8/13/2019 Appl. Environ. Microbiol. 1980 Simon 984 7

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A P P L I E D AND E N V I R O N M E N T A L M I C R O B I O L O G Y , N o v . 1 9 8 0 , p . 9 8 4 - 9 8 7 V o l . 4 0 , N o . 50 0 9 9 - 2 2 4 0 / 8 0 / 1 1 - 0 9 8 4 / 0 4 0 2 . 0 0 / 0

I n t e r a c t i o n s B e t w e e n L i g h t a n d G a s V a c u o l e s i nH a l o b a c t e r i u m s a l i n a r i u m S t r a i n 5 : E f f e c t o f U l t r a v i o l e tL i g h t

ROBERT D . SIMOND e p a r t m e n t o f B i o l o g y , U n i v e r s i t y o f R o c h e s t e r , R o c h e s t e r , New Y o r k 1 4 6 2 7

Th e p o t e n t i a l l i g h t s h i e l d i n g b y i n t r a c e l l u l a r g a s v a c u o l e s i n H a l o b a c t e r i u ms a l i n a r i u m s t r a i n 5 was e x a m i n e d b y l o o k i n g a t t h e u l t r a v i o l e t l i g h t i n a c t i v a t i o nc u r v e s o f b o t h w i l d - t y p e c e l l s a n d m u t a n t s w h i c h a r e d e f e c t i v e i n t h e p r o d u c t i o no f g a s v a c u o l e s . W h e r e a s s t r a i n s d e f e c t i v e i n g a s v a c u o l e p r o d u c t i o n w e r e s l i g h t l ym o r e s e n s i t i v e t o u l t r a v i o l e t i n a c t i v a t i o n , no s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s i n u l t r a v i o l e ts e n s i t i v i t y w e r e s e e n , i n d i c a t i n g t h a t t h e s e s u b c e l l u l a r i n c l u s i o n b o d i e s a r e n o te f f e c t i v e a s l i g h t - s h i e l d i n g o r g a n e l l e s . I n a d d i t i o n , i t was s h o w n t h a t u l t r a v i o l e tl i g h t a c t s a s a p l a s m i d - c u r i n g a g e n t i n H a l o b a c t e r i u m .

G a s v a c u o l e s a r e s u b c e l l u l a r i n c l u s i o n s f o u n di n a v a r i e t y o f a q u a t i c m i c r o o r g a n i s m s . T h e s eb o d i e s c o n s i s t o f a g g r e g a t e s o f i n d i v i d u a l g a sv e s i c l e s , c y l i n d r i c a l s t r u c t u r e s w h i c h a r e f i l e dw i t h g a s ( 1 7 ) . B e c a u s e o f t h e l a r g e d i f f e r e n c eb e t w e e n t h e r e f r a c t i v e i n d e x o f c e l l c y t o p l a s ma n d t h e c o n t e n t s o f t h e v e s i c l e s ( g a s ) , t h e i n c l u -s i o n s i n t e n s i v e l y s c a t t e r l i g h t . G a s v a c u o l e s c a nb e c o l l a p s e d b y t h e a p p l i c a t i o n o f a c r i t i c a l p r e s -s u r e , w h i c h i n v i v o i s a f u n c t i o n o f t h e c h a r a c t e ro f t h e i n d i v i d u a l g a s v e s i c l e s a s w e l l a s o f t h ec e l l t u r g o r p r e s s u r e ( 1 5 ) . L i g h t s c a t t e r i n g d r o p sd r a m a t i c a l l y a f t e r p r e s s u r i z a t i o n o f a g a s v a c u -o l a t e c u l t u r e , a n d t h e c o m p a r i s o n o f c o n t r o l a n dp r e s s u r i z e d c u l t u r e s h a s b e e n o n e o f t h e m a j o rw a y s b y w h i c h t h e f u n c t i o n o f g a s v a c u o l e s h a sb e e n a n a l y z e d . C o l o n i e s o f many g a s v a c u o l a t em i c r o o r g a n i s m s h a v e a d i s t i n c t c r e a m y c o l o r ,a n d b y e x a m i n i n g c o l o n y c o l o r i t i s r e l a t i v e l ye a s y t o i d e n t i f y i s o l a t e s w h i c h d o n o t p r o d u c eg a s v a c u o l e s , a s w e l l a s t h o s e i n w h i c h t h e r e ma yb e a l t e r a t i o n s i n t h e t i m i n g o f s y n t h e s i s o r t h ea m o u n t o f g a s v a c u o l e s ( g a s v a c u o l e d e f e c t i v e ,g v d e f ( 1 2 , 1 6 ; R . D . S i m n o n , J . G e n . M i c r o b i o l . , i np r e s s ) .G a s v a c u o l e s p r o v i d e a way f o r a q u a t i c o r g a n -i s m s t o c h a n g e t h e i r p o s i t i o n i n t h e w a t e r c o l -um n 1 , 1 6 , 1 7 ) . T h u s , p h o t o s y n t h e t i c m i c r o o r -g a n i s m s c a n r e g u l a t e t h e a m o u n t o f l i g h t t h e yr e c e i v e , a n d o b l i g a t e a e r o b i c h e t e r o t r o p h s s u c ha s H a l o b a c t e r i u m p o t e n t i a l l y h a v e g r e a t e r a c -c e s s t o o x y g e n b e c a u s e t h e y c a n f l o a t t o t h es u r f a c e . I n a d d i t i o n , t h e r e i s a c o n t r o v e r s y o v e rw h e t h e r t h e l i g h t - s c a t t e r i n g p r o p e r t i e s o f g a sv a c u o l e s ma y a l s o s e r v e t o p r o t e c t i n d i v i d u a lc e l l s f r o m t h e p o t e n t i a l l y d e s t r u c t i v e e f f e c t s o fh i g h l i g h t i n t e n s i t i e s . B a s e d u p o n s t u d i e s o f t h es p e c t r o s c o p i c c h a r a c t e r o f g a s v a c u o l a t e m i c r o -

o r g a n i s m s , i t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e v a c u -o l e s a c t a s l i g h t - s h i e l d i n g b o d i e s 9 , 1 4 ) . How-e v e r , s u c h a f u n c t i o n w o u l d most o b v i o u s l y d e -p e n d u p o n t h e p o s i t i o n o f t h e i n c l u s i o n b o d y i nt h e c e l l r e l a t i v e t o t h e l i g h t - s e n s i t i v e s i t e . Morer e c e n t s t u d i e s s u g g e s t t h a t t h e s h i e l d i n g r e -p o r t e d ma y b e a n a r t i f a c t o f t h e t e c h n i q u e s u s e dt o m e a s u r e t h e a b s o r p t i o n s p e c t r a 8 , 1 1 , 1 7 ) .The o n l y d i r e c t t e s t o f t h e l i g h t - s h i e l d i n g h y -p o t h e s i s o f g a s v a c u o l e f u n c t i o n h a s b e e n r e -p o r t e d b y S h e a r a n d W a l s b y ( 1 1 ) , who s t u d i e da p h o t o s y n t h e t i c , f i l a m e n t o u s c y a n o b a c t e r i u m ,A n a b a e n a f l o s - a q u a e . T h e y s u g g e s t t h a t i f g a sv a c u o l e s a c t a s l i g h t s h i e l d s , t h e n a t l i m i t i n gl i g h t i n t e n s i t i e s p h o t o s y n t h e t i c r a t e s s h o u l d r i s ea f t e r p r e s s u r e - i n d u c e d g a s v a c u o l e c o l l a p s e .H o w e v e r , a t b e s t t h e r e i s o n l y a 4 i n c r e a s e i nt h e p h o t o s y n t h e t i c r a t e . L i g h t s c a t t e r i n c r e a s e se x p o n e n t i a l l y a s t h e w a v e l e n g t h o f l i g h t d e -c r e a s e s , a n d S h e a r a n d W a l s b y ( 1 1 ) a l s o e x a m -i n e d t h e e f f e c t o f b r i e f u l t r a v i o l e t ( U V ) l i g h te x p o s u r e o n t h e g r o w t h o f A . f l o s - a q u a e . T h e yi r r a d i a t e d d i l u t e s u s p e n s i o n s o f c y a n o b a c t e r i a t oa v o i d s i g n i f i c a n t s h i e l d i n g o f o n e c e l l b y o t h e r si n t h e s u s p e n s i o n ; n o d i f f e r e n c e s i n g r o w t h i n -h i b i t i o n w e r e n o t e d i n i r r a d i a t e d c e l l s w i t h o rw i t h o u t i n t a c t g a s v a c u o l e s , a n d t h e y s u g g e s tt h a t t h e s c a t t e r i n g o f UV l i g h t b y g a s v a c u o l e si s n o t e n o u g h t o p r o t e c t i n d i v i d u a l c e l l s f r o ml i g h t - i n d u c e d d a m a g e . T h e s e e x p e r i m e n t s a r es o m e w h a t d i f f i c u l t t o f u r t h e r a n a l y z e b e c a u s e i ti s n o t p o s s i b l e t o c h a r a c t e r i z e t h e e f f e c t s o f UVl i g h t o n i n d i v i d u a l c e l l s . I n a d d i t i o n , n o a l l o w -a n c e w a s made f o r p o s s i b l e p h o t o r e a c t i v a t i o nr e p a i r o f U V - i n d u c e d d a m a g e , r e p a i r w h i c h i t s e l fi s l i g h t d e p e n d e n t .I t i s l i k e l y t h a t g a s v a c u o l e s h a v e e v o l v e d t op l a y d i f f e r e n t f u n c t i o n s i n d i f f e r e n t e c o l o g i c a l

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V O L . 4 0 , 1 9 8 0n i c h e s . T h u s , t h e p o t e n t i a l e f f e c t s o f l i g h t s h i e l d -i n g m i g h t b e s t b e s t u d i e d i n an o r g a n i s m n o r -m a l l y a s s o c i a t e d w i t h an e n v i r o n m e n t r e c e i v i n ge x t r e m e l y h i g h l e v e l s o f l i g h t i r r a d i a t i o n . Th eh a l o b a c t e r i a a r e f o u n d i n s u c h an e n v i r o n m e n t :b o t h s a l i n e l a k e s a n d s a l t e r n s w h i c h c o n t a i n t h ee l e v a t e d s a l t c o n c e n t r a t i o n s r e q u i r e d f o r H a l o -b a c t e r i u m g r o w t h a r e u s u a l l y l o c a t e d i n a r e a s o fh i g h s o l a r i r r a d i a n c e . Th e ga s v a c u o l a t e f o r m so f h a l o b a c t e r i a w o u l d f l o a t t o t h e s u r f a c e u n d e rt h e s e c o n d i t i o n s , a n d i t m i g h t b e e x p e c t e d t h a tga s v a c u o l e s s er ve a s l i g h t s h i e l d s i n t h i s s i t u a -t i o n . I t h a s p r e v i o u s l y b e e n s h o w n t h a t H a l o -b a c t e r i u m a r e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t t o k i l l i n g b ys u n l i g h t 2 ; u n p u b l i s h e d d a t a ) a n d t h a t t h e c o l -o r e d c a r o t e n o i d s p r e s e n t i n t h e s e o r g a n i s m s pro-t e c t a g a i n s t p h o t o o x i d a t i v e d e a t h i n d u c e d b yt h e a d d i t i o n o f exoge nous p h o t o s e n s i t i z e r s ( 3 ) .I n t h i s s t u d y , I t e s t e d t h e l i g h t - s h i e l d i n g h y -p o t h e s i s b y r e p e a t i n g t h e U V - i n a c t i v a t i o n ex-p e r i m e n t s o f S h e a r a n d W a l s b y ( 1 1 ) w i t h H a l o -b a c t e r i u m s a l i n a r i u m s t r a i n 5 . E x p e r i m e n t swere c a r r i e d o u t u n d e r c o n d i t i o n s w h e r e o n l ys i n g l e c e l l s were i r r a d i a t e d a n d i n t h e a b s e n c e o fp h o t o r e a c t i v a t i o n r e p a i r o f DNA d a m a g e . B e -cause s p o n t a n e o u s ga s v a c u o l e m u t a n t s o f H.s a l i n a r i u m s t r a i n 5 a r e a v a i l a b l e , i t was a l s op o s s i b l e t o c o m p a r e UV s e n s i t i v i t i e s amongs t r a i n s p r o d u c i n g g r e a t l y d e c r e a s e d amounts o fga s v a c u o l e s . Th e m a j o r c o n c l u s i o n o f t h i s r e p o r ti s t h a t i n H a l o b a c t e r i u m , a s i n t h e c y a n o b a c -t e r i a , ga s v a c u o l e c o l l a p s e d o e s n o t i n c r e a s e t h es e n s i t i v i t y t o UV l i g h t , a n d t h u s , ga s v a c u o l e s d on o t a c t a s l i g h t s h i e l d s . I n a d d i t i o n , s t r a i n s w h i c hw e r e g e n e t i c a l l y i m p a i r e d i n ga s v a c u o l e p r o d u c -t i o n were s l i g h t l y more s e n s i t i v e t o UV l i g h t .H o w e v e r , t h i s may o n l y r e f l e c t a s m a l l c h a n g ea s s o c i a t e d w i t h t h i s m u t a t i o n .Th e o r i g i n a n d c h a r a c t e r o f t h e s t r a i n s u s e di n t h e e x p e r i m e n t s r e p o r t e d h e r e a r e g i v e n i nT a b l e 1 . Th e mutant s t r a i n s u s e d i n t h e s e s t u d i e sp r o d u c e d s m all amounts o f ga s v a c u o l e s o n l ya f t e r s e v e r a l weeks o f g r o w t h i n c u l t u r e . T h e r e -

NOTES 985f o r e , t h e y were c l a s s i f i e d a s g V d e f , r a t h e r t h a nn o n p r o d u c e r s o f ga s v a c u o l e s ( S i m o n , in p r e s s ) .H o w e v e r , t h e r e s p o n s e o f g v d e f s t r a i n s was anal y z e d a t t i m e s b e f o r e t h e f o n n a t i o n o f any gasv a c u o l e s , a s i n d i c a t e d b y t h e a b s e n c e o f a d i f f e r -ence i n t u r b i d i t y a f t e r p r e s s u r i z a t i o n o f t h e ex-p e r i m e n t a l m a t e r i a l . Th e m a j o r c a r o t e n o i d p r e s -e n t i n H a l o b a c t e r i u m i s b a c t e r i o r u b r i n ( 6 ) . As t r a i n l a c k i n g c o l o r e d c a r o t e n o i d s a n d ga s vac-u o l e s was i n c l u d e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h ea b s e n c e o f t h i s p r i m a r y p i g m e n t w o u l d a f f e c tUV s e n s i t i v i t y .Th e r e s p o n s e o f H a l o b a c t e r i u m t o UV l i g h twas m e a s u r e d b y p l a t i n g known n u m b e r s o fb a c t e r i a on medium s o l i d i f i e d w i t h 1 . 8 a g a r ( 7 )a n d d i r e c t l y i r r a d i a t i n g t h e p l a t e s w i t h a g e r m i -c i d a l l a m p . I r r a d i a t i n g c e l l s i n t h i s mannera v o i d s any p o p u l a t i o n e f f e c t s s u c h a s s h i e l d i n go f c e l l s b y o t h e r c e l l s . P r e v i o u s s t u d i e s s h o w t h a tH a l o b a c t e r i u m h a s 1 0 0 p l a t i n g e f f i c i e n c y un -d e r t h e c o n d i t i o n s u s e d h e r e . UV l a m p o u t p u twas c a l i b r a t e d w i t h a t h e r m o p i l e , a n d t h e t i m eo f i r r a d i a t i o n was v a r i e d t o p r o v i d e a k i l l curveo f a t l e a s t f o u r l o g s . I r r a d i a t i o n was c a r r i e d o u tu n d e r d i m y e l l o w l i g h t , a n d , a f t e r i r r a d i a t i o n ,p l a t e s were i m m e d i a t e l y w r a p p e d i n a l u m i n u mf o i l t o p r e v e n t p h o t o r e a c t i v a t i o n r e p a i r o f t h ed a m a g e d DNA 5 . P l a t e s were i n c u b a t e d a t4 2 0 C f o r 1 w e e k ; c o l o n i e s w e r e t h e n c o u n t e d ,a n d t h e p e r c e n t s u r v i v a l r a t e s w e r e c a l c u l a t e d .To d e t e r m i n e w h e t h e r t h e p h y s i c a l p res ence o fi n t a c t ga s v a c u o l e s a f f e c t e d UV s e n s i t i v i t y , somes a m p l e s o f H a l o b a c t e r i u m were t r e a t e d i n ap r e s su r e bomb a t 3 7 0 - k N / m 2 n i t r o g e n ga s pres-sure f o r 3 m i n i m m e d i a t e l y b e f o r e p l a t i n g a n dUV t r e a t m e n t . W a l s b y ( 1 5 ) h a s p r o v i d e d exper-i m e n t a l e v i d e n c e t o show t h a t 99 o f t h e ga sv a c u o l e s i n H . s a l i n a r i u m s t r a i n 5 w o u l d b ec o l l a p s e d b y t h i s t r e a t m e n t .Th e U V - i n a c t i v a t i o n curve f o r w i l d - t y p e H a l -o b a c t e r i u m w i t h i n t a c t ga s v a c u o l e s i s shown i nF i g . 1 , and t h e UV d o s e s r e q u i r e d f o r 3 7 and 1s u r v i v a l r a t e s a r e g i v e n i n t h e i n s e t o f t h e same

TABLE 1 . C h a r a c t e r i s t i c s o f i s o l a t e s o f H . s a l i n a r i u m s t r a i n 5C h a r a c t e r i s t i c s

S t r a i n i s o l a t e d G a s v a c u - C o l o r e d P l a s m i d c o m p o s i t i o n c S o u r c eole c a r o t e -o l e s n o i d s b p R D S 1 0 1 p R D S 1 0 2 p R D S 1 0 3

W i l d t y p e g v + H . L a r s e n7 7 0 5 g v d e f _ S p o n t a n e o u s , f r o m w i l d t y p e ( 1 2 )7 7 3 4 g v f _ _ U V - i n d u c e d m u t a t i o na S t r a i n s a r e c h a r a c t e r i z e d a s p r o d u c i n g a s s e m b l e d g a s v a c u o l e s ( g v + ) or p r o d u c i n g g a s v a c u o l e s b u t i na m o u n t s l e s s t h a n t h e w i l d - t y p e s t r a i n or a f t e r a t i m e d e l a y g v d e f .b P r e s e n c e ( + ) o r a b s e n c e ( - ) o f t h e m a j o r c o l o r e d c a r o t e n o i d .c W i l d - t y p e s t r a i n s c o n t a i n e d t h r e e s p e c i e s o f p l a s m i d DNA: p R D S 1 0 1 , p R D S 1 0 2 , a n d p R D S 1 0 3 w i t hm o l e c u l a r w e i g h t s o f 2 6 x 1 0 6 , 4 4 x 1 0 6 , a n d 8 6 x 1 0 6 , r e s p e c t i v e l y . P l a s m i d c o m p o s i t i o n o f t h e v a r i o u s s t r a i n swas d e t e r m i n e d a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d 1 2 .

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9 8 6 NOTES

ZzLA J

UV D O S E e r g s m m K 2F I G . 1 . E f f e c t o f UV l i g h t on t h e s u r v i v a l o f w i l d -t y p e H . s a l i n a r i u m s t r a i n 5 a n d g v d e f i s o l a t e s . C e l l s

w e r e grown a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 1 2 ) , a n d s u r v i v a lr a t e s a f t e r UV i r r a d i a t i o n were d e t e r m i n e d a s d e -s c r i b e d i n t h e t e x t . Th e curves p r e s e n t e d a r e t h eaverage o f f i v e i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s , a n d t h es t a n d a r d d e v i a t i o n o f t h e mean i s i n d i c a t e d b y t h eb a r s t h r o u g h e a c h p o i n t . D 3 7 a n d D i , D o s e s o f UVl i g h t necessary t o g i v e 3 7 a n d 1 s u r v i v a l , r e s p e c -t i v e l y . T h e i n s e r t e d b o x g i v e s t h e D 3 7 a nd D I t h es t a n d a r d d e v i a t i o n , w h i c h were d e t e r m i n e d f r o m t h es u r v i v a l curves f o r w i l d - t y p e a nd g v d e f s t r a i n s . S u r -v i v a l was m e a s u r e d u n d e r c o n d i t i o n s w h i c h w o u l dp r e c l u d e p h o t o r e a c t i v a t i o n r e p a i r ( P R ) o f U V - i n -d u c e d d a m a g e . H o w e v e r , t o t e s t t h e p h o t o r e a c t i v a t i o no f w i l d - t y p e and g v d e f s t r a i n s , s a m p l e s g i v e n a UVd o s e o f 1 , 5 0 0 ergs m m - 2 w e r e e x p o s e d t o 1 h o f w h i t el i g h t . T h e s u r v i v a l i n t h e s e s a m p l e s i s g i v e n ( P R ) f o rw i l d - t y p e and g v d e f - - - - - s t r a i n s .f i g u r e . I n a p a r a l l e l s e r i e s o f m e a su r e m e n t s , d i f f e r e n c e s were n o t e d i n t h e r a t e s o f i n a c t i v a -t i o n o f H a l o b a c t e r i u m w i t h ga s v a c u o l e s c o l -l a p s e d i m m e d i a t e l y b e f o r e i r r a d i a t i o n . Th es h a p e o f t h e i n a c t i v a t i o n curves an d t h e d o s e snece s s a r y t o p r o d u c e 3 7 a nd 1 s u r v i v a l rateswere s t a t i s t i c a l l y i d e n t i c a l . T h u s , t h e presenceo f i n t a c t ga s v a c u o l e s d o e s not p r o t e c t H a l o b a c -t e r i u m f r o m t h e d e s t r u c t i v e e f f e c t s o f UV l i g h t .The e f f e c t o f p h o t o r e a c t i v a t i o n r e p a i r o f DNAd a m a g e was m e a s u r e d by i l l u m i n a t i n g U V - i r r a -d i a t e d p l a t e s f o r 1 h i n c o o l w h i t e f l u o r e s c e n tl i g h t a t an i n t e n s i t y o f i - O erg s c m - 2 S - 1 . P l a t e swere t h e n w r a p p e d i n a l u m i n u m f o i l a n d t r e a t e d

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .a s u n - p h o t o r e a c t i v a t e d s e t s . S a m p l e s o f H a l o -b a c t e r i u m w h i c h were g i v e n d o s e s o f UV l i g h tw h i c h w o u l d n o r m a l l y r e s u l t i n 0 . 1 t o 0 . 5 s u r -v i v a l r a t e s ( 1 5 0 0 e r g s m m - 2 ) c o u l d b e p h o t o r e a c -t i v a t e d t o b e t w e e n 7 5 a n d 9 0 c o l o n y s u r v i v a lr a t e s . A l t h o u g h t h e d e t a i l e d k i n e t i c s o f p h o t o -r e a c t i v a t i o n were n o t s t u d i e d , t h e r e w e r e nom a j o r d i f f e r e n c e s b e t w e e n w i l d - t y p e s t r a i n s w i t ho r w i t h o u t i n t a c t g a s v a c u o l e s o r b e t w e e n w i l d -t y p e a n d g V d e f i s o l a t e s .S t r a i n s w h i c h w e r e g v d e f e . g . , 7 7 0 5 ) w e r es l i g h t l y m o re s e n s i t i v e t o UV i n a c t i v a t i o n t h a nw i l d - t y p e s t r a i n s ( F i g . 1 . Th e d i f f e r e n c e s a r es t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t , a n d t h e d o s a g e s n e c e s -s a r y f o r e q u i v a l e n t k i l l i n g a r e a p p r o x i m a t e l y 2 0h i g h e r i n t h e w i l d - t y p e i s o l a t e . S t r a i n 7 7 3 4 , a ni s o l a t e w i t h o u t c a r o t e n o i d s , s h o w s t h e same i n -a c t i v a t i o n c u r v e s a s g v d e f s t r a i n s c o n t a i n i n g c o l -o r e d c a r o t e n o i d s . T h u s , t h e p r e s e n c e o f t h e s ep i g m e n t s d o e s n o t p r o t e c t t h e c e l l s i n a n y wayf r o m U V - i n d u c e d d a m a g e . T h e g v d e f s t r a i n s u s e dh e r e a l l l a c k t h e p l a s m i d p R D S 1 0 2 ( 1 2 ; S i m o n ,i n p r e s s ) . A l t h o u g h i t i s k n o w n t h a t r e p a i r s y s -t e m s f o r U V - i n d u c e d d a m a g e c a n b e s p e c i f i e db y p l a s m i d - l o c a l i z e d g e n e s ( 1 0 ) , t h e i n c r e a s e i nUV s e n s i t i v i t y i s s m a l l a n d n o t t h e o r d e r - o f -m a g n i t u d e d i f f e r e n c e o f t e n a s s o c i a t e d w i t h t h el o s s o f a d a r k r e p a i r s y s t e m ( 1 3 ) . T h u s , p R D S 1 0 2d o e s n o t e n c o d e a UV r e p a i r s y s t e m . T h i s i ss u p p o r t e d b y t h e f i n d i n g s o f G r e y a n d F i t t 4 ,who s h o w t h a t t h e r e ma y b e n o d a r k r e p a i r i nH a l o b a c t e r i u m . Th e s l i g h t l y i n c r e a s e d s e n -s i t i v i t y o f g v d e f s t r a i n s c o u l d r e s u l t f r o m s m a l lc h a n g e s i n t h e U V - s e n s i t i v e t a r g e t , e . g . , v a r i a -t i o n s i n c e l l s i z e o r m o r p h o l o g y , c h a n g e s i n n u -c l e o i d s t r u c t u r e o r DNA c o n t e n t p e r c e l l , e t c .( 1 3 ) . T h u s , a l t h o u g h i t i s n o t p o s s i b l e t o s i m p l ye x p l a i n t h e o r i g i n o f t h e a l t e r e d UV s e n s i t i v i t y ,t h e d a t a d o s u g g e s t t h a t t h e r e a r e p r o b a b l yd i f f e r e n c e s b e t w e e n s t r a i n s w i t h a n d w i t h o u tp R D S 1 0 2 o t h e r t h a n t h e p r e s e n c e o f w i l d - t y p eg a s v a c u o l e s .

S t r a i n s o f H a l o b a c t e r i u m w h i c h l o s e t h e p l a s -m i d p R D S 1 0 2 a r e g a s v a c u o l e d e f e c t i v e s . I t b e -comes e a s y t o i d e n t i f y i s o l a t e s c u r e d o fp R D S 1 0 2 b e c a u s e t h e c o l o n y c o l o r i s d i f f e r e n tf r o m t h a t o f t h e w i l d - t y p e s t r a i n ( 1 2 ) . S t u d i e ss h o w t h a t a l t h o u g h p l a s m i d pRDS102 i s l o s tu n d e r n o r m a l g r o w t h c o n d i t i o n s a t a v e r y h i g hf r e q u e n c y ( 1 0 - 2 ) ( 1 2 ) , m a n y c o m p o u n d s w h i c hn o r m a l l y a c t a s p l a s m i d - c u r i n g a g e n t s i n b a c t e -r i a a r e w i t h o u t a f f e c t o n H a l o b a c t e r i u m ( 1 2 , 1 8 )a n d d o n o t i n c r e a s e t h i s f r e q u e n c y . H o w e v e r ,W i l l e t s ( 1 9 ) h a s s h o w n t h a t m u t a g e n i c a g e n t s ,i n c l u d i n g UV l i g h t , a r e a b l e t o i n d u c e t h e c u r i n go f t h e F l a c + p l a s m i d i n E s c h e r i c h i a c o l i .W h e r e a s s e v e r a l c h e m i c a l m u t a g e n s w i l l n o t a c ta s p l a s m i d - c u r i n g a g e n t s i n H a l o b a c t e r i u m 1 2 ;S i m o n , u n p u b l i s h e d d a t a ) , d a t a i n F i g . 2 s h o wt h a t d o s e s o f UV l i g h t w i l l i n c r e a s e t h e f r e q u e n c y

8/13/2019 Appl. Environ. Microbiol. 1980 Simon 984 7

5/5

V O L . 4 0 , 1 9 8 0

UV DOSE ergs * m m 2F I G . 2 . E f f e c t o f UV l i g h t on t h e f r e q u e n c y o f g v d fi s o l a t e s i n d u c e d i n w i l d - t y p e H . s a l i n a r i u m s t r a i n 5 .W i l d - t y p e H a l o b a c t e r i u m was t r e a t e d w i t h v a r i o u sd o s e s o f i g h t a s d e s c r i b e d i n t h e t e x t . T h e morp h o l o g y o f c o l o n i e s f o r m e d f r o m c e l l s s u r v i v i n g t h et r e a t m e n t was e x a m i n e d . A l l c o l o n i e s w h i c h w e r er e d d e r t h a n t h e c r e a m y - p i n k c o l o r o f t h e u n t r e a t e dw i l d - t y p e c o l o n i e s w e r e s c o r e d a s g v - f . Th e r e s u l t sg i v e n a r e t h e average o f f i v e e x p e r i m e n t s , a nd t h es t a n d a r d d e v i a t i o n o f t h e mean i s i n d i c a t e d b y t h eb a r s drawn t h r o u g h e a c h p o i n t . T h e e x p e r i m e n t sw e r e n o r m a l l y c a r r i e d o u t u n d e r c o n d i t i o n s w h i c hp r e c l u d e p h o t o r e a c t i v a t i o n r e p a i r ( P R ) o f U V - i n -d u c e d d a m a g e . H o w e v e r , t h e e f f e c t o f a l l o w i n g PR i sshown f o r s a m p l e s i r r a d i a t e d w i t h t 1 , 5 ( X ergsm - 2o f g v d e f p r o ge n y i n t h e s u r v i v o r s . At a d o s e o f1 , 5 0 0 ergs m n - 2 , w h i c h g i v e s o n l y a b o u t a 0 . 5s u r v i v a l r a t e , a l m o s t 4 o f t h e s u r v i v o r s a r eg v d e f . A n a l y s i s o f t h e p l a s m i d c o m p o s i t i o n o fs e l e c t e d U V - i n d u c e d g v d e f s t r a i n s i n di c a t e d t h ea b s e n c e o f pRDS102 ( n o t s h o w n ) . Th e p l a s m i dl o s s i s a s s o c i a t e d w i t h t h e U V - i n d u c e d muta-g e n i c e f f e c t , a s shown b y t h e f a c t t h a t c o n d i t i o n sw h i c h a l l o w f o r p h o t o r e a c t i v a t i o n d e c r e a s e t h ep e r c e n t a g e o f gv pr o gen y t o t h e l e v e l n o r m a l l ys een i n u n t r e a t e d c u l t u r e s ( F i g . 2 ) .G a s v a c u o l a t e h a l o b a c t e r i a o f t e n a r e f o u n d i na r e a s r e c e i v i n g h i g h r a t e s o f s o l a r i n f l u x f o r l o n gp e r i o d s o f t i m e . I n a d d i t i o n , t h e presence o f ga sv a c u o l e s w o u l d t e n d t o a c c u m u l a t e c e l l s a t t h ew a t e r s u r f a c e where t h e p o t e n t i a l f o r l i g h t - i n -d u c e d d a m a g e was t h e g r e a t e s t . Data p r o v i d e dh e r e a n d e l s e w h e r e ( 1 1 ) i n d i c a t e t h a t t h e l i g h t -s c a t t e r i n g p r o p e r t i e s o f ga s v a c u o l e s do not p r o -v i d e t h e i n d i v i d u a l c e l l w i t h p r o t e c t i o n froml i g h t - i n d u c e d d a m a g e . I f s u c h p r o t e c t i o n o c c u r s ,i t most l i k e l y d o e s s o a s a p o p u l a t i o n p h e n o m e -non w h e r e t h e upper c e l l s i n a l a y e r a r e them-

NOTES 9 8 7s e l v e s s a c r i f i e d , b u t p r o v i d e s o m e p r o t e c t i o n f o rsome c e l l s l y i n g b e l o w t h e m .

I t h a n k M . S h i l o f o r p r o v i d i n g f a c i l i t i e s w i t h w h i c h t op r e p a r e t h e m a n u s c r i p t a n d R a c h e l Y e h e z k e l f o r s e c r e t a r i a lh e l p .T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d i n p a r t b y g r a n t PCM 7 7 - 2 0 2 3 2 2f r o m t h e N a t i o n a l S c i e n c e F o u n d a t i o n .

LITERATURE CITED1 . D i n s d a l e , M . T . , and A . E . W a l s b y . 1 9 7 2 . The i n t e r r e -l a t i o n s o f c e l l t u r g o r p r e s s u r e , g a s - v a c u o l a t i o n , a n db u o y a n c y i n a b l u e -g r e e n a l g a . J . E x p . B o t . 2 3 : 5 6 1 - 5 7 0 .2 . D u n d a s , I . D . , and H . L a r s e n . 1 9 6 2 . The p h y s i o l o g i c a lr o l e o f c a r o t e n o i d p i g m e n t s o f H a l o b a c t e r i u m s a l i n a r -i u m . A r c h . M i k r o b i o l . 4 4 : 2 3 3 - 2 3 9 .3 . D u n d a s , L . D . , and H . L a r s e n . 1 9 6 3 . A s t u d y o n t h ek i l l i n g b y l i g h t o f p h o t o s e n s i t i s e d c e l l s o f H a l o b a c t e r -

i u m s a l i n a r i u m . A r c h . M i k r o b i o l . 4 6 : 1 9 - 2 8 .4 . G r e y , V . L . , and P . S . F i t t . 1 9 7 6 . E v i d e n c e f o r t h e l a c ko f d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d d a r k - r e p a i r i n H a l o b a c t e r i u mc u t i r u b r u m . B i o c h e m . J . 1 5 6 : 5 6 9 - 5 7 5 .5 . H e s c o x , M L A . , and D . M. C a r l b e r g . 1 9 7 2 . P h o t o r e a c t i -v a t i o n i n H a l o b a c t e r i u m c u t i r u b r u m . C a n . J . M i c r o b i o l .1 8 : 9 8 1 - 9 8 5 .6 . J e n s e n , S . L 1 9 6 2 . The c o n s t i t u t i o n o f s o m e b a c t e r i a lc a r o t e n o i d s a n d t h e i r b e a r i n g o n b i o s y n t h e t i c p r o b l e m s .K . N o r . V i d e n s k . S e l s k . S k r . 8 : 1 - 1 9 9 .7 . L a r s e n , H . , S . Omang, and H . S t e e n s l a n d . 1 9 6 7 . Ont h e g a s v a c u o l e s o f t h e H a l o b a c t e r i a . A r c h . M i k r o b i o l .5 9 : 1 9 7 - 2 0 3 .8 . O g a w a , T . , T . S e k i n e , and S . A i b a . 1 9 7 9 . R e a p p r a i s a lo f t h e s o - c a l l e d l i g h t s h i e l d i n g o f g a s v a c u o l e s i n M i c r o -c y s t i s a e r u g u w s a . A r c h . M i c r o b i o l . 1 2 2 : 5 7 - 6 0 .9 . P o r t e r , J . , a n d M. J o s t . 1 9 7 6 . P h y s i o l o g i c a l e f f e c t s o f t h ep r e s e n c e a n d a b s e n c e o f g a s v a c u o l e s i n t h e b l u e - g r e e na l g a M i c r o c y s t i s a e r u g i n o s a K u e t z . e m e n d . E l e n k i n .A r c h . M i c r o b i o l . 1 1 0 : 2 2 5 - 2 3 1 .1 0 . R e a n n e y , D . 1 9 7 6 . E x t r a c h r o m o s o m a l e l e m e n t s a s p o s -s i b l e a g e n t s o f a d a p t i o n a n d d e v e l o p m e n t . B a c t e r i o l .R e v . 4 0 : 5 5 2 - 5 9 0 .1 1 . S h e a r , H . , and A . E . W a l s b y . 1 9 7 5 . A n i n v e s t i g a t i o n i nt h e p o s s i b l e l i g h t - s h i e l d i n g r o l e o f g a s v a c u o l e s i n ap l a n k t o n i c b l u e - g r e e n a l g a . B r . J . P h y c o l . 1 0 : 2 4 1 2 5 11 2 . S i m o n , R . D . 1 9 7 8 . H a l o b a c t e r i u m s t r a i n 5 c o n t a i n s ap l a s m i d w h i c h i s c o r r e l a t e d w i t h t h e p r e s e n c e o f g a sv a c u o l e s . N a t u r e ( L o n d o n ) 2 7 3 : 3 1 4 - 3 1 7 .1 3 . S m i t h , K . C . , and P . C . H a n a w a l t . 1 9 6 9 . M o l e c u l a rp h o t o b i o l o g y : i n a c t i v a t i o n a n d r e c o v e r y . A c a d e m i cP r e s s , I n c . , New Y o r k .1 4 . W a a l a n d , J . R . , S . D . W a a l a n d , and D . B r a n t o n . 1 9 7 0 .G a s v a c u o l e s - l i g h t s h i e l d i n g i n b l u e - g r e e n a l g a e . J .C e l l B i o l . 4 8 : 2 1 2 - 2 1 5 .1 5 . W a l s b y , A . E . 1 9 7 1 . The p r e s s u r e r e l a t i o n s h i p s o f g a sv a c u o l e s . P r o c . R . S o c . L o n d o n S e r . B 1 7 8 : 3 0 1 - 3 2 6 .1 6 . W a l s b y , A . E . 1 9 7 6 . The b u o y a n c y - p r o v i d i n g r o l e o f g a sv a c u o l e s i n a n a e r o b i c b a c t e r i u m . A r c h . M i c r o b i o l . 1 0 9 :1 3 5 - 1 4 2 .1 7 . W a l s b y , A . E . 1 9 7 8 . Th e g a s v e s i c l e s i n a q u a t i c p r o c a r -y o t e s . S y m p . S o c . G e n . M i c r o b i o l . 2 8 : 3 2 7 - 3 5 8 .1 8 . W e i d i n g e r , G . , G . K l o t z , and W. G o e b e l . 1 9 7 8 . A l a r g ep l a s m i d f r o m H a l o b a c t e r i u m h a l o b i u m c a r r y i n g g e -n e t i c i n f o r m a t i o n f o r g a s v a c u o l e f o r m a t i o n . P l a s m i d 2 :3 7 7 - 3 8 6 .1 9 . W i l e t t s , N . S . 1 9 6 7 The e l i m i n a t i o n o f F l a c + f r o mE s c h e r i c h i a c o l i b y m u t a g e n i c a g e n t s . B i o c h e m . B i o -p h y s . R e s . Commun. 2 7 : 1 1 2 - 1 1 7 .