Coloración Bacteriana

COLORACION BACTERIANA

CURSO: Microbiología AmbientalINTEGRANTES:- Torpoco Cano, Evelyn- Bruno Grey, Karen V.- Chávez Yumpo, Betzy Y.- Zúñiga Luna , R. Alexander

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

Facultad de Ingeniería Ambiental y Recursos Naturales

PROFESORA: Blga. Beatriz Suyo L.SEMESTRE: 2015-B

DEFINICIÓN:

GRUPO CROMÓFORO

Son compuestos químicos que

poseen:

• otorga color a la molécula

GRUPO AUXOCROMO

• otorga al colorante la capacidad de disociarse electrolíticamente y por lo tanto, formar sales

• es el que facilita la unión del colorante a otras sustancias con carga eléctrica.

CLASIFICACIÓN

NATURALES

SINTÉTICOS

Básicamente son histológicos

Índigo

Orceína y Tornasol

Hematoxilina

Carmín

Se obtiene de la anilina, o es más exactamente del alquitrán de hulla.

los empleados con mayor frecuencia

• Por Origen:

CLASIFICACIÓN• Por Grupo

Funcional:COLORANTES BÁSICOS

Tiñen estructuras ácidas

SON SALES

Su grupo aminado forma una sal con un ácido, el cual es

soluble en agua

que están en relación con el componente básico de su molécula

el colorante será ácido (cuando posee carga negativa) o básico (cuando posee carga positiva).

Tiñe estructuras básicas

SON SALESque están con relación con el componente ácido de su molécula

Son colorantes citoplasmáticos

COLORANTES ÁCIDOS (colorante aniónico)

Ejm. Fucsina básica, Azul de metileno, Violeta de genciana, etc.

Ejm. Fucsina ácida, Rojo congo, Eosina, etc.

Ej. Giemsa, Wright, Leishman, etc

Ejm. La tinción argéntica

COLORANTES NEUTROS

COLORANTES INDIFERENTES

SON UNA MEZCLA DEColorante

ácidoColorante

básico

Colorean los tejidos

mecanismo de impregnación física

no poseen carácter ácido, básico o salino definido

COLORACIONES BACTERIANAS

Coloraciones simples

Emplean un único colorante

siempre es de tipo básico

Se utilizan solamente para incrementar el contraste

Ej. Coloración con azul de metileno, coloración con safranina, etc.

DIFERENCIA ENTRE TINCION Y COLORACION

La coloración químicamente ocurre a nivel superficial y la tinción a nivel molecular o incluso celular.

Coloraciones diferenciales

Distingue tipos de microorganismos

Ej. La tinción de Gram y la tinción de ácido alcohol resistencia

Tinciones negativas

Los colorantes no tiñen el microorganismo, sino el entorno

La muestra se extiende sobre una gota del colorante

Coloraciones específicas

Incrementan el contraste en las células microbianas

revelan estructuras particulares

Las endosporas

Los flagelos

Las cápsulas

COLORACIONES

BACTERIANAS

COLORACION SIMPLE Tiñe la superficie celular de los

microorganismos proporcionando información sobre su MORFOLOGÍA, definida por el tamaño, forma, agrupación, usando un UNICO COLORANTE.

COLORACION CON AZUL DE METILENOProtocolo

1• Extender la muestra en un portaobjetos.

2• Fijar la preparación al calor o al medio

ambiente.

3

• Lavar el exceso de colorante con agua.4

• Se agrega azul de metileno por 1 minuto.

5• Secar al aire o al mechero.

C16H18ClN3S

Cloruro de Metiltionina

1. Hisopado bucal.

2. Realización del protocolo mencionado.

3. Observación en el microscopio.

Ejemplo: Observación de la morfología bacteriana con Azul de Metileno

1. Hacer un extendido en un portaobjetos.

2. Cubra la muestra con azul de lactofenol.

3. Cubrir con el cubreobjetos.

4. Observar en el microscopio

COLORACIÓN CON AZUL DE LACTOFENOL

Protocolo- Fenol- Ácido láctico- Azul de algodón

Ejemplo: Identificación de las estructuras de los hongos con Azul de

Lactofenol

1. Colocar con un asa una cantidad de muestra en un portaobjetos limpio.

2. Realización del protocolo mencionado.

3. Observación en el microscopio.

TINCIÓN NEGATIVAC. SIMPLE INDIRECTA

2. Agregarle una gota de tinta china.

1. Colocar mediante un asa previamente esterilizada una cantidad de muestra en un portaobjetos limpio.

3. Cubrirlo con un cubreobjetos. Secar al aire y observar

Protocolo

COLORACION DIFERENCIAL La tinción diferencial es aquella en la cual

se usan dos o más colorantes o bien ciertos reactivos complementarios para la tinción y tienen como objetivo el diferenciar entre células bacterianas o entre partes de una misma célula.

Dentro de esta clasificación existen dos clases de coloraciones muy habituales, la tinción de Gram y la tinción de Ziehl – Neelsen.

Hans Christian Joachim Gram (1853 – 1938)

Fue un bacteriólogo danés que desarrolló la tinción de Gram, de amplio uso en microbiología.

En 1882 Paul Ehrlich publicó un método para colorear el bacilo de la tuberculosis y con esto Gram inició sus experimentos con la coloración de bacterias.

Analizó los tejidos de los fallecidos por neumonía, intentó establecer la diferencia entre dos bacterias causantes de neumonía: Klebsiella pneumoniae y el Neumococo.

Realizó la tinción con violeta de genciana, después la fijó con lugol; luego las lavó con etanol. Había bacterias que retenían el color y aparecían de color violeta al microscopio y otras que no, a estas bacterias las denominó Gram Positivo.

Gram señaló que “He publicado un método, aunque soy consciente de que todavía es defectuoso e imperfecto; pero deseo que en manos de otros investigadores pueda resultar de utilidad”.

Más tarde Carl Weigert incorporó un nuevo paso al proceso; añadió safranina después del lavado con etanol. De esta manera las bacterias que no retenían la coloración morada aparecían teñidas de rojo, y fueron llamadas Gram Negativo frente a las que sí se teñían primitivamente de violeta que eran las Gram Positivo.

Era un alemán judío patólogo.

TINCION DE GRAM

Gram Positivas

(+)

Gram Negativas

(-)

La tinción de Gram es una tinción deferencial porque no todas las células se

tiñen de la misma manera y permite diferenciar entre dos grandes grupos de

Eubacterias.

DIFERENCIAS EN LA PARED CELULARGram Positiva

(+) Gram Negativa (-)

N-Acetilglucosamida N-Acetilmurámico

Protocolo

1. Colocar mediante un asa previamente esterilizada una cantidad de muestra en un portaobjetos y dejar secar.

2. Cubrir con cristal violeta durante 1 minuto y luego lavar con agua.

3. Cubrir el preparado con Lugol durante 1 minuto y luego lavar.

4. Decolore con alcohol – acetona y lavar con agua.

5. Agregar un segundo colorante (Safranina).

6. Lavar con agua y dejar secar. Observar al microscopio.

Staphylococcus aureus (coco gram positivo) y Escherichia coli (bacilo gram negativo)

FUNDAMENTO

Franz Ziehl (1857 – 1926)

Fue un bacteriólogo alemán. Introdujo el colorante carbolfucsina para el bacilo de la

tuberculosis en 1882. Publicó su primer artículo sobre el bacilo de la

tuberculosis el 12 de agosto de 1882 y describió cómo modificar el método de Ehrlich cambiando el mordiente de anilina por ácido carbólico.

Friedrich Carl Adolf Neelsen (1854 – 1984)

Fue un patólogo alemán. Junto con el microbiólogo Franz Ziehl, Neelsen

desarrolló un método para la tinción de las bacterias ácido-resistentes, que se utiliza a este día en el diagnóstico de la tuberculosis y para detectar la presencia de otras micobacterias

Neelsen murió el 11 de abril de 1898, 44 años de edad, presumiblemente debido a la exposición de patógenos durante sus muchos años de investigación bacteriológica.

TINCIÓN DE ZIEHL - NEELSEN

Las micobacterias que resisten la decoloración se

llaman ácido alcohol resistentes (AAR) son coloreadas de rojo

por la Fucsina y retienen el color a pesar de la acción del ácido y

del alcohol.

La tinción de Ziehl - Neelsen es una coloración diferencial útil en la

identificación de Micobacterias y Nocardia, aunque no permite la

diferenciación de distintas especies.

Alto contenido de lípidos complejos (ácidos micólicos) y ceras que poseen algunos microorganismos en su pared celular.

CARACTERÍSTICAS DE LA PARED CELULAR

MICOBACTERIAS

Protocolo

Se hace el frotis

Se colorea con fucsina

fenicadaSe calienta en la

llama.Lavar con agua

inmediatamente y secar

Decolorar con ácido alcohol, quitando el

colorante.

Coloración de contraste de

azul metileno (1 minuto)

Lavar, secar y observar el

microscopio. Lavar con agua.

RESULTADOS

COLORACIONES

ESTRUCTURALESSon aquellas que utilizan más de un colorante sirven diferenciar distintas estructuras bacterianas.

TINCIONES PARA FLAGELOS:

FLAGELOS: Órganos de

locomoción. Filamentos simples

químicamente compuestos de proteína conocida como flagelina.

Espesor es alrededor de 0.01 micrones.

METODO DE

LEIFSON:

La tinción de flagelos de Leifson es una tinción simple que usa un colorante, la rosanilina y ácido tánico que engrosa los flagelos para que puedan verse.

PROCEDIMIENTO: Se fija químicamente la suspensión bacteriana,

mediante formol

Se deja secar al aire

Se cubre la preparación con una mezcla de ácido tánico y el colorante rosanilina

Se retira el exceso de colorante con agua.

Por último, se deja secar al aire, antes de su observación al microscopio

METODO DE RYU: PROCEDIMIENTO:

El método de Leifson fue modificado por Ryu y utiliza el cristal violeta en lugar de la fucsina, que hace más estables los reactivos a la temperatura ambiente.

Invertir y apretarlo suavemente para inundar el portaobjetos con el colorante para flagelos.

Dejar el colorante sobre el portaobjetos durante aproximadamente 4 minutos.

Quitar cuidadosamente el colorante del portaobjetos dejando correr agua sobre éste. No inclinar el portaobjetos.

Cuando se haya terminado de enjuagar el portaobjetos, inclinarlo un poco para dejar escurrir el agua sobrante. Dejar que el portaobjetos se seque al aire a temperatura ambiente.

Examinar el portaobjetos al microscopio con el objetivo de inmersión de aceite.

Las bacterias

y sus flagelos deben

teñirse de color

morado.

Tinción de Leifson

Tinción de Ryu

TINCION DE ESPORAS:

Las esporas son la forma de resistencia de las bacterias, tienen forma esférica u oval. Al microscopio sin teñir, presentan una estructura de granulo brillante.

METODO DE

Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales adversos. Estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio óptico como estructuras de difícil tinción.

WIRTZ

CONKLIN

1. Preparar los frotis bacterianos indicados.

2. Teñir con verde malaquita. Colocar la muestra encima de la llama del mechero de forma que el colorante humee durante 5 min.

3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.

4. Teñir con safranina 1 min. 5. Lavar con abundante agua el

exceso de colorante. 6. Secar la preparación. 7. Observar la preparación al

microscopio.

Procedimiento

Tinción de Corpúsculos

Metacromáticos

Muchas bacterias acumulan en su protoplasma grandes reservas de fosfato insolubles en agua. Estos son los gránulos metacromáticos o de velutina que aparecen como gránulos refráctiles, cuando se observan al microscopio sin teñir.

Un color diferente al del colorante primario

Permite la detección de la bacteria Cornebacterium.

Tienen alta afinidad por los colorantes catiónicos

Características:

Método De

AlbertFijar el frotis con calor

Echar colorante de Albert en la muestra. Agregar agua y dejar

secar-

Observar al microscopio

123

El colorante de Albert contiene verde malaquita.

METODO DE LOEFFLER

En este método esta solución es considerada como colorante de contraste, por lo que tiñe de color azul los tejidos de soporte y otras estructuras orgánicas de los bacilos.

Ejemplo: Observación de

bacillos difteroides saprofitos

1. Se fija el frotis con calor

2. Se echa el colorante azul de metileno

3. Se agrega agua destilada. Se deja secar.

4. Se observa al microscopio

Tinción de Cápsulas

MICROBIOLOGIA GENERAL - COLORACIONES MICROBIANAS

1 Tiene una composición de carácter proteico.

2

3

Son consideradas como un factor de virulencia.

Poseen un espesor variable.

4 Su teñido es más dificultosoLos métodos de tinción para observar la capsula son el método de la Tinta china y el método de Hiss.


Método de La tinta china

Se observan bacterias incoloras sobre fondo oscuro, La capsula aparece en forma de hablo claro que rodea el cuerpo de la bacteria.

Resultado

Procedimiento1. Hacer un extendido a partir de un cultivo bacteriano en un portaobjetos.2. Cubrir el extendido con tinta china.

3. Dejar secar y observar.

tinta china es una suspensión coloidal de

carbón.


Método de Hiss

Procedimiento

Hacer el frotis y dejar secar.

Una ver seco, teñir con el cristal violeta durante dos minutos

Lavar con la solución de sulfato cúprico.

Dejar secar al aire y se coloca en el microscopio para observar

Tinción de Espiroquetas-Las espiroquetas son bacterias Gram negativas largas, delgadas, helicoidales.-Treponema, Borrelia y Leptospira.



Método de Vago

Secar y observar.

lavar con agua corriente.

Cubrir con mercuro cromo durante 3 minutos

Fijar el frotis al calor suavemente.


TINCIONES ESPECIALES Este tipo de tinciones se emplean para visualizar ciertas estructuras bacterianas afines con colorantes fluorescentesLos colorantes fluorocromos iluminan con luz especial como: naranja de acridina, rodamina-auramina y el blanco calcoflúor.


Tinción de Rodamina-auramina 1. Extender, secar y fijar.

2. Teñir con Rodamina-Auramina.

3. Decolorar con alcohol-ácido y luego durante 2 minutos y lavar con agua destilada.

4. Contrastar con colorante de contraste 2 a 3 minutos.

5. Lavar, secar y observar al microscopio de fluorescencia.

Procedimiento

Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina.


Tinción de Naranja de acridina

1. Se extiende y se seca la preparación. 2. Fijar los frotis por calor. 3. Cubrir la preparación con el colorante

y se deja durante 2 a 3 minutos.4. Lavar con agua y secar al aire. 5. Observar la preparación con objetivo

de inmersión en microscopio de fluorescencia.

Procedimiento

Su funcionamiento se trata de la unión selectiva del naranja de acridina al ADN bacteriano


Tinción de blanco calcofluor

Procedimiento

1. Depositar la muestra sobre un portaobjetos.2.Agregar una gota de solución del fluorocromo (blanco de calcoflúor) y una gota de KOH al 10%.3. Dejar secar y observar.Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflúor aumentando considerablemente su visibilidad


GRACIAS

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