Purificao de

Carboidratos

Disciplina: Bioqumica de Carboidratos

Profa Dra Marisa A. Nogueira Diaz

Anlise de Carboidratos

Polissacardeos Oligossacardeos

Hidrlise cida total, derivatizao e Cromatografia gasosa

Composio de monossacardeos

Metilao Posio das ligaes glicosdicas

Hidrlise enzimtica com glicosidases especficas

Sequncia de monossacardeos

Posio das unidades monossacardicas

RMN e espectrometria de massa

Confirmao dos dados de metilao

Posio e configurao das ligaes glicosdicas

Mtodos baseados em caractersticas fsico-qumicas das biomolculas:

1. Tamanho Massa Densidade (ex: centrifugao, dilise, gel-filtrao)

2. Carga eltrica (ex: cromatografia de troca inica, eletroforese)

3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa)

Mtodos baseados em afinidade biolgica, que exploram a interao entre

duas molculas:

4. Cromatografia de afinidade (pressupe que uma das molculas do par que

interage um reagente de fcil obteno, disponvel comercialmente)

Mtodos de Isolamento de Biomolculas

Que caractersticas devem ter as resina cromatogrficas para

possibilitar separaes de molculas baseadas em diferentes

propriedades ?

Cromatografia de permeao em gel ou gel-filtrao:

separao de molculas pela massa molecular

gis so porosos, funcionando como peneiras ou filtros

Cromatografia de troca inica:

separao de molculas pela carga eltrica

gis apresentam grupos carregados positiva ou negativamente

Cromatografia de partio (fase reversa ou hidrofbica):

separao de molculas pela solubilidade relativa em meio aquoso

gis possuem carter hidrofbico

Cromatografia de afinidade:

separao de molculas pela capacidade de interagir com um ligante

gis possuem ligante especfico ligado covalente resina

Oligo e polissacardeos podem ser purificados por mtodos cromatogrficos como: Excluso ou gel filtrao Troca inica HPLC Eletroforese Eletroforese capilar

Purificao de Carboidratos

Funcionamento Bsico de uma Coluna Cromatogrfica

Uma coluna um tubo cilindrco aberto nas duas

extremidades e preenchido com a resina ou matriz ou gel

cromatogrfico. A coluna constantemente alimentada

com lquido (tampo/solvente), banhando a resina e

forando o contacto desta e as molculas que esto

sendo analisadas.

Co

nce

ntr

ao

Tempo ou volume

Coletor de

fraes

Tempo 1

Mais solvente

colocado na

coluna, forando

os componentes

da amostra a

interagirem com a

resina

Componentes da

amostra se separam

e saem da coluna

com diferentes

volumes de solvente

Tempo 2 Tempo n

Lquido que

sae da

coluna

recolhido em

tubos de um

coletor de

fraes

Os componentes da mistura so separados

por interao diferenciada com a resina, com

base em propriedades moleculares como:

massa molecular

carga eltrica

solubilidade

afinidade

Um cromatograma, como o

grfico ao lado, a maneira usual

de se representar o resultado de

uma cromatografia.

Amostra com

diferentes

componentes

Resina

embebida

em

solvente

Tempo zero

Abaixo est representado o esquema geral de uma cromatografia:

Compostos separados

Tampo

poroso

Amostra

Cromatografia Centrnfuga (Chromatroton)

Chromatotron

uma cromatografia em camada

delgada preparativa e acelerada

centrifugamente. Substitui as

CCD preparativas, pequenas

colunas e HPLC. Com

dimensies ~ 30 cm.

A amostra a ser

separada aplicada

como uma soluo

no centro do disco

giratrio umedecido

com o solvente.

A eluio com solvente gera

bandas circulares de separao

dos componentes que so

removidos juntamente com o

solvente para um tubo de

recepo.

Cromatografia de excluso ou

gel filtrao

Cromatografia de gel filtrao ou peneira molecular

gros (beads) da

resina com poros

gro da resina poroso

amostra grande

amostra pequena

Solvente

empurra

molculas

atravs da

resina

tubos

Na gel-filtrao, os carboidratos que penetram nos poros da resina precisam diferentes

volumes de solvente para sarem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os

canais internos dos gros. Quanto maior o nmero de gros que cada molcula entra durante o

percurso atravs da coluna, maior o volume necessrio para sua sada.

Compostos maiores que o dimetro dos poros no so separadas e saem da coluna com

pouco solvente, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos gros, tambm chamado de

volume morto (Vo).

Compostos menores que o dimetro dos poros no so separadas e saem da coluna com

um volume de solvente correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do prprio

gel).

Molculas com massas diferentes

Fluxo do solvente

Cromatografia de troca inica

Cromatografia de troca inica

A resina para cromatografia de troca inica apresenta carga eltrica,

positiva ou negativa, em uma ampla faixa de pH.

Trocadora de nions Trocadora de ctions

DEAE CM

Existem dois tipos bsicos: resinas trocadoras de nions (possuem carga

positiva), como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de ctions

(possuem carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose

- -

-

- - - -

O grfico mostra que essas resinas mantm suas cargas em uma

ampla faixa de pH. Assim, o DEAE-celulose pode ser utilizado em pH

abaixo de 10, enquanto que o CM-celulose utilizado em pH acima de

4, condies em que pelo menos 50% dos grupos dessas resinas

esto carregados.

Cromatografia de troca inica

Como funciona a Cromatografia de Troca Inica

A cromatografia de troca inica

compreende duas etapas:

1) adsoro das amostras com

carga contrria resina, e sada

da coluna das amostras com a

mesma carga;

2) eluio das amostras

adsorvidas.

Para a eluio, as condies de

adsoro da coluna (pH ou fora

inica) so alteradas para

neutralizar a interao entre as

amostras e a resina.

Adsoro

Molculas com a mesma carga,

ou sem carga, no interagem com a

resina, sendo as primeiras a sair da

coluna.

No exemplo, como funciona uma resina catinica ou

trocadora de nions, como o DEAE-celulose):

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+ +

+

+

+

+

+ +

+

+

+

+

Eluio

+

+

+

+

+

+

+

+

Adio de sal ao tampo

resulta em competio

entre os ons em soluo e

as molculas adsorvidas

na resina.

Na+Cl- +

Na+Cl- +

Carboximetil~celulose

(trocadora de ctions) Dietilaminoetil~celulose

(trocadora de nions)

Duas Modalidades de Cromatografia de Troca Inica

_

=

= _

+

+ + + +

(+)

(+)

(+)

(+)

0. 10 M

0. 15 M

0. 20 M

Eluio NaCl

No retidas

DEAE

Eluio NaCl

No retidas

+ +

0. 10 M

0. 15 M

0. 20 M

+

(-)

(-)

(-)

+ + +

_ =

= _ (-)

CM

HPLC

HPLC: high performance (pressure) liquid chromatography

Inicialmente desenvolvida para cromatografia de fase reversa em coluna, hoje em

dia abrange aplicaes para todos os tipos de cromatografias.

Caracterstica diferencial da cromatografia convencional:

partculas de resina com dimetro muito pequeno (poucos microns)

aumento da eficincia da separao em funo do nmero maior de gros de

resina em um mesmo volume da coluna

fase mvel - necessita bomba de alta presso para ter fluxo atravs da

coluna

Desenho bsico de um HPLC

bombas Injetor de

amostra

Coluna e

forno

Coletor de

fraes

Detector

Controle e

anlise dos

dados

Duas bombas permitem eluio em

gradiente

Detector: ndice de refrao, absorbncia

UV ou Vis, fluorescncia, etc.

Coluna pode ser aquecida para melhorar a

eluio diferencial na fase reversa

Manual

Automtico

CN Fenil NH2 C4 C8 C18

Reteno na coluna: aumenta com o tamanho da

cadeia

Condio de equilbrio: em meio cido

(0.1% de cido trifluoroactico) para

aumentar hidrofobicidade (protonar as

carboxilas)

Eluio com gradiente crescente de solvente

orgnico miscvel com gua - acetonitrila,

metanol, propanol

Fase reversa: resinas de slica derivatizadas com hidrocarbonetos de 2 C a 18 C

Fase estacionria Funo

C18 Si (CH3)2 C18 H37

C8 Si (CH3)2 C8 H17

tC2 Si C2 H5

Aminopropyl Si (CH2)3 NH2

Cyanopropyl Si (CH3)2 (CH2)3CN

Diol Si (CH2)3 OCH2CH(OH)CH2OH

Ab

sorb

n

cia

a 2

14 n

m

Tempo ou volume de reteno

% d

e a

ceto

nit

ril

a

100 Molculas

no retidas Molculas

retidas

Cromatograma de uma coluna de fase reversa, com eluio por um gradiente de acetonitrila

Fases Estacionrias

Colunas

Dimetros 15 21,2 30 50 mm

Tamanho de 50 600 mm

Partculas de 10 e 15 m

Vrias fases disponveis

Para processos de Purificao

Dimetros 4.6 X 250 mm

Partculas de 5 10 20

Tamanho de poro 50 a 10^6

Fases: C5 C18 C8 CN

SILICA PHENYL NH2 SCX

Para processos analticos

Tipos de Colunas

Analticas e semi-preparativas

Preparativas

Bombas

Isocrtica

Gradiente

Quando se usa um s eluente

Quando se usa mais de um

eluente

Detectores

UV/VIS Fluorescncia ndice de Refrao

Eletroqumico Condutividade

Cromatografia Lquida/Espectrmetro de Massas

LC/MS

Cromatografia Lquida/Espectrmetro de Ressonncia

LC/RMN

Chromatographic separation

of oligosaccharides

HPLC RI chromatograms:

(A) standard 100 mg/L, (B)

sample B, (C) sample B

spiked with tetraose

(3 mg/L) and (D) sample B

spiked with pentaose (3

mg/L).

Eletroforese Capilar

Envolve a aplicao de alta voltagem,

tipicamente 5 a 30 kV em um capilar de dimetro

reduzido gerando correntes na faixa de 10 a 100

mA.

As separaes em EC so baseadas na

presena de um fluxo eletricamente induzido,

denominado fluxo eletroosmtico (FEO),

um fenmeno eletrofortico que gera o

fluxo da soluo dentro do capilar, que faz com

que os solutos se movimentem em direo ao

detector.

Este fluxo pode reduzir significativamente

o tempo de anlise ou forar um on a reverter a

sua tendncia de migrao em direo a um

eletrodo, pelo qual est sendo atrado, devido

ao sinal de sua carga.

Fluxo Eletroosmtico

A parede do capilar de slica contm grupos

silanis (SiOH) os quais se ionizam (SiO- + H+)

quando em contato com solues tampo com pH

altos.

Esta dissociao produz uma superfcie

carregada negativamente. Uma camada de contra-

on (ctions) ento formada prxima parede do

capilar a fim de manter a eletroneutralidade.

Isto forma a dupla camada e cria uma diferena

de potencial muito prxima parede e este

fenmeno conhecido como potencial zeta.

Figura - Migrao dos ons metlicos em direo ao ctodo

Este movimento de ons resulta no movimento

das espcies em direo ao detector e pode ser

considerado como um fluxo eletricamente dirigido.

Gera o movimento das espcies apesar da carga para a mesma direo

A dependncia do fluxo eletroosmtico em funo do pH

Abaixo de pH 4, a ionizao dos grupos silanis

pequena e o FEO no significante, enquanto que acima

de pH 9 os silanis ficam completamente ionizados e

portanto o FEO alto.

Exemplo de um eletroferograma

Saem mais rpido, so atridos pelo ctodo

Saem mais

lento, so

atridos pelo

nodo

Figura - Perfil do fluxo eletroosmtico, comparado com o do fluxo pressurisado

CLAE EC

EC, diferentemente das tcnicas

cromatogrficas (Cromatografia Gasosa-

CG e Cromatografia Lquida de Alta

Eficincia-CLAE), a amostra no injetada

e sim introduzida no capilar pelo lado mais

distante do detector.

Esquemas para a introduo de amostras

Injeo eletrocintica

Insero do capilar e do eletrodo no

frasco da amostra seguida da aplicao de

uma voltagem, sendo que solutos neutros

so arrastados pelo FEO, ao passo que

solutos carregados iro migrar para dentro

do capilar, por causa do FEO e tambm da

migrao eletrofortica.

Volumes tpicos de injeo so de 10 a

100 nL.

O modo de injeo mais empregado em

EC o denominado hidrodinmico, onde o

capilar mergulhado em um frasco contendo

a amostra o qual em seguida pressurizado,

submetido ao vcuo ou erguido (efeito sifo)

provocando a entrada de um certo volume de

amostra no capilar

A separao de ons a forma mais simples de EC e

denominada eletroforese capilar em soluo livre. A

separao em ECSL

Baseia-se nas diferenas nas mobilidades eletroforticas

resultantes das diferentes velocidades de migraes de

espcies inicas no tampo, contido dentro do capilar.

Eletroforese Capilar em Soluo Livre (ECSL)

A ECCM foi inicialmente desenvolvida para a

resoluo de compostos neutros, os quais no podem ser

separados usando simplesmente a ECSL.

A separao baseada na partio das molculas

entre a fase micelar (pseudo-fase estacionria) e o tampo

aquoso. As micelas de SDS tm carga negativa e migram

contra o FEO.

Eletrocromatografia Capilar Micelar (ECCM)

Dodecil-sulfato de sdio

Detectores

O detector mais frequentemente utilizado

em EC o espectrofotomtrico de absoro no

UV/Vis devido sua natureza quase universal,

ou seja, pode ser aplicado na deteco de

vrias classes de substncias

Capillary electrophoresis has emerged as a

highly promising technique for the analysis of

mono- and oligosaccharides

Para carboidratos neutros necessrio fazer a

ionizao dos grupos hidroxilas;

Complexao das hidroxilas vicinais ou das

hidroxilas alternadas com grupos boratos;

Derivatisao com reagentes que possui grupos

ionizveis.

Electropherograms of a

standard solution containing

sucrose, glucose and fructose

with a concentration of

5.0 105 mol L1, under the

optimal CZE-AD conditions:

(a) sucrose; (b) glucose; (c)

fructose.

Electropherograms of the

honey (sample 1) being diluting

10,000 times under the optimal

CZE-AD conditions: (a) sucrose;

(b) glucose; (c) fructose.

Peak identification: 1, galactose; 2, glucose; 3, rhamnose; 4, mannose;

5, arabinose; 6, xylose. The peak of methanol indicates the electroosmotic

flow (EOF). Separation conditions: +17 kV, detection at 270 nm with direct

mode, injection pressure 0.5 psi for 6 s, capillary 50/60 cm (Ldet/Ltot),

separation temperature 20 C. Electrolyte solution: 130 mM NaOH36 mM

Na2HPO42H2O (pH 12.6).