8/2/2019 Appl. Environ. Microbiol.-1982-Buck-992-3

http://slidepdf.com/reader/full/appl-environ-microbiol-1982-buck-992-3 1/3

1982, 44(4):992.Appl. Environ. Microbiol.J D Buckreactions of marine bacteria.

determination of gramNonstaining (KOH) method for

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 b  y  g u e s  t  

h  t   t   p:  /   /   a em. a s m. or  g /  

D  ownl   o a d  e d f  r  om 

8/2/2019 Appl. Environ. Microbiol.-1982-Buck-992-3

http://slidepdf.com/reader/full/appl-environ-microbiol-1982-buck-992-3 2/3

V o l . 4 4 , N o . 4A P P L I E D AND ENVIRONMENTAL M I C R O B I O L O G Y , O C t . 1 9 8 2 , p . 9 9 2 - 9 9 3

0 0 9 9 - 2 2 4 0 / 8 2 / 1 0 0 9 9 2 - 0 2 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t C 1 9 8 2 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

N o n s t a i n i n g (KOH) Method f o r D e t e r m i n a t i o n o f Gram

R e a c t i o n s o f M a r i n e B a c t e r i a t

JOHN D . BUCKS

Mote M a r i n e L a b o r a t o r y , S a r a s o t a , F l o r i d a 3 3 5 7 7

R e c e i v e d 6 May 1 9 8 2 / A c c e p t e d 1 5 J u n e 1 9 8 2

A r a p i d n o n s t a i n i n g (KOH) m e t h o d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e Gram r e a c t i o n s

o f b a c t e r i a i s d e s c r i b e d , a n d i t s a p p l i c a t i o n t o m a r i n e i s o l a t e s i s d i s c u s s e d . A l lg r a m - p o s i t i v e a n d g r a m - n e g a t i v e r e s u l t s o b t a i n e d b y Gram s t a i n i n g were c o n -

f i r m e d b y t h e KOH m e t h o d . G r a m - v a r i a b l e b a c t e r i a p r o d u c e d e q u i v o c a l r e s u l t s .

A c e n t u r y a g o , H a n s C h r i s t i a n Gram d e v e l -o p e d a s t a i n i n g p r o c e d u r e w h i c h e n a b l e d t h es e p a r a t i o n o f m o s t c o m m o n l y e n c o u n t e r e d b a c -

t e r i a i n t o t w o g r o u p s : g r a m p o s i t i v e a n d g r a mn e g a t i v e . T o d a y , Gram s t a i n i n g r e m a i n s t h em o s t i m p o r t a n t d i f f e r e n t i a l t e c h n i q u e a p p l i e d t o

b a c t e r i a ( 2 ) ; i n f a c t , f o r 8 o f t h e 1 9 m a j o rg r o u p i n g s o f b a c t e r i a ( 1 ) , s t a i n i n g i s r e q u i r e d a s

a p r i m a r y a i d t o i d e n t i f i c a t i o n . A l t h o u g h manyb i o c h e m i c a l f e a t u r e s o f d i a g n o s t i c b a c t e r i o l o g yh a v e b e e n a d a p t e d f o r i n c r e a s e d t i m e - c o s t e f f i -

c i e n c y , t h e Gram s t a i n t e c h n i q u e i s e s s e n t i a l l yt h e s a m e n ow a s i t w a s i n 1 8 8 4 . P r e m i x e d s t a i n sc a n b e p u r c h a s e d , b u t t h e p r o c e d u r e i s s t i l l

r e l a t i v e l y t i m e c o n s u m i n g , c o s t l y , a n d o f t e nm e s s y , a n d r e a g e n t s m u s t b e r e p l a c e d p e r i o d i -c a l l y .

A p p r o x i m a t e l y 4 0 y e a r s a g o , a s i m p l e a n d

r a p i d n o n s t a i n i n g ( K O H ) m e t h o d f o r t h e d e t e r -m i n a t i o n o f t h e Gram r e a c t i o n a p p e a r e d i n t h eJ a p a n e s e l i t e r a t u r e ( 3 ) . T h e m e t h o d was d e -s c r i b e d o n c e a g a i n a n d u s e d f o r 6 9 s t r a i n s o f

b a c t e r i a e n c o u n t e r e d i n v e t e r i n a r y m i c r o b i o l o g yc l i n i c s ( 3 ) . T h e e f f i c a c y o f t h e KOH m e t h o d w a s

c o n f i r m e d f u r t h e r w i t h 2 2 b a c t e r i a o f i m p o r t a n c ei n t h e b r e w i n g i n d u s t r y ( 6 ) . Q u a l i t y c o n t r o l f o rt h e t r a d i t i o n a l Gram s t a i n p r o c e d u r e was

a c h i e v e d w i t h 1 0 0 c l i n i c a l i s o l a t e s ( 4 ) , a n d , t ok e e p c o s t s d o w n , t h e KOH m e t h o d h a s b e e ns u g g e s t e d f o r r o u t i n e u s e i n h o s p i t a l s ( 5 ) . I n t h i ss t u d y , I e x t e n d e d t h e u s e f u l n e s s o f t h e KOHt e c h n i q u e t o t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f a l a r g e c o l -l e c t i o n o f m a r i n e b a c t e r i a . I h o p e t o r e m i n d t h et e a c h i n g a n d r e s e a r c h c o m m u n i t y o f o r i n t r o -d u c e i t t o t h e e f f e c t i v e n e s s o f t h e m e t h o d .

To p e r f o r m t h e t e s t , p l a c e a d r o p o f 3%

a q u e o u s KOH o n a s l i d e . I f o n e p r e f e r s , 1 0 , u l

t C o n t r i b u t i o n n o . 1 4 9 f r o m t h e U n i v e r s i t y o f C o n n e c t i c u tM a r i n e R e s e a r c h L a b o r a t o r y .

t P r e s e n t a d d r e s s : D e p a r t m e n t o f M a r i n e S c i e n c e s a n dM a r i n e S c i e n c e s I n s t i t u t e , M a r i n e R e s e a r c h L a b o r a t o r y , T h e

U n i v e r s i t y o f C o n n e c t i c u t , N o a n k , CT 0 6 3 4 0 .

f r o m a n a u t o m a t i c p i p e t t e i s a d e q u a t e . I n p r a c -t i c e , a s many a s 8 t o 1 0 t e s t s p e r s l i d e c a n b ed o n e c o n v e n i e n t l y . U s i n g a s t e r i l e l o o p , t r a n s f e ra v i s i b l e a m o u n t o f b a c t e r i a l g r o w t h f r o m a n

a g a r c u l t u r e t o t h e d r o p o f KOH. M i x t h e c e l l sa n d KOH t h o r o u g h l y o n t h e s l i d e , c o n s t a n t l ys t i r r i n g o v e r a n a r e a a b o u t 1 . 5 cm i n d i a m e t e r . I ft h e b a c t e r i u m - K O H s u s p e n s i o n b e c o m e s m a r k -

e d l y v i s c i d o r g e l s w i t h i n 5 t o 6 0 s , t h e i s o l a t e i s

g r a m n e g a t i v e . I f n o g e l l i n g i s o b s e r v e d , t h ei s o l a t e i s g r a m p o s i t i v e . T h e b e s t way t o d e t e r -

m i n e v i s c o s i t y i s t o r a i s e t h e l o o p a b o u t 1 cmf r o m t h e s l i d e . I f a n o b v i o u s s t r i n g i n e s s i s p r e s -e n t , t h e n t h e c u l t u r e i s g r a m n e g a t i v e .

I n t h i s s t u d y , 4 0 0 i s o l a t e s w e r e t e s t e d b y b o t h

t h e KOH m e t h o d a n d c o n v e n t i o n a l s t a i n i n g ; f o rt h e l a t t e r , a c o m m e r c i a l s t a i n k i t ( D i f c o L a b o r a -

t o r i e s ) w a s u s e d . B a c t e r i a w e r e i s o l a t e d f r o ms e a w a t e r a n d a w i d e v a r i e t y o f f i s h . A l l c u l t u r e sw e r e s t r e a k e d t o e n s u r e p u r i t y a n d m a i n t a i n e d

o n s l a n t s o f m a r i n e a g a r ( D i f c o ) o r t r y p t i c s o y

a g a r ( D i f c o ) . S t a i n i n g a n d t h e KOH p r o c e d u r ew e r e p e r f o r m e d a t t h e s a m e t i m e w i t h s l a n tc u l t u r e s r a n g i n g i n a g e f r o m s e v e r a l h o u r s t os e v e r a l w e e k s .

U s i n g t h e s t a i n p r o c e d u r e o n 1 8 - t o 2 4 - h

c u l t u r e s , I f o u n d 81% o f t h e c u l t u r e s t o b e g r a mn e g a t i v e , 11% t o b e g r a m p o s i t i v e , a n d 8% t o b eg r a m v a r i a b l e , i . e . , h a v i n g b o t h p u r p l e a n d p i n kc e l l s . A l l g r a m - p o s i t i v e a n d g r a m - n e g a t i v e r e -s u l t s o b t a i n e d b y s t a i n i n g w e r e c o n f i r m e d b y t h eKOH t e c h n i q u e . G r a m - v a r i a b l e b a c t e r i a g a v ee q u i v o c a l r e s u l t s . I n p r e v i o u s s t u d i e s , o n l y F l u -h a r t y a n d P a c k a r d ( 3 ) e n c o u n t e r e d a b a c t e r i u mf o u n d t o b e g r a m v a r i a b l e b y s t a i n i n g , a n d i t w a sf o u n d t o b e g r a m n e g a t i v e b y t h e KOH p r o c e -

d u r e . A t o t a l o f 3 0 o r g a n i s m s w e r e f o u n d t o b eg r a m v a r i a b l e b y s t a i n i n g i n t h e p r e s e n t s t u d y ;w h e n t e s t e d b y t h e KOH m e t h o d , 1 8 ( 6 0 % ) w e r ef o u n d t o b e g r a m n e g a t i v e , a n d 1 2 ( 4 0 % ) w e r ef o u n d t o b e g r a m p o s i t i v e . S i x c o n t a m i n a t e dc u l t u r e s c o n t a i n e d i n i t i a l l y b o t h g r a m - p o s i t i v e

a n d g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a a n d g e l l e d w i t h

9 9 2

  on J  an u ar  y  3 1  ,2  0 1 2 

 b  y  g u e s  t  

h  t   t   p:  /   /   a em. a s m. or  g /  

D  ownl   o a d  e d f  r  om 

8/2/2019 Appl. Environ. Microbiol.-1982-Buck-992-3

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NOTES 9 9 3

K O H ( i . e . , r e s p o n d e d a s g r a m n e g a t i v e ) . T h i s

p a t t e r n h a s b e e n n o t e d e a r l i e r ( 3 , 6 ) .I n o n e s t u d y ( 3 ) , t h e r e s u l t s f o r y o u n g ( 1 6 - t o

2 0 - h ) a n d o l d e r ( 2 - t o 1 0 - m o n t h ) c u l t u r e s o b -

t a i n e d b y s t a i n i n g a n d t h e KOH m e t h o d w e r ef o u n d t o b e i d e n t i c a l . I n t h e c u r r e n t s t u d y , 4 -w e e k - o l d c u l t u r e s o f r e c e n t l y o b t a i n e d B a c i l l u s ,S t a p h y l o c o c c u s , a n d S t r e p t o c o c c u s i s o l a t e sh e l d a t room t e m p e r a t u r e n e v e r s h o w e d a n y

g e l l i n g . T h e s e s t r a i n s r e m a i n e d g r a m p o s i t i v e b yt h e KOH m e t h o d , w h e r e a s s t a i n i n g r e v e a l e d

m i x t u r e s o f p i n k a n d p u r p l e c e l l s a f t e r a f e w

d a y s .T h e a d v a n t a g e s o f t i m e , e a s e , a n d c o s t o f t h e

KOH t e c h n i q u e a r e o b v i o u s . I n a s t u d y i np r o g r e s s o n t h e b a c t e r i a u s e d i n t h e s e e x p e r i -

m e n t s t h a t w e r e i s o l a t e d f r o m s h a r k s a n d o t h e rf i s h , i t w a s n e c e s s a r y t o r o u t i n e l y s e p a r a t eg r a m - n e g a t i v e , o x i d a s e - n e g a t i v e r o d s f r o m t h eo t h e r b a c t e r i a f o r s u b s e q u e n t i d e n t i f i c a t i o n b yr a p i d d i a g n o s t i c t e s t s f o r m e m b e r s o f t h e E n t e r o -

b a c t e r i a c e a e . T h e KOH t e c h n i q u e , t o g e t h e rw i t h a w e t - m o u n t p r e p a r a t i o n f o r o b s e r v i n g

m o r p h o l o g y a n d c y t o c h r o m e o x i d a s e t e s t s t r i p s ,p r o v i d e d a n e f f i c i e n t a n d r a p i d s c r e e n i n g p r o c e -

d u r e .T h e g e l r e a c t i o n i s a p p a r e n t ; g e n e r a l l y t h e r e i s

n o c o n f u s i o n r e g a r d i n g s t r i n g i n e s s , a l t h o u g hs o m e

c u l t u r e sa r e s l o w t o r e a c t , a n d t h e r e a c t i o n

i s n o t o b v i o u s i f t o o f e w c e l l s a r e u s e d . H o l d i n gt h e s l i d e a t a n a p p r o p r i a t e a n g l e a g a i n s t a d a r k

b a c k g r o u n d a i d s o b s e r v a t i o n . T h e KOH t e c h -n i q u e d o e s h a v e some d i s a d v a n t a g e s . I t d o e s n o t

b y i t s e l f e n a b l e a n y n o t a t i o n o f c e l l m o r p h o l o g y .H o w e v e r , a d d i t i o n a l c h a r a c t e r i s t i c s n e c e s s a r y

f o r e v e n t u a l i d e n t i f i c a t i o n ( e . g . , m o t i l i t y ) w o u l df u r n i s h t h i s . T h e c u l t u r e s a m p l e n e c e s s a r y f o rt h e KOH t e s t i s b i g g e r t h a n t h a t n e e d e d f o rGram s t a i n i n g , a l t h o u g h a l a r g e c o l o n y a n d a

s m a l l d r o p o f KOH w i l l f u n c t i o n i f n e c e s s a r y .

T h e KOH p r o c e d u r e d o e s n o t e n a b l e t h e d e t e c -

t i o n o f g r a m - v a r i a b l e b a c t e r i a : a s s h o w n a b o v e ,t h e s e b a c t e r i a a r e s e e n a s g r a m p o s i t i v e o r g r a mn e g a t i v e . T h e g r a m - v a r i a b l e c u l t u r e s u s e d i n t h i ss t u d y w e r e m e m b e r s o f t h e c o r y n e f o r m g r o u p

( C o r y n e b a c t e r i u m a n d A r t h r o b a c t e r ) . S e v e r a l

i s o l a t e s o f b o t h g e n e r a were f o u n d t o b e g r a mp o s i t i v e b y t h e KOH m e t h o d , w h e r e a s some

g e l l e d w e a k l y ( g r a m - n e g a t i v e r e a c t i o n ) . A l a r g e rc o l l e c t i o n o f g r a m - v a r i a b l e b a c t e r i a s h o u l d b e

s t u d i e d t o c l a r i f y t h i s a n o m a l y f u r t h e r . I t i s c l e a rt h a t p u r e c u l t u r e s a r e r e q u i r e d f o r r e l i a b l e o b s e r -

v a t i o n s ; t h e KOH m e t h o d w i l l n o t e n a b l e t h ed e t e c t i o n o f c o n t a m i n a t i o n i n u n k n o w n c u l t u r e s .T h e p r e s e n t s t u d y d i d n ot i nc l u d e a d e t a i l e d

p a r a l l e l c o m p a r i s o n o f s t a i n i n g r e s u l t s w i t h

KOH m e t h o d r e s u l t s f o r c u l t u r e s o v e r t i m e ;h o w e v e r , n o d i s c r e p a n c i e s among c u l t u r e s o f

d i f f e r e n t a g e s w e r e n o t e d . T h e r e s e e m s t o b e n o

e v i d e n c e i n t h i s r e p o r t o r e l s e w h e r e ( 3 ) s u g g e s t -i n g t h a t t h e KOH t e c h n i q u e c a n n o t b e u s e d f o rc u l t u r e s u p t o a t l e a s t s e v e r a l w e e k s o l d .

T h e a b o v e r e s u l t s s h o w t h a t t h e KOH m e t h o d

e n a b l e d t h e a c c u r a t e d e t e r m i n a t i on o f t h e Gram

r e a c t i o n s o f 92% o f a l a r g e c o l l e c t i o n o f m a r i n eb a c t e r i a . T h e p r o c e d u r e c a n b e u s e d t o e f f i c i e n t -l y a n d r a p i d l y c h a r a c t e r i z e a w i d e v a r i e t y o f

i s o l a t e s e n c o u n t e r e d i n b o t h c l i n i c a l a n d n o n m a -r i n e e n v i r o n m e n t a l m a t e r i a l . E a r l y i n s t r u c t i o ns h o u l d c o n t i n u e t o s t r e s s t h e s t a i n i n g p r o c e d u r ea s i t r e l a t e s t o c e l l c h e m i s t r y a n d s h o u l d i n t r o -d u c e t h e KOH t e c h n i q u e a s a n a p p r o p r i a t ee x a m p l e o f m o d e r n , e c o n o m i c a l l y p r a c t i c a l m i -c r o b i o l o g y .

T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y t h e M o t e M a r i n e L a b o r a t o r y ,

S a r a s o t a , F l a .

I t h a n k W i l l i a m H . T a f t , D i r e c t o r , M o t e M a r i n e L a b o r a t o r y ,f o r p r o v i d i n g s p a c e a n d f a c i l i t i e s d u r i n g a s a b b a t i c a l l e a v e . I

am g r a t e f u l t o M a r y P a r k s f o r t r a c i n g s e v e r a l l i t e r a t u r e c i t a -t i o n s .

LITERATURE CITED

1 . B u c h a n a n , R . E . , a n d N . E . G i b b o n s ( e d . ) . 1 9 7 4 . B e r g e y ' s

m a n u a l o f d e t e r m i n a t i v e b a c t e r i o l o g y , 8 t h e d . T h e W i l l i a m s

& W i l k i n s C o . , B a l t i m o r e .2 . D o e t s c h , R . N . 1 9 8 1 . D e t e r m i n a t i v e m e t h o d s o f l i g h t m i -

c r o s c o p y , p . 2 1 - 3 3 . I n P . G e r h a r d t ( e d . ) , M a n u a l o f m e t h -

o d s f o r g e n e r a l b a c t e r i o l o g y . A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o -

b i o l o g y , W a s h i n g t o n , D . C .

3 . F l u h a r t y , D . M . , a n d W. L . P a c k a r d . 1 9 6 7 . D i f f e r e n t i a t i o no f G r a m - p o s i t i v e a n d G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a w i t h o u t

s t a i n i n g . Am. J . V e t . C l i n . P a t h o l . 1 : 3 1 - 3 5 .4 . K o h n , F . S . , a n d S . A . H e n n e m a n . 1 9 7 7 . N o v e l q u a l i t ya s s u r a n c e p r o c e d u r e f o r t h e Gram s t a i n . J . Am. M e d .

T e c h n o l . 3 9 : 2 0 - 2 1 .5 . K u h n , P . J . 1 9 8 1 . P r a c t i c a l i d e a s f o r c o s t c o n t a i n m e n t i n

m i c r o b i o l o g y . M e d . L a b . O b s e r v . 1 3 : 7 3 - 8 6 .6 . L i n , Y . 1 9 8 0 . U s e o f p o t a s s i u m h y d r o x i d e t e c h n i q u e f o r t h e

d i f f e r e n t i a t i o n o f G r a m - p o s i t i v e a n d G r a m - n e g a t i v e b a c t e -r i a . B r e w . D i g . 5 5 : 3 6 - 3 7 .

V O L . 4 4 , 1 9 8 2

  on J  an u ar  y  3 1  ,2  0 1 2 

 b  y  g u e s  t  

h  t   t   p:  /   /   a em. a s m. or  g /  

D  ownl   o a d  e d f  r  om