde una diarrea leve y auto limitada hasta una colitis fulminante con pseudomembranas y megacolon tóxico2. La tasa de mortalidad de las IACD es aproximadamente de 5%; sin embargo, uno de los mayores problemas de las IACD es su elevada tasa de recurrencia, la que puede alcanzar tasas de 20% después de un primer episodio3. Clostridium difficile secreta dos principales factores de virulencia, la enterotoxina TcdA y la citotoxina TcdB4. Ambas toxinas se unen a receptores celulares promoviendo su internalización a través de endosomas, causando la alteración del citoesqueleto de actina, apoptosis, disrupción de la barrera epitelial, y una masiva respuesta inflamatoria5. Otro factor de virulencia presente en algunos aislados clínicos es la toxina binaria CDT (Clostridium difficile transferasa), la cual se une al receptor de lipoproteína6 para luego ser translocada hacia el citosol y ADP-ribosilar la actina de forma irreversible promoviendo un re-ordenamiento del citoesqueleto de actina5. Recientemente, un estudio clínico sugiere que la toxina binaria podría estar involucrada en la recurrencia de las IACD8.

Durante la última década, el número de casos

reportados de IACD ha experimentado un dramático incremento en la incidencia, con mayores tasas de mor-talidad, recurrencia y de casos graves9-11. Estos cambios epidemiológicos se deberían, en parte, a la aparición de cepas epidémicas pertenecientes al ribotipo 02712, 13. Se han descrito brotes de IACD causados por estas cepas con tasas de mortalidad y recurrencia cercanas a 15 y 30%, respectivamente9-11. Otros estudios han sugerido un aumento de la gravedad de las IACD y de la frecuencia de colectomía14. La elevada virulencia de cepas pertene-cientes al ribotipo 027 se debe en parte a que C. difficile posee un genoma muy plástico que le permite adaptarse a las presiones selectivas del entorno mediante la ad-quisición de nuevos genes, los que se transformarían en factores de virulencia y/o de adaptación al hospedero con potencial impacto en la gravedad de las IACD15. En esta línea, recientemente se ha reportado la aparición de cepas resistentes a fluoroquinolonas16, debido a una sustitución en Thr82Ile del gen gyrA. Otra mutación involucrada en la adquisición de una mayor virulencia del ribotipo 027 corresponde a una deleción en el gen que codifica un represor para la producción de toxina, tcdC17 y que determinaría un incremento en la producción de toxinas con el consecuente aumento de citotoxicidad comparado con otros ribotipos18. Finalmente, nuevos ribotipos (i.e. 078, 106, 001, 244) también han sido asociados a mayor incidencia de IACD graves19-21.

Clostridium difficile posee una serie de desventajas en su capacidad de colonizar el colon comparado con

Universidad Andrés Bello, Santiago, Chile.

Facultad de Ciencias Biológicas

Departamento de Ciencias

Biológicas.

LaboratoriodeMecanismosde

Patogénesis Bacteriana (JBC, DPS).

Pontificia Universidad Católica de Chile, Santiago, Chile.

Facultad de Medicina

Departamento de Gastroenterología

(CHR,PI,MAL).

DepartamentodeLaboratorio

Clínico (AMGD).

Recibido: 28 de abril de 2014

Aceptado: 23 de septiembre de

2014

Conflictosdeinterés:Losautores

declaran no tener conflictos de

interés

Financiamiento: Este trabajo fue

financiado por Fondo Nacional

de Ciencia y Tecnología de Chile

(FONDECYT Regular 1110569),

Fondos de la Vicerrectoría de

Investigación de la Universidad

Andrés Bello (DI-275-13/R),

Fondo de Fomento al Desarrollo

Científico y Tecnológico (FONDEF

IdeA CA13I10077) (to D.P.-S);

Fondos Nacional de Innovación en

Salud CONICYT-FONIS SA12I2197,

FONDECYT Regular 1131012 y del

Centro de Investigaciones Médicas

de la Pontificia Universidad Católica

deChile(CIM-UCPG06/13)M.A-L

y FONDECYT de Inicio 11130502

de C.H-R.

Correspondencia a: Daniel Paredes-Sabja

daniel.paredes.sabja@gmail.com.

Esporas de Clostridium difficile y su relevancia en la persistencia y transmisión de la infección

Jonathan Barra-Carrasco, Cristian Hernández-Rocha, Patricio Ibáñez, Ana M. Guzmán-Durán, ManuelÁlvarez-LobosyDanielParedes-Sabja

Clostridium difficile spores and its relevance in the persistence and transmission of the infection

C. difficile is an anaerobic spore former pathogen and the most important etiologic agent of nosocomial and community acquired antibiotics associated diarrheas. C. difficile infections (CDI) are responsible for an elevated rate of morbidity in developed and developing countries. Although the major virulence factors responsible for clinical symptoms of CDI are the two toxins TcdA and TcdB, C. difficile spores are the main vehicle of infection, persistence and transmission of CDI. Recent work has unrevealed unique properties of C. difficile spores that make them remarkable morphotypes of persistence and transmission in the host, including their resistance to antibiotics, the host immune response and disinfectants. The present review summarizes relevant aspects of C. difficile spore biology that have major implications from a clinical and medical perspective.

Key words: Clostridium difficile; spores; nosocomial diarrhea.Palabras clave: Clostridium difficile, esporas, diarreas nosocomiales.

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otros microorganismos como Bacteroides spp, otros Clostridium, Fusobacterium spp y Bifidiobacterium spp22. Por este motivo, normalmente no se encuentra formando parte de la microbiota colónica. Los tratamientos con antimicrobianos, sin embargo, provocan una alteración en esta microbiota, generando las condiciones para que esporas de C. difficile ingeridas inadvertidamente, germi-nen y se desarrollen hasta la forma vegetativa adulta de C. difficile y colonizen el colon23. Se desconoce cuál es la tasa infectante mínima de esporas requerida para producir una IACD. Clostridium difficile tiene la capacidad de generar esporas que son el vehículo de persistencia en el ambiente y en el colon24 donde son capaces de sobrevivir a los ataques del sistema inmune innato del hospedero25. Durante su ciclo infectante, C. difficile inicia un proceso de esporulación produciendo una elevada cantidad de esporas que son diseminadas al ambiente a través de las deposiciones26. La alteración de la microbiota favorece la germinación de esporas; posiblemente esté mediada por el incremento en los niveles de colatos y derivados27. Las esporas son eliminadas por las deposiciones al me-dio ambiente, donde pueden sobrevivir largo tiempo y probablemente representan la principal forma infectante de C. difficile, por lo que el manejo ambiental adecuado en los diferentes centros de atención de salud es crítico para evitar brotes28. Las esporas de C. difficile que no fueron eliminadas en las deposiciones pueden persistir en el tracto colónico del paciente, lo que pudiese favorecer los episodios de recurrencia de IACD. Los eventos de recurrencia de IACD se pueden clasificar como: recaída, si es causada por la misma cepa responsable del primer episodio, lo que representan ~75% de las recurrencias; re-infección, si es causada por una cepa diferente a la del episodio inicial, con una frecuencia de ~25% de todos las recurrencias3. En ambos casos, la recurrencia de IACD se vería favorecida por una modificación extrema de la microbiota colónica y la consecuente alteración de los mecanismos de defensa intrínsecos de esta microbiota contra de las infecciones por bacterias patógenas29,30.

A pesar de la enorme relevancia que implica el morfo-tipo de la espora en las IACD, los trabajos que consideran el estudio de las esporas de C. difficile dan cuenta sólo de 5,1% de todos los artículos científicos relacionados con C. difficile en PubMed (hasta el 20 de agosto de 2014). Por consiguiente, el objetivo de esta revisión es resumir el papel de las esporas de C. difficile en la persistencia y transmisión de las IACD, así como el conocimiento acerca de aspectos fundamentales sobre la formación, germinación y resistencia de sus esporas.

Formación de la espora de C. difficile durante la IACD

A diferencia de otras enfermedades entéricas causadas por enteropatógenos no formadores de esporas, C. diffi-

cile, emplea una estrategia única y altamente sofisticada para persistir en el ambiente colónico del hospedero –la esporulación– la que se inicia cuando las condiciones ambientales son desfavorables para su sobrevivencia31 y culmina con la formación de una espora durmiente y altamente resistente a múltiples factores de estrés. El inicio del ciclo de esporulación comienza cuando quina-sas histidinas huérfanas detectan estímulos ambientales y comienzan a fosforilar al regulador maestro de la esporulación, Spo0A31,32. El genoma secuenciado de C. difficile codifica cinco quinasas histidinas huérfanas (CD1352, CD1492, CD1579, CD1949 y CD2492)33. Estudios genéticos han demostrado que la inactivación de CD2492 reduce 3,5 veces la eficiencia de esporulación33. Al igual que en Bacillus subtilis, el circuito regulatorio del proceso de esporulación resulta en una cascada de activación de los factores sigma de la ARN polimerasa (i.e., σF, σE, σG y σK)34 específicos de la esporulación. Si bien los cuatro factores sigma están presentes en los genomas que hasta la fecha han sido secuenciados de C. difficile, y los cambios morfológicos durante el desarrollo de la espora son similares a los de B. subtilis, la regulación temporal difiere significativamente de este segundo35. Estudios transcriptómicos han demostrado que C. difficile comienza a esporular cuatro hs después de iniciada la infección en un modelo murino de IACD, observándose esporas maduras 14 h después de este inicio36. Recientemente, Deakinet y cols.37, demostraron que cepas de C. difficile que no forman esporas, producto de una mutación en el regulador maestro de esporulación, spo0A, son incapaces de persistir y diseminarse en un modelo murino de IACD.

A pesar de que no existe evidencia directa de esporu-lación y persistencia de esporas de C. difficile en el tracto colónico de humanos, es posible que estos procesos sean similares a los reportados en modelos murinos36,37. Estos datos concuerdan con estudios clínicos donde 50% de los pacientes que se recuperan de un episodio de IACD se convierten en diseminadores asintomáticos de sus esporas por un período de 1-4 semanas después de la antibioterapia26,38. Un estudio reciente ha demostrado que las esporas de C. difficile son capaces de adherirse con una elevada eficiencia a células epiteliales in vitro, llegando a niveles de 60% de adherencia después de tres horas de infección24. Si bien la(s) proteína(s) de la espora y el(los) receptor(es) celular(es) que median la adherencia de esporas no han sido identificados, evidencia preliminar sugiere que es receptor-dependiente39. Debido a la impor-tancia del proceso de esporulación para la persistencia de C. difficile en el hospedero, es esencial poder contar con estudios que permitan identificar las moléculas o señales que gatillan el proceso de esporulación con el fin de poder desarrollar análogos químicos que inhiban la esporulación in vivo y/o su persistencia en el hospedero.

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Esta inhibición de la esporulación ha sido ampliamente estudiada en levaduras y se han identificado fármacos catiónicos anfotéricos capaces de frenar este proceso40. La única molécula conocida a la fecha que inhibe la esporulación de C. difficile es el antibacteriano inhibidor de la ARN polimerasa, fidaxomicina, el que, a pesar que tiene el potencial de fracasar por resistencia durante el tratamiento y, por esta razón, se recomienda su uso sólo en casos específicos, ha demostrado disminuir la tasa de recurrencia comparado con otros antimicrobianos41. El mecanismo preciso de cómo afecta la esporulación no está del todo claro42. En suma, la inhibición del proceso de esporulación podría constituir un nuevo blanco tera-péutico para combatir las IACD. Para mayores detalles del proceso de formación de esporas de C. difficile, se recomienda consultar la referencia 43.

Esporas de C. difficile como vector de transmisión

Las esporas de C. difficile son metabólicamente durmientes y pueden sobrevivir por largos períodos (i.e.,

años) en el ambiente, convirtiéndolas en un eficiente morfotipo de transmisión. Recientemente se demostró que la contaminación del ambiente hospitalario con esporas de C. difficile contribuye con ~38% de los casos de IACD (Figura 1) en pacientes hospitalizados bajo terapia con antimicrobianos44. Los focos que contribuyen a la dise-minación de las esporas en el ambiente hospitalario son diversos. Estudios han demostrado que el personal médico puede actuar como vector de transmisión de esporas de C. difficile26,45,46. Recientemente, Landelle y cols.47, observa-ron que cerca de 25% del personal a cargo del cuidado de pacientes con IACD tenía sus manos contaminadas con esporas de C. difficile debido al no uso de guantes. Los pacientes con IACD son considerados diseminadores de esporas de C. difficile, a través de sus deposiciones, piel y ropa26,45,46. Debido a esto, es vital un diagnóstico tem-prano de los casos de IACD, lo que permite identificarlos oportunamente y aislarlos. Un adecuado aislamiento de cada caso, de preferencia en habitaciones individuales y el uso de guantes y delantales desechables por parte del personal de salud, permitirían evitar la diseminación de la

Figura 1. Esquematización del ciclo infectante de las IACD y de los mecanismos de infección, patogénesis, persistencia y diseminación de la IACD. El ciclo infectante de las IACDcomienzaconlaingestióndeesporasporpartedelpaciente.Lasesporassoncapacesderesistirelambientegástricoácidoyeltránsitointestinalhaciaelcolon.Unavez en el colon, las esporas de C. difficile en presencia de factores favorables (i.e alteración de la microflora por tratamiento antimicrobiano, aumento de taurocolato y/o glicina), germinan y comienzan su ciclo vegetativo de crecimiento, produciendo toxinas las cuales provocan una fuerte respuesta inflamatoria por parte del hospedero y la disrupción de la mucosa colónica (i.e alteración del citoesqueleto de actina y apoptosis) provocando los síntomas de la IACD. Al mismo tiempo estas formas vegetativas de C. difficile comienzan un ciclo de esporulación generando esporas que ya sea se mantienen en al ambiento colónico (i.e., provocando cuadros de recurrencia) o son diseminadas al ambiente donde permanecen dormantes hasta infectar otro paciente donde comienza un nuevo ciclo infectante (Adaptada de 23,28,39).

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infección28. Cabe mencionar que si bien, el uso de guantes protege del contacto directo con esporas de C. difficile, éstos deben ser autoclavados antes de su eliminación48. Por otra parte, si las salas de pacientes con IACD no son adecuadamente desinfectadas, se convierten en reservo-rios de C. difficile49. Interesantemente, la diseminación aérea de esporas de C. difficile podría ocurrir durante el aseo de las camas de los pacientes infectados contami-nando paredes y ductos de ventilación50-54, alcanzando recuentos de 53-476 ufc/m3 55. A pesar de la información disponible, se requieren más estudios para evaluar cómo contribuye de forma cuantitativa cada uno de los factores ambientales a la transmisión de las IACD. En resumen, las esporas de C. difficile pueden persistir fácilmente en el ambiente hospitalario, por lo que su erradicación del ambiente hospitalario podría ayudar a reducir las tasas de infección intrahospitalarias.

Factores de resistencia en la espora de C. difficile

Las esporas bacterianas poseen factores bastante con-servados involucrados en la resistencia hacia las noxas ambientales56. El núcleo de las esporas posee un bajo contenido de agua (25 a 50% en peso húmedo), niveles elevados de ácido dipicolínico (DPA, 25% del peso seco del núcleo) quelado con calcio (Ca-DPA) en una razón 1:1 y un ADN saturado con proteínas α/β-SASP (proteínas ácidas pequeñas y solubles), que contribuyen a las propiedades de resistencia de las esporas. El núcleo está rodeado de una membrana significativamente com-primida, en la cual los fosfolípidos están inmóviles57, contribuyendo a una baja permeabilidad, incluso hacia el agua58. La membrana interna está rodeada por una pared de peptidoglicano, llamada pared germinal, que se transforma en la pared celular de células en crecimiento una vez terminada la germinación; esta capa no juega rol alguno en la resistencia de esporas. Sobre la pared germinal se encuentra una corteza de peptidoglicano con tres modificaciones estructurales importantes: solamente un cuarto de los residuos de ácido N-acetilmurámico (NAM) están sustituidos con péptidos cortos, otorgándole a la corteza un menor grado de entrecruzamiento y por consiguiente, mayor flexibilidad que la pared germinal; un cuarto de los residuos NAM lleva un residuo simple de L-alanina, una modificación no encontrada en la pared germinal. Aproximadamente cada segundo residuo de ácido murámico en la corteza de peptidoglicano ha sido convertido a murámico-δ-lactamo (MAL), una modifi-cación que no se encuentra en la pared germinal59,60. El residuo MAL actuaría como elemento de reconocimiento para las enzimas hidrolíticas de la corteza61. Rodeando la corteza está la membrana externa, que si bien juega un rol esencial durante el ensamblaje de la espora, no juega un rol en las propiedades de resistencia de las esporas. Por

sobre la membrana externa hay una cubierta proteácea, formada por más de 70 proteínas en B. subtilis, que otorga resistencia hacia enzimas hidrolíticas de peptidoglicano y proteasas cuyos pesos moleculares sean mayores a 14 kDa62-65. Algunas especies como C. difficile, poseen una capa más externa llamada exosporium, que presenta proyecciones de filamentos que podrían jugar roles esenciales en la interacción espora-hospedero39,43,66 y/o en la resistencia de las esporas. Los primeros estudios en factores de resistencia de esporas de C. difficile han identificado dos factores con un rol en la resistencia; estos son: CdeC, el que está involucrado en la resistencia de la espora a etanol, calor y lisozima65 y CotA, involucrada en la pérdida de la resistencia al calor en un sub-grupo de la población total67. Ambos factores alteran el proceso de ensamblaje de las capas externas de las esporas de C. difficile. Sin embargo, no existen estudios moleculares que hayan caracterizado el rol de factores clásicos de resistencia de esporas bacterianas en C. difficile, como aquellos relacionados con deshidratación del núcleo de la espora (las proteínas SpmAB, DacB y SpoVA)68,69 y protección del ADN como las proteínas α/β-SASP y Ca-DPA56. En este contexto, son necesarios estudios en mecanismos de resistencia de esporas de C. difficile para desarrollar nuevas y eficientes estrategias que permitan eliminar las esporas tanto del hospedero como del am-biente hospitalario.

Factores de persistencia de las esporas de C. difficile en el hospedero

Durante el curso clínico de la IACD se ha observado un importante aumento de la cantidad de esporas excre-tadas por las deposiciones2,70,71, indicando que C. difficile esporula dentro del tracto intestinal, contribuyendo a la persistencia dentro del hospedero (Figura 2). La resis-tencia de las esporas de C. difficile a los antimicrobianos es tal, que éstas pueden persistir después de un curso terapéutico de metronidazol y vancomicina72. Se ha pos-tulado que la presencia de diverticulosis en el colon podría actuar como un potencial reservorio de esporas de C. diffiicle, contribuyendo a la persistencia de las IACD; sin embargo, estudios recientes no avalan esta hipótesis73. Se ha estudiado los mecanismos de adherencia de células vegetativas de C. difficile74,75; no obstante, pocos estudios han evaluado la capacidad de las esporas de adherirse al epitelio intestinal. Recientemente Paredes- Sabja y cols.24, demostraron que las esporas de C. difficile se adhieren a células epiteliales intestinales Caco-2 in vitro alcanzando niveles de adherencia de 60 a 70% del total de esporas, sugiriendo que la adherencia de esporas de C. difficile a la mucosa intestinal podría ser un posible mecanismo de persistencia en el hospedero. Otro estudio efectuado por nuestro grupo25 ha demostrado que las esporas de C. difficile, a pesar de ser eficientemente reconocidas e

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internalizadas por células fagocíticas, permanecen latentes y sobreviven a los ataques de la maquinaria antibacteriana de los macrófagos, causando efectos citotóxicos en éstos. Ambos estudios sugieren que las esporas de C. difficile son capaces de adherirse a la mucosa intestinal y sobrevivir el ataque de células fagocíticas.

En cuanto a factores del hospedero, estudios de pacien-tes con IACD y en modelos animales, han demostrado que una microbiota colónica normal puede disminuir la producción y diseminación de esporas y, por consiguiente, de la persistencia de una IACD a través de mecanismos aún no identificados76.

Desinfectantes y resistencia de las esporas de C. difficile en el ambiente

El principal problema para erradicar las esporas de C. difficile del ambiente hospitalario es que, al igual que las

esporas de otras especies bacterianas, éstas son resistentes a la mayoría de los desinfectantes utilizados en el ambien-te hospitalario77. Algunos estudios han caracterizado la sobrevivencia de esporas de C. difficile a varios desinfec-tantes usados de rutina en la desinfección hospitalaria77-79. Por ejemplo, desinfectantes a base de etanol, no afectan la viabilidad de las esporas de C. difficile78. Compuestos de amonio cuaternario tampoco poseen actividad espori-cida77. Entre los desinfectantes alternativos con actividad esporicida se encuentran el hipoclorito de sodio, que a concentraciones de 5.000 ppm reduce en siete ciclos logarítmicos la viabilidad de las esporas de C. difficile después de seis minutos de incubación a temperatura am-biente78. Los nitritos acidificados y el glutaraldehído han demostrado una reducción intermedia en la viabilidad de las esporas, con reducciones de 4 a 7 ciclos logarítmicos después de 15 y 30 min de exposición80. Sin embargo, por ser sus efectos nocivos, estos desinfectantes no son recomendados81. Alternativamente, iones paracetilos y peróxido de hidrogeno vaporizado son una opción como agentes de desinfección, reduciendo la presencia de C. difficile entre 0,3 y 0,6 ciclos logarítmicos después de un minuto82,83. En resumen, el acotado repertorio de desinfectantes disponibles para eliminar esporas de C. difficile del ambiente hospitalario resalta la necesidad de desarrollar nuevos compuestos que eliminen de manera efectiva las esporas de C. difficile.

Resistencia de esporas de C. difficile a antimicrobianos

Las esporas de C. difficile son resistentes a todos los an-timicrobianos conocidos, principalmente debido a que son metabólicamente inactivos y a que la membrana interna es impermeable a la difusión de moléculas pequeñas, lo que impide el ingreso de antimicrobianos hacia el núcleo de la espora84-87. Los principales antibacterianos utilizados en el tratamiento de las IACD son metronidazol, vancomicina y recientemente fidaxomicina88. Estudios in vitro han demostrado que, tanto metronidazol como vancomicina, no inhiben la formación de esporas de C. difficile84,85, lo que es consistente con las elevadas tasas de recurrencia de IACD observadas en estudios clínicos89. En contraste, fidaxomicina, a concentraciones sub-inhibitorias, inhibe la formación de esporas de C. difficile in vitro42, y los estudios clínicos han demostrado que reduce a la mitad los episodios de recurrencia de IACD, comparado con vancomicina41,90, debido posiblemente a la inhibición de la formación de esporas durante el tratamiento. Ninguno de estos tres antibacterianos afecta la viabilidad de las esporas latentes de C. difficile. Solamente vancomicina y fidaxomicina logran disminuir la eficiencia con la cual las esporas de C. difficile forman colonias (i.e., eficiencia de germinación)91.

Figura 2. Esquematización de la estructura de una espora bacteriana. Lacapamásexternaenalgunasespecieseselexosporiumyestácompuestapor~20proteínas.Lacapainferior,llamadacubierta,estácompuesta por ~70 proteínas en Bacillus subtilis y entrega protección contra agentes oxidantes y enzímas. Debajo de la cubierta está la membrana externa, la cual si bien es esencial durante la formación de la espora, con el tiempo se degrada y no juega rol alguno en la resistencia de esporas. Debajo de la membrana externa se encuentra la corteza de peptidoglicano, formado por un peptidoglicano espe-cífico para esporas con una estructura diferente al que se encuentra enlaparedcelulardecélulasbacterianas.Lacortezajuegaunrolfundamental en mantener el núcleo deshidratado actuando como una camisa de fuerza que mantiene al núcleo comprimido. Una vez degradada la corteza, esta presión se pierde con la consecuente hidratación del núcleo. Debajo de la corteza se encuentra la pared celular y está compuesta por peptidoglicano que pasará a formar parte de la pared celular de la célula naciente. Por debajo de la pared celular está la membrana interna. Debido a la fuerte presión osmótica del núcleo y la resistencia de la corteza, los fosfolípidos de de la membrana interna son inmóbiles y es impermeable a la difusión de solutos pequeños incluyendo agua. En el núcleo se encuentra el material genético y la maquinaria necesaria para re-iniciar el meta-bolismo. El núcleo se encuentra deshidratado y saturado de ácido dipicolínico quelado con calcio, el cual actúa como un protector hacia químicos y calor58. Modificado de (Paredes-Sabja, Setlow et al., 2011) con permiso de Elsevier.

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Reactivación de las esporas de C. difficile: germinantes y germinación

Las esporas bacterianas son capaces de retornar a su forma vegetativa en tan sólo cinco minutos después de entrar en contacto con los nutrientes, denominados germinantes. Estos germinantes son especie-específicos y captados por receptores de germinación pertenecientes a la familia GerA localizados en la membrana interna de la espora58. A diferencia de otras especies de los géneros Bacillus y Clostridium, C. difficile no posee los receptores canónicos de germinación de la familia GerA58; por el contrario, los germinantes (i.e., tauroco-lato y L-glicina) son detectados por la proteasa serina, CspC, cuya localización se presume entre la interface de la cubierta y la corteza de peptidoglicano92 (Figura 1). El mecanismo mediante el cual CspC activaría a CspB y la subsecuente activación de la hidrolasa SleC, la que va a degradar la corteza de peptidoglicano de la espora, es desconocido93. La degradación de la corteza de la espora permite un cambio en la fluidez de la membrana interna que activaría los transportadores de Ca-DPA, expulsando Ca-DPA desde el núcleo con la consecuente rehidratación y reiniciación del metabolismo. A medida que se incrementa la hidratación del núcleo, las α/β-SASP pierden la habilidad de asociarse al ADN69 y se activa la proteasa de germinación, GPR94, encargada de la degradación de las proteínas α/β-SASP. En esta etapa de la germinación, las esporas pierden todas sus propiedades de resistencia y son extremadamente susceptibles a ser inactivadas por desinfectantes95 o el sistema inmune innato25. La capa más externa de la espora, el exosporium, pareciera jugar un rol en la mantención de la latencia de las esporas actuando como un represor de la germinación, inhibiendo la reactivación de las esporas de C. difficile96. La eficiencia de germinación (i.e., el número de unidades formadoras de colonia por partículas de esporas) de las esporas de aislados clínicos de C. difficile varía entre 0,1 y 25% del total de las esporas96,97, muy por debajo del 70 a 90% de eficiencia de germinación observados en esporas de otras especies como B. subtilis y Clostridium perfringens98. Estudios nuestros recientes, indican que esta capa de exosporium se pierde después de cuatro meses de almacenamiento a temperatura ambiente, incre-mentando la eficiencia de germinación de las esporas en hasta 100 veces108. En resumen, a diferencia de la elevada eficiencia de germinación de esporas (i.e., 70 a 90% del total de esporas) observadas en otras especies98, la baja eficiencia de este proceso en C. difficile podría permitir su persistencia por períodos prolongados de tiempo en el tracto colónico del hospedero. Sin embargo, la pérdida de los factores de resistencia durante la germinación, sugiere que el desarrollo de terapias que involucren la modulación de la germinación, podrían contribuir a reducir al persistencia de C. difficile en el hospedero.

Esporulación y producción de toxinasLa regulación de la síntesis de toxina es un determi-

nante crítico en la patogenicidad de C. difficile. Muchos factores ambientales influencian la producción de toxina, como por ejemplo, la disponibilidad de nutrientes, el potencial redox y la temperatura del entorno. Al respecto, se han encontrado tres reguladores involucrados en la pro-ducción de toxina por parte de C. difficile: Ccpa, mediando la represión dependiente de glucosa; CodY y Spo0A; estos dos últimos controlando eventos previos y posteriores a la fase exponencial de crecimiento104. En C. perfringens, σK es producido en células en la fase pre-divisional y se encuentra involucrado en la producción de enterotoxina105. En cuanto a C. difficile, un estudio mostró que en relación a los roles de los distintos factores sigma involucrados en esporulación, C. difficile parece ser cercano al organismo modelo, B. subtilis, más que a otras especies del género Clostridium106.

Dos estudios independientes reportaron que mientras la mutación de Spo0A reduce la producción de TcdA, la mutación de SigH (factor sigma que regula positivamente algunos genes requeridos para la esporulación) estimularía la producción de TcdA104,107. Sin embargo, el efecto de estas dos proteínas en la expresión de toxinas por parte de C. difficile es indirecta y sus mecanismos todavía no han sido dilucidados.

Nuevas estrategias para eliminar las esporas de C. difficile

Recientes estudios han desarrollado novedosas estra-tegias de desinfección que involucran dos etapas. Una primera fase de “activación y germinación” de las esporas de C. difficile, seguida de una segunda etapa de “inacti-vación” donde las esporas ya germinadas son inactivadas por desinfectantes comúnmente utilizados en las rutinas de aseo de hospitales95,99. Interesantemente, estos estudios determinaron que luego de cinco minutos de la exposición a agentes germinantes, la espora germina y que la expo-sición de 104-105 esporas a agentes germinantes antes de la desinfección disminuye el tiempo en que se inactivan desde 45 a sólo 10 minutos95,99. Estas estrategias también podrían ser utilizada para incrementar la susceptibilidad de las esporas de C. difficile al sistema inmune innato del hospedero. De hecho, 90% de las esporas germinadas son inactivadas por macrófagos, cifra que sólo llega a 10% en el caso de esporas dormantes25. Sin embargo, se requiere un acabado conocimiento de la cinética de reactivación de las esporas de C. difficile y factores que afectan la dor-mancia de la espora. Por ejemplo, aunque el taurocolato y el co-germinante L-glicina son suficientes para iniciar la germinación100, la eficiencia de germinación de las esporas de C. difficile incrementa cuando éstas entran en contacto con células epiteliales97. También existe una elevada va-riabilidad en la especificidad de la germinación de esporas

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de C. difficile que debe ser considerada al momento de desarrollar estrategias de inhibición de germinación o de inactivación de dos pasos. Por ejemplo, utilizando esporas de aislados clínicos, se demostró que el inhibidor quenodeoxicolato sólo inhibe la germinación de 6 de 15 (40%) aislados clínicos de C. difficile101, sugiriendo que podrían haber diferencias en la especificidad del receptor CspC entre aislados clínicos. Como se mencionó con anterioridad, la eficiencia de germinación de las esporas de C. difficile también podría ser una variable importante en el desarrollo de estas terapias65,96, puesto que la frac-ción de esporas que no germina, permanece durmiente persistiendo por largos períodos de tiempo con el riesgo de causar IACD recurrentes. Son necesarios estudios para incorporar eficientemente la reactivación de las esporas de C. difficile con taurocolato y L-glicina en protocolos de desinfección que permitan erradicar las esporas del ambiente hospitalario.

Otra estrategia de modulación de la germinación de las esporas es aquella que busca la inhibición de la germina-ción mediante el uso de inhibidores del proceso. Recien-temente, Howerton y cols., utilizaron un análogo químico del taurocolato (CamSA) para inhibir la germinación de esporas de C. difficile y lograron atenuar la virulencia de C. difficile en un modelo murino102. Estos hallazgos resal-tan el potencial uso de inhibidores de la germinación de esporas como una estrategia profiláctica en contra de las IACD. Además, se ha visto que el uso de unidades móviles automáticas de luz UV, reduce significativamente la carga de esporas de C. difficile en superficies contaminadas de habitaciones de pacientes con IACD103. Claramente, son necesarios mayores esfuerzos para determinar los factores que permiten activar o bloquear la germinación de las esporas de C. difficile, tanto en superficies inertes o in vivo, con el fin de desarrollar estrategias más eficientes que pudieran eliminar completamente las esporas de C. difficile del ambiente hospitalario y del hospedero.

Conclusiones

Durante el curso de las IACD, C. difficile inicia un rápido y eficiente ciclo de esporulación contribuyendo a su persistencia en el hospedero y a su transmisión. Las esporas de C. difficile poseen similitudes ultraestructurales y propiedades de resistencia similares a las de esporas de otras especies bacterianas, permitiendo su supervivencia por períodos largos de tiempo en el hospedero y ambiente. A diferencia de otras especies, C. difficile posee un meca-

nismo único para gatillar la germinación de sus esporas, consistente en la utilización de sales biliares (taurocolato) y el co-germinante L-glicina. Esta elevada especificidad de germinación permite que las esporas de C. difficile sólo germinen en el tracto colónico del hospedero y permanezcan durmientes por largos períodos de tiempo en el ambiente.

Las rutinas de desinfección basadas en desinfectantes libres de cloro no logran inactivar las esporas, por lo que futuras maneras para eliminar esporas del ambiente hospitalario podrían incluir estrategias que contemplan un primer paso de germinación seguido por un paso de inactivación. Igualmente, la modulación in vivo de la germinación de las esporas de C. difficile podría inhibir el retorno de las esporas al crecimiento activo o desen-cadenar su germinación para ser luego inactivadas por algún tratamiento anti-C. difficile como metronidazol y/o vancomicina o por el sistema inmune del paciente, evitando la recurrencia de la IACD.

Resumen

Clostridium difficile es un patógeno anaerobio, forma-dor de esporas y el agente etiológico más importante de las diarreas asociadas a antimicrobianos, tanto nosocomiales como adquiridas en la comunidad. Las infecciones asocia-das a C. difficile poseen una elevada tasa de morbilidad en países desarrollados y en vías de desarrollo. Los dos factores de virulencia principales son TcdA y TcdB, toxinas que causan la remodelación del citoesqueleto lo cual desencadena los síntomas clínicos asociados a esta enfermedad infecciosa. A pesar que las esporas de C. difficile son el principal vehículo de infección, persistencia en el hospedero y de transmisión, pocos estudios se han enfocado sobre este clave aspecto. Es altamente probable que la espora juegue roles esenciales en los episodios de recurrencia y de transmisión horizontal de la infección por este microorganismo. Estudios recientes han reve-lado características únicas de las esporas de C. difficile que las hacen capaces de ser altamente transmisibles y persistir dentro del hospedero. Más aún, algunas de estas propiedades están relacionadas con la resistencia de sus esporas a los desinfectantes más comúnmente usados en los recintos hospitalarios. La presente revisión resume los conocimientos más relevantes en la biología de las esporas de C. difficile, con un énfasis en aquellos aspectos con implicancias clínicas, incluido el control de infecciones en el ambiente hospitalario.

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