Upload
doanhanh
View
238
Download
6
Embed Size (px)
Citation preview
2
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Tautvydas Bučnys
„Arcobacter spp. bakterijų paplitimas ir rūšinė įvairovė
šviežioje paukštienoje bei žaliame piene“
„Prevalence and species diversity of Arcobacter spp.
isolated from fresh poultry and raw milk“
Veterinarinės maisto saugos nuolatinių studijų programos
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: prof., dr.
Mindaugas Malakauskas
KAUNAS, 2015
3
DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Arcobacter spp. bakterijų paplitimas ir
rūšinė įvairovė šviežioje paukštienoje bei žaliame piene“.
1. Yra atliktas mano paties/pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
2015-04-30 Tautvydas Bučnys
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS
TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
2015-04-30 Tautvydas Bučnys
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO
2015-04-30 Prof. dr. Mindaugas Malakauskas
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE
Prof. dr. Mindaugas Malakauskas
(aprobacijos data) (katedros/instituto vedėjo/jos vardas,
pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
(gynimo komisijos sekretorės (-riaus) parašas)
4
TURINYS
SANTRAUKA ..................................................................................................................................... 6
SUMMARY ......................................................................................................................................... 7
SANTRUMPOS ................................................................................................................................... 8
ĮVADAS............................................................................................................................................... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA .................................................................................................. 10
1.1 Arcobacter spp. genties bakterijos ........................................................................................... 10
1.1.1 Arcobacter spp. klasifikacija............................................................................................. 10
1.1.2 Morfologija ir biologinės savybės..................................................................................... 11
1.2 Arkobakterijų paplitimas maisto gamybos grandinėje ............................................................. 11
1.2.1 Maisto žaliavų užkrėstumas arkobakterijomis .................................................................. 11
1.2.2 Maisto produkų užkrėstumas arkobakterijomis ................................................................ 13
1.2.3 Arkobakterijų išgyvenimas maisto produktuose ............................................................... 14
1.3 Arkobakterijų sąsajos su žmonių susirgimais ŪŽIL ................................................................ 14
1.3.1 Žmonių arkobakteriozė ..................................................................................................... 14
1.3.2 Galimi užsikrėtimo šaltiniai .............................................................................................. 15
1.3.3 Ligos simptomai ir patogenezė ......................................................................................... 15
1.3.4 Gydymas ir profilaktika .................................................................................................... 16
1.4 Arkobakterijų atsparumas antibakterinėms medžiagoms ........................................................ 17
1.5 Arcobacter spp. genties bakterijų identifikavimas ................................................................... 18
2. MEDŽIAGOS IR METODAI .................................................................................................... 21
2.1 Tyrimų planas .......................................................................................................................... 21
2.2 Arcobacter spp. išskyrimas iš maisto mėginių ......................................................................... 21
2.3 Arkobakterijų identifikavimas PGR metodu ............................................................................ 22
2.3.1 Arcobacter spp. DNR išskyrimas...................................................................................... 22
2.3.2 Arcobacter spp. identifikavimas PGR metodu ................................................................. 22
2.4 Atsparumo antibakterinėms medžiagoms nustatymas ............................................................. 23
2.5 Statistinė duomenų analizė ....................................................................................................... 24
3. REZULTATAI ........................................................................................................................... 25
3.1 Šviežios paukštienos ir žalio pieno užkrėstumas Arcobacter spp. bakterijomis ...................... 25
3.2 Išskirtų arkobakterijų rūšinė įvairovė ...................................................................................... 26
3.3 Arkobakterijų atsparumas antibiotikams ................................................................................. 28
3.3.1 Arkobakterijų išskirtų iš šviežios paukštienos atsparumas antibiotikams ........................ 28
3.3.2 Arkobakterijų išskirtų iš žalio pieno atsparumas antibiotikams ....................................... 29
5
4. REZULTATŲ APTARIMAS ..................................................................................................... 30
5. IŠVADOS ................................................................................................................................... 35
6. REKOMENDACIJOS ................................................................................................................ 36
7. PADĖKOS .................................................................................................................................. 37
8. LITERATŪROS SĄRAŠAS ...................................................................................................... 38
6
SANTRAUKA
Arcobacter spp. bakterijų paplitimas ir rūšinė įvairovė šviežioje paukštienoje bei žaliame
piene
Baigiamasis magistro darbas
Darbo vadovas: prof. dr. Mindaugas Malakauskas
Lietuvos sveikatos mokslų universitetas
Veterinarijos akademija, Veterinarijos fakultetas
Maisto saugos ir kokybės katedra
Kaunas, 2015
Darbo apimtis 41 puslapis, 6 lentelės, 6 paveikslai.
Darbo tikslas buvo įvertinti mažmeninėje prekyboje parduodamos šviežios paukštienos bei
žalio pieno užkrėstumą Arcobacter spp. bakterijomis. Tyrimo metu iš viso ištirta 50 šviežios
paukštienos bei 60 žalio pieno mėginių. Arkobakterijos iš maisto mėginių buvo išskirtos atlikus
selektyvų pagausinimą specifiniame Arcobacter sultinyje su penkių antibiotikų priedu, o po to
tiesiogiai sėjant ant mCCDA agaro su CAT priedu. Arkobakterijos iki rūšies buvo identifikuojamos
naudojant šiek tiek modifikuotą Douidah ir bendraautorių (2010) aprašytą PGR metodą. Taip pat
atliktas iš maisto mėginių išskirtų arkobakterijų izoliatų atsparumo antibiotikams (ciprofloksacinui,
eritromicinui, tetraciklinui, gentamicinui ir ceftriaksonui) įvertinimas agaro praskiedimo metodu.
Tyrimai parodė, kad 23 iš 50 tirtų šviežios paukštienos mėginių (46%) buvo užkrėsti
Arcobacter genties bakterijomis. Tuo tarpu žalio pieno mėginiuose šios bakterijos buvo rastos tik
11 iš 60 tirtų mėginių (18,22%). Šviežia paukštiena dažniausiai buvo užkrėsta A. butlzeri (69,56%),
rečiau A. cryaerophilus (17,39%), A. cibarius (8,69%) ir A. skirrowii (4,34%) rūšies
arkobakterijomis. Žalias pienas buvo išskirtinai užkrėstas tik A. butzleri rūšies arkobakterijomis.
Atlikus arkobakterijų, išskirtų iš šviežios paukštienos atsparumą antibakterinėms medžiagoms
nustatyta, kad A. cryaerophilus jautriausios tetraciklinui (MSK 0,5 µg/ml), o atspariausios
eritromicinui ir ciprofloksacinui (MSK 4 µg/ml). A. cibarius jautriausios ciprofloksacinui ir
tetraciklinui (MSK 0,5 µg/ml), o atspariausios eritromicinui (MSK 2 µg/ml). A. skirrowii
atsparumas visiems tirtiems antibiotikams siekė 0,5 µg/ml.
Nustatyta, kad A. butzleri išskirtos iš šviežios paukštienos pasižymėjo didesniu atsparumu
eritromicinui (MSK 16 µg/ml) ir ceftriaksonui (MSK 8 µg/ml) nei išskirtos iš pieno (MSK
eritromicinui 8 µg/ml ir ceftriaksonui 4 µg/ml).
Raktiniai žodžiai: Arcobacter spp., užkrėstumas, paukštiena, žalias pienas, atsparumas
antibiotikams.
7
SUMMARY
Prevalence and species diversity of Arcobacter spp. isolated from fresh poultry and raw milk
Master thesis
Thesis supervisor: prof. dr. Mindaugas Malakauskas
Lithuanian University of Health Science
Veterinary Academy
Faculty of Veterinary
Departament of Food Safety and Quality
Kaunas, 2015
The coverage of the work: 41 pages, 6 tables, 6 pictures.
The aim of this study was to evaluate contamination of fresh poultry and raw milk products
with Arcobacter spp. sold at the retail sale. A total of 50 fresh poultry and 60 raw milk samples
were collected and tested. Arcobacters from food samples were isolated by selective enrichment in
Arcobacter broth with 5 antibiotics supplement and then accomplished dirrect inoculation on
mCCDA agar with CAT supplement. Arcobacter species were identified by PCR method described
by Douidah and co-authors (2010) with some modifications. Then was carried out evaluation of
arcobacters, isolated from food samples, resistance to antibiotics (ciprofloxacin, erythromycin,
tetracycline, gentamicin and ceftriaxone) by agar dilution method.
The study showed that out of the 50 tested fresh poultry samples 23 (46%) were contaminated
with arcobacters while in raw milk samples these bacteria were found in 11 out of 60 tested samples
(18,22%). Fresh poultry were contaminated mostly with A. butzleri (69,56%), following A.
cryaerophilus (17,39%), A. cibarius (8,69%) and A. skirrowii (4,34%). Raw milk was contaminated
only with A. butzleri. Examination of antibiotic resistance of Arcobacter spp. isolated from fresh
poultry samples showed, that A. cryaerophilus strains were most sensitive to tetracycline (MIC 0,5
µg/ml), but resistant to erythromycin and ciprofloksacin (MIC 4µg/ml). A. cibarius strains were
mosty sensitive to ciprofloksacin and tetracykline (MIC 0,5 µg/ml), but resistant to erythromycin
(MIC 2 µg/ml). A. skirrowii resistance to all antibiotics was 0,5 µg/ml.
Our findings revealed that A. butzleri isolated from fresh poultry were characterized in higher
resistance (erythromycin 16 µg/ml, ceftriaxone 8 µg/ml) then isolated from raw milk (erythromycin
8 µg/ml, ceftriaxone 4 µg/ml).
Key words: Arcobacter spp., comtamination, poultry meat, raw milk, antibiotic resistance.
8
SANTRUMPOS
µg – mikrogramai
µm – mikrometrai
µl – mikrolitrai
ml – mililitrai
pH – vandenilio potencialas
bp – bazių pora
DNR – deoksiribonukleorūgštis
rRNR – ribosominė ribonukleino rūgštis
ELISA – imonofermentinis metodas
KSV – kolonijas sudarantys vienetai
MIC – minimali inhibuojanti koncentracija
MSK – minimali slopinanti koncentracija
df – laisvų narių skaičius
9
ĮVADAS
Arkobakteriozė – žmonių ūmi žarnyno infekcinė liga, kurią sukelia Arcobacter genčiai
priklausančios bakterijos. Dauguma naminių gyvūnų ir paukščių yra dažnai užsikrėtę
arkobakterijomis, tačiau jie suserga labai retai ir yra vienas iš pagrindinių šių patogeninių bakterijų
rezervuaras. Gyvūnų mėsa skirta maistui dažniausiai užkrečiama arkobakterijomis skerdimo metu, o
maisto produktai – kryžminės taršos būdu. Dažniausiai žmonių susirgimai arkobakterioze siejami su
paukštienos ir jos subroduktų, nepasterizuoto pieno vartojimu, užterštu geriamuoju vandeniu arba
higienos reikalavimų nesilaikymu maisto ruošimo metu [1].
Arkobakteriozė dažniausiai sukelia Arcobacter buzleri, Arcobacter cryaerophilus ir
Arcobacter skirrowii, tačiau yra ir kitų arkobakterijų rūšių, galinčių sukelti susirgimus žmonėms.
Tai ketvirta pagal dažnumą kampilobakteriozės tipo apsinuodijų sukėlėja. Nors yra atlikta nemažai
eksperimentinių tyrimų, tačiau tikslios šią zoonozę galinčios sukelti sukeliančios infekcinės dozės
nėra nustatyta. Visgi turima duomenų, kad didelę įtaką šiam susirgimui lemia ligonio organizmo
atsparumas, amžius bei kitos individualios savybės. Paprastai arkobakteriozė pasireiškia gausia
vandeninga diarėja su pilvo skausmais, pykinimu, vėmimu bei karščiavimu. Ligos simptomai gali
trukti 2 – 5 dienas [1; 2; 3].
Kadangi Lietuvoje iš viso nėra jokių duomenų apie arkobakterijas ir jų paplitimą maisto
produktuose, taip pat galimus susirgimus šia zoonoze, todėl siekėme būti vieni iš pirmųjų, atliekant
tokio pobūdžio tyrimus Lietuvoje.
Darbo tikslas: įvertinti šviežios paukštienos bei žalio pieno užkrėstumą Arcobacter spp.
bakterijomis.
Darbo uždaviniai:
1. Įsisavinti naujausius Arcobacter spp. mikrobiologinius maisto produktų tyrimo
metodus.
2. Įvertinti šviežios paukštienos bei žalio pieno užkrėstumą Arcobacter spp.
bakterijomis.
3. Įvertinti Arcobacter spp. rūšinę įvairovę šviežioje paukštienoje bei žaliame piene.
4. Nustatyti Arcobacter spp. bakterijų atsparumą antibakterinėms medžiagoms.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Arcobacter spp. genties bakterijos
Arkobakterijų gentis priklauso Campylobacteracea šeimai. Pirmą kartą išskirtos iš galvijų
abortuotų vaisių 1977m. [3]. Šis genties pavadinimas buvo suteiktas aerotolerantiškoms ir
gebančioms vystytis žemoje temperatūroje bakterijoms. Šios bakterijos kaip patogenai plačiai
paplitę maisto produktuose bei geriamajame vandenyje ir gali sukelti susirgimus žmonėms. A.
butzleri bei A. cryaerophilus buvo išskirtos iš klinikinių žmonių mėginių, sirgusių diarėja ar įvykus
abortui. Belgijoje ir Prancūzijoje šios minėtos dvi arkobakterijų rūšys dažniausiai aptinkamos
klinikiniuose žmonių išmatų mėginiuose [4]. Taip pat šių rūšių bakterijos išskirtos ir iš mastitu bei
diarėja sirgusių gyvulių. Kita arkobakterijų genties bakterijų rūšis – A. skirrowii siejama su
chroniška diarėja vyresniems pacientams [2].
1.1.1 Arcobacter spp. klasifikacija
Šiuo metu Arcobacter genčiai priklauso 17 bakterijų rūšių: A. butlzeri, A. cryaerophilus
(Grupės A ir B), A. skirrowii, A. nitrofigilis, A. cibarius, A. halophilus, A. molluscorum, A. defluvii,
A. marinus, A. trophiarum, A. mitily, A. thereius [3], A. cloacea, A. ellisii, A. bivalviorum, A.
venerupis ir A. suis [5]. Pagal kilmę Campylobacter cryaerophila pervadinta į Arcobacter
cryaerophilus. Vėliau viena iš šios bakterijos (Arcobacter cryaerophilus) padermių pervadinta į
Arcobacter butzleri [6].
Kartu su Helicobacter, Wolinella ir Sulfurospirillum gentimis arkobakterijos sudaro
svarbiausią rRNR VI superšeimą (1 pav.), arba yra priskiriamos Proteobacteria klasės ɛ grupės
bakterijoms.
1 pav. Arcobacter spp. klasifikacija pagal 16S rRNR geną [6].
11
Iš visų 17 arkobakterijų rūšių - 11 (A. nitrofigilis, A. halophilus, A. molluscorum, A. defluvii,
A. marinus, A. mitily, A. cloacea, A. ellisii, A. bivalviorum, A. venerupis ir A. suis) dažniausiai
išskiriamos iš aplinkos mėginių, o likusios 6 (A. butzleri, A. cryaerophilus, A. skirrowii, A.
trophiarum, A. cibarius ir A. thereius) išskiriamos iš klinikinių žmonių arba gyvūnų išmatų mėginių
[6].
A. skirrowii rūšis pirmiausia buvo išskirta iš ėriukų, sirgusių diarėja, vėliau taip pat išskirta iš
galvijų organų, kiaulių ir avių aborto liekanų, išmatų, vandens mėginių. Kita arkobakterijų genčiai
priskiriama A. cibarius rūšis yra laikoma kaip artimiausias A. cryaerophilus filogenetinis kaimynas.
Ir pirmiausia A. cibarius rūšis buvo išskirta iš paukščių skerdenų. A.thereius išskirta iš abortuotų
kiaulių vaisių (paršelių) organų, taip pat ančių išmatų. A. mytili išskirta iš midijų. A.nitrofigilis yra
azotą fiksuojanti bakterijų rūšis, išskirta iš pelkėse augančių Spartina alterniflora šaknų. A.halophilus
išskirta iš vandens mėginių, paimtų netoli Havajų salų esančiose lagūnose [7; 8].
1.1.2 Morfologija ir biologinės savybės
Arcobacter spp. genties bakterijos yra mažos 0,2 – 0,4 µm. pločio ir 1 – 3 µm. ilgio, išlenktos
arba S formos, Gram neigiamos, sporų neformuojančios, tačiau gebančios sudaryti bioplėveles,
lazdelės. Tai dažniausiai judrios, vieną poliarinį žiuželį turinčios bakterijos. Arkobakterijos gali
augti 15 – 42˚C temperatūroje aerobinėmis ir anaerobinėmis sąlygoms bei joms nėra būtinas
vandenilis (žr. 1 lentelę 11 psl.).
Jų gebėjimas augti 15˚C temperatūroje mikroaerofilinėmis sąlygomis būtent ir skiria nuo
giminingų kampilobakterijų. Optimalus šių bakterijų pH yra 6 – 7 (A. butzleri) ar 7 – 7,5 (A.
cryaerophilus).
1.2 Arkobakterijų paplitimas maisto gamybos grandinėje
1.2.1 Maisto žaliavų užkrėstumas arkobakterijomis
Gyvūnai ir fekalijomis užterštas vanduo yra pagrindinis arkobakterijų šaltinis. Neretai
arkobakterijomis būna užkrėsta ir žalia bei nepakankamai termiškai apdorota gyvūnų mėsa [9].
Turima duomenų, kad arkobakterijos gali būti aptinkamos ir sveikų gyvūnų ekskrementuose.
Arkobakterijų paplitimas sveikų skerdžiamų naminių gyvūnų žarnyne ir fekalijose kelia didelę
grėsmę mėsos bei skerdenos užkrėstumui šiomis bakterijomis. Tačiau arkobakterijos retai
išskiriamos iš naminių paukščių virškinamojo trakto turinio, todėl skerdenos užterštumo šaltinis
lieka iki galo neaiškus [3].
12
1 lentelė. Arkobakterijų biologinės savybės [3].
Bakterijų savybės 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Augimo sąlygos:
+ + + + V + + + N N N N Deguonis +25˚C
Deguonis +37˚C - + V + - V + N + - + +
Mikroaerobinės sąlygos +37˚C - + V + + - + V + - + +
2% NaCl V V V + - + + N N N N N
4% NaCl - - - + - + + + + - - +
Gebėjimas augti ant terpių:
+ - - - - - - N N - - - Mitybinė terpė su 1% glicinu
MacConkey agaras V + V - + - - + N V + +
Minimal medium mitybinė terpė + + + - + - - - N - + -
Fermentinis aktyvumas:
+ V + + V + - + - + + + Katalazė
Oksidazė + + + + + + + + N N N N
Ureazė - - - - - + - - - - + -
Redukuoja nitratus + + V + - + + - + - + +
Indolo acetato hidrolizė + + + + + + + - + + + -
1 – A. thereius, 2 – A. butzleri, 3 – A. cryaerophilus, 4 – A. skirrowii, 5 – A. cibarius, 6 – A.
nitrofigilis, 7 – A. halophilus, 8 – A. mytili, 9 – A. marinus, 10 – A. trophiarum, 11 – A. defluvii, 12
– A. molluscorum.
+ ≥95% teigiamų padermių; - ≤11% neigiamų padermių; V 12 – 94% teigiamų padermių; N nėra
nustatyta.
Pastaruosius 10 metų atlikta nemažai tyrimų, siekant nustatyti arkobakterijų paplitimą
aplinkoje, maisto produktuose ir žaliavose. Japonijoje, Australijoje, Olandijoje, Belgijoje,
Ispanijoje, Italijoje atliktų tyrimų metu nustatyta, kad paukštienos užkrėstumas arkobakterijomis
siekia nuo 23 – 100%, ir yra ženkliai didesnis nei paplitimas raudonoje mėsoje, pavyzdžiui,
kiaulienoje ir jautienoje (2 – 51,5%). Tokie rezultatai sudaro prielaidas manyti, kad paukštiena gali
būti arkobakterijų rezervuaras (žr. 2 lentelę) [10].
2011 metais Malaizijoje atlikti tyrimai, kurių metu nustatyta, kad arkobakterijų paplitimas
paukštienoje (krūtinėlė, sparneliai, šlaunelės) siekė 39% ir identifikuota išskirtinai A. butlzeri rūšis.
Taip pat šviežia paukštiena (41%) buvo labiau užkrėsta arkobakterijomos negu šaldyta (37%) [10].
13
Arkobakterijų paplitimas paukštienoje yra didžiausias lyginant su kitais produktais ir siekia
24 – 96%, tuo tarpu kiaulienoje – 53%, jautienoje – 33 – 40%, jūros produktuose – 40%, vandenyje
3 – 50% [11].
2 lentelė. Arkobakterijų paplitimas gyvūninės kilmės maisto žaliavose [3].
Šalis Mėginių rūšis Arkobakterijų paplitimas (%)
Malaizija Jautiena 38
Belgija Jautiena 31,3
Australija Ėriena 15
Meksika Liesa kiauliena 51,5
JAV Kiauliena 54
Belgija Kiauliena 21
Airija Karvės pienas 46
Belgija Karvės pienas 3,18
1.2.2 Maisto produkų užkrėstumas arkobakterijomis
2014 metais Turkijoje atlikti tyrimai, kurių metu nustatytas karvių, buivolų pieno bei
kaimiškų sūrių užkrėstumas arkobakterijomis. Karvės pieno užkrėstumas arkobakterijomis sudarė
36% ir dažniausiai aptinkamos A. butzleri (38.89%), A. cryaerophilus (22.23%), A. skirrowii
(11.12%) bakterijų rūšys. Buivolų pieno užkrėstumas siekė 48% ir dažniausiai buvo aptinkamos A.
cryaerophilus (33.33%), A. cibarius (20.83%), A. butzleri (12.50%) rūšys. Atitinkamai šviežių
kaimiškų sūrių užkrėstumas Arcobacter spp. genties bakterijos sudarė 56%, iš kurių dažniausiai
aptiktos A. skirrowii (28.57%), A. butzleri (21.43%) ir A. cryaerophilus (14.29%) rūšys [12].
Revez ir bendraautoriai (2013) Suomijoje atliko tyrimus, siekiant išsiaiškinti arkobakterijų
paplitimą ir rūšinę įvairovę žaliame piene. Iš tirtų 177 pieno mėginių arkobakterijų atžvilgiu
teigiamų nustatyta 26 (15% užkrėstumas) iš kurių – 25 A. butzleri ir 1 A. cryaerophilus. Svarbu tai,
kad šios dvi rūšys buvo rastos tame pačiame mėginyje. Brazilijoje ir Turkijoje atlikti panašaus
pobūdžio tyrimai, kurie parodė esant mažesnį pieno užkrėstumą arkobakterijomis, atitinkamai 3% ir
6% [13].
Čilėje 2010 – 2013 metais vykdomi tyrimai, siekiant nustatyti galimą arkobakterijų paplitimą
dvigeldžiuose moliuskuose. Tyrimo laikotarpiu surinkta ir ištirta 106 mėginiai – 21 jūros moliuskas,
18 midijų, 20 austrių, 20 pailgųjų moliuskų, 11 šukučių ir 16 makrelių. Didžiausias arkobakterijų
paplitimas nustatytas makrelėse ir siekė 87,5%, pailguosiuose moliuskuose 65%, midijose 33%,
14
jūros moliuskuose 23,8%, šukutėse 18% ir austrėse 15%. Bendras dvigeldžių moliuskų užkrėstumas
siekė 40,5%. Dažniausiai aptinkama arkobakterijų rūšis A. butzleri (62%), A. cryaerophilus (21%),
A. skirrowii (16%) ir A. defluvii (1%). Tokie atlikto tyrimo rezultatai rodo, kad moliuskai gali būti
vienas iš arkobakteriozės užsikrėtimo šaltinių [14].
1.2.3 Arkobakterijų išgyvenimas maisto produktuose
Atlikti tyrimai, kuriais įrodyta, kad A. butzleri negali išgyventi paukštienoje 5˚C
temperatūroje, esant pH=5, arba kai pH=9, o NaCl koncentracija siekia 8% [15].
Optimali vystymosi temperatūra yra 25 – 35˚C, bet gali svyruoti 15 – 37˚C temperatūros
ribose. Tačiau nors ir ne taip intensyviai gali augti +4 – 8˚C temperatūroje. A. butzleri gali išgyventi
bei daugintis +5˚C temperatūroje, ir tai reiškia, kad šios bakterijos geba išlikti skerdyklų aplinkoje
bei laikino sandėliavimo sąlygose šaldytuvuose [16].
Arkobakterijos geba daugintis esant 3,5% – 4% NaCl, o išgyventi esant ir 5% NaCl (paprastai
maisto produktuose NaCl koncentracija siekia apie 2%) [3].
A. butzleri esant 64% santykinei drėgmei gali net 4 paras išbūti prisitvirtinusi prie
nerūdijančio plieno, stiklinių bei plastikinių paviršių [17]. Tačiau nuvalius minėtus paviršius 10%
etanolio tirpalu, šios bakterijos yra visiškai sunaikinamos [18].
Arcobacter spp. bakterijos gali būti inaktyvuojamos pakaitinant maisto produktus iki +70˚C
temperatūros ir veikiant jonizuojančia spinduliuote (0,27 – 0,30kGy) 10 sekundžių. >0,2% acto bei
citrinų rūgščių panaudojimas – efektyvi priemonė sumažinant produktų užkrėstumą A. butzleri
bakterijomis. Chloras taip pat gali būti naudojamas A. butzleri inaktyvavimui. Tinkamas vandens
chloravimas galėtų ženkliai sumažinti su užterštu vandeniu užsikrečiamos arkobakteriozės atvejų
skaičių [3].
1.3 Arkobakterijų sąsajos su žmonių susirgimais ŪŽIL
1.3.1 Žmonių arkobakteriozė
Žmonėms susirgimus dažniausiai sukelia A. butzleri rūšis siejama su septicemija ir enteritu,
tačiau A. cryaerophilus ir A. skirrowii buvo išskirtos iš pacientų, sirgusių diarėja, išmatų mėginių.
Arkobakterijozės simptomai yra panašūs į kampilobakteriozės, tačiau su ilgesne vandeninga, kartais
iki dviejų mėnesių trunkančia, diarėja. A.butzleri buvo nustatyta kaip ketvirta pagal dažnumą
kampilobakteriozės tipo apsinuodijimų sukėlėja Belgijos bei Prancūzijos pacientams ir dažniausiai
nustatyta vaikams bei vyresnio amžiaus asmenims, sergantiems lėtinėmis ligomis. A. cryaerophilus
15
išskirta iš pacientų, sirgusių diarėja ir septicemija, kai tuo tarpu A. skirrowii išskirta iš vyresnių
pacientų, sirgusių diarėja [10].
Atlikta studija tyrimų, siekiant išsiaiškinti Campylobacter, Helicobacter ir Arcobacter genties
bakterijų paplitimą iš Pietų Afrikos pacientų, sergančių ir nesergančių ŽIV, išmatų mėginių.
Nustatyta, kad A. butzleri buvo trečia pagal dažnumą nustatoma bakterijų rūšis (6,2%), po
Helicobacter pylori (50,6%) ir C. jejuni (10,2%). Visai neseniai išsiaiškinta, kad Arcobacter spp.
bakterijos gali būti siejamos su europiečių, keliaujančių po Meksiką, Gvatemalą ir Indiją, ūmiais
žarnyno apsinuodijimais (8% paplitimas) [1].
Arkobakterijos gali būti išskirtos ir iš sveikų žmonių išmatų mėginių. Šveicarijos skerdykloje
iš sveikų darbuotojų 1,4% išmatų mėginių buvo išskirtos A. cryaerophilus rūšies bakterijos. Kito
Pietų Afrikoje atlikto tyrimo metu A. bulzleri nustatyta 8,8% sveikų asmenų išmatų mėginiuose,
tačiau diarėja sergančių žmonių mėginiuose šios bakterijos buvo aptinkamos dažniau (12,9%) nei
žmonių, kuriems nepasireiškė jokie susirgimo požymiai[1].
1.3.2 Galimi užsikrėtimo šaltiniai
Arkobakterijų paplitimas vandenyje ir gyvūninės kilmės maisto produktuose, - tokiuose kaip
paukštiena, kiauliena ir jautiena, yra laikomas kaip pagrindinis arkobakteriozės užsikrėtimo šaltinis
žmonėms [19].
Be to, tyrimais įrodyta, kad žmonių kontaktas tarpusavyje ir su gyvūnais gali būti užsikrėtimo
arkobakterioze priežastis [20].
Taip pat arkobakterijų užsikrėtimo šaltiniu laikomi ir naminiai gyvūnai, pavyzdžiui, avys ir
ožkos. 2011 metais Belgijoje atlikti tyrimai, kurių metu nustatyta, kad iš 153 avių išmatų mėginių
arkobakterijų atžvilgiu teigiamų nustatyta 66 (43,1%), atitinkamai ožkų – 19 iš 177 (10,7%).
Pabrėžtina, kad nustatytos dominuojančios rūšys priklausė A. butzleri ir A. cryaerophilus. Tačiau iš
šių naminių gyvūnų pieno mėginių arkobakterijų nebuvo išskirta [21].
Turima duomenų, kad arkobakterijos gali būti siejamos su susirgimais sukeltais C. jejuni, C.
coli, C. concisus ir H. pylori bakterijomis [1].
1.3.3 Ligos simptomai ir patogenezė
Pagrindiniai žmonių arkobakteriozės susirgimo požymiai: gausi vandeninga diarėja su pilvo
skausmais, pykinimas, vėmimas, karščiavimas, smegenų pažeidimai [22]. Taip pat manoma, kad
A.butzleri gali būti susijusi su kitų organų kolonizacija ir su tuo susijusiomis komplikacijomis –
kepenų ciroze, aštria apendicito forma [23].
16
A. butzleri protrūkio Italijos mokykloje metu susirgo 10 vaikų, iš kurių 3 buvo hospitalizuoti.
Pagrindiniai ligos simptomai nustatyti kaip pasikartojantys pilvo diegliai su arba be diarėjos.
Turima duomenų, kad arkobakterijos gali būti perduodamos motinų vaisiui transplacentiniu keliu ir
gali sukelti nėščiosioms gimdos kraujavimą [1].
Kol kas nėra žinių, kaip arkobakteriozė susijusi ligonių amžiumi bei imunine būkle. Tačiau
Samie ir kt. nustatė mažesnį arkobakterijų paplitimą (3%; 2/67) sveikų mokyklinukų (3 – 15 metų
amžiaus) tarpe lyginant su tokio paties amžiaus hospitalizuotų vaikų (10,4%; 12/115) [23].
Net ir po dviejų Arcobacter spp. genties bakterijų tyrinėjimo dešimtmečių yra mažai žinių
apie infekcinę dozę bei patogeniškumą. Vaivorykštinių upėtakių užkrėtimas 2,25x104 A.
cryearophilus lėmė 100% mirtingumą su pažeistomis žiaunomis, kepenimis, inkstais [25]. O
albinoses laboratorines žiurkes užkrėtus 109 KSV/ml. A. butzleri ir A. cryaerophilus buvo
nustatytas 100% arkobakteriozės sergamumas, tačiau nebuvo nustatyta mirties atvejų [26]. Kito
tyrimo metu vienos dienos paršeliai buvo užkrėsti skirtingų rūšių arkobakterijomis, kurios
kolonizavo virškinamąjį traktą ir buvo vėliau išskiriamos su ekskrementais, tačiau tik A. butzleri
gebėjo kolonizuoti kitus organus – kepenis, inkstus, nervinį audinį [3].
1.3.4 Gydymas ir profilaktika
Gydymas antibiotikais skiriamas esant sunkiai ligos eigai ir sisteminei arkobakteriozei.
Gydymui gali būti skiriami tokie antibiotikai kaip cefoperazonas, fluorochinolonai ir tetraciklinas
[1; 27; 28]. Pernelyg didelis ir nepagrįstas antibiotikų naudojimas gydant tokias zoonozes, kaip
kampilobakteriozė ar salmoneliozė, leido arkobakteriozės sukėlėjams tapti atspariems ampicilinui,
chloksacilinui, azitromicinui, klindamicinui [27; 29].
Profilaktikos priemonės, kurios galėtų apsaugoti žmones nuo susirgimų arkobakterioze būtų
šios:
laikytis švaros,
vengti kontakto su naminiais gyvūnais,
atskirti žaliavą ir pagamintą maistą,
maistą kruopščiai termiškai apdoroti,
maistą laikyti saugioje temperatūroje,
naudoti saugų vandenį ir žaliavas.
17
1.4 Arkobakterijų atsparumas antibakterinėms medžiagoms
Arkobakterijos, kaip parodė tyrimai, yra atsparios tokiems antibiotikams kaip eritromicinas
bei ciprofloksacinas, kurie yra naudojami kampilobakteriozės gydymui. Manoma, kad A. butzleri ir
A. cryaerophilus yra jautresnės rezveratroliui nei kitos Gram neigiamos bakterijos [30].
Yesilmen ir bendraautoriai atliko arkobakterijų, išskirtų iš karvių, buivolų pieno bei šviežių
kaimiškų sūrių, atsparumo antibiotikams tyrimus. Rezultatai parodė, kad A. cryaerophilus buvo
atspari cefoperazonui, kloksacilinui ir penicilinui G. Tačiau papildomai A. butzleri ir A. skirrowii
izoliatai buvo atsparūs tetraciklinui, ampicilinui ir eritromicinui [12].
2013 metais Portugalijoje atlikti tyrimai, siekiant nustatyti iš paukščių skerdyklos išskirtų
arkobakterijų atsparumą antibakterinėms medžiagoms (žr. 3 lentelę). Iš išskirtų 43 A. butzleri
izoliatų nustatyta, kad visi jautrūs gentamicinui, 2,3% atsparūs chloramfenikoliui, kai tuo tarpu 24
padermės (55,8%) buvo atsparios ciprofloksacinui [28].
3 lentelė. 43 A. butzleri izoliatų atsparumas antibiotikams [28].
Antibiotikai
Minimali
slopinanti
koncentracija
(MSK)a
MSK50
(mg/L)b
MSK90
(mg/L)c MSK riba
Atsparių
izoliatų
skaičius (%)
Ampicilinas ≥32 128 256 1/>256 42 (97,7)
Ciprofloksacinas ≥4 4 >8 0.03/>8 24 (55.8)
Vankomicinas ≥32 >512 >512 512/>512 43 (100)
Trimetoprimas ≥16 >512 >512 >512 43 (100)
Piperacilinas ≥128 512 >512 8/>512 42 (97,7)
Cefoperazonas ≥64 >512 >512 16/>512 42 (97,7)
Chloramfenikolis ≥32 8 16 4/32 1 (2,3)
Gentamicinas ≥8 0,5 1 0.125/1 0 (0)
Amoksicilinas ≥32 64 128 1/128 42 (97,7)
a MSK – atsparumo antibiotikams riba; jei bakterijos gali augti esant didesnei antibiotiko koncentracijai terpėje nei
nurodyta MSK, jos yra laikomos atspariomis
b, c MSK50 ir MSK90 parodo koncentraciją (mg/L), prie kurios 50% ir 90% tirtų izoliatų augimas buvo slopinamas
atitinkama antibakterine medžiaga
18
2 pav. A. butzleri atsparumas antibakterinėms medžiagoms [31].
Kito Malaizijoje atlikto tyrimo metu siekta išsiaiškinti iš kliniškai sveikų galvijų, ožkų bei
geriamojo vandens išskirtų A. butzleri izoliatų atsparumą antibakterinėms medžiagoms. Tyrimo
rezultatai pateikti aukščiau esančiame paveiksle (2 pav.).
Išsiaiškinta, kad tik 1 A. butzleri izoliatas buvo jautrus visiems 9 tirtiems antibiotikams.
Nustatyta, kad A. butzleri rūšies bakterijų padermės dažniausiai buvo atsparios ampicilinui (55,6%),
cefatoksimui (33,4%) ir ciprofloksacinui (33,4%). Šis tyrimas atskleidė, kad net 20% tirtų izoliatų
buvo atsparūs 4 ir daugiau antibiotikų. Remiantis šio tyrimo rezultatais buvo padaryta išvada, kad
gentamicinas ir enrofloksacinas galėtų būti naudojami arkobakteriozės gydymui [31].
1.5 Arcobacter spp. genties bakterijų identifikavimas
Houf ir bendraautoriai (2001) paskelbė daug metodų ir įrodė, kad naudojant mikroaerobinę
aplinką sudarančias sistemas, galima išskirti arkobakterijas iš klinikinių mėginių. Arkobakterijų
patvirtinimas iš maisto ir aplinkos mėginių gali užtrukti iki 6 dienų, tai sukelia sunkumų protrūkių
metu. Naudojant įvairius metodus galima sutrumpinti arkobakterijų išskyrimo ir patvirtinimo laiką.
Šių bakterijų identifikavimui paprastai reikalingas bakterijų pagausinimas [32].
Imunologiniai metodai
Arkobakterijos sukelia užkrėstų šeimininkų antikūnų atsaką ir šitie baltymai gali būti
naudojami greitam patogenų išaiškinimui ir/arba patvirtinimui maiste. Antolin ir kt. (2001)
apibūdino PGR – ELISA metodą arkobakterijų aptikimui ir išskyrė šios rūšies bakterijas iš
paukštienos mėginių. PGR tyrimų taikinys yra arkobakterijų DNR oligonukleotidų zondų 16S
rRNR tarpgeninės sritys. Šie tyrimai parodė, kad PGR – ELISA metodo pagalba galima aptikti
arkobakterijas ir iki galo identifikuoti pagausintuose paukštienos mėsos mėginiuose [33].
19
Fenotipinis metodas
Arkobakterijos neretai nustatomos remiantis klasikinėmis fenotipinėmis savybėmis, įskaitant
kolonijų morfologiją, judrumą, katalazės, ureazės, nitratų rekukcijos testais, indoksilo acetato
hidrolize, jautrumu antibiotikams (cefoperazonas, trimetoprimas) [1]. Klasikinio fenotipinio
identifikavimo metodo trūkumas yra tas, kad rūšių išskyrimas dažnai remiasi viena ar dviem
skirtingomis charakteristikomis, pavyzdžiui, katalazės ir ureazės aktyvumu. Tai sukelia problemų
identifikuojant rūšis, kai išimtinai taikomas tik fenotipinis tyrimas, tačiau šis metodas dažniausiai
naudojamas išskirti Arcobacter spp. įprastose laboratorijose. Norint tiksliai nustatyti kitas
arkobakterijas reikia atlikti papildomus biocheminius testus ir/arba molekulinius metodus.
Molekuliniai metodai
DNR paremti aptikimo metodai, tokie kaip PGR, yra naudojami arkobakterijoms
identifikuoti. Priešingai nei klasikiniais metodais, kai nustatomos tik gyvos, galinčios augti
bakterijos, genomu paremti metodai aptinka DNR tiek iš gyvų, tiek mirusių bakterijų. Tai nesudaro
problemų, kada mėginiai yra šviežių išmatų arba iš aklosios žarnos su dideliu skaičiumi gyvybingų
arkobakterijų, tačiau yra rimtų sunkumų, kada tiriami aplinkos ar maisto mėginiai, kuriuose yra ir
gyvų, ir mirusių bakterijų. Pavyzdžiui, keptoje paukštienoje arba pasterizuotame piene bus didelis
skaičius žuvusių – negyvybingų arkobakterijų. Šis molekulinių metodų trūkumas yra susijęs ne tik
su arkobakterijomis, bet ir su kitais mikroorganizmais.
PGR metodo atradimas sukėlė tikrą revoliuciją molekulinės biologijos technologijų, taikomų
biologijos bei medicinos mokslų tyrimuose, medicininėje diagnostikoje bei teismo medicinos
praktikoje. Tai greita ir nebrangi metodika, leidžianti padauginti DNR fragmentus nuo
pikograminių iki mikrograminių kiekių. Žurnalas „Science” 1989 metais PGR pavadino svarbiausiu
metų mokslo įvykiu. PGR metodo esmė yra individo DNR fragmento padauginimas, dalyvaujant
fermentui polimerazei [34].
Polimerazinė grandininė reakcija (PGR) - tai nebrangus ir greitas specifinių DNR atkarpų
pagausinimo (amplifikacijos) metodas, galintis per keliolika minučių pagaminti tūkstančius
specifinių DNR fragmentų iš nedidelio kiekio DNR.
PGR ciklas susideda iš 3 etapų:
1. DNR išvyniojimas: aukštoje temperatūroje dviguba DNR grandinė išsivyniojama ir tampa
prieinama jungčiai su vienos DNR grandinės specialiai tam pagamintais 2 pradmenimis;
2. Pradmenų prijungimas: sumažinus temperatūrą, DNR pradmenys prisijungia prie bandomos
DNR molekulės atkarpose, kurių sekos sutampa su pradmens sekomis;
20
3. DNR sintezė: pakėlus temperatūrą, pradedant nuo pradmens, sintetinama nauja DNR
grandinė DNR polimerazės enzimo pagalba pagal bandomos DNR nukleotidų sekas. Ciklas
kartojamas kelis kartus, kuo daugiau ciklų tuo daugiau pagaminama DNR fragmentų.
Siekiant aptikti arkobakterijų genties bakterijas naudojamas 16S arba 23S rRNR regionas,
kuris yra PGR taikinys, nors mažiau specifiniai lokusai yra skirti nustatyti konkrečias rūšis.
Tradicinis PGR aptikimas reikalauja didesnės darbuotojų techninės patirties, kurios reikia siekiant
išvengti kryžminės amplifikuotos DNR taršos. Dėl šios ir kitų priežasčių buvo sukurta tikro laiko
PGR. Metodo privalumas yra tai, kad gausinimo reakcijos metu padauginama ne viena, o keletas
DNR sekų. Dauginės PGR eksperimentai reikalauja ypatingo dėmesio reakcijos sąlygų
optimizacijai. Tai pradmenų koncentracija, PGR buferio sudėtis, magnio chlorido ir
nuleozidtrifosfatų (dNTP) koncentracijų balansas, DNR mėginio ir termostabilių polimerazių
koncentracija bei gausinimo režimas. Didžiulis metodo jautrumas gali kelti problemų – reikia labai
saugotis, kad į PGR skirtą reakcijos mišinį nepatektų šalutinės DNR priemaišos [35]. Sėkminga
dauginės PGR optimizacija padidina reakcijos jautrumą, specifiškumą, pagerina netolygų
analizuojamų sričių gausinimo efektyvumą [34].
21
2. MEDŽIAGOS IR METODAI
2.1 Tyrimų planas
Tyrimai buvo atlikti LSMU Veterinarijos akademijoje Maisto saugos ir kokybės katedros
Gyvūninių maisto žaliavų saugos ir kokybės tyrimų laboratorijoje. Siekiant įvertinti šviežios
paukštienos bei žalio pieno užkrėstumą Arcobacter spp. bakterijomis, mėginiai tyrimams rinkti
2014 m. vasario – gegužės ir rugsėjo – spalio mėnesiais. Iš viso surinkta 110 mėginių – 60 žalio
pieno (1 mėginys – 1l. pieno) bei 50 šviežios paukštienos (1 mėginys – 1 paukštienos blauzdelė).
Šviežios paukštienos bei žalio pieno mėginiai buvo renkami pirmadieniais Kauno mieste esančiose
turgavietėse bei prekybos centruose, iš čia esančių žalio pieno pardavimo automatų. Vidutiniškai
per savaitę buvo ištiriama 10 mėginių – vieną savaitę buvo tiriami paukštieno mėginiai, kitą – pieno
mėginiai. Iki tyrimo mėginiai saugoti šaldytuve +4o C temperatūroje ne ilgiau kaip 12 valandų.
Tyrimai atlikti etapais: 1) arkobakterijų išskyrimas iš maisto mėginių; 2) arkobakterijų
identifikavimas PGR metodu; 3) išskirtų arkobakterijų izoliatų atsparumo antibakterinėms
medžiagoms nustatymas; 4) statistinė duomenų analizė.
2.2 Arcobacter spp. išskyrimas iš maisto mėginių
Arkobakterijų išskyrimas iš maisto mėginių atliktas naudojant selektyvų pagausinimą.
Pristačius mėginius į laboratoriją steriliomis priemonėmis tyrimui buvo paimama 1g tiriamos
paukštienos arba 1ml žalio pieno. Tyrimui skirta mėginio dalis perkelta į homogenizavimo maišelį
užpiltant 9 ml Arcobacter selektyvaus pagausinimo sultinio (CMO 965 Oxoid., LTD., Basingstoke,
Hampshire, England) su penkių antibiotikų priedu: 5 – fluorouracilo (100mg/l)(F6627–5G, Sigma–
Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA), amfotericino B (10mg/l)(A9528–100MG, Sigma–Aldrich,
Saint Louis, Missouri, USA), cefoperazono (16mg/l)(C4292–1G, Sigma-Aldrich, Saint Louis,
Missouri, USA), novobiocino (32mg/l)(N1628–1G, Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA)
trimethoprimo (32mg/l)(T7883–5G Sigma–Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA). Toliau
paukštienos mėginiai buvo homogenizuoti persitaltinėje maišyklėje (BagMixer, Interscience 78860
st. Nom – France), pieno mėginiai – išmaišant homogenizavimo maišelio turinį purtymo būdu. Taip
paruošti mėginiai inkubuoti +30˚C temperatūroje 24 valandas termostate aerobinėmis sąlygomis.
Po selektyvaus pagausinimo arkobakterijos išskirtos užsėjant 20µl pagausinimo sultinio iš
homogenizavimo maišelio ant Petri lėkštelių su mCCDA agaru (Campylobacter Blood Free
Medium Base, Liofilchem s.r.l. Bacteriology products, Italy) su priedais (1– Campylobacter CCDA
Supplement Ref. 81037, Liofilchem s.r.l. Roseto D.A. – Italy; 2 – C.A.T. Selective Supplement
22
SR0174E, Oxoid LTD., Basingstoke, Hampshire, England). Užsėtos Petri lėkštelės inkubuotos
aerobinėmis sąlygomis +30˚C temperatūroje 48 valandas.
Po inkubavimo būdingos arba į arkobakterijas panašios kolonijos nuo Petri lėkštelių su
mCCDA agaru inokuliacine kilpele persėtos ant Petri lėkštelių su 5% defibrinuoto arklio kraujo
agaru (Blood Agar Base Nr.2 ISO 10560, Liofilchem s.r.l. Bacteriology products, Italy; Lysed
Horse Blood. Ref: HBL 100, E & Labaratories Limited, Burnhouse, Bannybridge, Scotland).
Užsėtos lėkštelės inkubuotos +37˚C temperatūroje 48 valandas termostate aerobinėmis sąlygomis.
Iš kiekvieno mėginio buvo persėjamos po 3 būdingos arba įtariamos kolonijos tolimesniems
tyrimams.
2.3 Arkobakterijų identifikavimas PGR metodu
2.3.1 Arcobacter spp. DNR išskyrimas
Po inkubavimo, nuo Petri lėkštelių inokuliacine kilpele paimtos kelios įtartinos arkobakterijų
kolonijos (0,5 – 1mm pilkai baltos, apvalios kolonijos) ir perkeltos į mėgintuvėlį su 200µl
„PrepMan Ultra“ DNR išskyrimo tirpalo (Applied Biosystems by Life Technologies, 2130
Woodward St. Austin, TX 788744, USA) ir išmaišyta su purtykle (Bio Vortex V1, Profitec, Gunnar
Holm – Petersen, GmbH and Co, Hamburg, Germany). Toliau mėgintuvėlis perkeltas į
termomikserį (Thermomixer compact, Eppendorf AG, Hamburg, Germany), ir kaitintas prie +99oC
temperatūros 10 minučių. Tada mėgintuvėliai buvo centrifūguojami 16 000 aps./min. greičiu ir
paimta 150µl viršutinio „PrepMan Ulta“ tirpalo, ir perkelta į kitą Epindorfo mėgintuvėlį.
Mėgintuvėliai vėl buvo centrifūguojami tomis pačiomis sąlygomis ir po centrifugavimo 70µl viršuje
esančio „PrepMan Ulta“ tirpalo su DNR buvo perkelta į naujus mėgintuvėlius, kurie iki tolesnio
tyrimo saugoti -20˚C temperatūroje.
2.3.2 Arcobacter spp. identifikavimas PGR metodu
Į 200µl PGR mėgintuvėlį buvo įpilama 12,5µl DreamTaq Green PCR Master Mix(2x) mišinio
(#K1081 1,25ml LOT 00121201, Thermo Scientific), po 1µl pradmenų (ButR, SkiR, Ther R, CibR,
ArcoF, Gyras F ir Gyras R (Thermo Fisher Scietific, Life technologies, Invitrogen Custom
Primers), 0,5µl tiriamosios bakterijų DNR ir 5µl sterilaus vandens (Water, nuclease – free 1,25ml
#R0581, LOT 00117365, Thermo Scientific). Reakcijos mišinį viso sudarė 25µl. PGR reakcija
vykdyta termocikleryje (Programmable Thermal Controller PTC – 100 SN:19176, MJ Research
Inc., Grove Street, Watertown, USA), esant tokioms sąlygoms (4 lentelė):
23
1. Pradinė denatūracija (94˚C 3min.)
2. Denatūracija (94˚C 45 s.)
3. Pradmenų prilipinimas (58˚C 45 s.)
4. Sintezė (72˚C 2 min.)
5. Galutinė sintezė (72˚C 5 min.)
4 lentelė. Polimerazinės grandininės reakcijos sąlygos
Temperatūra Laikas Ciklų skaičius
94˚C 3 min. 1
94˚C 45 sec.
30 58˚C 45 sec.
72˚C 2 min.
72˚C 5 min. 1
4˚C - -
Viso: 2 val. 32
Po DNR amplifikacijos į paruoštus 2% agarozės gelio (TopVision Agarose #R0491, LOT
00220705, Thermo Scientific) šulinėlius (pirmą ir paskutinį) buvo atmatuojama po 3µl DNR
žymeklio (GeneRuler 100bp Plus DNA Ladder, #SM0323, LOT 00117273, Thermo Scientific), o į
likusius po 11µl PGR produkto. Lovelis su geliu buvo įstatomas į elektroforezės vonelę pripildytą
buferiu (10xTBE Electrophoresis Buffer #B52, LOT 00114844, Thermo Scietific, Fermentas).
Elektroforezė vykdyta naudojant 120 V elektros srovę, kurios dažnis 98 mA, 1 valandą. Pasibaigus
elektroforezei, agarozės gelis perkletas į BioRAD (Molecular Imager Gel Doc XR+) aparatą ir
Image Lab kompiuterinės programos pagalba padaryta agarozės gelio fotografija, naudojant
ultravioletinius spindulius.
2.4 Atsparumo antibakterinėms medžiagoms nustatymas
Arkobakterijų atsparumas antibiotikams buvo nustatytas agaro praskiedimo metodu užsėjant
atskiras šių bakterijų padermes ant paruoštų Petri lėkštelių su Mueller – Hinton agaru ir 5%
defibirinuoto avies kraujo priedu (Mueller Hinton Agar Ref. 610033, LOT 12159202 Liofilchem,
Italy; Defibrinated Sheep Blood 25ml, Ref. DSC025, LOT 70423168, E&O Labaratories Limited,
Burnhouse, Bonnybridge, Scotland) bei su skirtingomis antibiotikų koncentracijomis. Tyrimui buvo
pasirinkti 5 skirtingi antibiotikai (gentamicinas G3632–1G, cefriaksonas C5793–250MG,
24
eritromicinas E5389–1G, ciprofloksacinas 17850–5G–F ir tetraciklinas T3258–5G Saint Louis,
Missouri, USA) ir 7 skirtingos šių antibiotikų koncentracijos: 0,5, 1, 2, 4, 8, 16, 32 (µg/ml).
Tyrimams buvo paruošta bakterijų suspensija atitinkanti 109 KSV/ml bakterijų kiekį (vertinant
spektrofotometru bakterijų suspensijos optinį tankį OD600). Kiekvienos tiriamos padermės taip
paruoštos suspensijos pipete 5 µl buvo perkeliami ant atitinkamos koncentracijos Petri lėkštelių su
atitinkamais antibiotikais.
Taip užsėtos Mueller – Hinton agaro lėkšteles su antibiotikais inkubuotos +37˚C
temperatūroje 16 – 20 valandų termostate aerobinėmis sąlygomis. Vertinta kaip antibakterinės
medžiagos slopino bakterijų augimą ir kokia buvo minimali augimą slopinanti antibiotikų
koncentracija.
2.5 Statistinė duomenų analizė
Statistiškai duomenys buvo įvertinti Microsoft Office Excel 2007 programa ir SPSS 16.0
programiniu paketu, apskaičiuojant rodiklių statistinį patikimumą, o skirtumai tarp imčių
besiskiriančių pagal vieną požymį buvo vertinami skaičiuojant vienfaktorinę ANOVA analizę.
25
3. REZULTATAI
3.1 Šviežios paukštienos ir žalio pieno užkrėstumas Arcobacter spp. bakterijomis
Mūsų atlikti tyrimai parodė, kad šviežios paukštienos mėginių užkrėstumas Arcobacter spp.
bakterijomis buvo labai didelis ir siekė net 46%, t.y., iš 50 tirtų paukštienos mėginių arkobakterijos
buvo aptiktos 23 mėginiuose (df=50, p<0,001) (žr. 2 pav.). Tuo tarpu tirti žalio pieno mėginiai buvo
užkrėsti ženkliai rečiau (18,33%) ir iš 60 tirpų žalio pieno mėginių arkobakterijos aptiktos tik 11
mėginių (df=60, p=0,001) (žr. 2 pav.). Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp šviežios
paukštienos bei žalio pieno užkrėstumo (χ2=14,55; df=4; p=0,006).
2 pav. Šviežios paukštienos ir žalio pieno užkrėstumas Arcobacter spp. bakterijomis
Iš trečiame paveiksle pateiktų duomenų galime matyti, kad žiemą tirti šviežios paukštienos
mėginiai buvo santykinai mažiau užkrėsti arkobakterijomis (8 užkrėsti mėginiai), nei rinkti pavasarį
(15 užkrėstų mėginių).
3 pav. Sezono įtaka šviežios paukštienos užkrėstumui Arcobacter spp. bakterijomis
26
Tuo tarpu vertinant sezoninį žalio pieno užkrėstumą (4 pav.), galime matyti, kad didžioji dalis
arkobakterijomis užkrėstų mėginių buvo nustatyta pavasario laikotarpiu rinktuose mėginiuose.
4 pav. Žalio pieno užkrėstumas Arcobacter spp. skirtingu laikotarpiu
3.2 Išskirtų arkobakterijų rūšinė įvairovė
Iš tiriamųjų maisto mėginių išskirtų arkobakterijų izoliatų identifiakvimas PGR metodu leido
sėkmingai identifikuoti visas keturias dažniausiai maisto žaliavose ir produktuose aptinkamas
arkobakterijų rūšis (5 pav.).
5 pav. Arcobacter spp. genties bakterijų identifikavimas dauginės PGR metodu (1,9,16 –
DNR žymeklis GeneRuler 100 bp Plus; 2,12 – A.cryaerophilus (400bp); 3,5,6,7,8,11,13,14 –
A.butzleri (2061 bp); 4 – A. cibarius (1120 bp); 10 – A. skirrowii (198 bp); 15 – neigiama kontrolė)
Įvertinus išskirtų iš tiriamųjų maisto mėginių arkobakterijų izoliatų rūšių įvairovę PGR
metodu nustatyta, kad šviežios paukštienos mėginiai buvo užkrėsti skirtingomis arkobakterijų
rūšimis (6 pav.). Dominuojanti arkobakterijų rūšis buvo A. butzleri aptikta 16 paukštienos mėginių,
27
tuo tarpu A. cryaerophilus – keturiuose, A. cibarius dvejuose, o A. skirrowii tik viename tirtame
mėginyje.
Tyrimai taip pat parodė, kad tas pats mėginys gali būti užkrėstas ir keliomis skirtingomis
arkobakterijų rūšimis, nes dvi arkobakterijų rūšys buvo aptiktos tame pačiame šviežios paukštienos
mėginyje – A. butzleri ir A. cryaerophilus.
Tuo tarpu visi arkobakterijų izoliatai išskirti iš 11 žalio pieno mėginių, pirktų prekybos centre
esančio pieno automato, buvo identifikuoti kaip A. butzleri rūšis.
6 pav. Arkobakterijų paplitimas šviežioje paukštienoje
28
3.3 Arkobakterijų atsparumas antibiotikams
3.3.1 Arkobakterijų išskirtų iš šviežios paukštienos atsparumas antibiotikams
Atlikti išskirtų iš šviežios paukštienos arkobakterijų padermių atsparumo antibakterinėms
medžiagoms tyrimai atskleidė, kad šių bakterijų atsparumas tam pačiam antibiotikui buvo gana
panašus (5 lentelė).
5 lentelė. Arkobakterijų, išskirtų iš šviežios paukštienos mėginių, atsparumas antibiotikams
Eil.
Nr. Arkobakterijų rūšis
Antibiotikų minimali slopinanti koncentracija (MSK) µg/ml
Gentamicinas Eritromicinas Ciprofloksacinas Tetraciklinas Ceftriaksonas
1. A. butzleri 1 16 4 0,5 4
2. A. butzleri 1 16 4 0,5 4
3. A. butzleri 1 16 4 0,5 4
4. A. butzleri 1 16 4 0,5 4
5. A. butzleri 2 16 4 0,5 4
6. A. butzleri 1 16 4 0,5 4
7. A. butzleri 1 16 4 0,5 4
8. A. butzleri 1 16 4 0,5 8
9. A. butzleri 1 16 2 0,5 4
10. A. butzleri 1 32 2 1 8
11. A. butzleri 1 16 4 0,5 4
12. A. butzleri 1 16 4 0,5 4
13. A. butzleri 0,5 16 4 0,5 4
14. A. butzleri 1 32 4 0,5 4
15. A. butzleri 1 32 4 1 4
16. A. butzleri 0,5 16 4 0,5 4
17. A. cryaerophilus 1 4 4 0,5 1
18. A. cryaerophilus 2 4 4 1 2
19. A. cryaerophilus 1 4 4 1 2
20. A. cryaerophilus 1 2 2 0,5 1
21. A. cibarius 1 2 0,5 0,5 1
22. A. cibarius 1 2 0,5 0,5 0,5
23. A. skirrowii 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Tyrimai parodė, kad net 13 iš 16 tirtų A. butzleri rūšies padermių augimą slopino 1 µg/ml
gentamicino koncentracija, 1 vienos padermės - 2 µg/ml koncentracija ir tik vienintelė padermė
buvo dar jautresnė gentamicinui, kada ir 0,5 µg/ml gentamicino koncentracija slopino šios
bakterijos augimą. Nustatyta, kad A. butzleri rūšies bakterijos išskirtos iš šviežios paukštienos buvo
jautriausios tetraciklinui (MSK 0,5 µg/ml; 14 iš 16 padermių), o atspariausios eritromicinui (MSK
16 µg/ml (13 iš 16 padermių); 32 µg/ml (3 iš 16 padermių)). A. cryaerophilus rūšies bakterijos
jautriausios taip pat tetraciklinui (MSK 0,5 µg/ml (3 iš 4 padermių); 1 µg/ml (1 iš 4 padermių)), o
29
atspariausios eritromicinui ir ciprofloksacinui (MSK 2 µg/ml (1 iš 4 padermių); 4 µg/ml (3 iš 4
padermių)). A. cibarius jautriausios ciprofloksacinui ir tetraciklinui (MSK 0,5 µg/ml (2 iš 2
padermių)), o atspariausios eritromicinui (MSK 2 µg/ml (2 iš 2 padermių)). Vienintelės išskirtos A.
skirrowii rūšies atsparumas visiems tirtiems antibiotikams tesiekė 0,5 µg/ml.
3.3.2 Arkobakterijų išskirtų iš žalio pieno atsparumas antibiotikams
Atlikus išskirtų iš žalio pieno arkobakterijų izoliatų analogišką atsparumo antibakterinėms
medžiagoms įvertinimą, gauti tyrimo rezultatai (6 lentelė) atskleidė, kad šių bakterijų atsparumas
tiems patiems antibiotikams buvo gana panašus. Tyrimai parodė, kad A. butzleri rūšies bakterijų
padermės išskirtos iš žalio pieno buvo jautriausios tetraciklinui (MSK 0,5 µg/ml (8 iš 11 padermių);
1 µg/ml (3 iš 11 padermių)), bei gentamicinui (MSK 0,5 µg/ml (4 iš 11 padermių); 1 µg/ml (MSK 7
iš 11 padermių)). Atspariausios A. butzleri padermės nustatytos eritromicinui (MSK 4 µg/ml (3 iš
11 padermių); 8 µg/ml (7 iš 11 padermių)).
6 lentelė. Arkobakterijų išskirtų iš žalio pieno atsparumas antibiotikams
Eil.
Nr. Arkobakterijų rūšis Antibiotikų minimali slopinanti koncentracija µg/ml
Gentamicinas Eritromicinas Ciprofloksacinas Tetraciklinas Ceftriaksonas
1. A. butzleri 1 8 4 0,5 4
2. A. butzleri 1 8 4 0,5 4
3. A. butzleri 1 8 4 1 4
4. A. butzleri 0,5 8 2 0,5 2
5. A. butzleri 1 8 4 0,5 4
6. A. butzleri 0,5 4 4 0,5 4
7. A. butzleri 1 8 4 1 4
8. A. butzleri 1 4 4 0,5 4
9. A. butzleri 1 8 4 1 2
10. A. butzleri 0,5 4 2 0,5 4
11. A. butzleri 0,5 4 4 0,5 4
30
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Šių tyrimų metu buvo įvertinta šviežios paukštienos bei žalio pieno, įsigyto iš mažmeninės
prekybos vietų Kaune, užkrėstumas Arcobacter genties bakterijomis bei nustatytas išskirtų
arkobakterijų izoliatų atsparumas antibakterinėms medžiagoms.
Siekiant gauti kiek įmanoma patikimesnius ir tikslesnius rezultatus, buvo pasirinktas
arkobakterijų nustatymo metodas – apimantis pagausinimą specifiniame Arcobacter sultinyje su 5
antibiotikų priedu bei po to sekantį sėjimą ant mCCDA agaro su CAT priedu, inkubuojant 30˚C
temperatūroje aerobinėmis sąlygomis. Merga ir bendraautoriai (2010) Jungtinėje Karalystėje atliko
tyrimus, kurių tikslas buvo ištirti jau naudojamų arkobakterijų nustatymo metodų jautrumą ir
specifiškumą [36]. Buvo pasirinkti 5 dažniausiai mokslininkų taikomi arkobakterijų aptikimo
metodai:
HH (selektyvus bakterijų pagausinimas – specifinis Arcobacter sultinys su 5 antibiotikų
priedu: 5-fluorouracilas (100mg/l), amfotericinas B (10mg/l), cefoperazonas (16mg/l),
novobiocinas (32mg/l), trimetoprimas (64mg/l); bakterijų išskyrimas ant H medium agaro su
tais pačiais 5 antibiotikais; inkubuota 30˚C temp. aerobinėmis sąlygomis) [32].
HCC (selektyvus bakterijų pagausinimas – specifinis Arcobacter sultinys su 5 antibiotikų
priedu: 5-fluorouracilas (100mg/l), amfotericinas B (10mg/l), cefoperazonas (16mg/l),
novobiocinas (32mg/l), trimetoprimas (64mg/l); bakterijų išskyrimas ant mCCDA agaro su
CAT priedu; inkubuota 30˚C temp. aerobinėmis sąlygomis) [37].
ACH (selektyvus bakterijų pagausinimas – specifinis Arcobacter sultinys su CAT priedu
(cefoperazonas (8mg/l), amfotericinas B (10mg/l) ir teicoplaninas (4mg/l); bakterijų
išskyrimas ant H medium agaro 5-ių antibiotikų priedu; inkubuota 30˚C temp. aerobinėmis
sąlygomis) [38].
ACCC (selektyvus bakterijų pagausinimas – specifinis Arcobacter sultinys su CAT priedu
(cefoperazonas (8mg/l), amfotericinas B (10mg/l) ir teicoplaninas (4mg/l); bakterijų
išskyrimas ant mCCDA agaro su CAT priedu; inkubuota 30˚C temp. aerobinėmis
sąlygomis).
CC (selektyvus bakterijų pagausinimas – specifinis Campylobacter sultinys su 5%
defibrinuoto arklio kraujo ir CVTC priedu (cefoperazonas (20mg/l), vankomicinas (20mg/l),
trimetoprimas (20mg/l), cikloheksimidas (50mg/l); bakterijų išskyrimas ant Campylobacter
specific agaro; inkubuota 36˚C temp. mikroaerofilinėmis sąlygomis) [37].
Autoriai (Merga ir kt., 2010) atlikę tyrimus padarė išvadą, kad pats specifiškiausias (63,9%) ir
jautriausias (70,7%) yra HCC arkobakterijų nustatymo metodas, po to sekė HH (59,7% ir 41,5%),
31
CC (43,2% ir 43,9%), ACH (23,9% ir 43,9%) ir mažiausiai specifiškas (16,6%) bei jautrus (43,9%)
– ACCC metodas [36].
Iki šiol tokių tyrimų Lietuvoje nebuvo atlikta ir šis tyrimas buvo pirmasis kurio metu
nagrinėtas arkobakterijų paplitimas maiste. Tyrimų rezultatai parodė, kad tirtų maisto mėginių
užkrėstumas arkobakterijomis buvo labai didelis ir šviežios paukštienos užkrėstumas (46%) buvo
didesnis nei tirtų žalio pieno mėginių (18,22%).
Skirtingai nei Lietuvoje, panašūs tyrimai yra atliekami ir kitose šalyse. Ispanijoje paukštienos
užkrėstumas arkobakterijomis siekė 45% (23 iš 51 mėginių) [39], Irane Arcobacter spp.
užkrėstumas paukštienoje siekė 45% (244 iš 540 mėginių) [40]. Malaizijoje buvo tirtas šaldytos ir
žviežios paukštienos užkrėstumas, kuris siekė 39% (48 iš 123 mėginių). Arkobakterijų išskyrimui
naudotas HCC metodas. Verta pažymėti, kad šviežios paukštienos užkrėstumas arkobakterijomis
buvo šiek tiek didesnis (25 iš 61 (41%)), nei atšaldytos (23 iš 62 (37,1%)) [10].
Vertinant sezoniškumo įtaką šviežios paukštienos užkrėstumui arkobakterijomis atlikti
tyrimai rodo, kad paukštienos mėginiai buvo santykinai mažiau užkrėsti arkobakterijomis (8
užkrėsti mėginiai) žiemą, nei rinkti pavasarį (15 užkrėstų mėginių). Tyrimų, nagrinėjančių
sezoniškumo įtaką arkobakterijų paplitimui maisto produktuose kol kas nėra, tačiau galėtume daryti
prielaidą, kad aplinkos temperatūra susijusi su spartesniu arkobakterijų dauginimusi produkte.
Tuo tarpu analizuojant žalio pieno užkrėstumą arkobakterijomis situacija įvairiose šalyse
buvo skirtinga – Malaizijoje pieno užkrėstumas siekė 5,7% (naudotas ACH metodas) [20],
Suomijoje – 15% (26 iš 177 mėginių; ACCC metodas) [13], Turkijoje - 36% (18 iš 50 mėginių;
modifikuotas AC metodas – selektyviam bakterijų pagausinimui naudotas specifinis Arcobacter
sultinys su CAT priedu (cefoperazonas (8mg/l), amfotericinas B (10mg/l) ir teicoplaninas (4mg/l);
bakterijų išskyrimui naudotas kraujo agaras)) [12], Šiaurės Airijoje – 46% [41].
Vertinant sezoniškumo įtaką žalio pieno užkrėstumui arkobakterijomis atlikti tyrimai rodo,
jog didžioji dalis arkobakterijomis užkrėstų žalio pieno mėginių buvo nustatyta pavasario
laikotarpiu. Tačiau šiltesnio rudens sezono metu, iš 20 pieno mėginių nei viename nebuvo nustatyta
arkobakterijų. Tokius rezultatus sudėtinga vertinti, nes nėra atlikta tyrimų vertinančių sezoniškumo
įtaką pieno užkrėstumui arkobakterijomis. Visgi gautus tyrimo rezultatus galėtume sieti su tuo, kad
galbūt žalio pieno pardavimo automatai buvo kruopščiai išvalyti ir dezinfekuoti, arba pardavimui
buvo tiekiamas sveikų arkobakteriozės atžvilgiu karvių pienas.
Atlikus išskirtų izoliatų rūšinės įvairovės nustatymą PGR metodu (atliktas remiantis Douidah
ir bendraautorių (2010) aprašytu metodu [42] su tam tikromis modifikacijomis – vietoj 5 µl
10×PCR buferio naudota 12,5µl DreamTaq Green PCR Master Mix (2x), o galutinis reakcijos
mišinys sudarė 25 µl vietoj 50 µl) nustatėme, kad mažmeninėje prekyboje parduodamoje
32
paukštienoje dominavo A. butzleri rūšies bakterijos (69,56%), A. cryaerophilus (17,39%), A.
cibarius (8,69%) ir A. skirrowii (4,34%). Skirtingi rezultatai gauti Vokietijoje, kai paukštienoje
nustatytos išskirtinai A. butzleri rūšies arkobakterijos (15 iš 56 tirtų mėginių) [43]. Tačiau panašūs
rezultatai gauti lyginant Irano mokslininkų atliktus tyrimus, kurių metu nustatyta, kad paukštienoje
dominavo A. butzleri rūšies bakterijos (73%), po to sekė A. cryaerophilus (9%) [40]. Korėjoje
atlikto tyrimo metu nustatyta, kad vėl dominavo A. butzleri (18,9%), A. cryaerophilus (3,3%) [44],
o Malaizijoje visi 48 iš 123 teigiami arkobakterijų atžvilgiu mėginiai priskirti imtinai A. butzleri
rūšiai [10].
Mūsų atlikto tyrimo duomenis piene nustatytos tik vienos rūšies arkobakterijos – A. butzleri
(100%). Tačiau remiantis kitais mokslininkų atliktais tyrimais ir studijomis kitose šalyse, nustatyta,
kad piene, tirtame Turkijoje taip pat dažniausiai dominavo A. butzleri (38,89%), po to sekė A.
cryaerophilus (22,23%) ir A. skirrowii rūšies bakterijos (11,12%) [12]. Papildomai, pieno
mėginiuose kartu rastos kelios arkobakterijų rūšys – A. butzleri ir A. cryaerophilus. Kito 2011
metais Suomijoje atlikto tyrimo metu piene dominavo A. butzleri (96%), A. cryaerophilus – 4%
[13]. Taip pat pieno mėginiuose tirtuose Malaizijoje kartu rastos netgi kelios arkobakterijų rūšys –
A. butzleri ir A. skirrowii bei A. butzleri ir A. cryaerophilus [20].
Atlikus išskirtų iš maisto mėginių arkobakterijų izoliatų atsparumą antibakterinėms
medžiagoms nustatyta, kad A. butzleri rūšies bakterijos išskirtos iš šviežios paukštienos bei žalio
pieno atspariausios eritromicinui, o jautriausios tetraciklinui. Tiesa, verta pažymėti, jog A. butzleri
padermių, išskirtų iš šviežios paukštienos, augimą slopino 16 µg/ml eritromicino koncentracija (13
iš 16 padermių), kai tuo tarpu išskirtų iš žalio pieno 8 µg/ml (7 iš 11 padermių). Tačiau vertinant A.
butzleri padermių jautrumą tetraciklinui tokių skirtumų nepastebėta: 0,5 µg/ml (14 iš 16 iš
paukštienos išskirtų padermių), 0,5 µg/ml (8 iš 11 iš žalio pieno išskirtų padermių). Atlikti tyrimai
parodė labai panašius rezultatus, vertinant A. butzleri padermių atsparumą kitoms antibakterinėms
medžiagoms. Nustatyta minimali A. butzleri bakterijų augimą slopinanti antibiotiko gentamicino
koncentracija 1µg/ml (13 iš 16 iš paukštienos išskirtų padermių; 7 iš 11 iš žalio pieno išskirtų
padermių), ciprofloksacino 4 µg/ml (14 iš 16 iš paukštienos išskirtų padermių; 9 iš 11 iš žalio pieno
išskirtų padermių) ir cefriaksono 4 µg/ml (15 iš 16 iš paukštienos išskirtų padermių; 9 iš 11 iš žalio
pieno išskirtų padermių).
Insook ir bemdraautoriai (2007) atliko panašius tyrimus, kurių metu siekė išsiaiškinti
arkobakterijų, išskirtų iš paukštienos skerdienos mėginių, atsparumą antibakterinėms medžiagoms.
Nustatytas atsparumas antibiotikams skyrėsi nuo mūsų tyrimo metu nustatyto atsparumo (MSK):
ciprofloksacino ≥4 µg/ml, eritromicino ≥32 µg/ml, gentamicino ≥16 µg/ml, tetraciklino ≥16 µg/ml.
Iš 140 A. butzleri padermių nei viena nebuvo atspari ciprofloksacinui, gentamicinui ir tetraciklinui
33
bei tik 6 (8,4%) padermės buvo atsparios eritromicinui. Iš 34 A. cryaerophilus padermių
ciprofloksacinui atspari buvo tik 1 (2,94%), o etritomicinui, gentamicinui ir tetraciklinui visos
padermės buvo neatsparios [27].
Lyginant Insook ir bendraautorių (2007) bei mūsų tyrimo rezultatus, pasirenkant tokias pat
MSK ribas, iš šviežios paukštienos išskirtos A. butzleri rūšies atsparumas ciprofloksacinui siekė 4
µg/ml (atsparios 14 iš 16 (87,5%) padermių), eritromicinui 16 µg/ml (atsparios 3 iš 16 (18,75%)
padermių), gentamicinui 1µg/ml (visos neatsparios), tetraciklinui 0,5 µg/ml (visos neatsparios).
Panašūs rezultatai pastebimi ir su A. cryaerophilus rūšimi – ciprofloksacinas 4 µg/ml (atsparios 3 iš
4 (75%) padermių), o eritromicinas 4 µg/ml, gentamicinas 1 µg/ml, tetraciklinas 1 µg/ml – visos
tirtos padermės buvo neatsparios.
Ferreira ir bendraautoriai (2013) [28] taip pat tyrinėjo A. butzleri, išskirtų iš paukštienos
skerdienos mėginių, atsparumą antibakterinėms medžiagoms. Nustatyta atsparumo ciprofloksacinui
MSK buvo tokia pat kaip ir Insook ir bendraautorių (2007) (≥4 µg/ml), tačiau gentamicinui buvo
per pus mažesnė ir siekė ≥8 µg/ml. Tačiau lyginant su mūsų duomenimis gauti panašūs rezultatai,
net 14 iš 16 (87,5%) padermių yra galėtų būti priskiriamos kaip atsparios ciprofloksacinui, o
gentamicinui visos 16 padermių neatsparios.
Atabay ir bendraautoriai (2001) tyrė A. butzleri, išskirtų iš paukščių skerdenos mėginių,
parduodamų mažmeninės prekybos tinkluose, atsparumą antibiotikams. Nustatytos MSK buvo
tokios: eritromicino 15 µg, gentamicino 10 µg, tetraciklino 30 µg. Atlikus testus nustatyta, kad 34 iš
39 (87,17%) A. butzleri padermių buvo neatsparios eritromicinui, 38 iš 39 (97,43 %) neatsparios
gentamicinui ir visos 39 (100%) neatsparios tetraciklinui [45].
Po daugiau nei dešimtmečio Abay ir bendraautoriai (2012), atliko panašius tyrimus [46].
Pasirinktos atsparumo antibiotikams MSK ribos buvo identiškos kaip ir Atabay ir bendraautorių –
eritromicino 15 µg, gentamicino 10 µg, tetraciklino 30 µg. Nustatyta, kad 6 iš 31 (19,3%) A.
butzleri padermių atsparios eritromicinui, 100% neatsparios gentamicinui, o 18 iš 31 (58%)
neatsparios tetraciklinui.
Rahimi 2014 m. irgi atliko panašius tyrimus Irane [47]. Pasirinktos MSK buvo labai panašios
– ciprofloksacino 15 µg, eritromicino 15 µg, gentamicino 10 µg, tetraciklino 15 µg. Išsiaiškinta, jog
A. butzleri – ciprofloksacinas atsparios 1 iš 64 (1,5%), o eritromicinui, gentamicinui ir tetraciklinui
visos padermės buvo neatsparios. Taip pat visos 5 tirtos A. cryaerophilus padermės buvo
neatsparios minėtiems antibiotikams. Tačiau A. skirrowii viena padermė (1 iš 2) buvo atspari
eritromicinui, o likusiems antibiotikams taip pat buvo neatspari.
Yesilmen ir bendraautoriai (2014) tyrė A. bulzleri, išskirtų iš karvių pieno, atsparumą
antibakterinėms medžiagoms. Nustatytos MSK ribos: eritromicino 15 µg/disc, tetraciklino 30
34
µg/disc, gentamicino+amoksicilino 35 µg/disc. Eritromicinas – 13 iš 16 padermių (81,25%)
atsparios, tetraciklinas – 15 iš 16 (93,75%) atsparios, gentamicinas+amoksicilinas – 10 iš 16
padermių (62,5%) buvo neatsparios [12].
Taigi lyginant mūsų atlikto tyrimo rezultatus su Yesilmen ir bendraautorių (2014) galėtume
daryti prielaidą, kad visos A. butzleri padermės išskirtos iš žalio pieno buvo neatsparios visiems
tirtiesiems antibiotikams.
Fera ir bendraautoriai (2002) metais atliktos studijos metu nustatyta A. butzleri ir A.
cryaerophilus atsparumo ceftriaksonui MSK buvo ≤8 µg/ml [48]. Remiantis mūsų atliktais tyrimais
matyti, kad tiek A. butzleri, tiek A. cryaerophilus iškirtos iš paukštienos ir žalio pieno yra
neatsparios ceftriaksonui.
Lyginant arkobakterijų atsparumą toms pačioms antibakterinėms medžiagoms su jų
filogenetinių kaimynu – kampilobakterijomis pastebimi skirtumai. Insook ir bendraautoriai (2007)
atliktos tyrimų studijos metu nustatyta, kad C. jejuni išskirtų iš šviežios paukštienos mėginių
atsparumas ciprofloksacinui sudarė 30,3% (57 iš 188 padermių), C. coli 3,7% (1 iš 27 padermių) o
iš viso sudarė 27% (58 iš 215 padermių). Tiek eritromicinui, tiek gentamicinui C. jejuni ir C. coli
visos visos tirtos padermės buvo neatsparios. Tačiau tetraciklinui net 99,5% (187 iš 188 padermių)
C. jejuni atsparios, o C. coli 96,3% (26 iš 27 padermių). Tuo tarpu lygiagrečiai tiriant A. butzleri
padermių atsparumą nustatyta, kad ciprofloksacinui, gentamicinui ir tetraciklinui buvo neatspari, o
eritromicinui atsparumas sudarė 8,4% [27].
Kovalenko ir bendraautoriai 2014 metais Latvijoje atliko kampilobakterijų, išskirtų iš
paukštienos, parduodamos mažmeninės prekybos vietose, atsparumo antibakterinėms medžiagoms
tyrimus [49]. Nustatytos atsparumo antibiotikams MSK ribos buvo tokios: eritromicino >4 µg/ml
(C. jejuni), >16 µg/ml (C. coli), ciprofloksacino >1 µg/ml, tetraciklino >2 µg/ml ir gentamicino >1
µg/ml (C. jejuni), o >2 µg/ml (C. coli). Atlikus tyrimus nustatyta, kad C. jejuni padermių
atsparumas eritromicinui sudarė 32,2%, ciprofloksacinui visos 28 tirtos padermės buvo atsparios,
atsparumas tetraciklinui siekė 78,6%, o gentamicinui 57,2%. Kitos tirtos rūšies - C. coli atsparumas
eritromicinui sudarė 56,7%, ciprofloksacinui visos tirtos 30 padermių buvo atsparios, atsparumas
tetraciklinui siekė 76,7%, o gentamicinui – 66,6%.
Mūsų žiniomis, tokio pobūdžio tyrimas, siekiant nustatyti mažmeninėje prekyboje
parduodamos šviežios paukštienos bei žalio pieno užkrėstumą arkobakterijomis, Lietuvoje buvo
atliktas pirmą kartą. Atlikti ir Lietuvoje tyrimai parodė, kad nors ir Europos Sąjungoje šiuo metu
arkobakterijų skaičius paukštienoje ir žaliame piene nėra reglamentuojamas, būtina plėsti tokio
pobūdžio tyrimus, siekiant išsiaiškinti maisto žaliavų ir produktų vaidmenį žmonių arkobakteriozės
epidemiologijoje.
35
5. IŠVADOS
1. Tyrimai parodė, net 46% mažmeninėje prekyboje parduodamos šviežios paukštienos yra
užkrėsta Arcobacter genties bakterijomis, tuo tarpu prekybos centre iš automato
parduodamo žalio pieno užkrėstumas yra mažesnis ir siekia 18,22%. Nustatyta, kad šviežia
paukštiena yra dažniau užkrėsta arkobakterijomis nei žalias pienas parduodamas
mažmeninėje prekyboje (χ2=14,55; df=4; p=0,006).
2. Šviežioje paukštienoje dažniausiai buvo aptinkamos A. butlzeri (69,56%), rečiau A.
cryaerophilus (17,39 proc.), A. cibarius (8,69%) ir A. skirrowii (4,34%) rūšies
arkobakterijomis.
3. Nepasterizuotas pienas buvo išskirtinai užkrėstas tik A. butzleri rūšies arkobakterijomis.
4. A. butzleri išskirtos iš šviežios paukštienos pasižymėjo didesniu atsparumu antibakterinėms
medžiagoms (eritromicino MSK 16 µg/ml, ceftriaksono MSK 8 µg/ml) nei išskirtos iš pieno
(eritromicino MSK 8 µg/ml, ceftriaksono MSK 4 µg/ml).
5. A. butzleri išskirtos išskirtos iš žalio pieno buvo jautriausios tetraciklinui – MSK 0,5 µg/ml
(14 iš 16 šviežios paukštienos išskirtų padermių ir 8 iš 11 žalio pieno išskirtų padermių).
6. A. cryaerophilus jautriausios tetraciklinui (MSK 0,5 µg/ml), o atspariausios eritromicinui ir
ciprofloksacinui (MSK 4 µg/ml). A. cibarius jautriausios ciprofloksacinui ir tetraciklinui
(MSK 0,5 µg/ml), o atspariausios eritromicinui (MSK 2 µg/ml). A. skirrowii atsparumas
visiems tirtiems antibiotikams siekė 0,5 µg/ml.
36
6. REKOMENDACIJOS
Kadangi atlikti tyrimai parodė, kad šviežia paukštiena ir žalias pienas yra užkrėsti
Arcobacter spp., todėl būtina skirti ypatingą dėmesį šių produktų terminiam apdorojimui bei
higienos laikymuisi, siekiant išvengti kryžminės taršos.
Manome, kad būtų tikslinga atlikti daugiau tyrimų, siekiant nustatyti užkrėstų
arkobakterijomis maisto žaliavų ir produktų (šviežios paukštienos, žalio pieno ir kt.) galimą
įtaką visuomenės sveikatai.
37
7. PADĖKOS
Dėkoju darbo vadovui prof. dr. Mindaugui Malakauskui už suteiktas vertingas konsultacijas
ruošiant šį darbą. Taip pat norėčiau padėkoti rezidentei Jurgitai Aksomaitienei, doktorantėms –
Viktorijai Lėgaudaitei – Lydekaitienei bei Gintarei Zakarienei už pagalbą Gyvūninių maisto žaliavų
saugos ir kokybės tyrimų laboratorijoje.
38
8. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Collado L., Figueras J. M. Taxonomy, Epidemiology, and Clinical Prelevance of the Genus
Arcobacter. Clinical Microbiology Reviews 2011, Volume 24, No. 1, P. 174 – 192.
2. Saleem S., Kamili A. N., Kakru D. K., Bandh S. A. Microbiology of Genus Arcobacter: A
Review. Journal of Pharmacy Research 2011, Vol. 4, Issue 12, P. 4615 – 4617.
3. Shah A.H., Saleha A.A., Zunita Z. and Murugaiyah M. Arcobacter An emerging threat to
animals and animal origin food products? Trends in Food Science & Technology 2011,
Volume 22, P. 225 – 236.
4. Hoa T.K. Ho, Len J.A. Lipman, Gaastra W. Arcobacter, what is known and unknown about
a potential foodborne zoonotic agent! Veterinary Microbiology 2006, Volume 115, Issues 1
– 3, P. 1 – 13.
5. Levican A., Collado L., Figueras M. J. Arcobacter cloacae sp. nov. and Arcobacter suis sp.
nov., two new species isolated from food and sewage. Systematic and Applied Microbiology
2013, Volume 36, P. 22 – 27.
6. Kiehlbauch K. A., Brenner D. J. Campylobacter butzleri isolated from humans and animals
with diarrheal illness. Journal of Clinical Microbiology 1991, Volume 29, Number 2, P. 376
– 385.
7. Milesi S. Emerging pathogen Arcobacter spp. in food of animal origin. Doctoral Program in
Animal Nutrition and Food Safety 2010. Universitą degli Studi di Milano.
8. Houf K., Stephen L. W. On, Vandamme P., Coenye T., Jan M., Hoof J. V. Arcobacter
cibarius sp. nov., isolated from broiler carcasses. International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology 2005, Volume 55, P. 713 – 717.
9. Alonso R., Girbau C., Martinez – Malaxetxebarria I., Fernández – Astorga A. Multilocus
sequence typing reveals genetic diversity of foodborne Arcobacter butzleri isolates in the
North of Spain. International Journal of Food Microbiology 2014, Volume 191, P. 125 –
128.
10. Amare L.B., Saleha A.A., Zunita Z., Jalila A., Hassan L. Prevalence of Arcobacter spp. on
chicken meat at retail markets and in farm chickens in Selangor, Malaysia. Food Control
2011, Volume 22, Issue 5, P. 732 – 736.
11. Balamurugan S., Rafath A., Chambers J. R. Survival of Arcobacter butzleri on vacuum
packaged chill stored beef. Food Research International 2013, Volume 52, Issue 2, P. 503 –
507.
39
12. Yesilmen S., Vural A., Mehmet E. E., Yildirim I. H. Prevalence and antimicrobial
susceptibility of Arcobacter species in cow milk, water buffalo milk and fresh village
cheese. International Journal of Food Microbiology 2014, Volume 184, P. 11 –14.
13. Revez J., Huuskonen M., Ruusunen M., Lindstrom M., Hanninen M. L. Arcobacter Species
and Their Pulsed – Field Gel Electrophoresis Genotypes in Finnish Raw Milk during
Summer. Journal of Food Protection 2013, Volume 76, No. 9, P. 1630 – 1632.
14. Collado L., Ronald J., Vasquez N., Telsaint C. Antimicrobial resistance and virulence genes
of Arcobacter isolates recovered from edible bivalve molluscs. Food Control 2014, Volume
46, P. 508 – 512.
15. Park SY, Ha SD. Development of an absorbance-based response model for monitoring the
growth rates of Arcobacter butzleri as a function of temperature, pH, and NaCl
concentration. Poultry Science 2015, Volume 94, No.1, P. 136 –143.
16. Kjeldgaard J., Jorgense K. and Ingmer H. Growth and survival at chiller temperatures of
Arcobacter butzleri. International Journal of Food Microbiology 2009, Volume 131, P. 256
– 259.
17. Cervenka L., Kristlova J., Peskova I., Vytrosova J., Pejchalova M., and Brozkova I.
Persistance of Arcobacter butzleri CCUG 30484 on plastic, stainless steel and glass glasses.
Brazilian Journal of Microbiology 2008, Volume 39, P. 517 – 520.
18. Phillips C. A., Bates P. The survival of Arcobacter butzleri, an emerging human pathogen,
in the presence of acids or ethanol. Nutrition and Food Sciences 2004, Volume 34, Issue 5,
P. 210 – 215.
19. Tabatabaei M., Hesamaddin A. S., Hossein S., Khoshbakht R. Occurrence of six virulence-
associated genes in Arcobacter species isolated from various sources in Shiraz, Southern
Iran. Microbial Pathogenesis 2014, Volume 66, P. 1 – 4.
20. Shah A.H., Saleha A.A., Zunita Z., Cheah Y.K., Murugaiyah M., Korejo N.A. Genetic
characterization of Arcobacter isolates from various sources. Veterinary Microbiology 2012,
Volume 160, P. 355 – 361.
21. De Smet S., De Zutter L., Houf K. Small ruminants as carriers of the emerging foodborne
pathogen Arcobacter on small and medium farms. Small Ruminant Research 2011, Volume
97, P. 124 – 129.
22. Snelling W. J., Matsuda M., Moore J. E. and Dooley J. S. G. Under the microscope:
Arcobacter. Letters in Applied Microbiology 2006, Volume 42, P. 7 – 14.
40
23. Yan J. J., Ko W. C., Huang A. H., Chen H. M., Jin Y. T. and Wu J. J. Arcobacter butzleri
bacteremia in a patient with liver cirrhosis. Journal of Formos Medical Association 2004,
Volume 99, P. 166 – 169.
24. Samie A., Obi C. L., Barrett L. J., Powell S. M., and Guerrant R. L. Prevalence of
Campylobacter species, Helicobacter pylori and Arcobacter species in stool samples from
the Venda region, Limpopo, South Africa: studines using molecular diagnostic methods.
Journal of Infection 2007, Volume 54, Issue 6, P. 558 – 566.
25. Yildiz H., Aydin S. Pathological effects of Arcobacter cryaerophilus infection in rainbow
trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum). Acta Veterinaria Hungarica 2006, Volume 54, P.
191 – 199.
26. Adesiji Y. O., Benjamin E. O., Jannet O. O. Histopathological changes associated with
experimental infection of Arcobacter butzleri in albino rats. Sierra Leone Journal of
Biomedical Research 2009, Volume1, Issue 2, P. 4 – 9.
27. Insook S., Englen M. D., Berran M. E., Fedorka – Cray P. J., Harrison M. A. Antimicrobial
resistance of Arcobacter and Campylobacter from broiler carcasses. International Journal of
Antimicrobial Agents 2007, Volume 29, P. 451 – 455.
28. Ferreira S., Fraqueza M. J., Queiroz João A., Domingues F. C., Oleastro M. Genetic
diversity, antibiotic resistance and biofilm-forming ability of Arcobacter butzleri isolated
from poultry and environment from a Portuguese slaughterhouse. International Journal of
Food Microbiology 2013, Volume 162, P. 82 – 88.
29. Ünver A., Atabay H. İ., Şahin M., Çelebi Ö. Antimicrobial susceptibilities of various
Arcobacter species. Turkish Journal of Medical Sciences 2013, Volume 43, P. 548 – 552.
30. Ferreira S., Silva F., Queiroz Joćo A., Oleastro M., Domingue F. C. Resveratrol against
Arcobacter butzleri and Arcobacter cryaerophilus: Activity and effect on cellular functions.
International Journal of Food Microbiology 2014, Volume 180, P. 62 – 68.
31. Shah A. H., Saleha A. A., Zunita Z., Murugaiyah M., Aliyu A. B., Jafri N. Prevalence,
Distribution and Antibiotic Resistance of Emergent Arcobacter spp. from Clinically Healthy
Cattle and Goats. Transboundary and Emerging Diseases 2013, Volume 60, P. 9 – 16.
32. Houf K., Devriese L. A., De Zutter L., Hoof J. V., Vandamme P. Development of a new
protocol for the isolation and quantification of Arcobacter species from poultry products.
International Journal of Food Microbiology 2001, Volume 71, P. 189 – 196.
33. Antolı́n A., González I., Garcı́a T., Hernández Pablo E., Rosario M. Arcobacter spp.
enumeration in poultry meat using a combined PCR – ELISA assay. Meat Science 2001,
Volume 59, Issue 2, P. 169 – 174.
41
34. Ambrasienė D. Naujausių mokslinių pasiekimų biotechnologijos srityje mokslinė studija.
VDU Gamtos fakultetas 2007.
35. Houf K., Tutenel A., De Zutter L., Hoof J. V., Vandamme P. Development of a multiplex
PCR assay for the simultaneus detection and identification of Arcobacter butzleri,
Arcobacter cryaerophilus and Arcobacter skirrowii. FEMS Microbiology Letters 2000,
Volume 193, P. 89 – 94.
36. Merga J. Y., Leatherbarrow A. J. H., Winstanley C., Bennett M., Hart C. A., Miller W. G.
and Williams N. J. Comparison of Arcobacter isolation methods, and diversity of
Arcobacter spp. in Cheshire, United Kingdom. Applied Environmental Microbiology 2011,
Volume 77, Number 5, P. 1646 – 1650.
37. Kemp R., Leatherbarrow A. J. H., Williams N. J., Hart C. A., Clough H. E., Turner J.,
Wright E. J. and French N. P. Prevalence and genetic diversity of Campylobacter spp. in
environmental water samples from a 100-square-kilometer predominantly dairy farming
area. Applied Environmental Microbiology 2005, Volume 71, P. 1876 – 1882.
38. Atabay H. I., and Corry J. E. Evaluation of a new Arcobacter enrichment medium and
comparison with two media developed for enrichment of Campylobacter spp. International
Journal of Food Microbiology 1998, Volume 41, P. 53 – 58.
39. González I., Fernández – Tomé S., García T., Martín R. Genus-specific PCR assay for
screening Arcobacter spp. in chicken meat. Journal of the Science of Food and Agriculture
2014, Volume 94, Issue 6, P. 1218 – 1224.
40. Khoshbakht R., Tabatabaei M., Shirzad Aski H., Seifi S. Occurrence of Arcobacter in
Iranian poultry and slaughterhouse samples implicates contamination by processing
equipment and procedures. British Poultry Science 2014, Volume 55, Issue 6, P. 732 – 736.
41. Scullion R., Clare S. H., Robert H. M. Prevelance of Arcobacter species in raw milk and
retail raw meats in Northern Ireland. Journal of Food Protection 2006, Volume 69, Issue 8,
P. 1986 – 1990.
42. Douidah L., De Zutter L., Vandamme P., Houf K. Identification of five human and mammal
associated Arcobacter species by a novel multiplex-PCR assay. Journal of Microbiological
Methods 2010, Volume 80, P. 281 – 286.
43. Lehmann D., Alter T., Lehmann L., Uherkova S., Seidler T., Gölz G. Prevalence, virulence
gene distribution and genetic diversity of Arcobacter in food samples in Germany. Journal
of the Science of Food and Agriculture 2014, Volume 94, Issue 6, P. 1218 – 1224.
42
44. Hwa L. M., Cheon D. S., Choi S., Lee B. H., Jung J. Y., Choi C. Prevalence of Arcobacter
Species Isolated from Retail Meats in Korea. Journal of Food Protection 2010, Number 7, P.
1313 – 1316.
45. Atabay H.I. and Aydin F. Susceptibility of Arcobacter butzleri isolates to 23 antimicrobial
agents. Letters in Applied Microbiology 2001, Volume 33, P. 430 – 433.
46. Abay S., Kayman T., Hizlisoy H., and Aydin F. In vitro Antibacterial Susceptibility of
Arcobacter butzleri Isolated from Different Sources. J. Vet. Med. Sci. 2012, Volume 74, No.
5, P. 613 – 616.
47. Rahimi E. Prevalence and antimicrobial resistance of Arcobacter species isolated from
poultry meat in Iran. British Poultry Science 2014, Volume 55, No. 2, P. 174 – 180.
48. Fera M. T., Maugeri T. L., Giannome M., Gugliandolo C., La Camera E., Blandino G.,
Carbone M. In vitro susceptibility of Arcobacter butzleri and Arcobacter cryaerophilus to
different antimicrobial agents. International Journal of Antimicrobial Agents 2003, Volume
21, P. 488 – 491.
49. Kovalenko K., Roasto M., Šantare S., Berzins A., Hörman A. Campylobacter species and
their antimicrobial resistance in Latvian broiler chicken production. Food Control 2014,
Volume 46, P. 86 – 90.