Cooperazione tra determinanti

citoplasmatici e reazioni

induttive per specificare il

destino dell’embrione

….allo stadio a 32 blastomeri ogni singola

cellula uccisa porta alla mancanza della

discendenza

C. elegans

1974: Sydney Brenner first introduced

Caenorhabditis elegans in the scientific community

as a model organism.

The nematode has been extensively used as a

model system to study cellular biology. One of the

most intriguing fields of molecular biology that

have been investigated using this model host and

that led to the 2002 Nobel Prize in Physiology or

Medicine, is programmed cell death.

Caenorhabditis elegans

Kuranaga, 2011: evolutionarily conserved

method employed by multicellular

organisms to maintain tissue homeostasis

during development and differentiation;

Bailly and Gartner, 2013: it can also serve

as a way to prevent growth of cells mutated

due to DNA damage.

Apoptosis

Vogt, 1842: la morte cellulare è parte del normale sviluppo.

Lockshin and Williams, 1965: propongono il termine

morte cellulare programmata (Programmed Cell Death)

osservando che alcune cellule destinate a morire durante

la metamorfosi di anfibi e insetti sembrano essere guidate

da un programma intrinseco alla cellula stessa.

Kerr, Wyllie and Currie, 1972: introducono il termine

apoptosi (dal greco antico: come il cadere delle foglie) per

descrivere la morte cellulare associata con una serie di

caratteristiche morfologiche comuni e ben definite.

Horvitz and Sulston, fine degli anni 70: caratterizzazione

genetica dei componenti critici che regolano i meccanismi

apoptotici utilizzando il nematode C. elegans.

Apoptosi

Apoptosis in C. elegansAbout half of all neurons born will die through a pre-programmed “suicide” mechanism called apoptosis

Motor neuron expressing different colored fluorescent proteins in a C. elegans larva.Image courtesy of David Miller, Ph.D., Vanderbilt Department of Cell & Developmental Biology

Apoptosis in C. elegans

Seven Apoptotic cells (arrows) which appear as “raised button” objects in a C. elegans embryo are shown.Some apoptotic cells are not visible at this focus plane.

Confocal fluorescent image of a wild-type C. elegans embryo (anterior to the left) apoptotic cells with condensed DNA

La caratteristica …..…unica di questo organismo è rappresentata da un

numero costante di cellule: 959

1090 cells

Ced 9 agisce come freno

Ricerca di mutazioni in cui il pattern di morte cellulare è alterato: identificazione di regolatori apoptotici poi ritrovati anche in mammiferi

La clonazione dei geni apoptotici di

C. elegans e la loro caratterizzazione

hanno permesso di comprendere gli

eventi molecolari dell’apoptosi e di

identificare gli effettori omologhi dei

mammiferi

ced 4 Apaf 1

ced 9 Bcl-2

Ced-3 e ced-4: mutazioni che li inattivano portano alla conservazione di tutte e 131 le cellule “condannate a morte”

Ced-9: mutazioni che inattivano ced-9 portano a morte cellulare estesa a tutte le cellule, livelli aumentati di espressione di ced-9 bloccano l’apoptosi.

C. elegansapoptotic genes

Nei doppi mutanti ced-9/ced-3 la morte cellulare non si verifica: CED-9 agisce a monte di CED-3 inibendo la via apoptotica.

Studi genetici in C. elegans

Larva appena schiusa con mutazione del gene ced-1 che impedisce la fagocitosi delle cellule morte.

Studi genetici in C. elegans

Larva appena schiusa con mutazione del gene ced-1 e ced-3. L’assenza di cellule morte dimostra che l’apoptosi non avviene. La proteina CED-3 è necessaria per l’apoptosi.

Evolutionary conservation of apoptotic patrhways

EGL-1 funziona da attivatore a monte del processo di morte cellulare programmata regolandola positivamente: interagisce direttamente con CED-9 per indurre il rilascio CED-4

Il gene bcl-2 è stato isolato in tumori umani

Il primo gene per l’apoptosi clonato nei

mammiferi è stato il gene bcl-2

Promuove la sopravvivenza delle cellule

Le proteine Bcl-2 e CED-9 sono

omologhe e fungono da proteine

regolatrici che inibiscono la via

apoptotica

La famiglia Bcl-2:

regolazione della sopravvivenza e

dell’apoptosi

Adams, J. & Cory, S. (1998). Science 281: 1322-1326.

Queste proteine possono essere localizzate sulla membrana nucleare, su quella mitocondriale esterna e su quelle del reticolo endoplasmatico

Bcl-2 family

Geni anti apoptotici

Geni proapoptotici

Bcl-2

Bcl-XL

Bax

Bad

La sensibilità della cellula agli stimoli apoptotici dipende

dall’equilibrio dei due gruppi

Perché una cellula dovrebbe

suicidarsi?

A volte la morte cellulare rappresenta un

evento positivo per l’organismo

1. L’apoptosi é richiesta per un normale

sviluppo embrionale

2. L’apoptosi é necessaria per la distruzione di

cellule che rappresentano una minaccia per l’integrità dell’organismo

Vari processi dello sviluppo

coinvolgono l’apoptosi

A. Eliminazione di organi transitori e di tessuti

Pronefro e mesonefro nei vertebrati superiori

Chiusura del tubo neurale, loop cardiaco

Coda e branchie degli anuri

Organi larvali negli insetti olometaboli

B. Rimodellamento tissutale

Sviluppo degli arti

C. Omeostasi cellulare

turnover fisiologico delle cellule “mature” in tessuti

continuamente proliferanti

Sindattilia

1/2500 nascite

L’apoptosi è il risultato di un

equilibrio

Aumento Apoptosi

AIDS

Malattie neurodegenerative

Malattia di Alzeheimer,

Morbo di Parkinson,

Malattia di Huntington

Inhibizione Apoptosi

Cancro

linfoma Follicolare

carcinomi con mutazione di p53

Malattie Autoimmuni

Lupus erytematoso sistemico

Infezioni Virali

Herpesvirus, poxvirus, adenovirus

Il processo apoptotico

NECROSI

APOPTOSI

For every cell, there is a time to live and a time to die.

Apoptosi vs necrosi

Richiede alcune ore

Irreversibilità

Fisiologico

Riduzione dei contatti

Processo controllato

Evento acuto che si

completa in pochi minuti

Può regredire e la cellula

recuperare funzionalità

Trauma

Lisi cellulare

Rilascio di citoplasma

Risposta infiammatoria

Fasi dell’apoptosi

Death signals

condensation

fragmentation

engulfment

Induzione

Esecuzione

Riconoscimento e Fagocitosi

Degradazione

Eventi molecolari, biochimici e morfologici

FASI DELL’APOPTOSI- 1

FASE DI INDUZIONE

I diversi stimoli ed eventi apoptogeni seguono due

(o forse più) distinte pathways: una attivata dai

"segnali di morte" che giungono ai recettori di

superficie, l'altra attivata da segnali endogeni e

regolata dal mitocondrio.

Si ritiene che tali pathways siano regolabili e

reversibili fino al momento in cui convergono

nell'attivazione delle caspasi.

Fattori che scatenano

l‘apoptosi

Stimoli apoptoticiestrinseci

1. Legame (di ligandi che

inducono morte) ai recettori

di superficie

2. Recettori che si legano ai

linfociti T citotossici (4)

intrinseciseguono ad uno stress cellulare

coinvolgimento dei mitocondri

1. Esposizione a radiazioni

2. Esposizione a sostanze chimiche

3. Esposizione ad agenti virali

4. Mancanza del fattore di crescita

5. Stress ossidativo

Death receptors

Recettori specifici sulla superficie cellulare trasmettono il

segnale apoptotico, grazie a specifici ligandi

Questi recettori appartengono alla superfamiglia

dei TNF, svolgono anche altre funzioni

Recettori della morte meglio caratterizzati: CD95 (or

Fas), TNFR1 (TNF receptor-1) e i recettori DR4 and

DR5 TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand).

Tumour Necrosis Factor Receptor-1 (TNFR1)

Il legame porta ad una

trimerizzazione del recettore

che lega TRADD e FADD

(molecole adattatrici) e la pro-

caspasi 8

Attivazione dell’apoptosi attraverso CD95/Fas

Il ligando per CD95 è un trimero, legato al recettore promuove l’associazione del DD (Death Domain) con altre molecole

FADD= Fas associate death domain

Il complesso CD95/FADD lega

la pro-caspasi 8

Caspasi 8

Caspasi 9

La via di segnalazione mitocondriale

Ruolo dei mitocondri

Proteine antiapoptotiche della

famiglia di Bcl2 si trovano sulla

membrana esterna e promuovono la

sopravvivenza della cellula

I mitocondri possono favorire

l’apoptosi attraverso il rilascio di

citocromo C

Citocromo c + Apaf- 1+ ATP + pro-caspasi 9

Caspasi 9 Cascata delle caspasiBax e bad= pore forming protein

FASI DELL’APOPTOSI- 2

FASE DI ESECUZIONE

L'attivazione delle caspasi è determinata da un evento

proteolitico e determina a sua volta un'ulteriore cascata di

eventi proteolitici e nucleolitici preordinati, che amplificano

il segnale e portano alle tipiche modificazioni morfologiche

dell'apoptosi.

La finalità è quella di predisporre la cellula ad essere

facilmente fagocitata

Attivazione delle caspasi

(cysteinyl aspartate-specific proteinases )

Proteine che tagliano specifici substrati: proteine

strutturali del citoscheletro e proteine nucleari

(enzimi che riparano il DNA)

Nell’uomo sono state identificate più di 10

proteine

Cistein proteasi

-Nella cellula si trovano nella forma inattiva

(zimogeno).

-Passano nella forma attiva in seguito all’induzione

del processo apoptotico.

Le caspasi possono essere suddivise in due classi

principali:

1. iniziatrici (o di avvio)

2. effettrici.

Le caspasi di avvio sono responsabili

dell’attivazione delle caspasi effettrici.

Nuclear activation

Un evento tipico dell’apoptosi

è la suddivisione del DNA in

nucleosomi

E’ un evento che segue

l’attivazione delle caspasi

Poly(ADB ribosio) polimerasi

Ripara il DNA

Substrato per le caspasi, è coinvolta nei processi

di riparazione del DNA

caspase activated DnaseICAD normalmente inattiva, durante l’apoptosi diventa

CAD (nucleasi)

La cellula in apoptosi subisce modificazioni

morfologiche e biochimiche che portano alla

sua frammentazione e ne favoriscono la

fagocitosi

CELLULA APOPTOTICA AL

MICROSCOPIO ELETTRONICO

Elettroforesi del DNA di cellule in apoptosi

1- DNA di cellule in apoptosi: si può osservare il ladder (scaletta),

formato da frammenti di peso molecolare discreto (multipli

di nucleosomi)

2- DNA ad alto peso molecolare di cellule integre

3- DNA di cellule in necrosi: i frammenti sono di peso molecolare

vario, per lo più piccolo

Fagocitosi: segnali “eat-me” nelle

cellule di mammifero

Fagocitosi di cellule apoptotiche

Cell surface modifications:

phosphatidylserine exposure