Tierärztliche Hochschule Hannover

Degradation und Biokompatibilität der neuen Magnesiumlegierung LANd442 im

Vergleich zu LAE442 und der nicht degradablen Titanlegierung Ti6Al4V-Eli

nach intramedullärer Implantation in die Kaninchentibia

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Carolin Hampp

Heilbronn – Neckargartach

Hannover 2012

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Andrea Meyer-Lindenberg

Klinik für Kleintiere

Jetzt: Chirurgische und Gynäkologische Kleintierklinik

der Ludwig-Maximilians-Universität München

1. Gutachterin: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Andrea Meyer-Lindenberg

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Ingo Nolte

Tag der mündlichen Prüfung: 10.05.2012

Diese Dissertation entstand im Rahmen des Sonderforschungsbereichs 599 „Zukunftsfähige

bioresorbierbare und permanente Implantate aus metallischen und keramischen

Werkstoffen“ im Teilprojekt R6 „Degradable Implantate“, gefördert durch die Deutsche

Forschungsgemeinschaft (DFG).

Für meine Familie

Ergebnisse dieser Dissertation wurden in international anerkannten Fachzeitschriften

mit Gutachtersystem (peer review) zur Veröffentlichung angenommen oder

eingereicht:

• Advanced Engineering Materials: Advanced Biomaterials (angenommen am

29.10.2011)

DOI: 10.1002/adem.201180066

Research on the biocompatibility of the new magnesium alloy LANd442 –

an in vivo study in the rabbit tibia over 26 weeks

C. Hampp, B. Ullmann, J. Reifenrath, N. Angrisani, D. Dziuba, D. Bormann,

J.-M. Seitz, A. Meyer-Lindenberg

• Materials Science and Engineering: C (eingereicht am 07.03.2012)

Evaluation of the biocompatibility of two magnesium alloys as

degradable implant materials in comparison to titanium as non

resorbable material in the rabbit

C. Hampp, N. Angrisani, J. Reifenrath, D. Bormann, J.-M. Seitz,

A. Meyer-Lindenberg

Teilergebnisse dieser Dissertation wurden auf folgenden Fachkongressen

präsentiert:

• Euro BioMat 2011 – European Symposium on Biomaterials and related areas,

Jena, 13.-14.04.2011

In-vivo research on the biocompatibility of the new magnesium alloy

LANd442 on the basis of imaging procedures

C. Hampp, D. Rittershaus, J. Reifenrath, D. Bormann, J. Seitz,

A. Meyer-Lindenberg

• Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Biomaterialien, Gießen,

10.-12.11.2011; BioMaterialien, 12, 1-4, 2011.

Untersuchung der Biokompatibilität von degradablen

Magnesiumlegierungen im Vergleich zu Titan im Kaninchenmodell

C. Hampp, J. Reifenrath, N. Angrisani, D. Bormann, J.-M. Seitz,

A. Meyer-Lindenberg

Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________________

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ........................................................................................................... 9

2 Publikation I ..................................................................................................... 12

2.1 Abstract ...............................................................................................................13

2.2 Introduction.........................................................................................................13

2.3 Materials and Methods .......................................................................................15

2.3.1 Implants.....................................................................................................15

2.3.2 Animal model.............................................................................................15

2.3.3 Clinical investigation..................................................................................16

2.3.4 Radiological investigation ..........................................................................16

2.3.5 In vivo µ-computed tomography ................................................................16

2.3.6 Intravital staining for histologically investigating new bone growths ...........17

2.3.7 Euthanasia ................................................................................................18

2.3.8 Ex vivo µ-computed tomography ...............................................................18

2.3.9 Histological investigations .........................................................................19

2.3.10 Statistics....................................................................................................20

2.4 Results.................................................................................................................21

2.4.1 Clinical investigation..................................................................................21

2.4.2 Radiological investigations ........................................................................21

2.4.3 In vivo µ-computed tomography ................................................................22

2.4.4 Ex vivo µ-computed tomography ...............................................................25

2.4.5 Histological investigations .........................................................................27

2.5 Discussion...........................................................................................................29

2.6 Conclusions ........................................................................................................37

2.7 Acknowledgements ............................................................................................38

2.8 References ..........................................................................................................39

3 Publikation II .................................................................................................... 45

3.1 Abstract ...............................................................................................................46

Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________________

4 Diskussion ....................................................................................................... 47

5 Zusammenfassung.......................................................................................... 62

6 Summary.......................................................................................................... 65

7 Literaturverzeichnis ........................................................................................ 68

Einleitung ___________________________________________________________________

9

1 Einleitung

In der Orthopädie ist eine der wichtigsten Fragestellungen die nach den am besten

geeigneten Osteosynthesematerialien. Seit Jahren wird neben den etablierten

Materialien wie Titan und Stahl, die sich durch eine hohe Stabilität auszeichnen, an

resorbierbaren Implantatmaterialien geforscht. Bereits etabliert sind hierbei

verschiedene Kunststoffe wie PLA, PGA und PMMA (HOFMANN et al. 1990;

GRIFFITH 2000). Diese sind jedoch nicht stabil genug, um Anwendung am

belasteten Knochen zu finden (SONG 2007; SEALY a. GUO 2010; LICHTE et al.

2011). Daher konzentriert sich die Forschung auf degradable Metalle, wobei

Magnesium im Fokus dieser neuen Orientierung steht (WITTE et al. 2004; STAIGER

et al. 2006; FEYERABEND et al. 2010; MEYER-LINDENBERG et al. 2010;

HUEHNERSCHULTE et al. 2011). Das Leichtmetall Magnesium zeichnet sich durch

einen Elastizitätsmodul von 45 GPa aus (AVEDESIAN 1999), der im Vergleich zu

Titan (105-110 GPa (LONG a. RACK 1998)) oder Stahl (190-210 GPa (LEVESQUE

et al. 2004; MOAVENI 2010)) eine weitaus geringere Differenz zu dem des kortikalen

Knochens (18,6 GPa (RHO et al. 1993)) aufweist. Beachtet man zusätzlich die

Tatsache, dass ein Osteosyntheseimplantat zunächst die auftretenden Belastungen

aushalten muss, um den regenerierenden Knochen vor einer erneuten Fraktur zu

bewahren, erscheint ein etwas höherer Elastizitätsmodul durchaus vorteilhaft. Ist der

Unterschied jedoch zu groß, kommt es zum Phänomen des stress-shielding (SEALY

a. GUO 2010), bei dem das Implantat den heilenden Knochen von jeglicher

Belastung abschirmt. Hierdurch kommt es zu einer verminderten Mineralisierung des

Knochens (TONINO et al. 1976; BENLI et al. 2008) und die Gefahr der

Refrakturierung nach Entfernen des Implantates steigt, da das Implantatlager

zunächst wieder vom Knochen stabilisiert werden muss (WITTE et al. 2004).

Herkömmliche Implantatmaterialien haben zusätzlich den Nachteil, dass sie eine

Fremdkörperreaktion hervorrufen können, wenn sie im Körper belassen werden

(VOGGENREITER et al. 2003; LICHTE et al. 2011). Um diese Probleme zu

umgehen, werden die Implantate häufig entfernt, nachdem der erwünschte

Heilungseffekt eingetreten ist. Eine solche Zweitoperation zur Entfernung der

eingebrachten Implantate ist bei einem degradablen Osteosynthesematerial hinfällig

Einleitung ___________________________________________________________________

10

und stellt dadurch einen weiteren Vorteil von Magnesiumlegierungen dar (SONG

2007; BENLI et al. 2008). Da jede Operation Kosten, Schmerzen sowie ein nie

auszuschließendes Narkoserisiko für den Patienten bedeutet (ROKKANEN et al.

2000; WITTE et al. 2004), bietet ein degradierendes Implantat die Möglichkeit der

Verringerung dieser Faktoren.

Zusätzlich zeichnet sich Magnesium als körpereigenes Element grundsätzlich durch

eine sehr gute Verträglichkeit aus. Ein erhöhter Magnesiumspiegel, wie er im

Rahmen des Abbaus eingebrachter Implantate eventuell entstehen könnte, wird

durch den Körper selbst reguliert (VORMANN 2003) und hat in den zu erwartenden

Höchstkonzentrationen keine toxischen Folgen (SARIS et al. 2000).

Jedoch kann Magnesium nicht als alleiniges Element für Osteosyntheseimplantate

verwendet werden, da seine Primärstabilität nicht ausreicht, um den Knochen

postoperativ optimal zu stützen (MCBRIDE 1938) und diese zudem in chloridhaltigen

Medien zu schnell abnimmt (STAIGER et al. 2006; MEYER-LINDENBERG et al.

2010). Daher müssen andere Elemente zulegiert werden, um die Eigenschaften des

Materials zu verbessern. Bisherige Studien konnten zeigen, dass sich Seltene Erden

hierfür besonders eignen (WITTE et al. 2005; MINGXING et al. 2007; KRAUSE 2008;

HORT et al. 2009). In der Folge wurden verschiedene Legierungen wie LAE442,

ZEK100 und WE43 entwickelt und sowohl in vitro als auch in vivo getestet, wobei

sich LAE442 sehr vielversprechend zeigte (WITTE et al. 2005; THOMANN et al.

2009). Allen diesen Seltene Erden enthaltenden Materialien ist gemein, dass das

Mischungsverhältnis der einzelnen Elemente innerhalb der Legierungen nicht genau

bekannt ist.

Hierin liegt ein Problem für die Reproduzierbarkeit der Legierung und damit für die

Gewährleistung einer gleich bleibenden Qualität, was eine essentielle Voraussetzung

für den Einsatz in der Medizin darstellt. Daher wurde die neue Magnesiumlegierung

LANd442 entwickelt (SEITZ et al. 2011), die aufgrund der bisherigen guten

Ergebnisse auf LAE442 basiert (WITTE et al. 2005; THOMANN et al. 2009).

Verschiedene Studien stuften unter anderen Elementen der Seltenen Erden Neodym

in in vitro Versuchen als gut verträglich ein (DRYNDA et al. 2009; FEYERABEND et

Einleitung ___________________________________________________________________

11

al. 2010). Daher wurde der Anteil des in LAE442 enthaltenen Seltenen Erden-

Gemisches bei der Entwicklung der neuen Legierung durch das Einzelelement

Neodym ersetzt, um eine genau definierte Legierungszusammensetzung zu

erreichen (ROKHLIN 2003). Dieser Ansatz wurde bereits bei der Legierung

LACer442 verfolgt, bei der die Seltene Erden-Mischung durch das Element Cer

ersetzt wurde, die sich jedoch im in vivo Versuch als nicht biokompatibel

herausstellte (REIFENRATH et al. 2010). Allerdings besitzt Neodym im Gegensatz

zu Cer laut einer Verträglichkeitsstudie in vitro kein toxisches Potential

(FEYERABEND et al. 2010) bzw. erst in sehr hohen Konzentrationen (DRYNDA et

al. 2009), sodass von einer besseren Verträglichkeit ausgegangen wird.

In der zugänglichen Literatur existieren jedoch keine in vivo Studien, die die

Biokompatibilität von Neodym als Legierungselement untersuchen. Daher war es das

Ziel der vorliegenden Arbeit, die Biokompatibilität der neuen Legierung LANd442 in

vivo unter Berücksichtigung der Degradation über verschiedene Zeiträume (vier und

acht Wochen bzw. sechs Monate) im Kaninchenmodell zu prüfen. Als

Vergleichsmaterial wurde die als vielversprechend geltende Magnesiumlegierung

LAE442 herangezogen und das etablierte Osteosynthesematerial Titan diente als

Kontrolle. Zudem wurden Tibiae in die Untersuchung einbezogen, bei denen die

Operation durchgeführt wurde, die aber kein Implantat erhielten (Leertibiae), um die

Auswirkungen der Operationsmethode von den potentiellen durch die Implantate

induzierten Vorgängen am Knochen zu unterscheiden.

Publikation I ___________________________________________________________________

12

2 Publikation I

Das Manuskript wurde am 07.03.2012 im Journal „Materials Science and

Engineering: C“ zur Veröffentlichung eingereicht.

Evaluation of the biocompatibility of two magnesium alloys as

degradable implant materials in comparison to titanium as non

resorbable material in the rabbit

Carolin Hampp*, Nina Angrisani, Janin Reifenrath, Dirk Bormann, Jan-Marten Seitz,

Andrea Meyer-Lindenberg

C. Hampp, Dr. N. Angrisani, Dr. J. Reifenrath:

Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hanover, Bünteweg 9, 30559

Hanover, Germany

Dr. D. Bormann, J.-M. Seitz:

Institute of Materials Science, Leibniz University Hanover, An der Universität 2,

30823 Garbsen, Germany

Prof. Dr. A. Meyer-Lindenberg:

Clinic for Small Animal Surgery and Reproduction, Centre of Clinical Veterinary

Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Ludwig-Maximilians-University München,

Veterinärstraße 13, 80539 Munich, Germany

* Corresponding author

Publikation I ___________________________________________________________________

13

2.1 Abstract

The aim of this study is to compare the biocompatibility of the two magnesium based

alloys LAE442 and LANd442 with that of titanium. For this purpose, cylindrical

implants were introduced into the medullary cavity of rabbit’s tibiae for 4 and 8

weeks. Animals without any implant served as a control. In the follow-up, clinical, X-

ray and µCT-investigations were performed to evaluate the reactions of the bone

towards the implanted materials. After euthanasia, ex vivo µCT- and histological

investigations were performed to verify the results of the in vivo tests. It could be

shown that all materials induce changes in the bone. Whereas LANd442 caused the

most pronounced reactions, such as increasing bone volume and bone porosity and

decreasing bone density, titanium showed the most bone-implant contact by forming

trabeculae. The tibiae of rabbits without implants also reacted by forming cavities, it

is therefore assumed that the surgery method itself influences the bone. Compared

to LANd442, LAE442 seems to be the more qualified alloy since it demonstrated

better clinical tolerance.

2.2 Introduction

The treatment of fractures is a major field within orthopaedic surgery. Commonly

used materials are stainless steel or titanium (DISEGI a. ESCHBACH 2000;

POHLER 2000; FERRARIS et al. 2011) which have been long established and are

still considered appropriate and almost unrivalled. This is evident due to the fact that

current research focuses on the improvement of these established materials

(JAIMES et al. 2010; KERÄNEN et al. 2011) rather than developing alternatives.

However, the disadvantage of stainless steel and titanium is that both materials are

non resorbable. Therefore, they have to be removed, following complete bone

healing, in a second surgery or, when left in the organism, can cause foreign body

reactions (VOGGENREITER et al. 2003).

Competing with these durable materials are resorbable materials like polymers and

ceramics which spare the patient a second surgical procedure to remove the implant.

However, polymers can also cause foreign body reactions and neither material has

sufficient mechanical load carrying capacity for the use in weight bearing bones

(LICHTE et al. 2011). In recent years, degradable implant materials which are based

Publikation I ___________________________________________________________________

14

on magnesium were studied to a greater extent (WITTE et al. 2005; REIFENRATH et

al. 2010; ATRENS et al. 2011). They should combine the ability to degrade with

sufficient mechanical properties. The advantages of employing magnesium as the

main component are obvious: as an essential element of the human body,

magnesium is well tolerated (SARIS et al. 2000) and it prevents stress shielding

during bone healing (SEALY a. GUO 2010) due to its Young’s modulus which, of all

the osteosynthetic materials, is closest to that of bone (STAIGER et al. 2006; XU et

al. 2007). Several studies showed that the mechanical properties and the

biocompatibility of magnesium can be influenced by alloying with other elements

(STAIGER et al. 2006; KIM et al. 2008; ATRENS et al. 2011). Particularly the use of

rare earth elements (RE) led to good results (MORDIKE 2002; MINGXING et al.

2007; HORT et al. 2009). The alloy LAE442 which, besides magnesium, lithium and

aluminium, contains a mixture of various RE proved especially promising (THOMANN

et al. 2009; KRAUSE et al. 2010; WITTE et al. 2010).

Previous studies of this alloy described implantation periods of three or more months

(THOMANN et al. 2009; KRAUSE et al. 2010). However, literature on earlier time

points, which would represent the remodelling processes during fracture healing, is

currently lacking. For this reason, the present study chose implantation periods of 4

and 8 weeks to evaluate the potentially early occurrence of bone remodelling

processes. Owing to the previous good results for LAE442, this alloy was included in

the present study and was compared to LANd442, which is based on LAE442 but

only contains neodymium instead of the RE mixture. The replacement of the RE

mixture by the single element neodymium aims to achieve a better reproducibility. As

control groups, two models were chosen. On the one hand, titanium implants were

introduced; on the other hand, tibiae were used, which underwent the same surgical

procedure but without receiving an implant as performed in previous studies

(THOMANN et al. 2009; HUEHNERSCHULTE et al. 2011).

Publikation I ___________________________________________________________________

15

2.3 Materials and Methods

2.3.1 Implants

In this study, cylindrical implants (Ø 2.5 mm, 25 mm length) made of the magnesium

based alloys LAE442 and LANd442 were used as well as titanium-alloy implants of

the same geometry which were employed as a control (Ti6Al4V-Eli; S+D Spezialstahl

Handelsgesellschaft mbH, Stelle, Germany). The magnesium implants were specially

produced for this study according to a previously published method (KRAUSE et al.

2010; THOMANN et al. 2010a; HUEHNERSCHULTE et al. 2011; SEITZ et al. 2011).

Besides 90 wt% magnesium, the alloy LAE442 contains 4 wt% lithium, 4 wt%

aluminium and 2 wt% of a rare earth mixture. The alloy LANd442 is based on

LAE442 and contains the same proportions of magnesium, lithium and aluminium.

Here however, the rare earth mixture was replaced by 2 wt% of the single element

neodymium.

2.3.2 Animal model

The animal tests were approved by the Federal Office of Consumer Protection and

Food Safety, according to paragraph 8 of the animal protection law, with the

reference number 33.9-42502-04-07/1363.

For the current study 28 New Zealand White Rabbits (Charles River, Kisslegg,

Germany) were randomly placed into six groups, a 4- and an 8-week group for each

implant material (table 1). The implants of the LAE442- and LANd442-groups were

introduced according to a previously described method (HAMPP et al. 2012) into the

medullary cavity of both tibiae in four rabbits, respectively. Two rabbits only received

one implant each. In their other hind leg, surgery was carried out using the same

procedure, but no implant was inserted. The titanium implants were introduced into

two rabbits per time group on both sides at the same location. After surgery, the

rabbits received enrofloxacin (10 mg/kg, Baytril® 2.5%, Bayer HealthCare,

Leverkusen, Germany) and meloxicam (0.15 mg/kg, Metacam®, Boehringer

Ingelheim, Ingelheim, Germany) for a time period of ten days.

Publikation I ___________________________________________________________________

16

Table 1: Overview of the number of tibiae per implant material and time period

material 4-week group 8-week group LAE442 10 10

LANd442 10 10 Titanium 4 4

without implant 4 4

2.3.3 Clinical investigation

The animals were examined daily according to a previously described method

(HAMPP et al. 2012). These examinations focused on possible changes occurring in

the rabbits’ hind legs. If the rabbits showed lameness, they were treated with

meloxicam (0.15 mg/kg, Metacam®, Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Germany)

beyond day 10 after surgery.

2.3.4 Radiological investigation

The tibiae of all rabbits were radiologically investigated once every week in two

layers (anterior-posterior, mediolateral; 48 kV and 6.3 mAs) to evaluate bone

alterations and the development of gas. All changes were assessed by a semi-

quantitative scoring according to HUEHNERSCHULTE et al. (2011) which allows

score values from 0 (no occurrence) to 3 (strong occurrence) for the individual

parameters (growths at the implantation site at the proximal tibia, growths at the

implant location at the diaphysis, gas, changes in the medullary cavity and corticalis).

Finally, all score values of the rabbits in one group were summed to a total score and

the respective group’s mean value was computed for each time point of the

investigation.

2.3.5 In vivo µ-computed tomography

Over the investigation periods of 4 and 8 weeks, µ-computed tomography

evaluations (µCT) of the rabbits were performed (resolution: 41 µm, projections: 1000

at 0-180°, integration time: 100 ms; XtremeCT, Scanco Medical, Zurich, Switzerland).

The rabbits of the 4-week groups were scanned weekly and those in the time period

Publikation I ___________________________________________________________________

17

over 8 weeks, biweekly. The investigation was done under general anaesthesia. The

evaluated area was limited by the knee joint space in the proximal direction and

reached up to about 5 mm beneath the implant in the distal direction. The analysis of

the µCT-investigations was done in both two and also three dimensions.

Two-dimensional evaluation

The overall impression of the bone including formation of cavities, periosteal and

endosteal new bone growth, the growth behaviour onto the implant as well as the

formation of gas bubbles were evaluated by an established semi-quantitative scoring

(HUEHNERSCHULTE et al. 2011) based on nine selected cross-sections

(THOMANN et al. 2010a). For every parameter, score values from 0 to 3 were given

for each cross-section (no occurrence: value 0, strong occurrence: value 3) and a

mean value per time group and per investigation time point was computed. The tibiae

of the animals with titanium implants were not investigated in this way because of an

expected insufficient resolution of detail as a consequence of the titanium’s stronger

absorption of X-rays (BERNHARDT et al. 2004).

Three-dimensional evaluation

On the basis of every in vivo µCT-investigation a three-dimensional evaluation of

each tibia was performed, including the bone area, in which the bone-implant-

compound was completely visible. Using the computational software (µCT Evaluation

Program V6.0; Scanco Medical, Zurich, Switzerland), the threshold for the evaluation

of the bone was determined to be 160. Subsequently, the computations of the tibia

areas were used to compute the bone volume (in mm³/slice), the bone density (in mg

HA/ccm) as well as the bone porosity (in %). An evaluation of mean values and

standard deviations was done for every investigation time point for every time group.

2.3.6 Intravital staining for histologically investigating new bone growths

For the fluorescent-microscopic investigation following euthanasia, the animals

received three different fluorochromes which were chosen according to RAHN (1976)

and injected subcutaneously at specific times (table 2).

Publikation I ___________________________________________________________________

18

Table 2: Overview of the specific injection times of the fluorochromes and the resulting time periods

calcein green xylenolorange tetracycline time period 1 time period 2 4-week groups day 3+6 day 13+16 day 23+26 day 3-13 day 16-23 8-week groups day 3+6 day 27+30 day 51+54 day 3-27 day 30-51

2.3.7 Euthanasia

At the end of the investigation time period the rabbits were painlessly euthanized as

described in previous studies (LALK et al. 2010; HUEHNERSCHULTE et al. 2011;

HAMPP et al. 2012). The rabbit’s tibiae were removed and, after removal of adherent

tissue, fixed in formaldehyde (4%). The left tibiae of the rabbits containing the

magnesium implants were not used for the following investigations.

2.3.8 Ex vivo µ-computed tomography

After removing the tibiae, they were again evaluated by a µCT-investigation but using

a higher resolution of 36 µm (integration time: 1 s; MicroCT80, Scanco Medical,

Zurich, Switzerland). The evaluation of these µCT-scans corresponds to the two-

dimensional evaluation of the in vivo scans but also includes the titanium implants

(figure 1). In addition to this, an assessment of the implant degradation was

performed by means of a semi-quantitative scoring for the examination of the

implant’s cross-sections. Depending on the degradation rate (no degradation: value

0; initial changes at the implant’s edge: value 1; changes at the implant’s edge with

crack formation: value 2; coarse structural changes: value 3) and subsequent to the

score values determined for each implant (n = 9), the median, minimum and

maximum values were computed for every group.

Publikation I ___________________________________________________________________

19

Figure 1: Ex vivo µCT cross-sections of the bone-implant-compounds of a) LAE442, b) LANd442, c)

titanium, d) cross-section of a tibia without implant

2.3.9 Histological investigations

Following the µCT-investigations, the complete bone-implant-compound was

detached and embedded in hydroxyethylmethacrylate (Technovit 7200 VLC, Heraeus

Kulzer GmbH, Wehrheim, Germany) according to the manufacturer’s instructions. To

produce the 50 µm thick histological cross-sections of the bone, the cutting and

grinding technique was used according to DONATH (1988). At central cross-sections

of the bone, fluorescent investigations were carried out as well as transmission

microscopy investigations of histological slices stained with TRAP and toluidine blue.

Fluorescent-microscopic investigation

One cross-section per tibia was fluorescent-microscopically evaluated. Based on the

intravitally injected fluorochromes, which were visible as double bands due to two

successive injections, the mineral apposition rate (MAR) could be determined

(PARFITT 1987). Therefore, the distance between the bands of two adjacent

fluorochrome sequences was measured and divided by the number of days between

the corresponding injections (PARFITT 1987). The time points of the intravital

stainings resulted in two different time periods for the 4-week groups and the 8-week

groups, respectively (table 2). In the present study, a multichannel image of the

histological slices was generated using specific filters (FS 14, FS 18, FS 46, Carl

Zeiss AG, Jena, Germany) and the distance at twelve specific locations was

Publikation I ___________________________________________________________________

20

measured according to an established method (REIFENRATH et al. 2011; HAMPP et

al. 2012). Finally, mean values and standard deviations were computed for every

slice to determine the mean value of the individual groups.

TRAP staining

One cross-section of each tibia was subjected to a TRAP staining (Tartrate-Resistant

Acid Phosphatase; naphthol AS-MX phosphate / Fast Red TR Salt, Sigma Aldrich,

St. Louis, USA) for viewing the osteoclasts (MOSTAFA et al. 1982; LINDUNGER et

al. 1990). The counting of osteoclasts and Howship’s lacunae was carried out three

times at x 200 magnification on every stained histological slice. Afterwards, mean

values and standard deviations for all groups were determined.

Toluidine blue

The toluidine blue staining (0.1% toluidine blue O, Chroma, Münster, Germany) was

applied to two histological cross-sections of the bone per tibia. Using a previously

described semi-quantitative scoring (HAMPP et al. 2012), the slices were

investigated at x 100 magnification for the following parameters: overall impression of

the bone including cavities, periosteal bone growth and remodelling, endosteal bone

growth and remodelling, bone-implant contact area, peri-implant fibrous capsule

formation. For the evaluation, score values from 0 (no occurrence) to 3 (strong

occurrence) were assigned depending on the parameter’s occurrence. Subsequent

to this, the mean value as well as the standard deviation of all investigated cross-

sections in one group was computed (LAE442, LANd442, without implant: n = 10;

titanium: n = 8).

2.3.10 Statistics

The values determined for the present study were analyzed using the Microsoft

Office Excel program (Microsoft Office XP, Microsoft Corporation, Redmond, USA)

and SPSS version 17.0 (SPSS: an IBM Company, Chicago, USA). Firstly, they were

tested for a normal distribution. Normally distributed values were checked for

statistical significance by means of a t-test or ANOVA, respectively; non-normally

Publikation I ___________________________________________________________________

21

distributed values were tested by means of Wilcoxon- or Mann-Whitney-tests.

Statistical significance existed for p < 0.05, whereas p < 0.01 indicated a highly

significant difference.

2.4 Results

2.4.1 Clinical investigation

During the post-operative period, all rabbits showed swelling and coarse peripheral

augmentation at the implantation's location. Redness occurred in 45 of 56 legs. Only

one animal of the 4-week LAE442-group demonstrated wound dehiscence on day 15

and 16. Mild subcutaneous emphysema could be found in two legs of the 4-week

LAE442-group (lasting 1 and 16 days, respectively) and four legs of the 8-week

LANd442-group (1 to 7 days). Within this group two rabbits showed a low-grade

lameness of one hind leg which lasted one day and resulted in the administration of

meloxicam. No tibiae showed infections.

2.4.2 Radiological investigations

Within the 4-week groups, tibiae with magnesium implants showed initial alterations

in week 1 (figure 2). Contrary to this, in the titanium-group an increase in the score

could not be found before week 3, however, then an abrupt score value of 2.0 was

found which increased further to the final value 2.5 in week 4.

The final value of the LAE442-group was also 2.5 whereas the 4-week LANd442

group reached a final score of 1.5. Also, tibiae without implants showed radiographic

changes. The score values increased parallel to the LANd442-group from 0.3 in

week 1 to 1.8 in week 4.

In contrast to this, all groups over 8 weeks showed initial changes in week 3. Here, in

the titanium-group an increase to 1.0 score point was noted which, at the same time,

appeared as the maximum final value obtained. The animals with magnesium

implants showed a nearly parallel development, whereas the LAE442-group

constantly showed higher values, but already attained the final value of 1.8 score

points in week 7. The LANd442-group exhibited a stronger increase in week 8 to the

Publikation I ___________________________________________________________________

22

final value of 2.3 score points. The group without implants formed a plateau at 1.3

score points in week 5 to 7, but decreased finally to 0.7 score points.

The largest fraction of bone changes was contributed by the parameters for growth at

the implantation site and growths at the diaphysis.

Figure 2: Development of the investigated bone alterations in all experimental groups by means of

radiological investigations over a) 4 weeks, b) 8 weeks

2.4.3 In vivo µ-computed tomography

Two-dimensional evaluation

In the two-dimensional evaluation of the in vivo µCT-scans, which excluded the

titanium implants because of their expected irradiation, it was shown that not all

parameters were equally pronounced. The highest score values were achieved for

the formation of gas (figure 3 a), especially in the LANd442-group over 4 weeks. In

contrast to this, gas was not even observed directly after surgery in either group

without implants. This was followed by the formation of cavities (figure 3 b), mainly in

the LANd442-group over 8 weeks (0.1 score point in week 8). Contrastingly, the

group without implants showed less cavities (0.2 score points in week 8) in the

corresponding time period. With 0.8 score points for their respective final time points,

the LAE442-groups showed over 4 and 8 weeks the most periosteal formation of new

bone which, in the groups without implants, was not detected over the entire

investigation period (figure 3 c). However, the endosteal formation of new bone was

most strongly pronounced in both LANd442-groups, while again both groups without

implants showed the least changes (figure 3 d). All in all, less contact between bone

Publikation I ___________________________________________________________________

23

and implant existed (figure 3 e). Regarding this, most contacts were formed in the

LAE442-group in week 6 and 8. No contact between bone and implant was detected

at all in the LANd442-group over 8 weeks.

Figure 3: Development of the investigated parameters in all groups by means of two-dimensional

evaluation of the in vivo µCT scans; a) formation of gas, b) formation of cavities, c) periosteal

formation of new bone, d) endosteal formation of new bone, e) bone-implant-contact

Three-dimensional evaluation

The three-dimensional evaluation resulted in different developments for the three

investigated parameters. The respective values are shown in tables 3 a-c. The bone

density, which showed normally distributed values, was in the groups with

magnesium implants subjected to a decrease (table 3 a) and already differed

significantly from the base value in the 4-week group in week 2 (LANd442; p = 0.002)

Publikation I ___________________________________________________________________

24

and week 3 (LAE442; p = 0.016). These significant changes persisted until week 4. In

the 8-week groups only those animals of the LANd442-group showed significant

changes in bone density from week 6 (p < 0.001), compared to the base value. In

contrast, both titanium-groups showed an increase of the bone density which,

however, underwent no significant changes. The groups without implants showed a

contradictory behaviour. Here, in the 4-week group a tendency of the bone density to

decrease was noted and to increase in the 8-week group. Both developments also

produced no significant changes. In comparing the individual groups, the LANd442-

group over 8 weeks already showed significant differences to the LAE442-group (p =

0.001) and the titanium-group (p = 0.003) from week 2, to the group without implants

from week 6 (p = 0.029).

The values of the bone volume also followed a normal distribution and showed, in

contrast to the bone density in the LAE442- and LANd442-groups, an increase (table

3 b). However, in both LANd442-groups significant differences to the base value

were again observable. The 4-week group differed significantly from the base value

in weeks 2 (p = 0.024) and 3 (p = 0.002), the 8-week group in week 8 (p = 0.022).

The LAE442-group over 4 weeks showed significant differences between weeks 1

and 4 (p = 0.005). Comparing the groups, significant differences were seen in week 4

between the 4-week groups of titanium and without implants (p = 0.008), and

between titanium and LANd442 (p = 0.039).

The values of bone porosity were not normally distributed and, by considering the

base and end values (table 3 c), underwent no or only minor changes. In the 8-week

groups of LAE442, LANd442 and without implants, a tendency to increase was

noted, whereas both titanium-groups as well as the LAE442-group showed a minor

decrease of the porosity over 4 weeks. From these results, significant differences

resulted from week 3 (p = 0.024) between the 4-week titanium group and the

respective LAE442- and LANd442-groups. In the corresponding time period over 8

weeks, the titanium-group differed significantly from the LAE442-group (p = 0.014)

and the LANd442-group (p = 0.024) in week 8. In the chronological sequences, no

group showed significant changes.

Publikation I ___________________________________________________________________

25

Table 3: Development of the investigated parameters in all groups by means of three-dimensional

evaluation of the in vivo µCT scans; a) bone density (in mg HA/ccm), normally distributed values; b)

bone volume (in mm³/slice), normally distributed values; c) bone porosity (in %), non-normally

distributed values. Additionally stated are significances between the individual groups (a) and within a

group (b), respectively.

2.4.4 Ex vivo µ-computed tomography

Bone

The results of the ex vivo µCT-investigations confirmed those of the in vivo

investigations to the extent that the parameters “formation of cavities” and “periosteal

Publikation I ___________________________________________________________________

26

formation of new bone” occurred most strongly, whereas bone-implant contact

developed only sporadically (table 4). The formation of cavities was demonstrated by

all groups and the deviations between them were only slight. The contact between

bone and implant only occurred distinctly in both titanium-groups (1.4 and 1.8 score

points, respectively) and was rudimentary in the LANd442-group over 8 weeks (0.1

score point). Endosteal, as well as periosteal formation of new bone could be

observed in all groups, except the groups without implants. For the endosteal

parameter, again both titanium-groups showed the strongest formation (1.2 and 0.9

score points, respectively) and the LAE442-groups the lowest (0.3 and 0.4 score

points, respectively). The results for the periosteal parameter contrasted this (both

LAE442-groups: 1.6 score points; titanium: 0.4 and 0.3 score points, respectively).

Table 4: Final values of the investigated parameters in all groups by means of two-dimensional

evaluation of the ex vivo µCT scans; stated are in each case (a) minimum value, (b) median and (c)

maximum value per group and parameter

group cavities bone-implant-contact

endosteal formation of new

bone

periosteal formation of new

bone (a) (b) (c) (a) (b) (c) (a) (b) (c) (a) (b) (c) LAE442

4 weeks 1.1 1.2 2.3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.3 0.4 0 1.6 2.0 8 weeks 0.6 1.0 1.4 0.0 0.0 0.1 0.3 0.4 0.9 0.6 1.6 2.6

LANd442 4 weeks 0.8 1.0 1.3 0.0 0.0 0.1 0.0 0.6 0.7 0.0 0.8 2.9 8 weeks 1.0 1.3 1.8 0.0 0.1 0.3 0.4 0.8 0.8 0.2 1.0 2.8

Titanium 4 weeks 1.0 1.2 2.0 0.9 1.4 2.3 1.1 1.2 1.3 0.3 0.4 0.8 8 weeks 0.2 0.8 1.3 1.0 1.9 2.7 0.8 0.9 1.2 0.0 0.3 0.7

without implant 4 weeks 0.6 0.8 1.0 - - - 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.3 8 weeks 0.4 0.7 0.9 - - - 0.0 0.0 0.2 0.0 0.0 0.0

Implant

For the degradation of the implants, a median value of 0.0 was determined in all the

4-week groups (LANd442: min 0.0, max 1.0; LAE442: min 0.0, max 0.0; titanium: min

0.0, max 0.0). In the 8-week groups, LANd442 attained a median value of 1.0 (min

0.0, max 1.0), in the LAE442- and titanium-groups the implants appeared almost

Publikation I ___________________________________________________________________

27

unchanged (LAE442: median 0.0, min 0.0, max 1.0; titanium: median 0.0, min 0.0,

max 0.0).

2.4.5 Histological investigations

Fluorescent microscopy

The highest MAR value over all time periods was achieved by the animals in the

LANd442-groups, followed by the LAE442-groups (figure 4). The latter differed

significantly both in the time period over 4 weeks from the titanium-group and from

the group without implants (p = 0.041 and p = 0.026, respectively) as well as over 8

weeks (p = 0.009 and p = 0.033, respectively). All in all, the titanium-groups showed

the lowest MAR values, apart from the time period 1 in the 4-week groups. Here the

group without implants showed the lowest mineral apposition. In the 8-week group

without implant, the MAR differed significantly between time periods 2 and 1 (p =

0.026).

Figure 4: Mineral apposition rate (in µm/d) per time period and experimental group; stated are in each

case the mean values and significances (stars), when indicated

TRAP

The highest count of the osteoclasts and Howship’s lacunae produced over the time

period of 4 weeks was attained by the LAE442-group (table 5), followed by the group

Publikation I ___________________________________________________________________

28

without implants, LANd442 and titanium. In contrast to this, in the time period over 8

weeks the descending order was LANd442, LAE442, titanium, without implants.

Comparing both time periods within the materials, the groups LAE442 and without

implants showed higher values over 4 weeks whereas LANd442 and titanium

implants activated more osteoclasts over 8 weeks (table 5). There were no significant

differences between the individual time groups. However, the titanium-group and the

group without implants differed significantly over 4 weeks from the respective 8-week

group (p = 0.043 and p = 0.029, respectively).

Table 5: Number of osteoclasts and Howship’s lacunae per implant material and time group; stated

are in each case the mean values and standard deviations, as well as significances between the time

groups of titanium (a) and the time groups without implant (b)

material 4-week group 8-week group MV 82 55 LAE442 SD 57 39 MV 42 61 LANd442 SD 20 39 MV 11a 42a Titanium SD 5 24 MV 48b 12b

without implant SD 25 5

Toluidine blue

With the help of the toluidine blue staining, it could be shown, that the cross-sections

of the tibiae in all groups exhibited cavities (figure 5), whereas less cavities were

formed over 4 weeks than over 8 weeks, apart from the titanium-groups. The extent

of the periosteal remodelling occurred in almost all groups equally with the score

value 1.0. The exceptions were both LAE442-groups and the LANd442-group over 8

weeks, which showed a stronger remodelling with 2.0 and 1.5 score points,

respectively. The parameter “endosteal remodelling” was assessed in all groups with

the score value 1.0. According to this, the periosteal formation of new bone occurred

more strongly than the endosteal formation. In the first case, the LANd442-groups

and the LAE442-group over 8 weeks demonstrated the most extensive changes,

whereas in the second case, only the LANd442-group over 8 weeks attained more

Publikation I ___________________________________________________________________

29

than 2.0 score points. Contact between bone and implant could be observed only for

both titanium-groups, however, it was strongly pronounced with 3.0 and 2.5 score

points, respectively. The same holds true for the formation of a fibrous capsule,

which was assessed with 2.0 score points each.

0

1

2

3

4

assesment of thebone structure

(cavities)

periostealremodelling

endostealremodelling

periostealformation of new

bone

endostealformation of new

bone

bone implantcontact

(trabeculae)

periimplantfibrosis

Sco

re p

oin

ts

LAE442 4 weeks

LAE442 8 weeks

LANd442 4 weeks

LANd442 8 weeks

Titanium 4 weeks

Titanium 8 weeks

without implant4 weeks

without implant8 weeks

Figure 5: Overview of the occurrence of the investigated parameters by means of with toluidine blue

stained cross-sections of the bone.

2.5 Discussion

The aim of this study was to compare the biocompatibility of two degradable

magnesium alloys with that of titanium as an established, permanent implant

material. For this purpose, two materials were employed: the material LAE442, which

has already been successfully tested over long periods of time (WITTE et al. 2005;

THOMANN et al. 2009), as well as the newly developed alloy LANd442.

Intramedullar implantation into a rabbit's tibia was selected as the animal model since

this is established for the fundamental research of biocompatibility of various

magnesium alloys (MEYER-LINDENBERG et al. 2006; THOMANN et al. 2009;

KRAUSE et al. 2010; REIFENRATH et al. 2010; HUEHNERSCHULTE et al. 2011).

Apart from implanting titanium, control tibiae were used in which the operation was

Publikation I ___________________________________________________________________

30

carried out but received no implant. This procedure has already been described in

other studies (THOMANN et al. 2010b; HUEHNERSCHULTE et al. 2011).

By means of the clinical investigations in the current study, it was possible to

establish that no differences occurred between the individual groups with regard to

the redness, swelling or peripheral augmentation. Mild subcutical emphysema

occurred in the 4-week LAE442-group as well as the 8-week LANd442-group in 2

and 4 tibiae, respectively. However, no occurrence was found in the tibiae of the

titanium-groups or the groups without implant. Since hydrogen is formed during the

degradation of magnesium (MCBRIDE 1938; WITTE et al. 2005; LI et al. 2008), it is

no surprise to discover gas bubbles during the investigations of the respective alloys.

This was also described in other studies (WITTE et al. 2005; XU et al. 2007; LI et al.

2008; ZHANG et al. 2010). Similar to the above mentioned studies, the gas bubbles

had absolutely no clinical effect on the current study.

In the 8-week LANd442-group, it was established that 2 rabbits each exhibited

lameness lasting one day. This corresponds with a previous study of LANd442, in

which the alloy was tested over a longer period of time (HAMPP et al. 2012). In that

study, a single implant degraded quicker than the other implants of the same group.

It was assumed that this was the cause of the occurring lameness. Lameness also

occurred using the unsuitable alloy LACer442 (REIFENRATH et al. 2010) since the

implants here also degraded too quickly and thereby induced pain. In the current

study, no differences could be established in the degradation behaviour of the pins,

which were implanted into the debilitated animals, compared with the other implants

in this group. It is possible that the formation of gas bubbles in the medullary cavity

leads to changed pressure ratios and therefore to short-term soreness. It may be the

case that the rabbits also received external impacts or the pain resulted from the

animal's characteristic "knocking" with their hind legs in conjunction with the existing

changes in the affected limbs. Nevertheless, lameness represents an undesirable

effect of the implanted alloy and should therefore be negatively assessed. However,

because the lameness lasts only one day, it is questionable whether this can actually

be attributable to the material or whether the totality of all the circumstances caused

the animals' pain.

Publikation I ___________________________________________________________________

31

In the current study, no greater soft-tissue reactions were established during the

clinical investigations of the LAE442 alloy than those in the groups without implant

and the titanium-groups. This corresponds to the previous studies of LAE442, where

it showed good clinical compatibility (WITTE et al. 2007a; THOMANN et al. 2009).

For all the groups, changes could be radiologically detected. The extent of the

changes is similar for all the groups, with titanium and LAE442 producing most

processes within the time period of 4 weeks whereas the LANd442-groups attained

the highest value over the 8 week time period. It is noticeable that both titanium-

groups produced changes quite late, but then to a greater extent. Besides this, even

the groups without implant also exhibited increasing curve profiles. Thus it can be

assumed that the surgical method itself has a certain influence on the bone and

leads to proliferating bone reactions. This agrees with an already existing study in

which the influence of various medullary nailing methods were investigated in rabbits

and periosteal bone regeneration was established (DANCKWARDT-LILLIESTRÖM

1969). The changes in the LANd442- and the LAE442-groups can not therefore be

attributed just to the degrading implant. The growths at the implantation site

constitute the largest contribution to the changes. This is less relevant to the

assessment of the introduced implants' biocompatibility than to assessing the

influence on the post operative healing process. The fact that the totality of changes

in the 4-week groups already occurred in the first week, whereas recognisable

changes in the 8-week groups were first seen in week 3 appears inexplicable. Such

behaviour has not previously been described in the literature. Since it is supposed to

concern the same initial material, the same behaviour in each case would be

expected. A dependency of the changes on the origin or age of the animals can be

excluded since no differences existed between the individual groups with respect to

these factors. A varying behaviour of different material charges, which can be

established using X-ray analysis, was described in a study by THOMANN (2008).

However in the current case, it concerns the same charge of each material in the

corresponding time groups. It is possible that the differing behaviour can be attributed

to a non-uniform composition of the implants within the charge used which can lead

Publikation I ___________________________________________________________________

32

to different corrosion rates (ULLMANN et al. 2011). However, this does not explain

the varying behaviour of the groups without implant.

By using the cross-sectional µCT images, gas bubbles were observable over the

entire test period in all animals carrying a magnesium implant. Here, variations were

only very slightly pronounced in each group. Other authors concluded that hydrogen

diffuses into the tissue and is therefore only visible as gas bubbles during too rapid

degradation (WITTE et al. 2007c; LI et al. 2008). In the present study, the occurrence

of gas bubbles is thus initially interpreted as more intense release of hydrogen with

which an equilibrating ratio of regeneration to resorption of the emanating gases is

associated since the total amount of gas does not increase.

Besides the formation of gas, the most pronounced change was the development of

cavities which, albeit on only a small scale, also occurred for animals without

implants. It can also be concluded from this that the implantation process produces

changes in the bone. In contrast to this, the animals without implant exhibited no

periosteal growth and only very little endosteal remodelling from week 2 to 4. On the

other hand, increasing curves exist in the LANd442- and LAE442-groups for all the

nominal parameters over the entire course of the investigation. This agrees with the

results of the investigations using LAE442 over 6 weeks (WITTE et al. 2005) as well

as the alloys LACer442 and MgCa0.8 over longer periods (REIFENRATH et al. 2010;

THOMANN et al. 2010a), which also reported periosteal bone reactions in the form of

bone growth. It is concluded from this that the osseous changes in this and in the

mentioned studies can be attributed to degradation induced influences of the

magnesium implants, which are considered to be unavoidable. The contact between

bone and implant appears to be only very slightly pronounced in the selected cross-

sectional images. From week 2, both groups were assessed with an average value of

0.1 scoring points over 4 weeks. The LANd442-group developed no trabecula over 8

weeks, whereas the LAE442-group attained an average maximum value of 0.3

scoring points over 8 weeks. This is contrary to a study of LAE442 by WITTE et al.

(2005), in which bulk trabecula formation was described in guinea pigs’ femurs after

6 weeks. In the current case, it is possible that the remodelling processes in the

endosteal region lead to reduced bone regeneration in the implant direction.

Publikation I ___________________________________________________________________

33

The relationships in the three dimensional evaluation of the in vivo µCT-scans are

represented more clearly than those in the two dimensional assessment. The fall in

the bone density for the LANd442- and the LAE442-groups can, on the one hand, be

attributed to the formation of cavities, which were already seen in the 2D cross-

sectional images. On the other hand, the drop in density could be due to

regeneration of bone in the periosteal region. According to a study by FUCHS et al.

(2008), 67% of the new bone is mineralised in rabbits after 18 days. However,

complete mineralisation only exists after 12 months. Thus, at the time of the current

investigation, the bone could not be completely mineralised and therefore exhibits a

lower density. In contrast to this, titanium induced less cavitation but significantly

increased contiguous bone growth at the implant which forms a ring of bone. These

bone braces are macroscopically denser than the periosteal bone tissue regenerated

in, for example, LANd442 and could thereby produce an increase in the bone

density.

The development of bone volume is to be seen in direct relationship to the density

changes. The increasing volume in the magnesium alloy groups, as well as that in

the titanium-group over 8 weeks, can also be attributed to the partially unrestricted

regenerated bone tissue which, for the magnesium implants, mainly occurs

periosteally and for titanium implants as peri-implant bone braces. These

observations agree with a study of WITTE et al. (2005) who have described both

periosteal as well as endosteal regenerated bone in magnesium alloys after 6 and 18

weeks in which the additional periosteal growth was significantly stronger. The

titanium-group in the current study represents an exception to this observation over 4

weeks. This group exhibits a decrease in volume between week 3 and 4. It is

possible that this observation is due to intrinsic features of the depicted µCT scan. As

already described, titanium absorbs more X-rays than bone which impedes

differentiating the implant from the bone (BERNHARDT et al. 2004) and possibly

leads to errors in the computation. Apart from the slight rise in density already

mentioned, this group shows an almost constant volume up to the 3rd week with a

slightly increasing trend.

Publikation I ___________________________________________________________________

34

The changes in the bone porosity, which can, on the whole, be referred to as very

small, can be accounted for by the factors already mentioned. This is, on the one

hand, the increasing formation of cavities, which, on the other hand, is

simultaneously balanced by the regenerated bone which is still cavity-free. This is

most significant during observations of the titanium-group, which, as already

mentioned, was only subjected to low cavitation but induced the formation of a bulk

ring of bone. Unrestricted implant-bone contact is interpreted by other authors as a

sign of good biocompatibility (WITTE et al. 2006). Since this regenerated bone

around the implant is depicted in the µCT as very dense, thus balancing the

formation of cavities, this behaviour leads on the whole to a drop in porosity.

In comparison within the two groups, the groups without implant exhibited contrary

behaviour regarding the density and volume curves and showed almost no changes

in the bone porosity. It can be concluded from this that certain changes within these

parameters are physiological and in turn not all of the changes are, in each case,

attributable to the introduced implant. However, the implants presumably reinforce

the processes of bone reconstruction since these are more pronouncedly depicted

for the rabbits with implants than in the groups without implant.

The ex vivo µCT-investigations confirmed the results of the in vivo investigations

inasmuch that the parameters cavity formation and additional periosteal formation

appeared strongly pronounced. The fact that the assessment of the bone-implant

contact differs from the in vivo investigation can be explained by the higher resolution

of the equipment used for the ex vivo investigations enabling a better ability both to

recognise structural details and also to assess the titanium implants.

The implants were almost unchanged at the end of the testing period which was to

be expected for the non-degradable titanium material. Only the LANd442-group

demonstrated low levels of degradation phenomena over the 8 weeks. However,

SEITZ et al. (2011) described the complete corrosion of LANd442 implants having

the same geometry in one in vitro test after 18 days. Here, various studies appear to

be confirmed which report that in vitro test results do not directly reflect the in vivo

behaviour of materials (WITTE et al. 2006; HUANG et al. 2007; ZHANG et al. 2010).

Publikation I ___________________________________________________________________

35

Although WITTE et al. (2010) reported significant in vivo corrosion of cylindrical

LAE442 implants after only 2 weeks.

However, Witte's implants' were, on the one hand, smaller than those used in the

present study and, on the other hand, were not intramedullarily introduced into the

rabbit's tibia but into the femoral condyle. This could explain the degradation

behaviour deviating from the present and the other investigations (THOMANN et al.

2009; KRAUSE et al. 2010). In the current case, both magnesium alloys exhibit a

promise of slow degradation which is desirable for use as osteosynthetic materials

(ATRENS et al. 2011).

By means of fluorescent microscopy, it is shown that LANd442 implants induce the

highest MAR at all points in time. This in turn confirms that bulk remodelling

processes are active in the corresponding tibiae. LAE442 also produces a high MAR,

which was significantly higher in each of the initial time intervals of the test period

than those of the titanium-groups and the animals without implant. The result that

LANd442 does not significantly differ from the other groups can be attributed to a

higher standard deviation. Besides this, it is noticeable that, for both magnesium

alloys, the MAR was larger in each of the initial time intervals than that found in the

second time interval of the test period. This corresponds with the investigation of

WITTE et al. (2007b), which also recorded falling MAR values due to the AZ91

magnesium alloy. In contrast to this, the titanium implants used in the current study

induced a relatively low increasing MAR in the curve. The low MAR values can be

explained by the bone's marked trabecula formation since little additional periosteal

but much endosteal bone was developed and the MAR was determined on the

periosteal bone. The groups without implant behaved differently but demonstrated

almost always a higher MAR than the titanium-groups. Since the cyclic remodelling

processes in the cortical bone are physiological (BALA et al. 2010), this could

indicate that titanium implants diminish the bone's natural restructuring processes in

favour of more marked trabecula formation. This would correspond to the

VOGGENREITER’s et al. (2003) assessment that titanium is not biologically inert as

has been long assumed.

Publikation I ___________________________________________________________________

36

On the other hand, the magnesium implants showed, on the whole, the most

osteoclasts in the TRAP stained histological sections in which, as a direct

comparison, more osteoclasts were counted in the group without implant over 4

weeks than in the corresponding LANd442-group. On comparing the osteoclasts'

count with the density values, which were determined using the µCT computation, it

was possible to establish a relationship since a more marked decrease in density

accompanied a higher number of osteoclasts. The single exception to this rule was

the titanium-group whose density was, as already described, subjected to an

increase despite the high osteoclast activity. This can in turn be attributable to the

formation of a bulk ring of bone around the implant in which no osteoclasts were

found and which balances or exceeds the processes in the original bone.

The results of the evaluated toluidine blue stained bone sections also confirmed the

in vivo results. Agreeing with observations from the µCT analysis, more additional

bone tissue was formed periosteally than endosteally and the bone cross-sections in

all the groups are pervaded by cavities. However, it was only possible to see contact

between bone and implant in the titanium-groups and not in the LAE442 or the

LANd442 implants, in which the latter still showed incipient trabecula formation in the

µCT. Since the contact there is also only represented as minimally pronounced, it is

assumed that the evaluated histological sections originate from other localisations at

which no trabecula had formed. In addition to this, a moderate fibrous capsule was

seen around the titanium implants by means of the histological evaluation. However,

this was not seen around the magnesium implants. One such capsule, which

separated the untreated titanium implant from the newly generated bone, was also

described by YAN et al. (1997). Whereas VAN DER POL et al. (2010) considered the

existence of fibrous tissue as unfavourable in a study of bone replacement materials,

various other authors assume that a fibrous capsule around the implant will

eventually be replaced by bone (YAN et al. 1997; WITTE et al. 2007c). This

assumption supports the results of the current study since the formation of new bone

was also only observed around the titanium implants. According to VAN DER POL et

al. (2010), the fibrous capsule around the titanium would, however, argue for a poor

biocompatibility of the introduced implant. In contrast to the current investigation,

Publikation I ___________________________________________________________________

37

magnesium implants, which are surrounded by newly generated bone, were also

observed in previous studies after various time periods (WITTE et al. 2006; XU et al.

2007; ZHANG et al. 2009; ZHANG et al. 2010), sometimes even to a larger extent

than a titanium implant used as a control (LI et al. 2008; CASTELLANI et al. 2011).

Although it must be taken into consideration that, in these studies, the implantation

was performed in the femur and, with the exception of ZHANG et al. (2010), all the

authors selected an animal model other than the rabbit. This could explain the

different growth behaviour. In addition to this, all the studies mentioned above lasted

for a time period of at least 9 weeks. Thus it can not be excluded that bone trabecula

would also have eventually formed in the current investigation.

2.6 Conclusions

The present study showed that, in principle, both tested magnesium alloys were well

tolerated. Alterations, detectable by means of imaging and histological procedures,

appeared mainly in terms of periosteal formation of newly built bone. However, it

could also be shown that in an identical experimental set-up, the material titanium,

which is long established and in clinical use, also exerts bulk influences on the

surrounding bone. Given that titanium is frequently employed as an established

implant material, the potential degree of bone changes in clinical applications seems

to be negligible. For this reason, an absence of effects on the bone should not also

be expected from magnesium based alloys. In addition to this, the animals, which

were only subjected to the surgery but received no implant in the current study, also

showed active bone remodelling processes. Hence, it is assumed that by merely

manipulating of the bone under surgical conditions leads to cell activation and

remodelling processes and can thus not be assessed as an exclusive effect of the

implant material. However, despite these observations for the two tested magnesium

alloys, LAE442 seems to be the more qualified alloy since it demonstrated better

clinical tolerance.

Publikation I ___________________________________________________________________

38

2.7 Acknowledgements

All the work for this study was carried out within the collaborative research centre 599

‘‘Sustainable bioresorbable and permanent implants of metallic and ceramic

materials’’, which is funded by the German Research Foundation (DFG).

The authors would like to thank Melanie Dahms-Büttner, Melanie Kielhorn and Diana

Strauch for excellent technical support.

Publikation I ___________________________________________________________________

39

2.8 References ATRENS, A., M. LIU a. N. I. ZAINAL ABIDIN (2011): Corrosion mechanism applicable to biodegradable magnesium implants. Materials Science and Engineering B 176, 1609-1636 BALA, Y., D. FARLAY, P. D. DELMAS, P. J. MEUNIER a. G. BOIVIN (2010): Time sequence of secondary mineralization and microhardness in cortical and cancellous bone from ewes. Bone 46, 1204-1212 BERNHARDT, R., D. SCHARNWEBER, B. MÜLLER, P. THURNER, H. SCHLIEPHAKE, P. WYSS, F. BECKMANN, J. GOEBBELS a. H. WORCH (2004): Comparison of microfocus- and synchrotron X-ray tomography for the analysis of osteointegration around Ti6Al4V implants. Eur Cell Mater 7, 42-51 CASTELLANI, C., R. A. LINDTNER, P. HAUSBRANDT, E. TSCHEGG, S. E. STANZL-TSCHEGG, G. ZANONI, S. BECK a. A.-M. WEINBERG (2011): Bone-implant interface strength and osseointegration: Biodegradable magnesium alloy versus standard titanium control. Acta Biomater 7, 432-440 DANCKWARDT-LILLIESTRÖM, G. (1969): Reaming of the medullary cavity and its effect on diaphyseal bone. A fluorochromic, microangiographic and histologic study on the rabbit tibia and dog femur. Acta Orthop Scand Suppl, 1-153 DISEGI, J. A. a. L. ESCHBACH (2000): Stainless steel in bone surgery. Injury 31, 2-6 DONATH, K. (1988): Die Trenn-Dünnschliff-Technik zur Herstellung histologischer Präparate von nicht schneidbaren Geweben und Materialien. Präparator 34, 197-206 FERRARIS, S., S. SPRIANO, G. PAN, A. VENTURELLO, C. L. BIANCHI, R. CHIESA, M. G. FAGA, G. MAINA a. E. VERNÈ (2011): Surface modification of Ti-6Al-4V alloy for biomineralization and specific biological response: Part I, inorganic modification. J Mater Sci Mater Med 22, 533-545

Publikation I ___________________________________________________________________

40

FUCHS, R. K., M. R. ALLEN, M. E. RUPPEL, T. DIAB, R. J. PHIPPS, L. M. MILLER a. D. B. BURR (2008): In situ examination of the time-course for secondary mineralization of Haversian bone using synchrotron Fourier transform infrared microspectroscopy. Matrix Biol. 27, 34-41 HAMPP, C., B. ULLMANN, J. REIFENRATH, N. ANGRISANI, D. DZIUBA, D. BORMANN, J.-M. SEITZ a. A. MEYER-LINDENBERG (2011): Research on the biocompatibility of the new magnesium alloy LANd442 - an in vivo study in the rabbit tibia over 26 weeks. Adv. Eng. Mater 14, B28–B37 HORT, N., Y. HUANG, D. FECHNER, M. STÖRMER, C. BLAWERT, F. WITTE, C. VOGT, H. DRÜCKER, R. WILLUMEIT, K. U. KAINER a. F. FEYERABEND (2009): Magnesium alloys as implant materials - Principles of property design for Mg-RE alloys. Acta Biomater 6, 1714-1725 HUANG, J., Y. REN, Y. JIANG, B. ZHANG a. K. YANG (2007): In vivo study of degradable magnesium and magnesium alloy as bone implant. Front. Mater. Sci. China 1, 405-409 HUEHNERSCHULTE, T. A., N. ANGRISANI, D. RITTERSHAUS, D. BORMANN, H. WINDHAGEN a. A. MEYER-LINDENBERG (2011): In vivo corrosion of two novel magnesium alloys ZEK100 and AX30 and their mechanical suitability as biodegradable implants. Materials 4, 1144-1167 JAIMES, R. F., M. L. AFONSO, S. O. ROGERO, S. M. AGOSTINHO a. C. A. BARBOSA (2010): New material for orthopedic implants: Electrochemical study of nickel free P558 stainless steel in minimum essential medium. Materials Letters 64, 1476-1479 KERÄNEN, P., N. MORITZ, J. J. ALM, H. YLÄNEN, B. KOMMONEN a. H. T. ARO (2011): Bioactive glass microspheres as osteopromotive inlays in macrotextured surfaces of Ti and CoCr alloy bone implants: trapezoidal surface grooves without inlay most efficient in resisting torsional forces. J Mech Behav Biomed Mater 4, 1483-1491 KIM, W. C., J. G. KIM, J. Y. LEE a. H. K. SEOK (2008): Influence of Ca on the corrosion properties of magnesium for biomaterials. Materials Letters 62, 4146-4148

Publikation I ___________________________________________________________________

41

KRAUSE, A., N. VON DER HÖH, D. BORMANN, C. KRAUSE, F.-W. BACH, H. WINDHAGEN a. A. MEYER-LINDENBERG (2010): Degradation behaviour and mechanical properties of magnesium implants in rabbit tibiae. J Mater Sci 45, 624-632 LALK, M., J. REIFENRATH, D. RITTERSHAUS, D. BORMANN a. A. MEYER-LINDENBERG (2010): Biocompatibility and degradation behaviour of degradable magnesium sponges coated with bioglass - method establishment within the framework of a pilot study. Mat Sci Eng Tech (Materials Science and Engineering Technology) 41, 1025-1034 LI, Z., X. GU, S. LOU a. Y. ZHENG (2008): The development of binary Mg-Ca alloys for use as biodegradable materials within bone. Biomaterials 29, 1329-1344 LICHTE, P., H. C. PAPE, T. PUFE, P. KOBBE a. H. FISCHER (2011): Scaffolds for bone healing: concepts, materials and evidence. Injury 42, 569-573 LINDUNGER, A., C. A. MACKAY, B. EK-RYLANDER, G. ANDERSSON a. S. C. MARKS (1990): Histochemistry and biochemistry of tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and tartrate-resistant acid adenosine triphosphatase (TrATPase) in bone, bone marrow and spleen: implications for osteoclast ontogeny. Bone Miner 10, 109-119 MCBRIDE, E. D. (1938): Absorbable Metal in Bone Surgery. J Am Med Assoc 111, 2464-2467 MEYER-LINDENBERG, A., D. BORMANN, H. WINDHAGEN, C. HACKENBROICH a. A. KRAUSE (2006): Changes of the surfaces of different magnesium alloys as degradable implants during degradation in rabbit tibiae. Biomaterialien 7, 92 MINGXING, W., Z. HONG a. W. LIN (2007): Effect of Yttrium and Cerium addition on microstructure and mechanical properties of AM50 magnesium alloy. Journal of Rare Earths 25, 233-237 MORDIKE, B. L. (2002): Creep-resistant magnesium alloys. Materials Science and Engineering A, 103-112

Publikation I ___________________________________________________________________

42

MOSTAFA, Y. A., R. A. MEYER a. R. LATORRACA (1982): A simple and rapid method for osteoclast identification using a histochemical method for acid phosphatase. Histochem J 14, 409-413 PARFITT, A. M. (1987): Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols and units. Summary of proposed system. Bone Miner 2, 595-610 POHLER, O. E. M. (2000): Unalloyed titanium for implants in bone surgery. Injury 31, 7-13 RAHN, B. (1976): Die polychrome Sequenzmarkierung des Knochens. Nova Acta Leopoldina 44, 249-255 REIFENRATH, J., A. KRAUSE, D. BORMANN, B. VON RECHENBERG, H. WINDHAGEN a. A. MEYER-LINDENBERG (2010): Profound differences in the in-vivo-degradation and biocompatibility of two very similar rare-earth containing Mg-alloys in a rabbit model. Mat.-wiss. u. Werkstofftech. 41, 1054-1061 REIFENRATH, J., D. BORMANN a. A. MEYER-LINDENBERG (2011): Magnesium alloys as promising degradable implant materials in orthopaedic research in: CZERWINSKI, F. (Hrsg.): Magnesium Alloys - Corrosion and Surface Treatments, InTech Publisher, Ukraine, 93-108 SARIS, N. E., E. MERVAALA, H. KARPPANEN, J. A. KHAWAJA a. A. LEWENSTAM (2000): Magnesium. An update on physiological, clinical and analytical aspects. Clin Chim Acta 294, 1-26 SEALY, M. P. a. Y. B. GUO (2010): Surface integrity and process mechanics of laser shock peening of novel biodegradable magnesium-calcium (Mg-Ca) alloy. J Mech Behav Biomed Mater 3, 488-496 SEITZ, J.-M., K. COLLIER, E. WULF, D. BORMANN a. F.-W. BACH (2011): Comparison of the corrosion behavior of coated and uncoated magnesium alloys in an in vitro corrosion environment. Advanced Biomaterials 13, 313-323

Publikation I ___________________________________________________________________

43

STAIGER, M. P., A. M. PIETAK, J. HUADMAI a. G. DIAS (2006): Magnesium and its alloys as orthopedic biomaterials: a review. Biomaterials 27, 1728-1734 THOMANN, M., C. KRAUSE, D. BORMANN, N. VON DER HÖH, H. WINDHAGEN a. A. MEYER-LINDENBERG (2009): Comparison of the resorbable magnesium alloys LAE442 und MgCa0.8 concerning their mechanical properties, their progress of degradation and the bone-implant-contact after 12 months implantation duration in a rabbit model. Mat Sci Eng Tech 40, 82-87 THOMANN, M. (2008): Untersuchungen zur Degradation und Biokompatibilität von intramedullären Implantaten auf Magnesiumbasis im Kaninchenmodell: Prüfung der Degradation im Langzeitversuch und Untersuchung des Einflusses einer Fluoridbeschichtung. Hannover, Stiftung Tierärztliche Hochschule, Klinik für Kleintiere, Diss. THOMANN, M., C. KRAUSE, N. ANGRISANI, D. BORMANN, T. HASSEL, H. WINDHAGEN a. A. MEYER-LINDENBERG (2010a): Influence of a magnesium-fluoride coating of magnesium-based implants (MgCa0.8) on degradation in a rabbit model. J Biomed Mater Res A 93, 1609-1619 THOMANN, M., VON DER HOEH N., D. BORMANN, D. RITTERSHAUS, C. KRAUSE, H. WINDHAGEN a. A. MEYER-LINDENBERG (2010b): Comparison of the cross sectional area, the loss in volume and the mechanical properties of LAE442 and MgCa0.8 as resorbable magnesium alloy implants after 12 months implantation duration. Mater Sci Forum (Materials Science Forum) 638-642, 675-680 ULLMANN, B., J. REIFENRATH, D. DZIUBA, J.-M. SEITZ, D. BORMANN a. A. MEYER-LINDENBERG (2011): In vivo degradation behaviour of the new magnesium alloy LANd442 in rabbit tibiae. Materials 4, 2197-2218 VAN DER POL, U., L. MATHIEU, S. ZEITER, P.-E. BOURBAN, P.-Y. ZAMBELLI, S. G. PEARCE, L. P. BOURÉ a. D. P. PIOLETTI (2010): Augmentation of bone defect healing using a new biocomposite scaffold: an in vivo study in sheep. Acta Biomater 6, 3755-3762 VOGGENREITER, G., S. LEITING, H. BRAUER, P. LEITING, M. MAJETSCHAK, M. BARDENHEUER a. U. OBERTACKE (2003): Immuno-inflammatory tissue reaction to stainless-steel and titanium plates used for internal fixation of long bones. Biomaterials 24, 247-254

Publikation I ___________________________________________________________________

44

WITTE, F., I. ABELN, E. SWITZER, V. KAESE, A. MEYER-LINDENBERG a. H. WINDHAGEN (2007a): Evaluation of the skin sensitizing potential of biodegradable magnesium alloys. J Biomed Mater Res A 86, 1041-1047 WITTE, F., J. FISCHER, J. NELLESEN, H. A. CROSTACK, V. KAESE, A. PISCH, F. BECKMANN a. H. WINDHAGEN (2006): In vitro and in vivo corrosion measurements of magnesium alloys. Biomaterials 27, 1013-1018 WITTE, F., J. FISCHER, J. NELLESEN, C. VOGT, J. VOGT, T. DONATH a. F. BECKMANN (2010): In vivo corrosion and corrosion protection of magnesium alloy LAE442. Acta Biomater 6, 1792-1799 WITTE, F., V. KAESE, H. HAFERKAMP, E. SWITZER, A. MEYER-LINDENBERG, C. J. WIRTH a. H. WINDHAGEN (2005): In vivo corrosion of four magnesium alloys and the associated bone response. Biomaterials 26, 3557-3563 WITTE, F., H. ULRICH, C. PALM a. E. WILLBOLD (2007b): Biodegradable magnesium scaffolds: Part II: Peri-implant bone remodeling. J Biomed Mater Res A 81, 757-765 WITTE, F., H. ULRICH, M. RUDERT a. E. WILLBOLD (2007c): Biodegradable magnesium scaffolds: Part 1: appropriate inflammatory response. J Biomed Mater Res A 81, 748-756 XU, L., G. YU, E. ZHANG, F. PAN a. K. YANG (2007): In vivo corrosion behavior of Mg-Mn-Zn alloy for bone implant application. J Biomed Mater Res A 83, 703-711 YAN, W. Q., T. NAKAMURA, M. KOBAYASHI, H. M. KIM, F. MIYAJI a. T. KOKUBO (1997): Bonding of chemically treated titanium implants to bone. J Biomed Mater Res 37, 267-275 ZHANG, E., L. XU, G. YU, F. PAN a. K. YANG (2009): In vivo evaluation of biodegradable magnesium alloy bone implant in the first 6 months implantation. J Biomed Mater Res A 90, 882-893 ZHANG, S., X. ZHANG, C. ZHAO, J. LI, Y. SONG, C. XIE, H. TAO, Y. ZHANG, Y. HE, Y. JIANG a. Y. BIAN (2010): Research on an Mg-Zn alloy as a degradable biomaterial. Acta Biomater 6, 626-640

Publikation II ___________________________________________________________________

45

3 Publikation II

Research on the biocompatibility of the new magnesium alloy

LANd442 – an in vivo study in the rabbit tibia over 26 weeks

Carolin Hampp, Janin Reifenrath, Nina Angrisani, Dina Dziuba, Dirk Bormann,

Jan-Marten Seitz, Andrea Meyer-Lindenberg

Advanced Engineering Materials 2012

Volume 14, Issue 3, Pages: B28–B37

doi: 10.1002/adem.201180066

Publikation II ___________________________________________________________________

46

3.1 Abstract

Research on magnesium based, degradable implant materials has finally obtained

success in the field of orthopaedics. Based on the previous good results with LAE442

magnesium alloy, the new LANd442 alloy was developed for the current study. In

doing this, the single element neodymium replaces the rare earth compound. The

primary objective of this study is to assess the biocompatibility of the new alloy using

cylindrical implants in the rabbit model. During a 26 week testing period, the animals

were investigated using clinical, radiological as well as in vivo µ-computed

tomographic techniques. Following euthanasia, histological (toluidine blue and TRAP

staining), fluorescent microscopy and µ-computed tomographic investigations were

carried out. Clinically, it can be observed that additional bone forms at the implant's

location and small amounts of subcutaneous gas accumulate. Radiological

investigations show brightening of the medullary cavity as well as thickening in the

region of the diaphysis. The µ-computed tomographies reveal a reduction in the bone

density from 1226.31 mg HA/ccm to 1192.95 mg HA/ccm together with increases in

bone porosity from 4.55% to 6.6% and bone volume from 1.51 mm³/slice to 2.06

mm³/slice. By means of fluorochrome sequential marking, the determined mineral

apposition rates lie between day 93 and day 120 at 3.58 µm/d and between day 120

and day 179 at 2.25 µm/d. Elevated remodelling processes in the bone are

histologically confirmed due to the periosteal and endosteal growths as well as an

increased appearance of osteoclasts.

Owing to the established considerable bone remodelling processes following

intramedullary implantation, LANd442 appears to be a less suitable degradable

implant material for cortical bone applications.

Diskussion ___________________________________________________________________

47

4 Diskussion

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Biokompatibilität der bereits als

vielversprechend beschriebenen Magnesiumbasislegierung LAE442 (WITTE et al.

2005; THOMANN et al. 2009) und der neu entwickelten Legierung LANd442 unter

Berücksichtigung der Degradation beider Materialien zu vergleichen. Als

Kontrollgruppen dienten zum einen Tiere, die Titanimplantate (Ti6Al4V-ELI) erhielten,

zum anderen wurden Sham-Tiere ohne Implantat einbezogen. Für diese

Untersuchungen wurde ein Kaninchenmodell gewählt, da es für

Biokompatibilitätsstudien von Magnesiumimplantaten etabliert ist (THOMANN et al.

2009; KRAUSE et al. 2010; REIFENRATH et al. 2010; HUEHNERSCHULTE et al.

2011) und sich durch Anwenden des gleichen Versuchsaufbaus zudem eine gute

Vergleichbarkeit mit den genannten Studien bot.

Die Biokompatibilität der Legierungen wurde im Versuchsverlauf mittels klinischer

Untersuchung der Tiere sowie bildgebender Verfahren (Röntgen, in vivo µCT) und

histologischer Methoden (Fluoreszenzmikroskopie und TRAP- sowie

Toluidinblaufärbung an Trenndünnschliffen) beurteilt. Um als degradables

Osteosynthesematerial in Betracht gezogen zu werden, muss ein Implantat die

Voraussetzung der uneingeschränkten Biokompatibilität besitzen und es darf zu

keinerlei Schädigung des Organismus führen (WITTE et al. 2004). Hierbei ist es

wichtig, ein Material über einen zeitlichen Verlauf von mehreren Monaten zu

untersuchen, wie es dem Einsatz in der orthopädischen Chirurgie entspricht

(VOGGENREITER et al. 2003). Ebenso aufschlussreich sind jedoch auch die Tage

bzw. Wochen direkt nach der Implantation, in denen sich die potentiell auftretenden

initialen Veränderungen des umgebenden Gewebes durch das eingebrachte

Implantat beobachten lassen (WITTE et al. 2010; KRAUS et al. 2012).

Als Versuchszeiträume wurden in der vorliegenden Untersuchung daher Perioden

von vier und acht Wochen gewählt, die es erlaubten, sowohl Eintreten als auch

Ausmaß der kurz nach der Implantation stattfindenden Prozesse des Knochens zu

beurteilen. Aufgrund des Umstands, dass bezüglich der neu entwickelten Legierung

LANd442 keinerlei Untersuchungsergebnisse vorhanden sind, wurde für dieses

Diskussion ___________________________________________________________________

48

Material ein weiterer Untersuchungszeitraum von sechs Monaten gewählt. Dies sollte

eine umfassendere Beurteilung bezüglich der Eignung von LANd442 im Bereich der

Osteosynthese ermöglichen, da die im Knochen stattfindenden Prozesse und die

Auswirkungen des Materials auf das umgebende Gewebe über eine längere Dauer

beobachtet werden können. LAE442, das in der vorliegenden Untersuchung als

resorbierbares Vergleichsmaterial diente, wurde hingegen bereits mit dem gleichen

Studiendesign über Zeiträume von drei und sechs (KRAUSE 2008) bzw. neun und

zwölf Monate (THOMANN 2008) untersucht, weshalb für die eigene Studie auf eine

erneute Implantation des Vergleichsmaterials LAE442 über sechs Monate verzichtet

wurde.

Bei den eigenen Kurzgruppen und der LANd442-6-Monatsgruppe zeigten sich in der

klinischen Untersuchung kaum Unterschiede bezüglich der Auswirkungen der

Implantatmaterialien auf Magnesiumbasis im Vergleich zu den Leertibiae und den

Tibiae mit Titanimplantaten. Alle Tiere zeigten Rötungen, Schwellungen und derbe

Umfangsvermehrungen an der Implantationsstelle. Diese Veränderungen

entsprachen in ihrem Ausmaß denen anderer Studien über die

Magnesiumlegierungen AX30, ZEK100, MgF und LAE442 (KRAUSE et al. 2010;

THOMANN et al. 2010; HUEHNERSCHULTE et al. 2011). Eine subkutane

Gasbildung an der Implantationsstelle trat lediglich bei sechs Tibiae der LANd442-

Gruppen zwischen der ersten und der zwölften Woche und zwei Tibiae der LAE442-

4-Wochengruppe innerhalb der ersten 16 Tage in Form leichter Gasblasen und

Emphyseme auf. Da Magnesium unter Wasserstoffbildung degradiert (LAMBOTTE

1932; TROITSKII a. TSITRIN 1944; WITTE et al. 2005; STAIGER et al. 2006), stellt

das Auftreten von Gasblasen keine Seltenheit dar, sondern wurde in zahlreichen

Studien, in denen die Magnesiumimplantate teilweise in Kontakt mit Weichgewebe

standen, bereits beschrieben (WITTE et al. 2007b; XU et al. 2007; LI et al. 2008; von

der HÖH et al. 2009; ZHANG et al. 2010; ERDMANN et al. 2011). Diese Studien

stimmen jedoch in ihrer Aussage überein, dass die Gasbildung unabhängig von

ihrem Ausmaß keine klinischen Beeinträchtigungen verursachte. In der vorliegenden

Arbeit konnte diese Beobachtung bestätigt werden.

Diskussion ___________________________________________________________________

49

Allerdings wurden klinisch in der vorliegenden Studie bei drei Kaninchen der

LANd442-Gruppen (8-Wochengruppe: n = 2; 6-Monatsgruppe: n = 1) Lahmheiten

festgestellt. Dieses wurde in bisherigen Untersuchungen nur für die Legierung

LACer442 berichtet, die sehr schnell degradierte und insgesamt als nicht

biokompatibel beurteilt wurde (REIFENRATH et al. 2010). Lahmheiten stellen

insgesamt einen unerwünschten Effekt dar und in der vorliegenden Arbeit könnte in

Erwägung gezogen werden, dass das eingebrachte Implantat die

lahmheitsauslösenden Schmerzen verursachte. Da im vorliegenden Fall in der 8-

Wochengruppe aber keine Unterschiede zwischen den Implantaten der

schmerzhaften Gliedmaßen und den übrigen Implantaten derselben Gruppe

festgestellt werden konnten und die Lahmheiten mit nur einem Tag sehr kurz

andauerten, können auch andere Ursachen wie zum Beispiel eine Distorsion beim

Freilauf in Betracht gezogen werden. In der 6-Monatsgruppe machte das Ausmaß

der Lahmheit des betroffenen Kaninchens dagegen eine medikamentöse

Behandlung über mehrere Tage erforderlich. Das Auftreten dieser Lahmheit

entsprach der Beobachtung von REIFENRATH et al. (2010) dahingehend, dass das

eingebrachte LANd442-Implantat wesentlich schneller degradierte als die übrigen

Implantate derselben Gruppe. Die Ursache für dieses unterschiedliche Verhalten ist

unklar. Möglicherweise stammte das entsprechende Implantat aus einer anderen

Lokalisation des im Herstellungsprozess verwendeten Stranges, da schon kleinste

Veränderungen in der Implantatzusammensetzung das Degradationsverhalten

beeinflussen können (SONG a. ATRENS 1999; ULLMANN et al. 2011).

Ebenso wie in der klinischen Untersuchung konnten bei den 4- und 8-

Wochengruppen auch röntgenologisch bei allen Versuchsgruppen Veränderungen

festgestellt werden, wobei deren Ausprägung zwischen den einzelnen Gruppen

ähnlich war. Zubildungen an der Implantationsstelle, die bei allen Gruppen

festgestellt wurden, sind zu vernachlässigen, da sie auf die Operationsmethode

zurückzuführen sind. Den größten Anteil an Veränderungen im diaphysären

Implantatbereich machten bei den LANd442-Gruppen über vier und acht Wochen

sowie den LAE442- bzw. Leertibiae-8-Wochengruppen periphere Zubildungen an der

Diaphyse aus, gefolgt von Aufhellungen in der Markhöhle. Zu der in der klinischen

Diskussion ___________________________________________________________________

50

Untersuchung beobachteten Bildung von subkutanen Emphysemen konnte dagegen

keine Entsprechung festgestellt werden. Es traten stattdessen an jeweils einer Tibia

in der LANd442-Gruppe über vier Wochen sowie in beiden LAE442-Gruppen und an

zwei Tibiae der LANd442-6-Monatsgruppe kleine Gasansammlungen an der

Implantationsstelle auf. Diese wurden jedoch zu Zeitpunkten festgestellt, die nicht

denen der subkutanen Emphyseme aus der klinischen Untersuchung entsprachen,

meist gegen Ende des Untersuchungszeitraums. Bei der LAE442- sowie der Titan-4-

Wochengruppe war die Verdickung der Kortikalis am stärksten ausgeprägt. Die

Titan-8-Wochengruppe zeigte keine Veränderungen. Insgesamt unterlagen die Tiere

der LANd442-Gruppen den massivsten Veränderungen vor LAE442, den Leertibiae

und Titan. In der LANd442-6-Monatsgruppe stellten Zubildungen an der Diaphyse

und periimplantäre Aufhellungen der Markhöhle die beiden am stärksten

ausgebildeten Parameter dar. Die Zubildungen an der Diaphyse und Aufhellungen

der Markhöhle sind als direkte Reaktionen auf das eingebrachte Implantat zu

interpretieren (THOMANN 2008). Diese Ergebnisse entsprechen der Arbeit von

KRAUSE (2008), die bei der Legierung LAE442 nach sechs Monaten ebenfalls

Zubildungen an der Diaphyse beobachtete. In einem Untersuchungszeitraum von

zwölf Monaten konnte THOMANN (2008) an einer Tibia diesen Befund bestätigen,

zudem zeigten in der genannten Arbeit acht von neun untersuchten Tibiae

periimplantäre Aufhellung der Markhöhle, wie sie in der vorliegenden Studie

ebenfalls gesehen wurden.

Bestätigt wurden die auftretenden röntgenologisch sichtbaren Veränderungen

zunächst durch die zweidimensionale Auswertung der in vivo µCT-Scans, wo sie

weiter differenziert werden konnten. Die Titan-Gruppen wurden jedoch von der

zweidimensionalen Auswertung der µCT-Untersuchungen ausgeschlossen, da der

Implantat-Knochen-Kontakt in den Schnittbildern durch das Titan überstrahlt und

nicht zu beurteilen war. Bei allen Tibiae mit Magnesiumimplantat war, unabhängig

von der Legierung und der Implantationsdauer, die Bildung von sowohl diffus

auftretendem Gas als auch von abgrenzbaren Gaskavernen in der Markhöhle der

Tiere über die gesamten Versuchszeiträume erkennbar, womit die anhand der

Röntgenbilder festgestellten periimplantären Aufhellungen der Markhöhle erklärt

Diskussion ___________________________________________________________________

51

werden könnten. In der LANd442-4-Wochengruppe bildete sich dabei das meiste

Gas, während die Gasmengen bei den 8-Wochengruppen der beiden

Magnesiumlegierungen nahezu gleich groß und die der LAE442-4-Wochengruppe

am geringsten waren. Schwankungen im Ausmaß des vorhandenen Gases waren in

jeder Gruppe nur sehr gering ausgeprägt. Auch KRAUSE (2008) stellte mittels µCT –

allerdings nicht in vivo, sondern post mortal – periimplantäre Aufhellungen fest und

vermutete in der Markhöhle eingeschlossene Gasblasen als Ursache. In anderen

Studien wurde geschlussfolgert, dass die Bildung von sichtbaren Gasblasen in der

Muskulatur oder subkutan nur bei zu schnell degradierenden Legierungen

beobachtet werden kann (WITTE et al. 2007b; LI et al. 2008; REIFENRATH et al.

2010). In der vorliegenden Studie wurde aufgrund der klinisch kaum sichtbaren

Gasbildung ebenfalls vermutet, dass zwar Gas gebildet wird, aber ein

ausgeglichenes Verhältnis von Bildung und Resorption des entstehenden Gases

besteht.

Die hohe Auflösung des in vivo µCTs erlaubte in der vorliegenden Arbeit zusätzlich

die Beurteilung von im kortikalen Knochen auftretender Kavitäten, wobei LANd442

über vier Wochen ähnlich geringe Werte erreichte wie die Gruppe der Leertibiae. In

der LAE442-Gruppe bildeten sich dagegen im Vergleich zu den anderen 4-Wochen-

Gruppen die meisten Kavitäten. Nach acht Wochen zeigten beide

Magnesiumlegierungen die am stärksten ausgeprägte Kavitätenbildung, die bei

LAE442 jedoch geringer ausgeprägt war, als bei LANd442. In der LANd442-6-

Monatsgruppe waren ebenfalls Kavitäten in der Kortikalis festzustellen, deren

Ausmaß dem der LANd442-8-Wochengruppe entsprach. Hier stimmen die

Ergebnisse der vorliegenden Arbeit mit einer Studie von KRAUSE (2008) überein,

die bei der Legierung LAE442 im Zeitraum über sechs Monate gleichermaßen von

der Bildung von Kavitäten im kortikalen Knochen berichtet, wenn auch in deutlich

geringerem Ausmaß als in der vorliegenden Studie bei LANd442. In einer Studie von

THOMANN (2008) konnten bei LAE442 nach zwölf Monaten dagegen keine

Kavitäten festgestellt werden.

Relevante periostale und endostale Knochenneubildungen, die den röntgenologisch

sichtbaren Veränderungen an der Diaphyse entsprachen, konnten dagegen im µCT

Diskussion ___________________________________________________________________

52

nur bei LANd442 und LAE442 über den gesamten Versuchszeitraum nachgewiesen

werden. Beide Phänomene nahmen bei den Magnesiumlegierungen in ähnlichem

Ausmaß über den zeitlichen Verlauf zu und sprechen damit für aktive

Remodellingprozesse (REIFENRATH et al. 2011). In der LANd442-6-Monatsgruppe

nahmen die periostalen Zubildungen noch geringfügig weiter zu, endostal erreichte

die Gruppe denselben Endwert wie die LANd442-8-Wochengruppe. Die Leertibiae

wiesen kein periostales Remodelling auf, nur endostal konnte neu gebildeter

Knochen in Woche 2-4 in Ansätzen beobachtet werden. Bestätigt werden die

Ergebnisse der LANd442- und LAE442-Gruppen durch die Beobachtung von

hauptsächlich vom Periost ausgehender Knochenzubildungen in früheren Studien mit

LACer442 und MgCa0,8 (REIFENRATH et al. 2010; THOMANN et al. 2010). Im

Zusammenhang mit den beobachteten Kavitäten im kortikalen Knochen könnte

vermutet werden, dass dem Knochen durch das periostale Remodelling Stabilität

verliehen werden soll, die durch die zunehmende Anzahl an Kavitäten verloren geht.

Ein direkter Kontakt zwischen Knochen und Implantat war in der vorliegenden Studie

kaum vorhanden. Im Zeitraum über vier Wochen zeigten sich bei beiden

Magnesiumlegierungen geringgradige Trabekelbildungen ab Woche 3, im Zeitraum

über acht Wochen dagegen konnte nur bei LAE442 ein beginnendes Heranwachsen

an das Implantat beobachtet werden. In der LANd442-6-Monatsgruppe wurde erst im

letzten Viertel des Untersuchungszeitraumes eine implantatgerichtete

Trabekelbildung festgestellt, die jedoch ebenfalls nur gering ausgeprägt war. Auch

THOMANN et al. (2009) konnten nach zwölf Monaten bei LAE442 ein Heranwachsen

an das Implantat beobachten und in einer Arbeit von KRAUSE (2008) wurden bei

LAE442 nach sechs Monaten implantatgerichtete Trabekel beschrieben. Andere

Autoren berichteten sogar von nahezu eingewachsenen Implantaten (WITTE et al.

2006; XU et al. 2007; LI et al. 2008; ZHANG et al. 2009). Letztere Studien bedienten

sich jedoch größtenteils anderer Tiermodelle bezüglich Tierart (Ratte,

Meerschweinchen) und Implantatlokalisation (Femur), was die bessere Integration

der Magnesiumimplantate erklären könnte.

Die dreidimensionale Berechnung des Knochens aus den in vivo µCT-

Untersuchungen war bei allen Gruppen möglich, Titan eingeschlossen. Mittels dieser

Diskussion ___________________________________________________________________

53

konnten die Beobachtungen bezüglich der aktiven Knochenumbauprozesse (z.B.

Dichte- und Volumenveränderungen) weiter konkretisiert werden. Derartige

Untersuchungen mittels in vivo µCT sind in der zugänglichen Literatur bisher nicht

beschrieben. Bei beiden Magnesiumlegierungen waren Dichteabnahmen des

Knochens über den gesamten Verlauf zu beobachten. Der stärkste Dichteverlust

fand in der LANd442-8-Wochengruppe statt, der sich in der 6-Monatsgruppe

fortsetzte. Fast ebenso hoch war die Abnahme in der LAE442-4-Wochengruppe, die

Veränderungen in den LANd442-4-Wochen- und LAE442-8-Wochengruppen waren

milder ausgeprägt. Die Abnahme der Dichte ging gleichzeitig mit einem Anstieg des

Knochenvolumens einher, die in den 4-Wochengruppen beider

Magnesiumlegierungen ein vergleichbares Ausmaß erreichte. In den 8-

Wochengruppen nahm das Knochenvolumen der LANd442-Tiere jedoch doppelt so

stark zu wie das der LAE442-Tiere. Bei der LANd442-6-Monatsgruppe war

anschließend eine weitere Verdopplung der Zunahme festzustellen. Beide

Phänomene könnten auf verschiedene Reaktionsmuster des Knochens

zurückzuführen sein: Zum einen bildet der Knochen im Verlauf der

Implantatdegradation Kavitäten aus, was in der zweidimensionalen Auswertung

sichtbar war und zur Verminderung der Knochendichte führt (GALANTE et al. 1970).

Zum anderen wird, analog zu einer Studie von WITTE et al. (2005), periostal und in

geringerem Ausmaß endostal neuer Knochen zugebildet. In beiden Fällen verleiht

das neu gebildete Knochengewebe dem kortikalen Knochengefüge die Stabilität, die

durch vorhergehende Abbauprozesse verringert wurde. Dieses neue

Knochengewebe ist jedoch während des Untersuchungszeitraums von bis zu sechs

Monaten noch nicht komplett mineralisiert. Nach einer Studie von FUCHS et al.

(2008) kann erst nach zwölf Monaten von einer vollständigen Mineralisierung

ausgegangen werden, weswegen trotz neuem, kavitätenfreiem Knochengewebe die

Dichte einem Abfall unterliegt.

Auch die Porosität des Knochens ist vermutlich durch diese Prozesse beeinflusst,

unterliegt allerdings nur sehr geringen Veränderungen, die über vier Wochen in der

LANd442-Gruppe nicht feststellbar waren. Nach acht Wochen war sie bei LANd442

etwas ausgeprägter und am deutlichsten erkennbar war die Zunahme der Porosität

Diskussion ___________________________________________________________________

54

aufgrund der Kavitätenbildung nach sechs Monaten. Bei LAE442 zeigte sich nach

vier Wochen dagegen eine leichte Porositätsabnahme, nach acht Wochen zeigte

sich aber eine Zunahme, die der von LANd442 glich. Die gleich bleibende bzw. sogar

abnehmende Porosität in den 4-Wochengruppen trotz Bildung von Kavitäten, die in

den zweidimensionalen Untersuchungen gesehen wurde, ist möglicherweise durch

das periostal in den ersten Wochen nach der Implantation neu gebildete,

kavitätenfreie Knochengewebe zu erklären. RITTERSHAUS et al. (2010)

beschrieben in einer Untersuchung über ZEK100 im zeitlichen Verlauf von zwölf

Monaten dieselben Phänomene bezüglich Dichteverlust und Volumen- sowie

Porositätszunahme des Knochens.

Demgegenüber stellten sich die Entwicklungen der Knochenveränderungen in den

Titangruppen anders dar. Die Zunahme der Knochendichte, die über vier und acht

Wochen mit einer Abnahme der Knochenporosität und nach vier Wochen mit einer

Abnahme, jedoch nach acht Wochen mit einem Anstieg des Knochenvolumens

einherging, ist zwar ebenfalls auf eine Neubildung von Knochen zurückzuführen. In

den ex vivo µCT-Untersuchungen zeigte sich aber, dass die Zubildungen im

Vergleich zu den Magnesiumimplantaten hauptsächlich im endostalen Bereich und

um das Implantat stattfand. Dieser Knochen in Form von Trabekeln und Spangen um

das Implantat stellte sich makroskopisch dichter als die periostalen Zubildungen der

Magnesiumgruppen dar und war frei von Kavitäten, weshalb er als Grund für die

Dichtezunahme zu sehen ist.

Auch die Gruppe der Leertibiae zeigte in der dreidimensionalen Auswertung

Veränderungen aller Parameter, allerdings nicht in einheitlicher Form. Die 4- und die

8-Wochengruppen verhielten sich bezüglich Knochendichte und -volumen

widersprüchlich. Die 4-Wochengruppe wies eine den LANd442- und LAE442-

Gruppen entsprechende Dichteabnahme in Verbindung mit einer Volumenzunahme

auf, während hingegen bei der 8-Wochengruppe ein Dichteanstieg mit einem

Volumenverlust ähnlich der Titan-4-Wochengruppe einherging. Die Knochenporosität

zeigte sich nahezu unverändert, obwohl anhand der zweidimensionalen Schnittbilder

in der 4-Wochengruppe ein die LANd442-Gruppe geringfügig übertreffendes Ausmaß

an Kavitäten nachgewiesen wurde. Dem liegen vermutlich physiologische

Diskussion ___________________________________________________________________

55

Umbauvorgänge zugrunde, die in den Gruppen mit Magnesiumimplantat durch die

eingebrachten Implantate verstärkt wurden, allerdings bei allen auch als Reaktion auf

die operative Manipulation gesehen werden könnten.

Insgesamt sind bei den Magnesiumgruppen vor allem die Dichteabnahme sowie die

steigende Porosität im zeitlichen Verlauf als unerwünschter Effekt zu beurteilen, der

im klinischen Einsatz eine Refrakturierung nach der vollständigen Degradation des

eingebrachten Implantates möglicherweise begünstigen würde. Die Auswirkungen

gleichen denen der Osteoporose, die ihrerseits mit einem erhöhten Frakturrisiko

einhergeht (SCHUMACHER et al. 2007). Dabei zeigte in der vorliegenden

Untersuchung die Legierung LANd442 verglichen mit LAE442 die deutlicheren

Veränderungen bezüglich Volumenzunahme und Dichteabnahme.

Abgesehen von der tatsächlichen Beurteilung der Knochendichte, konnte in der

vorliegenden Arbeit eine zusätzliche Schlussfolgerung aus der dreidimensionalen

Auswertung der in vivo µCT-Untersuchungen gezogen werden: Bei Betrachtung der

Knochendichte zeigten sich in der vorliegenden Studie in den LANd442-Gruppen in

allen drei Untersuchungszeiträumen kontinuierliche Dichteabnahmen. Wären nun

ohne in vivo Verlaufskontrolle nur die Endzustände nach Ablauf des

Versuchzeitraums untersucht worden, wie es in vielfachen Studien angewandt wurde

(YAN et al. 1997; XU et al. 2007; LI et al. 2008; ZHANG et al. 2009; WITTE et al.

2010), hätte sich anhand der vorliegenden Ergebnisse zwar ein Dichteabfall

zwischen der 4. und 8. Versuchswoche dargestellt (von 1189 auf 1145 mg HA/ccm),

anschließend jedoch eine Dichtezunahme zwischen der 8. und der 26. Woche (von

1145 auf 1193 mg HA/ccm). Diese scheinbare Dichtezunahme entspricht allerdings

nicht der tatsächlichen Situation, da sie lediglich durch tierindividuelle Unterschiede

in der Knochendichte der Einzeltiere bedingt war, was durch abweichende

Anfangswerte zwischen den einzelnen Gruppen erfasst werden konnte. Nur aufgrund

des Vorliegens der Ausgangswerte und der Werte aus den regelmäßigen

Verlaufskontrollen war es in der vorliegenden Studie möglich, den tatsächlichen

Verlauf der Knochendichte darzustellen. Eine andere Möglichkeit, diese in

individuellen Unterschieden der Tiere begründeten Fehler zu beheben, wäre die

Wahl einer größeren Stichprobenmenge. Die Ergebnisse von Studien mit kleinen

Diskussion ___________________________________________________________________

56

Gruppengrößen ohne regelmäßige in vivo Verlaufskontrolle sind daher kritisch zu

betrachten.

Die ex vivo durchgeführten µCT-Untersuchungen wurden genutzt, um die in vivo im

zeitlichen Verlauf bereits beurteilten Parameter nach Versuchsende mit einer noch

höheren Auflösung, die die Einbeziehung der Titanimplantate in die Auswertung

erlaubte, erneut zu untersuchen. Auch hier konnten Kavitätenbildung und periostale

Knochenzubildungen als vorrangige Prozesse im Rahmen des Knochenumbaus

deutlich dargestellt werden. Die Titanimplantate zeigten bezüglich der Bildung von

Kavitäten nach vier Wochen eine den Magnesiumimplantaten vergleichbare

Ausprägung, nach acht Wochen dagegen eine geringere. Der Kontakt zwischen

Knochen und Implantat sowie die endostalen Zubildungen waren jedoch stärker

ausgeprägt. Die periostalen Zubildungen traten in deutlich geringerem Maß auf. Die

Leertibiae unterlagen ebenfalls der Bildung von Kavitäten, die Parameter periostale

und endostale Zubildungen konnten nur in Einzelfällen festgestellt werden.

Abweichungen zwischen in vivo und ex vivo µCT gab es, abgesehen von der

ausschließlichen ex vivo Beurteilung der Titanimplantate, lediglich bezüglich der

Ausprägung des Knochen-Implantat-Kontaktes, der sich im ex vivo µCT

ausgeprägter darstellte. Dies ist wiederum auf die bessere Auflösung zurückzuführen

(LALK et al. 2010), wodurch feine Trabekel, die sich im in vivo µCT als

Hintergrundrauschen darstellen, erst als solche zu erkennen waren.

Mittels fluoreszenzmikroskopischer Untersuchung an histologischen

Trenndünnschliffen konnte bei allen Gruppen mit der Zeit eine Zunahme der

mineralen Appositionsrate (MAR) beobachtet werden. Vorrangig galt dies für beide

Magnesiumlegierungen, was die Ergebnisse der µCT-Untersuchungen bezüglich der

massiven periostalen Knochenzubildungen bestätigte. LAE442 unterschied sich

hierbei in allen Zeitspannen signifikant von den Titan- und Leertibiaegruppen.

Zwischen LANd442, das insgesamt die stärkste MAR erreichte, und den

Vergleichsmaterialien konnten nach vier und acht Wochen keine statistischen

Signifikanzen festgestellt werden, was auf höhere Standardabweichungen der

LANd442-Gruppen zurückgeführt werden muss. Nach sechs Monaten lagen die

Diskussion ___________________________________________________________________

57

gemessenen Werte über den von REIFENRATH et al. (2011) für LAE442

dokumentierten MAR-Werten. Sowohl LAE442 als auch LANd442 zeigten in allen

Zeitgruppen höhere MAR-Werte in der ersten Zeitspanne (4-Wochengruppen: Tag 3-

13; 8-Wochengruppen: Tag 3-27; 6-Monatsgruppe: Tag 93-120). Dies entspricht

einer Studie von WITTE et al. (2007a), die ebenfalls von fallenden mineralen

Appositionsraten berichten. LANd442 und LAE442 induzieren daher eine stärkere

initiale Knochenreaktion als Titan, die sich jedoch im zeitlichen Verlauf wieder

abschwächt. Auffällig war zudem, dass Titan mit einer Ausnahme (erste Zeitspanne

der 4-Wochengruppen) niedrigere MAR-Werte erzielte als die Gruppe der Leertibiae.

Dies könnte damit erklärt werden, dass die Tiere mit Titanimplantaten hauptsächlich

mit endostaler Knochenneubildung auf den eingebrachten Pin reagierten, die MAR

aber periostal gemessen wurde.

Die Auswertung der mit TRAP gefärbten histologischen Schnitte ergab in allen

Zeiträumen höhere Osteoklastenzahlen für beide Magnesiumlegierungen als für

Titan, was bei den Magnesiumimplantaten erneut für einen höheren Grad an

Knochenumbauprozessen spricht. Bei LAE442 wurden nach vier Wochen nahezu

doppelt so viele Osteoklasten gesehen wie bei LANd442, dagegen war die ermittelte

Anzahl bei LANd442 nach acht Wochen etwas größer als die bei LAE442. Bei den

Leertibiae wurde nach vier Wochen ein Wert erreicht, der geringfügig höher war als

bei LANd442, die für Titan beobachtete Osteoklastenzahl aber deutlich übertraf.

Nach acht Wochen wurde bei den Leertibiae aber das geringste

Osteoklastenvorkommen nachgewiesen. Insgesamt traten jedoch aufgrund der

hohen Standardabweichungen keine Signifikanzen zwischen den einzelnen Gruppen

auf.

Im Vergleich beider Zeitgruppen desselben Materials wurde dagegen bei Titan nach

acht Wochen eine signifikant höhere Osteoklastenaktivität festgestellt als nach vier

Wochen, die Leertibiae hingegen wiesen nach vier Wochen signifikant mehr

Osteoklasten auf als nach acht Wochen. Bei LAE442 wurden nach vier Wochen

mehr Osteoklasten nachgewiesen als nach acht Wochen, jedoch ohne statistische

Signifikanz. LANd442 zeigte dagegen einen statistisch ebenfalls nicht signifikanten

Anstieg der Osteoklastenzahl im Verlauf von vier über acht Wochen bis hin zu sechs

Diskussion ___________________________________________________________________

58

Monaten. Auch SCHÄFER (2011) beschrieb nach drei und sechs Monaten eine

höhere Osteoklastenaktivität bei LAE442 im Vergleich zu Titan. Die dort für LAE442

angegebene Anzahl nach sechs Monaten war hingegen deutlich geringer als die in

der vorliegenden Arbeit für LANd442 ermittelte Osteoklastenzahl. Diese war zudem

auch weitaus höher als die entsprechenden für LAE442, MgF und MgCa0,8

ermittelten Osteoklastenzahlen. Auch HÜHNERSCHULTE et al. (2012) stellten nach

sechs Monaten bei den Legierungen AX30 und ZEK100 hohe Osteoklastenzahlen

fest, die von den LANd442-Werten der vorliegenden Studie sogar fünffach bzw.

dreifach übertroffen werden. Diese Unterschiede sind möglicherweise auf

abweichende Qualitäten der TRAP-gefärbten histologischen Schnitte zwischen den

Studien aufgrund der hierfür benötigten Enzymaktivität der Osteoklasten

zurückzuführen.

Zwischen der in der vorliegenden Arbeit ermittelten Anzahl an Osteoklasten und der

Entwicklung der anhand der µCT-Untersuchungen ermittelten Dichte konnte ein

Zusammenhang festgestellt werden: Die Abnahme der Dichte ging mit hohen

Osteoklastenzahlen einher. Einzige Ausnahme stellte Titan dar, bei dem eine

Dichtezunahme zu verzeichnen war, obwohl histologisch dennoch viele Osteoklasten

sichtbar waren. Die Osteoklasten konnten aber nicht in dem vermutlich für die

Dichtezunahme verantwortlichen Knochenring festgestellt werden, sondern wurden

im kortikalen Knochen nachgewiesen.

Die mit Toluidinblau gefärbten histologischen Schnitte bestätigten in ihren

Ergebnissen vorrangig die Beobachtungen aus der zweidimensionalen Auswertung

der in vivo und ex vivo µCT-Untersuchungen. Der am stärksten ausgeprägte

Parameter war dabei die nach acht Wochen bei beiden Magnesiumimplantaten

gleichermaßen ausgeprägte periostale Zubildung von neuem Knochen, nach vier

Wochen war bei LANd442 die stärkere Knochenneubildung festzustellen. Mittels

Toluidinblau-Färbung gelang es, auch bei den Leertibiae beider Gruppen periostale

Zubildungen nachzuweisen, wenngleich deutlich geringer ausgeprägt als bei den

implantattragenden Tibiae. Gefolgt wurde dieser Parameter von den endostalen

Zubildungen, insbesondere bei LANd442, und Kavitätenbildungen. Entsprechend der

Ausmaße der Knochenneubildungen übertraf das periostale Remodelling (nach vier

Diskussion ___________________________________________________________________

59

Wochen LAE442 > LANd442; nach acht Wochen LANd442 > LAE442) das

endostale, welches bei allen Gruppen gleichermaßen ausgeprägt war. Über

periostale bzw. endostale Veränderungen am diaphysären Knochen nach

Implantation von Magnesiumimplantaten existieren in der zugänglichen Literatur

keine Hinweise.

Auch in der LANd442-6-Monatsgruppe waren die beiden Parameter

Knochenzubildungen und Remodelling periostal am stärksten ausgeprägt, gefolgt

von der Ausbildung von Kavitäten sowie Zubildungen und Remodelling endostal.

Demgegenüber wurde in der Arbeit von KRAUSE (2008) über drei und sechs Monate

bei LAE442 nur ein geringes periostales Remodelling beobachtet. THOMANN (2008)

hingegen stellte sowohl bei MgF-Implantaten nach sechs Monaten als auch bei

LAE442-Implantaten nach zwölf Monaten periostales und endostales Remodelling

fest, wobei letzteres wie in der vorliegenden Studie im direkten Vergleich deutlich

geringer ausgeprägt war. Kontakt zwischen Knochen und Implantat konnte in der

vorliegenden Arbeit histologisch nur bei den Titanzylindern und in der LANd442-6-

Monatsgruppe festgestellt werden, die auch im µCT dargestellt werden konnte. In der

vier und acht Wochengruppe war er dagegen nur im in vivo µCT erkennbar. Eine

Erklärung hierfür könnte sein, dass für die histologische Auswertung der 4- und 8-

Wochengruppen zufällig Schnitte ausgewählt wurden, die von anderen

Lokalisationen stammten, an denen keine Trabekelbildung stattgefunden hatte. Die

Ergebnisse bei LANd442 nach sechs Monaten entsprechen ebenfalls der Arbeit von

KRAUSE (2008), die bei LAE442 nach drei und sechs Monaten ebenfalls, sogar in

etwas deutlicherer Form, Knochen-Implantat-Kontakt in Form von Trabekeln

feststellen konnte. Bei THOMANN (2008) war dies nach 12 Monaten darüber hinaus

noch stärker ausgeprägt.

Auffällig war in der Toluidinblaufärbung die Bildung einer fibrösen Kapsel, die sowohl

um die Titanimplantate nach vier und acht Wochen als auch in sehr geringer

Ausprägung um die LANd442-Implantate der 6-Monatsgruppe gesehen wurde. Bei

LANd442 und LAE442 hingegen konnte weder in den 4- noch in den 8-

Wochengruppen eine fibröse Kapsel nachgewiesen werden. KRAUSE (2008)

beobachtete entsprechende Fibrosen nach sechs Monaten nur bei wenigen

Diskussion ___________________________________________________________________

60

Implantaten der Legierung LAE442 und bei der Hälfte der untersuchten

Titanimplantate. Die Bedeutung einer solchen bindegewebigen Kapsel wird in der

Literatur kontrovers diskutiert. Während VAN DER POL et al. (2010) sie als Folge

einer Entzündungsreaktion und damit als negative Auswirkung betrachten, sehen

andere Autoren in einer fibrösen Kapsel die Vorstufe zur Bildung eines

Knochenringes (YAN et al. 1997; WITTE et al. 2007b). Die vorliegende Studie könnte

letztere Aussage unterstützen, da auch hier eine fibröse Kapsel nur bei Titan und der

LANd442-Langzeitgruppe festgestellt werden konnte, die als einzige Gruppen einen

nennenswerten knöchernen Kontakt zwischen Knochen und Implantat zeigten.

Im Hinblick auf LANd442 ist allen aufgeführten Veränderungen des Knochens

gemein, dass sie keine systemische Immunantwort in Form einer Entzündung zur

Folge haben. Dies erschließt sich daraus, dass der Test aller Blutproben der 6-

Monatsgruppe auf Interleukin 6 negativ ausfiel. Es kann allerdings nicht

ausgeschlossen werden, dass es lokal zu leichten Entzündungsreaktionen kam.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass in der vorliegenden Studie anhand

der bildgebenden Verfahren sowie den histologischen Methoden Veränderungen an

allen untersuchten Tibiae nachgewiesen werden konnten, was die Tibiae mit

Titanimplantaten und die Leertibiae einschließt. Daher können die verursachten

periostalen und endostalen Zubildungen und die Bildung von Kavitäten nicht in

vollem Ausmaß als Auswirkung des eingebrachten Implantates verstanden werden,

sondern müssen zum Teil als Folge der Operationsmethode gesehen werden. Diese

Effekte werden allerdings vermutlich durch das Einbringen eines Implantates

verstärkt. Dabei war es jedoch nicht ausschlaggebend, aus welchem Material das

Implantat hergestellt wurde, da die Titanimplantate ebenfalls Veränderungen am

Knochen induzierten. Diese entsprechen jedoch nicht in jeder Form den durch die

Magnesiumimplantate verursachten Prozessen. Die Knochenveränderungen, die

sich im Rahmen dieser Untersuchungen vor allem bei LANd442 im periostalen

Bereich manifestierten, erreichten trotz allem ein Ausmaß, das inakzeptabel

erscheint und zu einem Stabilitätsverlust bei abnehmender Dichte führt, weshalb eine

Anwendung dieser Legierung im lasttragenden Knochen als ungünstig erscheint.

Nach den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit stellt sich LAE442 als das besser

Diskussion ___________________________________________________________________

61

geeignete Implantatmaterial dar, da es in vivo deutlich weniger Veränderungen

induziert als LANd442. Weitere Studien hinsichtlich der routinemäßigen Verwendung

der Legierung sind allerdings notwendig.

Zusammenfassung ___________________________________________________________________

62

5 Zusammenfassung

Carolin Hampp (2012): Degradation und Biokompatibilität der neuen

Magnesiumlegierung LANd442 im Vergleich zu LAE442 und der nicht

degradablen Titanlegierung Ti6Al4V-Eli nach intramedullärer Implantation in

die Kaninchentibia

In der vorliegenden Arbeit sollte die neu entwickelte Legierung LANd442 als

Modifizierung der vielversprechenden Legierung LAE442 in vivo im Tiermodell

Kaninchen untersucht werden. Bei dieser Legierung wurde statt der in LAE442

enthaltenen Seltenen Erden das Einzelelement Neodym verwendet. Dabei wurde

LANd442 mit der Legierung LAE442 einerseits und dem etablierten nicht

resorbierbaren Material Titan andererseits über Zeiträume von vier und acht Wochen

verglichen. Als weitere Kontrollgruppe dienten Tibiae, an denen die Operation

gleichermaßen durchgeführt wurde, ohne jedoch ein Implantat einzubringen.

Zusätzlich wurde die Legierung LANd442 über eine Untersuchungsperiode von

sechs Monaten in vivo geprüft, um Aussagen über einen längeren Zeitraum zu

erhalten.

Für die Untersuchungen wurden bei insgesamt 33 Kaninchen zylindrische Implantate

von 25 mm Länge und 2,5 mm Durchmesser aus LANd442 (n = 30), LAE442 (n = 20)

und Titan (n = 8) in die Mitte der Tibiamarkhöhle eingebracht. 25 Kaninchen erhielten

beidseits ein Implantat, bei insgesamt acht Kaninchen wurde jeweils eine Tibia als

Kontrolle leer gelassen. Im Anschluss an die Operation wurden die Tiere täglich

klinisch (v.a. auf Umfangsvermehrungen, subkutane Emphyseme und Lahmheiten),

wöchentlich röntgenologisch (v.a. auf Veränderungen der Diaphyse, Aufhellungen

der Markhöhle und Gasbildung) und je nach Untersuchungszeitraum wöchentlich

bzw. zweiwöchentlich in vivo µ-computertomographisch (v.a. auf Kavitätenbildung,

periostale und endostale Knochenneubildungen, Veränderungen von Knochendichte

und -volumen) untersucht. Nach Ablauf der Untersuchungszeiträume fand eine

erneute Untersuchung in einem höher auflösenden µCT ex vivo statt, die mit den in

vivo µCT Untersuchungen verglichen wurde. Zudem wurden Querschnitte des

Knochen-Implantat-Verbundes histologisch mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie

Zusammenfassung ___________________________________________________________________

63

(Entwicklung der MAR) bzw. TRAP- (Osteoklastennachweis) und Toluidinblaufärbung

(v.a. Kavitätenbildung, periostale und endostale Knochenneubildungen, Knochen-

Implantat-Kontakt) untersucht.

Klinisch führten LANd442-Implantate bei insgesamt drei Kaninchen zu Lahmheiten.

Schwellungen, Rötungen und derbe Umfangsvermehrungen an der

Implantationsstelle traten bei allen Tieren auf. Subkutane Gasansammlungen wurden

bei LAE442 an zwei Tibiae der 4-Wochengruppe festgestellt, bei LANd442 an

insgesamt sechs Tibiae der 8-Wochen- (n = 4) und 6-Monatsgruppen (n = 2).

Röntgenologisch zeigten sich bei allen Gruppen außer Titan Zubildungen der

Kortikalis an der Diaphyse im Implantationsbereich. Die Bildung von Gas konnte über

jeweils maximal eine Woche sowohl in der LAE442-4-Wochengruppe in Woche 3 als

auch in beiden 8-Wochengruppen bei LAE442 in Woche 3 und bei LANd442 in

Woche 8 an der Implantationsstelle festgestellt werden. In der Gesamtheit der mittels

Röntgen beurteilten Veränderungen erreichte LANd442 nach acht Wochen den

höchsten Endwert aller Gruppen und zeigte über sechs Monate einen weiteren

Anstieg. Im µCT standen sowohl zwei- als auch dreidimensional deutliche periostale

Knochenneubildungen und den kortikalen Knochen durchziehende Kavitäten im

Vordergrund. LAE442 zeigte nach vier und acht Wochen vergleichbare periostale

Zubildungen wie LANd442, aber stärkere als die Leertibiae. Dagegen wies LANd442

über acht Wochen bei der Kavitätenbildung den höheren Wert auf. Bei den

Parametern Gasbildung und endostale Knochenzubildungen zeigte LANd442 nach

vier Wochen eine stärkere Ausprägung, nach acht Wochen erreichten aber beide

Magnesiumlegierungen denselben Endwert. Der Knochen-Implantat-Kontakt war

dagegen nach vier Wochen bei beiden Materialien gleichermaßen ausgebildet, nach

acht Wochen jedoch bei LAE442 stärker vorhanden. Zusätzlich wurde in allen

LANd442- und LAE442-Gruppen eine Abnahme der Knochendichte über den

gesamten Zeitraum beobachtet, welche mit einer Zunahme des Knochenvolumens

einherging. Die erneute ex vivo µCT-Untersuchung bestätigte die Ergebnisse der in

vivo Untersuchungen und die der Histologie. Als besonders geeignet zeigte sich die

höhere Auflösung bei der Beurteilung des Knochen-Implantat-Kontaktes, da hier eine

differenziertere Betrachtung der gebildeten Trabekel möglich war. Zudem konnte

Zusammenfassung ___________________________________________________________________

64

anhand der TRAP-Färbung die Aktivität von Osteoklasten beurteilt werden, die nach

vier Wochen bei LAE442 und nach acht Wochen bei LANd442 am höchsten war.

Aufgrund der auftretenden Lahmheiten und der massiven Knochenveränderungen

erscheint LANd442 für den orthopädischen Einsatz am lasttragenden Knochen

weniger geeignet. Entgegen der Erwartungen verursachte jedoch auch das etablierte

Material Titan in der vorliegenden Arbeit Knochenveränderungen, deren Ursache in

nachfolgenden Studien weitergehend überprüft werden sollte. Im direkten Vergleich

der beiden Magnesiumlegierungen zeigte sich das bereits als vielversprechend

beurteilte Material LAE422 als besser geeignet.

Summary ___________________________________________________________________

65

6 Summary

Carolin Hampp (2012): Degradation and biocompatibility of the new magnesium

alloy LANd442 in comparison to LAE442 and the non-degradable titanium alloy

Ti6Al4V-Eli after intramedullary implantation in the rabbit tibia

In the study at hand the new developed alloy LANd442 – as a modification of the

promising alloy LAE442 – should be investigated in vivo within the rabbit as animal

model. In this alloy the single element neodymium was used instead of the rare earth

composition contained in LAE442. Thereby, over time periods of four and eight

weeks LANd442 was compared to the alloy LAE442 and to the well-established non

resorbable material titanium, respectively. Furthermore, tibiae served as control

group, which underwent the same surgical procedure, however, without inserting an

implant. Additionally, the alloy LANd442 was investigated in vivo over a period of six

months to gain conclusions about a longer implantation period.

For the investigations cylindrical implants of 25 mm length and 2.5 mm diameter

made out of LANd442 (n = 30), LAE442 (n = 20) and titanium (n = 8) were inserted in

a total of 33 rabbits in the middle of the tibia’s medullary cavity. 25 rabbits received

an implant on both sides, in a total of eight rabbits one tibia, respectively, was left

empty as a control. Subsequent to the surgery, the animals were investigated

clinically (esp. for peripheral augmentation, subcutaneous emphysema, lameness)

every day, radiographically (esp. for changes of the diaphysis, brightening of the

medullary cavity, formation of gas) once a week and µ-computertomographically

(esp. for formation of cavities, periosteal and endosteal new bone growth, changes of

bone density and volume) weekly or biweekly, depending on the investigation period.

At the end of the investigation periods a second evaluation in a higher resolutive µCT

was performed ex vivo, which was compared to the in vivo investigations. Moreover,

cross sections of the bone-implant-compound were investigated histologically by

means of fluorescent microscopy (development of MAR) and TRAP- (detection of

osteoclasts) as well as toluidine blue staining (esp. formation of cavities, periosteal

and endosteal new bone growth, bone-implant-contact).

Summary ___________________________________________________________________

66

Clinically, LANd442-implants lead to lameness in a total of three rabbits. All rabbits

showed swelling, redness and coarse peripheral augmentations at the site of

implantation. Subcutaneous formations of gas were observed at two tibiae of the

LAE442-group over four weeks and in a total of six tibiae of the LANd442-groups

over eight weeks (n = 4) and six months (n = 2). Radiographically, in all groups

except titanium growths at the implant location at the diaphysis were shown. The

formation of gas could be observed at the implantation site for at most one week in

the LAE442-group over four weeks (in week 3) as well as in both groups over eight

weeks (LAE442: in week 3; LANd442: in week 8). With reference to all

radiographically evaluated changes LANd442 reached the highest final value of all

groups after eight weeks and showed a further increase over six months. In the µCT

in both two and three dimensions considerable periosteal formation of new built bone

as well as the cortical bone permeating cavities were the main findings. LAE442

showed similar periosteal new bone growth after four and eight weeks compared to

LANd442, but more than the tibiae without implant. In contrast, LANd442 reached a

higher value over eight weeks regarding the formation of cavities. In the parameters

formation of gas as well as endosteal formation of new built bone LANd442 showed a

stronger occurrence after four weeks, however, after eight weeks both magnesium

alloys reached the same final value. In contrast, the bone-implant-contact occurred in

both materials after four weeks in equal measure, however, after eight weeks it was

more pronounced at LAE442. Additionally, in all LANd442- and LAE442-groups a

loss of bone density was observed, which is attended by an increase of bone volume.

The ex vivo µCT-investigation confirmed both the findings of the in vivo µCT- and the

histological investigations. The higher resolution proved to be particularly appropriate

for the assessment of the bone-implant-contact, because it allowed a more

differentiated examination of the formed trabeculae. Furthermore, by means of the

TRAP-staining the activity of osteoclasts could be assessed, which was after four

weeks the highest at LAE442 and after eight weeks at LANd442.

Because of the occurring lameness and the massive bone changes LANd442 seems

to be less suitable for orthopaedic applications at the load-bearing bone. Contrary to

the expectations, in the study at hand the well-established material titanium induced

Summary ___________________________________________________________________

67

bone changes as well whose cause should be further investigated in future studies.

In the direct comparison of both magnesium alloys the already as promising rated

material LAE442 proved to be more suitable.

Literaturverzeichnis ___________________________________________________________________

68

7 Literaturverzeichnis

AVEDESIAN, M. M. a. BAKER, H. (1999): ASM specialty handbook, Materials Park, OH ASM International, 2. printing BENLI, S., S. AKSOY, H. HAVITCIOĞLU a. M. KUCUK (2008): Evaluation of bone plate with low-stiffness material in terms of stress distribution. J Biomech 41, 3229-3235 DRYNDA, A., N. DEINET, N. BRAUN a. M. PEUSTER (2009): Rare earth metals used in biodegradable magnesium-based stents do not interfere with proliferation of smooth muscle cells but do induce the upregulation of inflammatory genes. J Biomed Mater Res A 91, 360-369 ERDMANN, N., N. ANGRISANI, J. REIFENRATH, A. LUCAS, F. THOREY, D. BORMANN a. A. MEYER-LINDENBERG (2011): Biomechanical testing and degradation analysis of MgCa0.8 alloy screws: A comparative in vivo study in rabbits. Acta Biomater 7, 1421-1428 FEYERABEND, F., J. FISCHER, J. HOLTZ, F. WITTE, R. WILLUMEIT, H. DRÜCKER, C. VOGT a. N. HORT (2010): Evaluation of short-term effects of rare earth and other elements used in magnesium alloys on primary cells and cell lines. Acta Biomater 6, 1834-1842 FUCHS, R. K., M. R. ALLEN, M. E. RUPPEL, T. DIAB, R. J. PHIPPS, L. M. MILLER a. D. B. BURR (2008): In situ examination of the time-course for secondary mineralization of Haversian bone using synchrotron Fourier transform infrared microspectroscopy. Matrix Biol. 27, 34-41 GALANTE, J., W. ROSTOKER a. R. D. RAY (1970): Physical properties of trabecular bone. Calcif Tissue Res 5, 236-246 GRIFFITH, L. G. (2000): Polymeric biomaterials. Acta materialia 48, 263-277 HOFMANN, G. O., H. LIEDTKE, G. RUCKDESCHEL a. G. LOB (1990): The influence of bacterial contaminations on the biodegradation of PLA implants. Clin Mater 6, 137-150

Literaturverzeichnis ___________________________________________________________________

69

VON DER HÖH, N., D. BORMANN, A. LUCAS, B. DENKENA, C. HACKENBROICH a. A. MEYER-LINDENBERG (2009): Influence of different surface machining treatments of magnesium-based resorbable implants on the degradation behavior in rabbits. Adv Eng Mater 11, B47-B54 HORT, N., Y. HUANG, D. FECHNER, M. STÖRMER, C. BLAWERT, F. WITTE, C. VOGT, H. DRÜCKER, R. WILLUMEIT, K. U. KAINER a. F. FEYERABEND (2009): Magnesium alloys as implant materials - Principles of property design for Mg-RE alloys. Acta Biomater 6, 1714-1725 HUEHNERSCHULTE, T. A., J. REIFENRATH, B. VON RECHENBERG, D. DZIUBA, J. M. SEITZ, D. BORMANN, H. WINDHAGEN a. A. MEYER-LINDENBERG (2012): In vivo assessment of the host reactions to the biodegradation of the two novel magnesium alloys ZEK100 and AX30 in an animal model. Biomedical engineering online 11, 14-42 HUEHNERSCHULTE, T. A., N. ANGRISANI, D. RITTERSHAUS, D. BORMANN, H. WINDHAGEN a. A. MEYER-LINDENBERG (2011): In vivo corrosion of two novel magnesium alloys ZEK100 and AX30 and their mechanical suitability as biodegradable implants. Materials 4, 1144-1167 KRAUS, T., S. F. FISCHERAUER, A. C. HÄNZI, P. J. UGGOWITZER, J. F. LÖFFLER a. A. M. WEINBERG (2012): Magnesium alloys for temporary implants in osteosynthesis: In vivo studies of their degradation and interaction with bone. Acta Biomater 8, 1230-1238 KRAUSE, A., N. VON DER HÖH, D. BORMANN, C. KRAUSE, F.-W. BACH, H. WINDHAGEN a. A. MEYER-LINDENBERG (2010): Degradation behaviour and mechanical properties of magnesium implants in rabbit tibiae. J Mater Sci 45, 624-632 KRAUSE, A. (2008): Untersuchung der Degradation und Biokompatibilität von degradablen, intramedullären Implantaten auf Magnesiumbasis im Kaninchenmodell. Hannover, Tierärztliche Hochschule, Klinik für Kleintiere, Dissertation LALK, M., J. REIFENRATH, D. RITTERSHAUS, D. BORMANN a. A. MEYER-LINDENBERG (2010): Biocompatibility and degradation behaviour of degradable magnesium sponges coated with bioglass - method establishment within the framework of a pilot study. Mat Sci Eng Tech 41, 1025-1034

Literaturverzeichnis ___________________________________________________________________

70

LAMBOTTE, A. (1932): L’utilisation du magnesium comme materiel perdu dans l’osteosynthèse. Bull Mém Soc Nat Chir 28, 1325-1334 LEVESQUE, J., D. DUBE, M. FISET a. D. MANTOVANI (2004): Materials and Properties for Coronary Stents. Advanced materials & processes 162, 45-48 LI, Z., X. GU, S. LOU a. Y. ZHENG (2008): The development of binary Mg-Ca alloys for use as biodegradable materials within bone. Biomaterials 29, 1329-1344 LICHTE, P., H. C. PAPE, T. PUFE, P. KOBBE a. H. FISCHER (2011): Scaffolds for bone healing: concepts, materials and evidence. Injury 42, 569-573 LONG, M. a. H. J. RACK (1998): Titanium alloys in total joint replacement - a materials science perspective. Biomaterials 19, 1621-1639 MCBRIDE, E. D. (1938): Absorbable metal in bone surgery. J Am Med Assoc 111, 2464-2467 MEYER-LINDENBERG, A., M. THOMANN, A. KRAUSE, D. BORMANN, B. VON RECHENBERG u. H. WINDHAGEN (2010): Untersuchungen zum Einsatz einer Magnesiumbasislegierung als neues resorbierbares Implantatmaterial für die Osteosynthese. Kleintierpraxis 55, 349-363 MINGXING, W., Z. HONG a. W. LIN (2007): Effect of Yttrium and Cerium addition on microstructure and mechanical properties of AM50 magnesium alloy. Journal of Rare Earths 25, 233-237 MOAVENI, S. (2010): Engineering fundamentals: An introduction to engineering. 4. Aufl. Cengage Learning, Mason OH REIFENRATH, J., A. KRAUSE, D. BORMANN, B. VON RECHENBERG, H. WINDHAGEN a. A. MEYER-LINDENBERG (2010): Profound differences in the in-vivo-degradation and biocompatibility of two very similar rare-earth containing Mg-alloys in a rabbit model. Mat.-wiss. u. Werkstofftech. 41, 1054-1061

Literaturverzeichnis ___________________________________________________________________

71

REIFENRATH, J., D. BORMANN a. A. MEYER-LINDENBERG (2011): Magnesium alloys as promising degradable implant materials in orthopaedic research in: CZERWINSKI, F. (Hrsg.): Magnesium Alloys - Corrosion and Surface Treatments, InTech Publisher, Ukraine, 93-108 RHO, J. Y., R. B. ASHMAN a. C. H. TURNER (1993): Young's modulus of trabecular and cortical bone material: ultrasonic and microtensile measurements. J Biomech 26, 111-119 RITTERSHAUS, D., T. A. HUEHNERSCHULTE, N. ANGRISANI, D. BORMANN a. A. MEYER-LINDENBERG (2010): Continuous in-vivo evaluation of degradation and biocompatibility of the magnesium alloy ZEK100 by use of in-vivo micro computed tomography. Bone-tec International Bone-Tissue-Engineering Congress. Hannover, Germany ROKHLIN, L. L. (2003): Magnesium Alloys Containing Rare-earth Metals. Taylor & Francis Ltd, London ROKKANEN, P. U., O. BÖSTMAN, E. HIRVENSALO, E. A. MÄKELÄ, E. K. PARTIO, H. PÄTIÄLÄ, S. I. VAINIONPÄÄ, K. VIHTONEN a. P. TÖRMÄLÄ (2000): Bioabsorbable fixation in orthopaedic surgery and traumatology. Biomaterials 21, 2607-2613 SARIS, N. E., E. MERVAALA, H. KARPPANEN, J. A. KHAWAJA a. A. LEWENSTAM (2000): Magnesium. An update on physiological, clinical and analytical aspects. Clin Chim Acta 294, 1-26 SCHÄFER, M. (2011): Vergleichende histologische Untersuchungen von intramedullären Implantaten auf Magnesiumbasis im Kaninchenmodell. 1. Aufl. VVB Laufersweiler, Giessen SCHUMACHER, J., U. THIEM, R. SMEKTALA, J. PFEILSCHRIFTER u. L. PIENTKA (2007): Osteoporose und Sturz: medizinische Versorgung älterer Menschen mit einem erhöhten Frakturrisiko in Deutschland. ZaeFQ (101, 593-597 SEALY, M. P. a. Y. B. GUO (2010): Surface integrity and process mechanics of laser shock peening of novel biodegradable magnesium-calcium (Mg-Ca) alloy. J Mech Behav Biomed Mater 3, 488-496

Literaturverzeichnis ___________________________________________________________________

72

SEITZ, J.-M., K. COLLIER, E. WULF, D. BORMANN a. F.-W. BACH (2011): Comparison of the corrosion behavior of coated and uncoated magnesium alloys in an in vitro corrosion environment. Adv. Eng. Mater. 13, B313-B323 SONG, G. L. (2007): Control of biodegradation of biocompatable magnesium alloys. Corros Sci 49, 1696-1701 SONG, G. L. a. A. ATRENS (1999): Corrosion mechanisms of magnesium alloys. Adv Eng Mater 1, 11-33 STAIGER, M. P., A. M. PIETAK, J. HUADMAI a. G. DIAS (2006): Magnesium and its alloys as orthopedic biomaterials: a review. Biomaterials 27, 1728-1734 THOMANN, M., C. KRAUSE, D. BORMANN, N. VON DER HÖH, H. WINDHAGEN a. A. MEYER-LINDENBERG (2009): Comparison of the resorbable magnesium alloys LAE442 und MgCa0.8 concerning their mechanical properties, their progress of degradation and the bone-implant-contact after 12 months implantation duration in a rabbit model. Mat Sci Eng Tech 40, 82-87 THOMANN, M. (2008): Untersuchungen zur Degradation und Biokompatibilität von intramedullären Implantaten auf Magnesiumbasis im Kaninchenmodell: Prüfung der Degradation im Langzeitversuch und Untersuchung des Einflusses einer Fluoridbeschichtung. Hannover, Stiftung Tierärztliche Hochschule, Klinik für Kleintiere, Diss. THOMANN, M., C. KRAUSE, N. ANGRISANI, D. BORMANN, T. HASSEL, H. WINDHAGEN a. A. MEYER-LINDENBERG (2010): Influence of a magnesium-fluoride coating of magnesium-based implants (MgCa0.8) on degradation in a rabbit model. J Biomed Mater Res A 93, 1609-1619 TONINO, A. J., C. L. DAVIDSON, P. J. KLOPPER a. L. A. LINCLAU (1976): Protection from stress in bone and its effects. Experiments with stainless steel and plastic plates in dogs. J Bone Joint Surg Br 58, 107-113 TROITSKII V. V. a. D. N. TSITRIN (1944): The resorbing metallic alloy "Osteosintezit" as material for fastening broken bones. Khirurgiya 8, 41-44

Literaturverzeichnis ___________________________________________________________________

73

ULLMANN, B., J. REIFENRATH, D. DZIUBA, J.-M. SEITZ, D. BORMANN a. A. MEYER-LINDENBERG (2011): In vivo degradation behaviour of the magnesium alloy LANd442 in rabbit tibiae. Materials 4, 2197-2218 VAN DER POL, U., L. MATHIEU, S. ZEITER, P.-E. BOURBAN, P.-Y. ZAMBELLI, S. G. PEARCE, L. P. BOURÉ a. D. P. PIOLETTI (2010): Augmentation of bone defect healing using a new biocomposite scaffold: an in vivo study in sheep. Acta Biomater 6, 3755-3762 VOGGENREITER, G., S. LEITING, H. BRAUER, P. LEITING, M. MAJETSCHAK, M. BARDENHEUER a. U. OBERTACKE (2003): Immuno-inflammatory tissue reaction to stainless-steel and titanium plates used for internal fixation of long bones. Biomaterials 24, 247-254 VORMANN, J. (2003): Magnesium: nutrition and metabolism. Mol Aspects Med 24, 27-37 WITTE, F., J. FISCHER, J. NELLESEN, H. A. CROSTACK, V. KAESE, A. PISCH, F. BECKMANN a. H. WINDHAGEN (2006): In vitro and in vivo corrosion measurements of magnesium alloys. Biomaterials 27, 1013-1018 WITTE, F., J. FISCHER, J. NELLESEN, C. VOGT, J. VOGT, T. DONATH a. F. BECKMANN (2010): In vivo corrosion and corrosion protection of magnesium alloy LAE442. Acta Biomater 6, 1792-1799 WITTE, F., V. KAESE, H. HAFERKAMP, E. SWITZER, A. MEYER-LINDENBERG, C. J. WIRTH a. H. WINDHAGEN (2005): In vivo corrosion of four magnesium alloys and the associated bone response. Biomaterials 26, 3557-3563 WITTE, F., C. PODOLSKY, T. HASSEL u. A. LUCAS (2004): Fertigung von Magnesium-Implantaten. wt Werkstattstechnik online 94, 692-696 WITTE, F., H. ULRICH, C. PALM a. E. WILLBOLD (2007a): Biodegradable magnesium scaffolds: Part II: Peri-implant bone remodeling. J Biomed Mater Res A 81, 757-765

Literaturverzeichnis ___________________________________________________________________

74

WITTE, F., H. ULRICH, M. RUDERT a. E. WILLBOLD (2007b): Biodegradable magnesium scaffolds: Part 1: appropriate inflammatory response. J Biomed Mater Res A 81, 748-756 XU, L., G. YU, E. ZHANG, F. PAN a. K. YANG (2007): In vivo corrosion behavior of Mg-Mn-Zn alloy for bone implant application. J Biomed Mater Res A 83, 703-711 YAN, W. Q., T. NAKAMURA, M. KOBAYASHI, H. M. KIM, F. MIYAJI a. T. KOKUBO (1997): Bonding of chemically treated titanium implants to bone. J Biomed Mater Res 37, 267-275 ZHANG, E., L. XU, G. YU, F. PAN a. K. YANG (2009): In vivo evaluation of biodegradable magnesium alloy bone implant in the first 6 months implantation. J Biomed Mater Res A 90, 882-893 ZHANG, S., X. ZHANG, C. ZHAO, J. LI, Y. SONG, C. XIE, H. TAO, Y. ZHANG, Y. HE, Y. JIANG a. Y. BIAN (2010): Research on an Mg-Zn alloy as a degradable biomaterial. Acta Biomater 6, 626-640

___________________________________________________________________

75

Danksagung ___________________________________________________________________

76

Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. med. vet. Andrea Meyer-Lindenberg für

die Überlassung des interessanten Themas und die stets herzliche und fachlich

herausragende Betreuung und Unterstützung während der Entstehung dieser Arbeit.

Ein herzliches Dankeschön geht an Dr. Nina Angrisani, Dr. Dina Dziuba und Dr.

Janin Reifenrath, die immer ein offenes Ohr für meine Fragen hatten. Ihr habt mit

euren Korrekturen und Ratschlägen wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit

beigetragen. Meinen Mitdoktoranden Andreas, Melanie, Nina, Mareike, Berit und

Christina danke ich besonders dafür, dass wir immer ein Team waren, in dem ich

mich von Anfang an wohl gefühlt habe und auf eure Unterstützung zählen konnte.

Ebenso groß ist mein Dank an Diana, Melanie, Melanie und Rike. Neben eurer

großartigen Unterstützung bei allen Arbeiten, die so anfallen, seid ihr einfach Teil des

Teams und die Stunden im Labor und am CT werde ich nie vergessen.

Meinem Freund Rüdiger danke ich sehr dafür, dass er mich wieder aufgebaut hat,

wenn ich vor allem im Endspurt das Gefühl hatte, es würde mir alles über den Kopf

wachsen. Du warst da, als es wichtig wurde und die Wochenenden mit dir habe ich

als Ausgleich gebraucht und genossen.

Mein allergrößter Dank gilt aber meiner Familie, die mit großem Interesse und

tatkräftiger Hilfe immer für mich da war. Meiner Schwester Christina danke ich vor

allem für das Korrekturlesen in letzter Minute und das Beherrschen von

tausendundeiner Kommaregel. Insbesondere danke ich aber von ganzem Herzen

meinen Eltern Sonja und Karlheinz. Ihr habt mir sowohl das Studium als auch diese

Doktorarbeit mit eurer Geduld und eurer bedingungslosen Unterstützung in jeglicher

Hinsicht erst ermöglicht und immer an mich geglaubt. Ohne euch wär’s nicht

gegangen!!!