Università degli Studi di Torino / ASL TO2

Dipartimento di Scienze Mediche, Malattie Infettive Laboratorio di Farmacologia Clinica e Farmacogenetica

Padiglione Q, Ospedale Amedeo di Savoia, C.so Svizzera 164 10149 TORINO (Italy)

Web Site: www.tdm-torino.org e-mail: info@tdm-torino.org UNI EN ISO 9001:2008 CERTIFIED LABORATORY

Development and validation of an UPLC-MS/MS

method for Sildenafil and N-desmethysildenafil

plasma determination and quantification

Debora Pensi, Marco Simiele, Daniela Pasero, Francesca Ivaldi, Mauro

Rinaldi, Giovanni Di Perri, Vito Marco Ranieri, Antonio D'Avolio

1986 : sintetizzato dalla Pfizer in Inghilterra come inibitore della

fosfodiesterasi 5 (PDE5)

1996 : viagra brevettato dalla Pfizer

1998 : approvato dall’FDA per la cura della disfunzione erettile

2005 : approvato da FDA e EMA per il trattamento ipertensione

polmonare arteriosa di classe II e III

Sildenafil

2013 : termine del brevetto della Pfizer possibile commercializzazione di farmaci generici contenenti il sildenafil

Sildenafil N-desmetilsildenafil

ha il 50% della potenza del sildenafil

inibisce Non inibisce

PDE 1

PDE 3 PDE 5 PDE 6

PDE 9

PDE 2 PDE 7

PDE 8

PDE 5 A1 875 aa

PDE 5 A2 833 aa

vescica, colon, prostata, corpo cavernoso, piccolo intestino,

stomaco, condrociti, muscolatura liscia dei vasi

Sildenafil e N-desmetilsildenafil sono inibitori selettivi delle fosfodiesterasi

Guanilato ciclasi

5’-GMP

cGMP

Ca2+ Ca2+

Ca2+

Ca2+ Ca2+

NO

Ca2+

PDE

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Meccanismo d’azione del sildenafil

Muscolo vascolare liscio

Piastrine

Intestino

Corpo cavernoso

Vescica, Colon, Prostata, Placenta

riduzione transitoria della pressione sanguigna sistemica

azione antitrombotica aumento rischio emorragico

riduzione traffico intestinale reflusso gastrico rilassamento sfintere gastro-esofageo

solo in seguito a stimolo sessuale rilascio di Ach NO ↑[cGMP]

Retina (PDE-6) incapacità temporanea di distinguere blu-verde

Farmacodinamica

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Assorbimento

Distribuzione

Eliminazione

Metabolismo

somministrazione orale a digiuno a livello del tratto gastrointestinale 30-120 min raggiungimento Cmax

volume di distribuzione SIL circa 105 L SIL e N-desmetil legati a proteine del plasma legano sostanza nera, pelle, retina

SIL metabolizzato a livello epatico a N-desmetil metabolita secondario UK150,564 CYP3A4 e CYP2C9 anche l’N-desmetil viene metabolizzato

eliminato principalmente nelle feci eliminazione in misura minore nelle urine tasso di eliminazione è 41L/h

Farmacocinetica

Infusione endovena

TEMPO INFUSIONE = 15 min C max = 15 min T max = 15 min

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Bosentan

Cimetidina

Eritromicina

Indinavir

Ritonavir

Saquinavir

Beta-bloccanti

Succo di pompelmo

Induttore del CYP3A4, co-somministrazione aumenta metabolismo sildenafil

Inibitore CYP3A4, co-somministrazione induce aumento del 56% delle concentrazioni plasmatiche di sildenafil

Inibitore CYP3A4, co-somministrazione induce aumento del 182% delle concentrazioni plasmatiche di sildenafil

Antiretrovitrale, co-somministrazione aumenta concentrazione plasmatica sildenafil

Antiretrovitrale, co-somministrazione aumenta concentrazione plasmatica sildenafil

Antiretrovitrale, co-somministrazione aumenta concentrazione plasmatica sildenafil

Co-somministrazione aumenta concentrazione plasmatica sildenafil

Co-somministrazione aumenta concentrazione plasmatica sildenafil

Farmaci che possono interferire sulla farmacocinetica del sildenafil

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PAH: ipertensione polmonare arteriosa

Malattia rara (2/1000000 abitanti) Associata a malattie del connettivo, del fegato, HIV, cardiopatie congenite, trombo-embolia polmonare Aumento pressione polmonare Malattie del sistema vascolare (casi gravi)

Stanchezza Sensazione di affanno Ritenzione liquidi

Vita quotidiana compromessa

Il cuore destro si dilata e non risulta più in grado di pompare sangue nel

circolo polmonare

Trattamento sildenafil di pazienti sottoposti a chirurgia cardiaca per :PATOLOGIA DELLA

VALVOLA MITRALE PRESENTANTI IPERTENSIONE POLMONARE SEVERA

Studio clinico 2013 (ancora in corso) presso La Città della Salute (presidio

Molinette) di Torino

Scopo del lavoro

Messa a punto e validazione di un metodo bioanalitico per la

quantificazione plasmatica (con finalità cliniche) di sildenafil e N-

desmetilsildenafil

rapido e preciso

adattabile alla pratica clinica

sensibile e specifico

Assenza di metodi QUANTITATIVI dedicati Indagini antidoping

2013 termine del brevetto della Pfizer

farmaci generici contenenti il sildenafil

UPLC vs HPLC

Fasi stazionarie con particelle < a 2µm

Velocità delle analisi aumentata di 2-3 volte rispetto all’HPLC

Efficienza separativa e alta risoluzione

Sensibilità e produttività

Riduzione lunghezza colonna

Riduzione dimensioni particelle

Aumento delle pressioni da 6000 psi a 15000 psi

15000 psi

QC H QC M QC L

750 ng/mL 100 ng/mL 10 ng/mL

Cal 9 Cal 1

1000 ng/mL 3,9 ng/mL

Controlli di Qualità e Curva di Calibrazione

Concentrazioni uguali per sildenafil e N-desmetilsildenafil

Pensi et al.,2014 Submited

5,06 min

6,06 min

5,11 min

Cromatogramma di un mix chimico (sildenafil, N-desmetilsildenafil e quinaxolina alla concentrazione di 10µg/mL)

Run Time 10 minuti

Pensi et al.,2014 Submited

Validazione del metodo secondo linee guida FDA (2013)

PRECISIONE

ACCURATEZZA

Misura la distanza tra i vari valori misurati, espressa in CV%

Misura la distanza dei valori misurati dal valore vero

STABILITA’

SPECIFICITA’

Calibratori, controlli di qualità, campioni devono essere stabili fino al momento delle analisi

Capacità di riconoscere l’analita d’interesse senza interferenze da parte di altri farmaci

LLOD

LLOQ

Limite minimo di rilevazione (3 volte rumore di fondo)

Limite minimo di quantificazione (RSD<20%; 5 volte rumore di fondo)

Recupero Efficienza della procedura estrattiva

Effetto matrice Rumore di fondo causato da analiti che competono con l’analita d’interesse

ULOQ Limite massimo di quantificazione

FDA RISULTATI

PRECISIONE CV % < 15% 5 prove intra-day :(8,26-2,58%) e 5 inter-day(1,02-3,25%)

ACCURATEZZA < 15% -7,16% - 9,01%

Curva di

calibrazione

deviazione % dalla conc nominale

<15%, per Cal 1 <20%;

Coefficiente di regressione >0,995

r2 = 0,995-0,999

Deviazione % dalla concentrazione nominale <15%, per tutti

i calibratori

STABILITA’ _ Vos et al., 2008 : stabili per 6 mesi a -20°C

SPECIFICITA’ No interferenze 6 campioni di plasma bianco, senza interferenze

LLOQ RSD%<20% ; almeno 5

volte rumore di fondo

3,9 ng/mL (= CAL1)

LLOD almeno 3 volte rumore

di fondo

1,95 ng/mL (diluizione 1:1 CAL 1)

RECUPERO Costante per ogni

campione (>70%)

Recupero medio per sildenafil 83,2%

Recupero medio per N-desmetilsildenafil 84,5%

Effetto Matrice Assente (<20%) 6 campioni di plasma bianco ricostituiti, deviazione

percentuale 3-4 % effetto matrice <15%

Risultati della validazione

LLOD

LLOQ

sildenafil sildenafil

QC M

PLASMA BIANCO RICOSTITUITO

MIX CHIMICO

QC H 1,2µg/mL QC M 160 ng/mL QC L 16 ng/mL

Pensi et al.,2014 Submited

Applicazione del metodo

20 pazienti dell’ospedale La Città della Salute presidio Molinette (studio clinico di Fase III)

somministrati 10 mg di sildenafil per via endovenosa

(ogni 8 h per un massimo di 72h)

Prelievi ematici

T0 -15 min (Ctrough) T1 20 min (Cmax) T2 1 h T3 4 h T4 8 h

steady state 1° infusione

Tutti i campioni dei pazienti sono stati analizzati in doppio I valori delle concentrazioni plasmatiche dei

pazienti rientrano nei range di curva

Pensi et al.,2014 Submited

Parametri farmacocinetici allo steady-state dei pazienti analizzati

Cmin

Cmax

AUC

emivita

Volume distribuzione

Concentrazione più bassa di farmaco nel plasma tra una somministrazione e l’altra

Concentrazione più alta di farmaco nel plasma tra una somministrazione e l’altra

Area sottesa alla curva nella concentrazione plasmatica nel tempo

(t1/2) tempo di dimezzamento necessario affinchè la concentrazione plasmatica di farmaco si dimezzi

Valore correlato alla concentrazione plasmatica rispetto alla concentrazione totale di farmaco

sildenafil N-desmetil

38.0 ng/mL

[31.7-93,0]

52,50 ng/mL

[38,75-85,75]

328,50 ng/mL

[177,0-475,2]

74.0 ng/mL

[55,7-101,5]

655,7 h*ng/mL

[535,9-1249,9]

493,5 h*ng/mL

[352,83-717,8]

5,1 h

[4,0-5,5]

15.4 h

[14,7-15,7]

75,2 L

[57-128]

403,3L

[385-615]

Pensi et al.,2014 Submited

primo metodo sviluppato su sistema UPLC-MS/MS

seguite le norme UNI EN ISO 9001: 2008 (progettazione e sviluppo metodi)

validazione del metodo seguendo le linee guida FDA 2013 separazione efficace del sildenafil da N-desmetilsidenafil (metodo molto specifico) alta sensibilità (nonostante il piccolo volume di plasma) assenza di effetto matrice e buon recupero

rapidità e affidabilità: analisi adatta alla pratica clinica

Conclusioni

Conclusioni

tutte queste caratteristiche rendono

questo metodo utilizzabile nella routine di laboratorio e, in base alle

necessità dei clinici, per un futuro TDM plasmatico del sildenafil

Sviluppi futuri di questo lavoro

Ricerca dei polimorfismi genetici che correlino con le concentrazioni plasmatiche degli analiti in oggetto:

per prevedere a priori le concentrazioni del sildenafil e del suo metabolita

per spiegare le eventuali differenze inter-paziente

applicazione di tale metodo anche ad indagini anti-doping

Grazie per l’attenzione