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A P P L I E D M I C R O B I O L O G Y , D e c . 1 9 7 3 , p . 8 4 6 - 8 4 9C o p y r i g h t 0 1 9 7 3 A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y V o l . 2 6 . N o . 6P r i n t e d i n U . S . A .

D e g r a d a t i o n o f P a r a t h i o n b y B a c t e r i a I s o l a t e df r o m F l o o d e d S o i lR . SIDDARAMAPPA, K . P . RAJARAM, AND N . SETHUNATHAN

D e p a r t m e n t o f S o i l M i c r o b i o l o g y , C e n t r a l R i c e R e s e a r c h I n s t i t u t e , C u t t a c k - 6 , O r i s s a , I n d i aR e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 2 5 J u l y 1 9 7 3

Two b a c t e r i a , B a c i l l u s sp. a n d P s e u d o m o n a s sp., were i s o l a t e d f r o m p a r a t h i o n -amended f l o o d e d a l l u v i a l s o i l w h i c h e x h i b i t e d p a r a t h i o n- h y d r o l y z i n g a b i l i t y .B a c i l l u s sp. r e a d i l y l i b e r a t e d n i t r i t e f r o m t h e h y d r o l y s i s p r o d u c t , p - ni t r o p h e no l ,b u t n o t f r o m i n t a c t p a r a t h i o n . P s e u d o m o n a s sp . h y d r o l y z e d p a r a t h i o n a n d t h e nr e l e a s e d n i t r i t e f r o m p - n i t r o p h e n o l . T h e s e s t u d i e s e s t ab l i s h b a c t e r i a l d e g r a d a t i o no f p a r a t h i o n p a s t t h e p - ni t r o p h e no l s t a g e t o t h e e n d p r o d u c t , n i t r i t e .F o l i d o l , a c o m m e r c i a l f o r m u l a t i o n o f p a r a -t h i o n ( O , O - d i e t h y l - 0 - p - n i t r o p h e n y l p h o s p h o r o -t h i o a t e ) , i s e x t e n s i v e l y u s e d i n I n d i a f o r c o n t r o lo f common i n s e c t p e s t s o f r i c e . A l t h o u g h p a r -a t h i o n i s k n o w n t o b e r e l a t i v e l y l e s s p e r s i s t e n tt h a n c h l o r i n a t e d h y d r o c a r b o n i n s e c t i c i d e s , r e -c e n t l y t h i s c o m p o u n d w a s r e p o r t e d t o p e r s i s t f o rm o r e t h a n 1 6 y e ar s i n a s a n d y l o a m s o i l ( 1 3 ) .P a r a t h i o n u n d e r g o e s r a p i d d e g r a d a t i o n i nf l o o d e d r i c e s o i l s e i t h e r v i a r e d u c t i o n o f t h e n i t r og r o u p ( 1 2 ) o r v i a h y d r o l y s i s a t t h e P-O-C

l i n k a g e a f t e r r e p e a t e d a p p l i c a t i o n s ( 1 0 ) . D e g r a -d a t i o n o f p a r a t h i o n b y F l a v o b a c t e r i u m s p . i s o -l a t e d f r o m d i a z i n o n - a m e n d e d f l o o d e d r i c e s o i lc e a s e d a t t h e p - n i t r o p h e n o l s t a g e ( 1 1 ) . T h i sp a p e r r e p o r t s m o r e e x t e n s i v e d e g r a d a t i o n o fp a r a t h i o n p a s t t h e p - n i t r o p h e n o l s t a g e b y as i n g l e b a c t e r i u m i s o l a t e d f r o m f l o o d e d a l l u v i a ls o i l a n d i d e n t i f i e d a s P s e u d o m o n a s s p . F o r m a -t i o n o f n i t r i t e a s a n e n d p r o d u c t i n t h e d e g r a d a -t i o n o f p - n i t r o p h e n o l b y a s p e c i e s o f B a c i l l u sw a s a l s o i n v e s t i g a t e d .MATERIALS AND METHODS

P r e p a r a t i o n o f p a r a t h i o n - h y d r o l y z i n g e n r i c h -ment c u l t u r e . One m i l l i l i t e r o f a q u e o u s 1 , 0 0 0 - p p ms o l u t i o n o f p a r a t h i o n w a s a d d e d t o 2 0 g o f a n a l l u v i a ls o i l f r o m t h e I n s t i t u t e f a r m a t 2 - w e e k i n t e r v a l s . T h es o i l s c o n t a i n e d i n t e s t t u b e s ( 2 5 b y 2 2 0 m m ) w e r ef l o o d e d w i t h 2 4 m l o f d i s t i l l e d w a t e r . W i t h i n 2 4 t o 4 8 ha f t e r t h e t h i r d a d d i t i o n , t h e s t a n d i n g w a t e r o v e r t h es o i l s i n c e r t a i n t u b e s t u r n e d y e l l o w , i nd i c at i n g t h eh y d r o l y s i s o f p a r a t h i o n t o p - n i t r o p h e n o l ( 1 0 ) . T h i ss t a n d i n g w at e r, t o g e t h e r w i t h s o i l s u s p e n s i o n e x h i b i t -i n g p a r a t h i o n - h y d r o l y z i n g a b i l i t y , w a s p o o l e d f r o ms e v e r a l t u b e s a n d e m p l o y e d a s a n e n r i c h m e n t c u l t u r e .I s o la t i o n o f b a c t e r i a . A d i l u t i o n ( 1 0 - 4 ) o f t h ee n r i c h m e n t c u l t u r e w a s m i x e d w i t h m o l t e n m o d i f i e dWakimoto n u t r i e n t a g a r medium ( 8 ) a n d i n c u b a t e d .I s o l a t e s f r o m t h e a g a r medium w e r e t r a n s f e r r e d t o as t e r i l e m i n e r a l s o l u t i o n [ ( N H 4 ) 2 H P 0 4 , 0 . 5 g ;

MgSO4 7 H 2 0 , 0 . 2 g ; F e S O 4 7 H 2 0 , 0 . 0 0 1 g ; K 2 H P O 4 ,0 . 1 g ; C a ( N O 3 ) 2 , 0 . 0 1 g ; d i s t i l l e d w a t e r , 1 , 0 0 0 m l ]c o n t a i n i n g p a r a t h i o n o r p - n i t r o p h e n o l a s t h e s o l ec a r b o n s o u r c e . N o n e o f t h e i s o l a t e s d e c o m p o s e dp a r a t h i o n , b u t a s p e c i e s o f B a c i l l u s c a p a b l e o f d e c o m -p o s i n g p - n i t r o p h e n o l w a s i s o l a t e d ( 1 0 ) .I n a n o t h e r e x p e r i m e n t , t h e e n r i c h m e n t c u l t u r e w a ss e r i a l l y d i l u t e d , a n d 1 m l o f e a c h d i l u t i o n wasi n c u b a t e d w i t h p a r a t h i o n i n a s t e r i l e m i n e r a l s o l u t i o nf o l l o w i n g t h e m e t h o d s d e s c r i b e d f o r d i a z i n o n - h y d r o -l y z i n g F l a v o b a c t e r i u m s p . ( 8 ) . T h e l o w e s t d i l u t i o n( 1 0 - 6 ) w h i c h e x h i b i t e d p a r a t h i o n - h y d r o l y z i n g a b i l i t yw a s c h o s e n f o r f u r t h e r s t u d i e s . Th e a c t i v e p a r a t h i o n -h y d r o l y z i n g a g e n t s i n t h e 1 0 6 d i l u t i o n w e r e m u l t i -p l i e d b y i n c u b a t i n g 1 m l o f t h i s d i l u t i o n w i t h 4 m l o fs t e r i l e m i n e r a l s o l u t i o n c o n t a i n i n g p a r a t h i o n a s t h es o l e c a r b o n s o u r c e . A f t e r 4 8 h , t h i s s o l u t i o n wass t r e a k e d o n a m o d i f i e d Wakimoto a g a r medium ( 8 ) .I n d i v i d u a l b a c t e r i a l i s o l a t e s d e v e l o p i n g o n t h e a g a rmedium w e r e t r a n s f e r r e d t o a s t e r i l e m i n e r a l s o l u t i o nc o n t a i n i n g p a r a t h i o n . T h e medium w h i c h was i n c u -b a t e d w i t h i s o l a t e P - 6 t u r n e d y e l l o w w i t h i n 2 4 h , a n dt h e y e l l o w c o l o r f a d e d w i t h i n t he n e x t 2 4 h . T h i si s o l a t e w a s f u r t h e r p u r i f i e d a n d i d e n t i f i e d a sP s e u d o m o n a s s p .D e g r a d a t i o n s t u d i e s . T h e a b i l i t y o f P s e u d o m o n a ss p . t o d e c o m p o s e p a r a t h i o n wa s t e s t e d a s f o l l o w s . T h e

m i n e r a l s o l u t i o n c o n t a i n i n g a q u e o u s p a r a t h i o n w a sp a s s e d t h r o u g h a membrane f i l t e r ( M i l l i p o r e C o r p . ;0 . 4 5 Am p o r e s i z e ) , a n d 2 5 - m l s a m p l e s o f t h i s s t e r i l es o l u t i o n ( p H 7 . 1 ) w e r e d i s t r i b u t e d i n 2 5 0 - m l E r l e n -m e y e r f l a s k s . T h e medium w a s i n o c u l a t e d w i t h 0 . 1 m lo f b a c t e r i a l s u s p e n s i o n i n s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r p r e -p a r e d f r o m 3 - t o 7 - d a y - o l d c u l t u r e s . Th e i n c u b a t i o nm i x t u r e w a s i n c u b a t e d a t 2 7 C i n a b i o l o g i c a l o x y g e nd e m a n d ( B O D ) i n c u b a t o r . U n i n o c u l a t e d m e d i a s e r v e da s c o n t r o l .M e t h o d s f o r e x t r a c t i o n ( 1 1 ) a n d a n a l y s i s ( 1 0 ) o fp a r a t h i o n r e s i d u e s i n t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e h a v eb e e n d e s c r i b e d e a r l i e r . R e s i d u e s i n t h e medium weree x t r a c t e d t h r e e t i m e s w i t h 2 0 m l o f c h l o r o f o r m - d i e t h y le t h e r ( 1 : 1 ) , a n d t h e s o lv en t f r a c t i o n wa s p o o l e d . T h er e s i d u e s w e r e e v a p o r a t e d t o d r y n e s s a t room t e m p e r a -t u r e a n d t h e n d i s s o l v e d i n 2 m l o f m e t h a n o l . Th e

8 4 6

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PARATHION DEGRADATIONr e s i d u e s s p o t t e d on 3 0 0 - M m - t h i c k S i l i c a G e l G p l a t e sw e r e d e v e l o p e d f o r a d i s t a n c e o f 1 5 cm b y e m p l o y i n gh e x a n e - c h l o r o f o r m - m e t h a n o l ( 7 : 2 : 1 ) a s a d e v e l o p i n ga g e n t . A f t e r d r y i n g , t h e a u t h e n t i c c o m p o u n d s o fp a r a t h i o n a n d p - n i t r o p h e n o l w e r e l o c a t e d b y s p r a y i n gt h e c h r o m a t o p l a t e w i t h 0 . 5 % p a l l a d i u m c h l o r i d e i n 2%H C l f o l l o w e d b y 2 . 5 N NaOH. T h e s i l i c a g e l a r e a s o ft h e s a m p l e s c o r r e s p o n d i n g t o p a r a t h i o n w e r e s c r a p e dc a r e f u l l y a n d t r a n s f e r r e d t o a t e s t t u b e . On e m i l l i l i t e ro f 2 . 5 N Na OH was a d d e d t o e a c h t u b e , a n d p a r a t h i o nwas c o n v e r t e d t o p - n i t r o p h e n o l b y a l k a l i n e h y d r o l y s i si n a w a t e r b a t h f o r 1 h . A f t e r c o o l i n g , t h e v o l u m e wasmade up t o 2 5 m l , s i l i c a g e l was r e m o v e d b y c e n t r i f u -g a t i o n , a n d t h e s u p e r n a t a n t was r e a d i n a K l e t t - S u m -merson c a l o r i m e t e r e m p l o y i n g a 4 2 0 - n m b l u e f i l t e r .T h e a mount o f p a r a t h i o n i n t h e s a m p l e s was o b t a i n e db y m u l t i p l y i n g t h e v a l u e s f o r p - n i t r o p h e n o l b y 2 . 0 9 4 .p - N i t r o p h e n o l i n t h e s i l i c a g e l a r e a s o f t h e s a m p l e so p p o s i t e t o t h e a u t h e n t i c c o m p o u n d was d i r e c t l ye l u t e d i n 0 . 1 N NaOH. A f t e r c e n t r i f u g a t i o n o f t h es i l i c a g e l s u s p e n s i o n , p - n i t r o p h e n o l i n t h e s u p e r n a -t a n t was d e t e r m i n e d c o l o r i m e t r i c a l l y a g a i n s t an a p-p r o p r i a t e b l a n k a s d e s c r i b e d e a r l i e r .I n a t e s t t o d e t e r mi n e w h e t h e r n i t r i t e was f o r m e dd u r i n g t h e b a c t e r i a l d e c o m p o s i t i o n o f p - n i t r o p h e n o l ,2 0 - m l s a m p l e s o f s t e r i l e m i n e r a l s o l u t i o n w i t h o u t( N H 4 ) 2 H P O 4 a n d C a ( N O 3 ) 2 s u p p l e m e n t e d w i t h p-n i t r o p h e n o l w e r e i n o c u l a t e d w i t h 0 . 1 m l o f a suspen-s i o n o f P s e u d o m o n a s s p . i n s t e r i l e w a t e r . T h e s a m p l e sw e r e d r a w n p e r i o d i c a l l y , a n d n i t r i t e i n t h e s a m p l e swas a n a l y z e d c a l o r i m e t r i c a l l y b y u s i n g s u l f a n i l a m i d ea n d N - 1 - n a p h t h y l e t h y l e n e d i a m i n e d i h y d r o c h l o r i d e( 2 ) .B a c i l l u s sp . w h i c h d e c o m p o s e d p - n i t r o p h e n o l a st h e s o l e c a r b o n source ( 1 0 ) was t e s t e d f o r i t s a b i l i t y t or e l e a s e n i t r i t e f r o m p - n i t r o p h e n o l a s d e s c r i b e d f o rP s e u d o m o n a s s p . T h e same b a c t e r i u m was a l s o t e s t e df o r i t s a b i l i t y t o l i b e r a t e n i t r i t e f r o m i n t a c t p a r a t h i o n .

RESULTST h e b a c t e r i a l i s o l a t e P - 6 was gram n e g a t i v e ,r o d , a n d a e r o b i c , a n d was i d e n t i f i e d a s a n o n -f l u o r e s c e n t s p e c i e s o f P s e u d o m o n a s . The i s o l a t es h o w e d many c h a r a c t e r i s t i c s o f P . m u l t i v o r a n sS t a n i e r e t a l . a n d a p p e a r e d t o b e l o n g or t o b ec l o s e l y r e l a t e d t o t h i s s p e c i e s . L a r g e i n c l u s i o n s ,w h i c h w e r e p r e s u m a b l y p o l y h y d r o x y b u t y r a t e ,

w e r e v e r y c l e a r w i t h t h e Gram s t a i n s . A l l t e s t sf o r spores w e r e n e g a t i v e .W h e n P s e u d o m o n a s s p . was i n c u b a t e d w i t hp a r a t h i o n , t h e i n s e c t i c i d e was r a p i d l y d e g r a d e d .T h e c o l o r o f t h e i n c u b a t i o n m e d iu m t u r n e dy e l l o w w i t h i n 4 h o f i n c u b a t i o n , i n d i c a t i n g t h ef o r m a t i o n o f p - n i t r o p h e n o l . A t 2 0 h , h o w e v e r ,t h e y e l l o w c o l o r d i s a p p e a r e d , e v i d e n t l y b e c a u s eo f t h e f u r t h e r m e t a b o l i s m o f p - n i t r o p h e n o l .Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f p a r a t h i o n a n d p - n i t r o -p h e n o l c o n f i r m e d t h e s e f i n d i n g s . A t 4 h , a b o u t5 0 g o f a d d e d p a r a t h i o n was h y d r o l y z e d a n d 1 9gg o f p - n i t r o p h e n o l was r e c o v e r e d as t h e m a j o rm e t a b o l i t e ( T a b l e 1 ) . No o t h e r m e t a b o l i t e c o u l d

b e d e t e c t e d i n t h e t h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a m o ft h e s o l v e n t e x t r a c t . A t 2 0 h , h o w e v e r , p a r a t h i o nw a s c o m p l e t e l y d e s t r o y e d a n d n o p - n i t r o p h e n o lc o u l d b e d e t e c t e d . No a p p r e c i a b l e d e g r a d a t i o no f p a r a t h i o n o c c u r r e d i n t h e u n i n o c u l a t e d c o n -t r o l d u r i n g 2 0 h o f i n c u b a t i o n . W h e n t h e b a c t e -r i u m w a s g r o w n i n a n i t r o g e n - f r e e medi um w i t hp - n i t r o p h e n o l a s t h e s o l e c a r b o n s o u r c e a t 2 7 C 2 C i n a BO D i n c u b a t o r , n i t r i t e n i t r o g e n w a sr e l e a s e d f r o m t h e o r g a n i c n i t r o m o l e c u l e ( T a b l e2 ) . T h e amount o f n i t r i t e f o r m e d w a s p r o p o r -t i o n a l t o t h e a m o u n t o f p - n i t r o p h e n o l d e g r a d e d .W i t h i n 1 6 h o f i n c u b a t i o n , 1 5 7 u g o f p - n i t r o -p h e n o l w a s d e c o m p o s e d , l i b e r a t i n g 5 1 t i g o fn i t r i t e . I n t h e u n i n o c u l a t e d c o n t r o l , n i t r i t e w a sn o t d e t e c t e d . I n a p r e l i m i n a r y r e s t i n g - c e l l e x -p e r i m e n t , n i t r i t e w a s f o r m e d w h e n l i v i n g r e s t i n gc e l l s o f P s e u d o m o n a s s p . w e r e e x p o s e d t op a r a t h i o n i n p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 1 ) . T h e s es t u d i e s i n d i c a t e d t h a t n i t r i t e w a s f o r m e d f r o mp - n i t r o p h e n o l .B a c i l l u s s p . , i s o l a t e d f r o m f l o o d e d a l l u v i a ls o i l , w a s r e p o r t e d e a r l i e r t o u t i l i z e p - n i t r o p h e n o la s a s o l e c a r b o n s o u r c e ( 1 0 ) . I n a t e s t t od e t e r m i n e t h e e n d p r o d u c t f o r m e d d u r i n g t h eb r e a k d o w n o f p - n i t r o p h e n o l b y B a c i l l u s s p . , t h eb a c t e r i u m w a s i n c u b a t e d w i t h p - n i t r o p h e n o l i na m i n e r a l s o l u t i o n a s d e s c r i b e d f o rP s e u d o m o n a s s p . W i t h i n 2 4 h o f i n c u b a t i o n , 1 6 6t g o f p - n i t r o p h e n o l wa s m e t a b o l i z e d , r e l e a s i n g4 3 M g o f n i t r i t e ( T a b l e 3 ) .

T o t e s t w h e t h e r B a c i l l u s s p . c o u l d r e l e a s eT A B L E 1 . D e g r a d a t i o n o f p a r a t h i o n b y P s e u d o m o n a ss p . i s o l a t e d f r o m f l o o d e d s o i l

I n c u b a t i o n R e c o v e r y ( j u g / 2 5 m l o f m e d i u m )( h ) P a r a t h i o n p - N i t r o p h e n o l0 8 7 00 . 5 7 5 54 3 6 1 9

2 0 0 0

T A B L E 2 . L i b e r a t i o n o f n i t r i t e f r o m p - n i t r o p h e n o l a st h e s o l e c a r b o n s o u r c e b y P s e u d o m o n a s s p . i s o l a t e df r o m f l o o d e d s o i lI n c u b a t i o n R e c o v e r y ( , u g / 2 0 m l o f m e d i u m )( h ) p - N i t r o p h e n o l N i t r i t e a

0 1 5 7 08 8 4 1 1

1 6 0 5 22 4 0 5 6a T h e o r e t i c a l v a l u e o f n i t r i t e f o r m e d f r o m 1 5 7 i g o fp - n i t r o p h e n o l , 5 2 M g .

V O L . 2 6 , 1 9 7 3 8 4 7

8/3/2019 applmicro00035-0034

3/4

SIDDARAMAPPA, RAJARAM, AND SETHUNATHANT A B L E 3 . L i b e r a t i o n o f n i t r i t e f r o m p - n i t r o p h e n o l a st h e s o l e c a r b o n s o u r c e b y B a c i l l u s s p . i s o l a t e d f r o mf l o o d e d s o i l

I n c u b a t i o n R e c o v e r y ( p a g / 2 0 m l o f m e d i u m )( h i ) p - N i t r o p h e n o l N i t r i t e r0 1 6 6 06 1 4 3 11 2 5 8 1 42 4 0 4 3

a T h e o r e t i c a l v a l u e o f n i t r i t e f o r m e d f r o m 1 6 6 p g o fp - n i t r o p h e n o l , 5 5 p g .n i t r i t e f r o m i n t a c t p a r a t h i o n , t h e b a c t e r i u mw a s i n c u b a t e d w i t h t h e i n s e c t i c i d e f o r 1 2 0 h .p - N i t r o p h e n o l a n d n i t r i t e w e r e n o t f o r m e d .P s e u d o m o n a s s p . w a s s u b c u l t u r e d r e p e a t e d l yo n p a r a t h i o n - o r p - n i t r o p h e n o l - f r e e m o d i f i e dW a k i m o t o a g a r . A f t e r t h e f i f t h s u b c u l t u r e , t h eb a c t e r i u m w a s t e s t e d f o r i t s a b i l i t y t o d e g r a d ep a r a t h i o n o r p - n i t r o p h e n o l a s t h e s o l e c a r b o ns o u r c e i n a m i n e r a l s o l u t i o n a s d e s c r i b e d e a r l i e r .T h e b a c t e r i u m r e t a i n e d i t s a b i l i t y t o h y d r o l y z ep a r a t h i o n w i t h i n 3 h o f i n c u b a t i o n a n d t h e nr e l e a s e n i t r i t e f r o m p - n i t r o p h e n o l w i t h i n 2 4 hd e s p i t e f i v e t r a n s f e r s o n p a r a t h i o n - a n d p - n i t r o -p h e n o l - f r e e m e d i a .

DISCUSSIONP a r a t h i o n m e t a b o l i s m i n p l a n t a n d i n s e c ts y s t e m s v i a o x i d a t i o n , r e d u c t i o n o f n i t r o g r o u p ,o r h y d r o l y s i s i s w e l l e s t a b l i s h e d ( 5 ) , b u t t h es t e p w i s e d e g r a d a t i o n o f t h i s i n s e c t i c i d e i n m i -c r o o r g a n i s m s h a s n o t b e e n i n v e s t i g a t e d ( 1 ) .U n t i l r e c e n t l y , t h e m a j o r p a t h w a y o f p a r a t h i o nm e t a b o l i s m i n s o i l s a n d m i c r o o r g a n i s m s a p -p e a r e d t o b e t h e r e d u c t i o n o f t h e n i t r o g r o u p .N o w , w e h a v e c l e a r e v i d e n c e t h a t p a r a t h i o n c a nb e h y d r o l y z e d b i o l o g i c a l l y a t t h e n i t r o p h e n y lC-O-P b o n d , b o t h i n f l o o d e d s o i l s a f t e r i t sr e p e a t e d a d d i t i o n s ( 1 0 ) a n d i n p u r e c u l t u r e b yF l a v o b a c t e r i u m s p . ( 1 1 , 1 2 ) . D e g r a d a t i o n o fp a r a t h i o n b y F l a v o b a c t e r i u m s p . , h o w e v e r ,c e a s e d I a t t h e p - n i t r o p h e n o l s t a g e ( 1 1 ) . Ther e s u l t s p r e s e n t e d i n t h i s s t u d y c l e a r l y e s t a b -l i s h e d t h e d e g r a d a t i o n o f p a r a t h i o n p a s t t h en i t r o p h e n o l s t a g e b y P s e u d o m o n a s s p . , l e a d i n gt o t h e f o r m a t i o n o f n i t r i t e a s a n e n d p r o d u c t .N i t r i t e f o r m e d a p p e a r e d t o p e r s i s t i n p u r ec u l t u r e s t u d i e s w i t h B a c i l l u s s p . a n dP s e u d o m o n a s s p . d u r i n g t h e 2 4 - h i n c u b a t i o np e r i o d . H o w e v e r , i n f l o o d e d s o i l n i t r i t e d o e s n o ta c c u m u l a t e ( 6 ) , b e c a u s e o f i t s r a p i d d e n i t r i f i c a -t i o n t o m o l e c u l a r n i t r o g e n i n - a n a n a e r o b i ce n v i r o n m e n t . V a r i o u s n i t r o p h e n o l s a r e k n o w nt o b e m e t a b o l i z e d , l i b e r a t i n g n i t r i t e i n t h e

p r o c e s s . C o r y n e b a c t e r i u m s i m p l e x f o r m e d n i -

t r i t e f r o m p h e n o l i c s u b s t r a t e s c o n t a i n i n g t h en i t r o g r o u p i n t h e p a r a p o s i t i o n ( 3 ) . A s p e c i e s o fA r t h r o b a c t e r r e l e a s e d n i t r i t e f r o m a h e r b i c i d e3 , 5 - d i n i t r o - o - c r e s o l ( 4 ) .S i m i l a r l y , b o t h B a c i l l u s s p . a n d P s e u d o -m o n a s s p . u s e d i n t h i s s t u d y r e a d i l y r e l e a s e dn i t r i t e f r o m p - n i t r o p h e n o l , u t i l i z i n g t h e l a t t e ra s a s o l e c a r b o n s o u r c e ( T a b l e 2 , 3 ) . T h i s f i n d -i n g i s i n a g r e e m e n t w i t h t h a t o f Raymond a n dA l e x a n d e r ( 7 ) . P s e u d o m o n a s s p . , i n a d d i t i o n ,p o s s e s s e d a n e n z y m e s y s t e m ( s ) c a p a b l e o fh y d r o l y z i n g p a r a t h i o n . T h i s r e s u l t i s a p p a r e n t l yt h e f i r s t r e p o r t o n t h e d e g r a d a t i o n o f p a r a t h i o nt o p - n i t r o p h e n o l a n d t h e n t o n i t r i t e b y t h e s a m eb a c t e r i u m .M e t a b o l i s m o f p a r a t h i o n i n f l o o d e d s o i l o r i np u r e c u l t u r e s o f m i c r o o r g a n i s m s i s o l a t e d f r o mf l o o d e d s o i l i n v o l v e s ( i ) n i t r o g r o u p r e d u c t i o n ,l e a d i n g t o t h e f o r m a t i o n o f a m i n o p a r a t h i o n a s am a j o r m e t a b o l i t e ( 9 ) ; ( i i ) h y d r o l y s i s t o p - n i t r o -p h e n o l a s a m a j o r m e t a b o l i t e w h i c h r e s i s t sf u r t h e r d e g r a d a t i o n ( 1 1 ) ; a n d / o r ( i i i ) h y d r o l y s i st o p - n i t r o p h e n o l f o l l o w e d b y t h e f o r m a t i o n o fn i t r i t e ( t h i s r e p o r t ) . T h e f i n d i n g s r e p o r t e d i nt h i s p a p e r s h o w t h a t m i c r o o r g a n i s m s i n f l o o d e ds o i l s c o n t r i b u t e t o t h e r a p i d b r e a k d o w n o fp a r a t h i o n v i a t h e h y d r o l y t i c p a t h w a y t o t h e e n dp r o d u c t , n i t r i t e .

ACKNOWLEDGMENTSW e t h a n k S . Y . P a d m a n a b h a n f o r c r i t i c a l l y g o i n g t h r o u g ht h e m a n u s c r i p t .T h i s i n v e s t i g a t i o n w a s s u p p o r t e d , i n p a r t , b y t h e I n t e r n a -t i o n a l A t o m i c E n e r g y A g e n c y ( V i e n n a , A u s t r i a ) g r a n t n o .1 1 7 9 / S D . P s e u d o m o n a s s p . a n d B a c i l l u s s p . w e r e i d e n t i f i e db y J . F . B r a d b u r y , C o m m o n w e a l t h M y c o l o g i c a l I n s t i t u t e ,K e w , S u r r e y , E n g l a n d .

LITERATURE CITED1 . A l e x a n d e r , M. 1 9 6 9 . M i c r o b i a l d e g r a d a t i o n a n d b i o l o g i c a le f f e c t s o f p e s t i c i d e s i n s o i l , p . 2 0 9 - 2 4 0 . I n S o i l b i o l o g y ,r e v i e w s o f r e s e a r c h . UNESCO, P a r i s .2 . B a r n e s , H . , a n d A . R . F o l k a r d . 1 9 5 1 . T h e d e t e r m i n a t i o no f n i t r i t e s . A n a l y s t ( L o n d o n ) 7 6 : 5 9 9 - 6 0 3 .3 . G u n d e r s e n , K . , a n d H . L . J e n s e n . 1 9 5 6 . A c t a A g r . S c a n d .6 : 1 0 0 - 1 1 4 . ( Q u o t e d b y M . A l e x a n d e r . 1 9 6 5 . B i o d e g r a -d a t i o n : p r o b l e m s o f m o l e c u l a r r e c a l c i t r a n c e a n d m i -

c r o b i a l f a l l i b i l i t y . A d v a n . A p p l . M i c r o b i o l . 7 : 3 5 - 8 0 . )4 . J e n s e n , H . L . , a n d G . L a u t r u p - L a r s e n . 1 9 6 7 . M i c r o o r g a -n i s m s t h a t d e c o m p o s e n i t r o a r o m a t i c c o m p o u n d s , w i t hs p e c i a l r e f e r e n c e t o d i n i t r o o r t h o - c r e s o l . A c t a A g r .S c a n d . 1 7 : 1 1 5 .5 . O ' B r i e n , R . D . 1 9 6 0 . T o x i c p h o s p h o r u s e s t e r s . A c a d e m i cP r e s s I n c . , Ne w Y o r k .6 . P o n n a m p e r u m a , F . N . 1 9 7 2 . T h e c h e m i s t r y o f s u b m e r g e ds o i l s . A d v a n . A g r o n . 2 4 : 2 9 - 9 6 .7 . R a y m o n d , D . G . M . , a n d M . A l e x a n d e r . 1 9 7 1 . M i c r o b i a lm e t a b o l i s m a n d c o m e t a b o l i s m o f n i t r o p h e n o l s . P e s t .B i o c h e m . P h y s i o l . 1 : 1 2 3 - 1 3 0 .8 . S e t h u n a t h a n , N . 1 9 7 2 D i a z i n o n d e g r a d a t i o n i n s u b -m e r g e d s o i l a n d r i c e - p a d d y w a t e r . A d v a n . C h e m . S e r .1 1 1 : 2 4 4 - 2 5 5 .9 . S e t h u n a t h a n , N . 1 9 7 3 . M i c r o b i a l d e g r a d a t i o n o f i n s e c t i -c i d e s i n f l o o d e d s o i l a n d i n a n a e r o b i c c u l t u r e s . R e s i d u eR e v . 4 7 : 1 4 3 - 1 6 5 .

8 4 8 A P P L . M i c R o B i o L .

8/3/2019 applmicro00035-0034

4/4

V O L . 2 6 , 1 9 7 3 PARATHION DEGRADATION 8 4 91 0 . S e t h u n a t h a n , N . 1 9 7 3 . D e g r a d a t i o n o f p a r a t h i o n i n 1 2 . S e t h m a t h a n , N . , a n d T . Y o s h i d a . 1 9 7 3 . A F l a v o r b a c t e -f l o o d e d a c i d s o i l s . J . A g r . F o o d C h e m . 2 1 : 6 0 2 - 6 0 4 . r i u m s p . t h a t d e g r a d e s d i a z i n o n a n d p a r a t h i o n . C a n .1 1 . S e t h u n a t h a n , N . , a n d T . Y o s h i d a . 1 9 7 2 . C o n v e r s i o n o f J . M i c r o b i o l . 1 t 8 7 3 - 8 7 5 .p a r a t h i o n t o p a r a - n i t r o p h e n o l b y d i a z i n o n - d e g r a d i n g 1 3 . S t e w a r t , D . K . R . , D . C h i s h o l m , a n d M. T . H . R a g a b .F l a v o b a c t e r i u m s p . P r o c . I n s t . E n v i r o n . S c i . N . Y . 1 9 7 1 . L o n g p e r s i s t e n c e o f p a r a t h i o n i n s o i l . N a t u r eM e e t . 1 8 : 2 5 5 - 3 5 7 . ( L o n d o n ) 2 2 9 : 4 7 .