Appl. Environ. Microbiol. 1987 Pyne 2844 8

8/10/2019 Appl. Environ. Microbiol. 1987 Pyne 2844 8

1/6

1987, 53(12):2844.Appl. Environ. Microbiol.

Bary W. WilsonJohn W. Pyne Jr., Dorothy L. Stewart, James Fredrickson and

Coriolus versicolorFraction fromSolubilization of Leonardite by an Extracellular

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2/6

V o l .

5 3 ,

N o .

1 2

P P L I E D AND

ENVIRONMENTAL

M I C R O B I O L O G Y ,

D e c .

1 9 8 7 ,

p . 2 8 4 4 - 2 8 4 8

0 0 9 9 - 2 2 4 0 / 8 7 / 1 2 2 8 4 4 - 0 5 0 2 . 0 0 / 0

C o p y r i g h t

1 9 8 7 ,

A m e r i c a n

S o c i e t y

f o r

M i c r o b i o l o g y

S o l u b i l i z a t i o n o f L e o n a r d i t e

b y

an E x t r a c e l l u l a r

F r a c t i o n

f r o m

C o r i o l u s

v e r s i c o l o r

JOHN

W.

PYNE, J R . , *

DOROTHY

L .

S T E W A R T ,

JAMES

FREDRICKSON,

AND BARY

W

WILSON

B a t t e l l e , P a c i f i c N o r t h w e s t

L a b o r a t o r i e s , R i c h l a n d , W a s h i n g t o n

9 9 3 5 2

R e c e i v e d

3

J u n e

1 9 8 7 / A c c e p t e d

1 0

S e p t e m b e r

1 9 8 7

C o r i o l u s

v e r s i c o l o r h a s

p r e v i o u s l y

b e e n

s h o w n

t o

d e g r a d e l e o n a r d i t e ,

an

o x i d i z e d

form o f

l i g n i t e .

A n

e x t r a c e l l u l a r

f r a c t i o n

c o n t a i n i n g

p r o t e i n p u r i f i e d

f r o m

a C .

v e r s i c o l o r

c u l t u r e

s o l u b i l i z e d

l e o n a r d i t e i n

v i t r o .

E x p r e s s i o n o f

t h e

a c t i v i t y

d i d

n o t

r e q u i r e

t h e

p r e s e n c e

o f l e o n a r d i t e

a n d

a p p e a r e d

d u r i n g

i d i o p h a s e . D u r i n g

i o n - e x c h a n g e

a n d

g e l

f i l t r a t i o n c o l u m n

c h r o m a t o g r a p h y ,

l e o n a r d i t e - b i o s o l u b i l i z i n g

a c t i v i t y

e l u t e d

w i t h

s y r i n g a l d az i ne o x i da s e

a c t i v i t y

a n d w i t h

p r o t e i n ,

as

m e a s u r e d

b y

A 2 8 0

a n d

t h e b i u r et

p r o t e i n

a s s a y .

S y r i n g a l d a z i n e

i s a

s u b s t r a t e

o f t h e

p o l y p h e n o l

o x i d a s e

f o r m e d

b y

C . v e r s i c o l o r .

C o m p a r i s o n

o f

l e o n a r d i t e -

b i o s o l u b i l i z i n g

a c t i v i t y

w i t h

t h e

e f f e c t s o f

c h e l a t o r s a n d s u r f a c e - a c t i v e

a g e n t s

o n

l e o n a r d i t e

showed

t h a t

b i o s o l u b i l i z a t i o n

w as

n o t d u e t o e i t h e r

s u r f a c t a n t

o r

c h e l a t i n g

a b i l i t y .

H e a t t r e a t m e n t o f t h e

p r e p a r a t i o n

a t

6 0 C

f o r

3 0 m i n

s i g n i f i c a n t l y

r e d u c e d b o t h

s y r i n g a l d a z i n e

o x i d a s e

a n d


a c t i v i t i e s .

C y a n i d e ,

a z i d e ,

a n d

t h i o g l y c o l a t e , w h i c h ar e

known i n h i b i t o r s o f


o x i d a s e

a c t i v i t y

o f C .

v e r s i c o l o r ,

a l s o

i n h i b i t e d l e o n a r d i t e

b i o s o l u b i l i z a t i o n .

From t h e s e

d a t a ,

we c o n c l u d e t h a t t h e

p u r i f i e d

p r o t e i n

f r a c t i o n f r o m

C .

v e r s i c o l o r

c o n t a i n s

a

s y r i ng a l d a zi n e o x i d as e

a c t i v i t y

t h a t p a r t i c i p a t e s

i n

l e o n a r d i t e


b y

e n z y m a t i c

a c t i o n .

M i c r o b i a l

b i o s o l u b i l i z a t i o n , a s e v i d e n c e d

b y t h e f o r m a t i o n

o f

d i s c r e t e p r o d u c t d r o p l e t s

f r o m l o w - r a n k c o a l

b y C o r i o l u s

v e r s i c o l o r

a n d

P o r i a m o n t i c o l a , was

f i r s t

r e p o r t e d

b y

C o h e n

a n d G a b r i e l e

( 2 )

a n d h a s

s i n c e

b e e n c o n f i r m e d

a n d

e x t e n d e d

t o

i n c l u d e C a n d i d a

s p .

s t r a i n M L 1 1 3 ,

P e n i c i l l i u m

w a k s -

m a n i i , S p o r o t h r i x

s p . , A s p e r g i l l u s s p .

( 9 ) , S t r e p t o m y c e s s p .

8 , B j e r k a n d e r a a d u s t a , P o r i a

p l a c e n t a , a n d Fomes a n -

n o s u s

( 1 0 ) .

T h e

t e r m

b i o s o l u b i l i z a t i o n h a s b e e n c o i n e d t o

e m p h a s i z e

t h e

m e t a b o l i c

o r i g i n

o f

t h e

s o l u b l e p r o d u c t . I n

n a t u r e ,

many

f u n g i u s e

c o m p l e x

p l a n t o r g a n i c

m o l e c u l e s

a s

s o u r c e s

o f

c a r b o n a n d

e n e r g y ,

a n d some

f u n g i

a r e

p r o m i n e n t

l i g n i n

d e g r a d e r s ,

w h i c h

m ay

a c c o u n t

f o r

t h e i r a b i l i t y t o

d e g r a d e

l o w - r a n k

c o a l s .

T h e

m a t e r i a l

u s e d

b y C o h e n

a n d

G a b r i e l e

( 2 )

i n

t h e i r

i n i t i a l

w o r k w a s

p r e s e n t

a s a n

o v e r b u r d e n t o

a l i g n i t e d e p o s i t a n d

w a s c o n s i d e r e d a

l e o n a r d i t e ( 4 ) . T h e p r o d u c t f o r m e d

b y t h e

a c t i o n o f

C . v e r s i c o l o r o n l e o n a r d i t e i s a

w a t e r - s o l u b l e

m a t e r i a l t h a t i s

d a r k

b r o w n

o r b l a c k .

T h i s m a t e r i a l i s

v e r y

a n i o n i c a n d

w e a k l y a c i d i c a n d c o n t a i n s

b o t h a r o m a t i c

a n d

a l i p h a t i c

p r o t o n s

i n a b o u t

a 1 : 1

p r o p o r t i o n .

A p p r o x i m a t e l y

85 o f

t h e

p r o d u c t

h a s

a

m o l e c u l a r m a s s

g r e a t e r t h a n

5 0 , 0 0 0

d a l t o n s a t

pHs 3

a n d

6 . 4 . A t p H 1 0 . 4 ,

40

o f

t h e

s o l u t e

h a s

a

m o l e c u l a r m a s s

g r e a t e r t h a n

5 0 , 0 0 0 d a l t o n s , a n d a b o u t

45

h a s

a

m o l e c u l a r m a s s b e t w e e n

1 0 , 0 0 0 a n d

5 0 , 0 0 0

d a l t o n s .

M e t a l

i o n s a r e

i m p o r t a n t e l e m e n t s

i n

t h e s t r u c t u r e o f

l o w - r a n k

c o a l s

( 5 ) , a n d t h e

c e l l - f r e e b i o s o l u b i l i z a t i o n

o f

c o a l

m ay

b e d u e

o n l y

t o

c h e l a t i o n . A

s e c o n d p o s s i b l e r o l e

o f

t h e

c e l l

e x t r a c t

i s

a s

a

s u r f a c t a n t .

A

p r o t e i n

f r a c t i o n

f r o m

P s e u d o m o n a s

f l u o r e s c e n s

l o w e r s s u r f ac e t e ns i o n a n d i n -

c r e a s e s

c o a l

s o l u b i l i t y

( R .

M.

F a k o u s s a , P h . D .

t h e s i s ,

F r i e d r i c h - W i l h e l m s

U n i v e r s i t y ,

B o n n ,

F e d e r a l

R e p u b l i c o f

G e r m a n y ,

1 9 8 1 ) .

T h e

r e s u l t s

p r e s e n t e d h e r e s h o w

t h a t

t h e


a c t i v i t y

o f C . v e r s i c o l o r

i s d u e

n e i t h e r

t o

c h e l a t i o n

n o r t o

s u r f a c t a n t c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e c e l l

e x t r a c t ,

b u t

r a t h e r

t o

a n o t h e r

m e c h a n i s m s u c h a s e n z y m a t i c b o n d

c l e a v a g e .

A

l a c c a s e l i k e

a c t i v i t y m ay

b e i n v o l v e d

i n

*

C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .


b y

C . v e r s i c o l o r

( 1 1 ) .

T h i s

a r t i c l e

p r e s e n t s

f u r t h e r

e v i d e n c e

s u p p o r t i n g

t h e

p a r t i c i p a t i o n

o f

l a c c a s e l i k e

a c t i v i t y

i n

b i o s o l u b i l i z a t i o n o f l e o n a r d i t e

b y

a n

e x t r a c e l l u l a r

f r a c t i o n .

M A T E R I A L S AND

M E T H O D S

M a t e r i a l s . C . v e r s i c o l o r ATCC 1 2 6 7 9 a n d

p r o d u c t

d e r i v e d

f r o m

f u n g a l a c t i o n o n

l e o n a r d i t e

w e r e

g i f t s o f

M a r t i n

C o h e n

o f t h e

U n i v e r s i t y

o f

H a r t f o r d .

L e o n a r d i t e

was o b t a i n e d

f r o m

A m e r i c a n

C o l l o i d

C o . ,

S k o k i e ,

I l l .

D E A E - c e l l u l o s e

( M a t r e x -

C e l l u f i n e

A M ) ,

G C - 2 0 0 M a t r e x - C e l l u f i n e f o r

g e l

f i l t r a t i o n ,

a n d

u l t r a f i l t r a t i o n

m e m b r a n e s

w e r e o b t a i n e d

f r o m A m i c o n

C o r p . ,

L e x i n g t o n ,

M a s s .

P i r i c u l a r i a

o r y z a e

l a c c a s e

w a s

f r o m

S i g m a

C h e m i c a l

C o . ,

S t .

L o u i s ,

M o .

P r o t e i n a s e K

( 2 0

U / m g )

was

f r o m

S i g m a .

B o v i n e

p a n c r e a s t r y p s i n ( 2 , 9 1 6

U / m g )

a n d

t h r e e - t i m e s - c r y s t a l l i z e d

p o r c i n e

s t o m a c h

m u c o s a l

p e p s i n

( 2 , 7 0 0

U / m g ) w e r e o b t a i n e d

f r o m

C a l b i o c h e m -

B e h r i n g ,

La

J o l l a ,

C a l i f . B u f f e r s

a n d o t h e r

i n o r g a n i c

a n d

o r g a n i c

s a l t s w e r e o f

r e a g e n t - g r a d e

q u a l i t y o r

b e t t e r .

D e t e r m i n a t i o n o f


a c t i v i t y .

An i n

v i t r o

a s s a y

w a s u s e d

t o m e a s u r e

l e o n a r d i t e b i o s o l u b i l i z a t i o n .

L e o n a r d i t e w a s

g r o u n d t o

p a s s a 2 8 - m e s h

s i e v e ,

a n d

1 0 - m g

s a m p l e s

w e r e

p l a c e d i n

s e p a r a t e c u l t u r e

t u b e s , w h i c h

w e r e

l o o s e l y

c a p p e d

a n d a u t o c l a v e d

a t

1 2 1 C

f o r 1 5 m i n .

A u t o c l a v e d

l e o n a r d i t e s a m p l e s w e r e

c o o l e d a n d u s e d

i m m e -

d i a t e l y

o r s t o r ed

a t

5 C

u n t i l

n e e d e d .

T h e

t o t a l

v o l u m e

o f

t h e

a s s a y

m i x t u r e was 1

m l ,

a n d

t h e m n i x t u r e c o n t a i n e d 0 . 1 m m ol

o f

s o d i u m

p h o s p h a t e

a t

p H 5 . 2 . T h e

a s s a y

m i x t u r e w a s

i n c u b a t e d a t t h e

d e s i r e d

t e m p e r a t u r e

w i t h

m a n u a l m i x i n g

e v e r y

3

m i n .

M i x i n g

was

k e p t

g e n t l e

t o

k e e p

p a r t i c l e s

s u s p e n d e d

b u t

o f f

t h e t e s t t u b e

w a l l s . A f t e r

i n c u b a t i o n , t h e

m i x t u r e

w a s

b r i e f l y c e n t r i f u g e d

a t 3 , 0 0 0

x

g

i n

a b e n c h t o p

c l i n i c a l

c e n t r i f u g e f o r 3 0

s

t o

s e p a r a t e t h e c o a l

f r o m t h e

l i q u i d .

An

a l i q u o t

o f

t h e s u p e r n a t a n t

w a s d i l u t e d i n w a t e r ,

a n d

i t s

A 2 9 0

was

m e a s u r e d

s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y . T h e

a b s o r b a n c e s o f a b l a n k

l a c k i n g

e n z y m e

a n d

a n

e n z y m e

b l a n k

w e r e

s u b t r a c t e d

f r o m

t h e a b s o r b a n c e

o f t h e r e a c t i o n m i x -

2 8 4 4


3/6

E X T R A C E L L U L A R

SOLUB IL IZ A T I O N OF

LEONARDITE

O L .

5 3 ,

1 9 8 7

2 . 7

~

N

A

1 . 8

-

I

D

0 . 9

_

O _C

20 0

25 0 30 0

35 0

W a v e l e n g t h

( n m )

40 0

45 0

F I G . 1 . A b s o r p t i o n s p e c t r a o f

r e a c t i o n b u f f e r s a n d r e a c t i o n

p r o d -

u c t .

T h e

U V - v i s i b l e s p e c t r a

o f

l a c c a s e

assay b u f f e r s ar e

c o m p a r e d

w i t h t h e

spectrum o f

t h e

b i o s o l u b i l i z a t i o n p r o d u c t .

A ,

0 . 1

M s o d i u m

p h o s p h a t e ,

p H

5 . 2 ; B , 0 . 1 M s o d i u m

c i t r a t e , p H 5 . 2 ; C ,

0 . 1 M

MES,

p H

5 . 2 ;

a n d

D ,

8

, u g o f f u n g a l l y

p r o d u c e d

p r o d u c t

p e r

m l .

t u r e .

T h i s c o r r e c t e d a b s o r b a n c e was

t h e v a l u e r e p o r t e d f o r

t h e

a c t i o n o f t h e a c t i v e

f r a c t i o n . A t

p H 5 . 2 ,

t h e

0 . 1

M

p h o s p h a t e

b u f f e r

c a u s e d

v e r y

l i t t l e

s o l u b i l i z a t i o n

o f

l e o n a r -

d i t e .

P r e p a r a t i o n

o f

c r u d e f r a c t i o n


l e o n a r d i t e .

C .

v e r s i c o l o r

was

grown i n

a

Chemap

C F - 2 0 f e r m e n t o r

a t

2 5 C

s u p p l i e d

w i t h

4

l i t e r s

o f f i l t e r e d a i r p e r

m i n

a t a t m o s p h e r i c

p r e s s u r e a n d w i t h 1 5

l i t e r s o f

g r o w t h

m e d i u m .

T h e

g r o w t h

medium

u s e d

was

t h a t

r e p o r t e d b y F a h r a e u s

a n d R e i n h a m -

mar

( 3 ) .

A

s t a n d a r d

t w o - s t a g e R u s h t o n t u r b i n e ( s i x - b l a d e )

a g i t a t o r

system

was

u s e d a t a

s p e e d o f 4 0 0

r p m .

I n o c u l a

f o r

t h e

f e r m e n t o r w e r e

t h r e e 5 0 - m l S a b o u r a u d

m a l t o s e b r o t h

c u l t u r e s

o f C .

v e r s i c o l o r grown f o r 7 t o

1 0

d a y s a t

2 3 C

w i t h

no

a g i t a t i o n ( 2 ) .

H y p h a l

mats were

t r a n s f e r r e d t o

a 5 0 0 - m l

E r l e n m e y e r

f l a s k

w i t h a

g r o u n d - g l a s s

f i t t i n g c o n t a i n i n g

2 0 0

m l

o f

d i s t i l l e d water a n d

1 0 0

m l

o f 3 - m m - d i a m e t e r g l a s s

b e a d s

a n d

were s h a k e n

v i g o r o u s l y . M y c e l i a l

f r a g m e n t s w e r e

t h e n

t r a n s f e r r e d t o t h e

f e r m e n t o r . A f t e r

3

d a y s o f

g r o w t h ,

0 . 3

m l

o f

2 , 5 - x y l i d i n e

was

a d d e d

t o

i n c r e a s e

t h e

l e v e l s

o f

e x t r a c e l l u l a r l a c c a s e

a c t i v i t y ( 3 ) .

The

p r o d u c t i o n

o f

e x t r a c e l -

l u l a r

e n z y m e s

was

m o n i t o r e d

b y m e a s u r i n g


o x i d a s e

a c t i v i t y

i n

t h e

c u l t u r e

b r o t h

w i t h 7 . 5

, u M s y r i n g -

a l d a z i n e i n

a

0 . 1 M

c i t r a t e - p h o s p h a t e

b u f f e r

( p H

5 . 2 )

( 1 ) o r a

0 . 1

M

p h o s p h a t e

b u f f e r

( p H

5 . 2 )

( 6 ) . P r o t e i n

l e v e l s

w e r e

d e t e r m i n e d

b y

t h e

b i u r e t

method

( 7 ) .

A t 7

d a y s

a f t e r

i n o c u l a t i o n ,

t h e

f e r m e n t a t i o n

b r o t h was

s e p a r a t e d

f r o m

t h e

C .

v e r s i c o l o r

c e l l mass

b y

f i l t r a t i o n

t h r o u g h

t h r e e

l a y e r s

o f c h e e s e c l o t h . The r e s u l t a n t f l u i d was

t h e n f i l t e r e d

t h r o u g h

an

u l t r a f i l t r a t i o n membrane w i t h

a

m o l e c u l a r

w e i g h t

c u t o f f

o f

1 0 0 , 0 0 0 ( H 5 P 1 0 0 - 4 3 ; A m i c o n ) .

The

h i g h - m o l e c u l a r - w e i g h t

m a t e r i a l i n t h e e x t r a c e l l u l a r

f l u i d

was

c o n c e nt r a t e d w i t h an

u l t r a f i l t r a t i o n membrane w i t h

a

m o l e c u l a r

w e i g h t

c u t o f f o f

1 0 , 0 0 0 ( H 5 P 1 0 - 4 3 ; A m i c o n ) .

The

r e s u l t i n g

r e t e n t a t e

( 1

l i t e r )

was

f i l t e r e d

b y

d i a l y s i s

w i t h

t h r e e

3 0 0 - m i

p o r t i o n s

o f

d e i o n i z e d

w a t e r w h i l e

b e i n g

c o n t i n u a l l y

p a s s e d

t h r o u g h

t h e membrane t o m a i n t a i n

a

c o n s t a n t volume

o f

1

l i t e r . The r e t e n t a t e

was

c l a r i f i e d

b y

c e n t r i f u g a t i o n

a t

6 , 0 0 0

x

g

f o r 1 0

m i n .

The

r e s u l t i n g

s u p e r n a t a n t

was

a p p l i e d

t o a


c o l u m n

( 2 b y

3 0

c m )

t h a t

h a d b e e n

e q u i l i b r a t e d

w i t h

0 . 0 1

M

s o d i u m

p h o s p h a t e

b u f f e r

( p H

7 . 0 ) .

The

c o l u m n

was

f i r s t washed

w i t h 1 0 0

m l o f

0 . 0 1

M

s o d i u m

p h o s p h a t e

b u f f e r

( p H

7 . 0 ) ,

and

t h e n

a d s o r b e d

p r o t e i n

was

e l u t e d

f r o m

t h e

column w i t h a l i n e a r

g r a d i e n t

o f

2 0 0 ml

o f

0 . 0 1 M

s o d i u m

p h o s p h a t e

( p H 7 . 0 )

and 2 0 0

ml

o f

0 . 5 M

s o d i u m c h l o r i d e - 0 . 0 1

M

sodium

p h o s p h a t e ( p H

7 . 0 ) .

T h i s

p u r i f i c a t i o n

s c h e m e f o l l o w e d

t h a t o f B o l l a g a n d

L e o n o w i c z

( 1 ) . T h e i r p u r i f i c a t i o n

s y s t e m y i e l d e d

a p r o t e i n p r e p a r a t i o n

t h a t

w a s h o m o g e n e o u s b y

c e t y l p y r i d i n i u m

b r o m i d e - p o l y -

a c r y l a m i d e

e l e c t r o p h o r e s i s . T h e s y r i n g a l d a z i n e

o x i d a s e -

c o n t a i n i n g

f r a c t i o n

was f r o z e n a t

- 1 5 C

u n t i l

u s e d ;

i t r e -

t a i n e d

1 0 0 %

o f

i t s

a c t i v i t y a f t e r s e v e r a l

m o n t h s o f

s t o r a g e

a t

t h a t

t e m p e r a t u r e .

RESULTS

A N D

DISCUSSION

L e o n ar d it e , a n

o x i d i z e d f o r m o f

l i g n i t e ( 1 1 ) , w a s t h e

s u b s t r a t e f o r

t h e b i o s o l u b i l i z i n g a c t i v i t y

o f a n e x t r a c e l l u l a r

f r a c t i o n

o b t a i n e d

f r o m

C . v e r s i c o l o r .

T h e c e l l - f r e e

r e a c t i o n

w a s f u r t h e r c h a r a c t e r i z e d

t o

d e v e l o p

a

d e p e n d a b l e

i n v i t r o

a s s a y

f o r

s t u d y i n g t h e

o p t i m i z a t i o n

a n d

m e c h a n i s m s o f t h e

a c t i v i t y o f

t h e c e l l e x t r a c t . F i g u r e 1

s h o w s

t h e

U V - v i s i b l e

s p e c t r u m o f t h e


p r o d u c t

o b t a i n e d

b y

t h e

a c t i o n

o f

C .

v e r s i c o l o r

c u l t u r e s g r o w n

i n t h e p r e s e n c e

o f

l e o n a r d i t e . A l s o s h o w n

i n F i g . 1 a r e t h e

s p e c t r a o f b u f f e r s

c o m m o n l y

u s e d

t o

a s s a y l a c c a s e a c t i v i t y , i n c l u d i n g 0 . 1

M

M E S

( m o r p h o l i n e e t h a n e s u l f o n i c

a c i d ) ( 5 ) ,

0 . 1

M c i t r a t e , a n d

0 . 1

M

p h o s p h a t e

( 1 ) .

From

t h e s e s p e c t r a , i t

i s

c l e a r t h a t

a

w a v e l e n g t h

o f 2 9 0 nm o r a b o v e

w o u l d b e u s e f u l f o r

t h e

a s s a y .

A t

w a v e l e n g t h s

- 2 9 0 n m , c o n s i d er a b l e p r o d u c t

a b s o r b a n c e i s

e v i d e n t ,

w h i l e

b a c k g r o u n d

a b s o r b an c e d u e

t o

b u f f e r

i s m i n i m a l .

T a b l e

1 s h o w s

A 3 5 0

o f

l e a c h a t e s

f r o m

r e p r e s e n t a t i v e

c o a l s w i t h p h o s p h a t e ,

c i t r a t e ,

a n d

a c e t a t e

b u f f e r s . T h e

p h o s p h a t e b u f f e r

was

c h o s e n f o r

r o u t i n e

u s e

b e c a u s e o f

i t s

l o w s o l u b i l i z i n g e f f e c t o n

l e o n a r d i t e

a n d

i t s l o w

a b s o r b a n c e

i n t h e

s p e c t r a l

r e g i o n w h e r e

t h e

p r o d u c t a b s o r b s

s t r o n g l y .

T h e

e n z y m e


u s e d was a

f r a c t i o n o b t a i n e d

f r o m D E A E - c e l l u l o s e

b y

t h e

p r o c e d u r e o f B o l l a g a n d

L e o n o w i c z

( 1 )

f o r t h e i s o l a t i o n

o f l a c c a s e s .

T h e

e n z y m e


h a d

a

b a r e l y

d i s c e r n i b l e b l u e

c o l o r

w h i c h ,

w e

p r e s u m e d ,

was d u e

t o

t h e

p r e s e n c e

o f

l a c c a s e .

F i g u r e

2

s h o w s t h e

t i m e

c o u r s e

o f

t h e

b i o s o l u b i l i z i n g a c t i v i t y

o n

l e o n a r d i t e a t 2 3 C . V a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f

t h e

e x t r a c e l l u -

l a r f r a c t i o n w e r e

u s e d ,

a n d

t h e


a c t i v i t y

was

n o t

l i n e a r

w i t h

r e s p e c t

t o

c o n c e n t r a t i o n

( F i g .

2 ,

i n s e t ) .

O n

t h e

b a s i s o f

t h e s e

e x p e r i m e n t s ,

a n

a s s a y p e r i o d

o f 2 0

m i n

was

u s e d

i n

s u c c e e d i n g e x p e r i m e n t s .

T h e

s t a b i l i t y

o f t h e

p r o d u c t

a b s o r b a n c e was

c o n s t a n t

f o r

more t h a n

2

h a f t e r

t h e

r e m a i n -

i n g

l e o n a r d i t e

p a r t i c l e s

w e r e f i l t e r e d

o f f .

T h e d e g r e e o f l e o n a r d i t e

s o l u b i l i z a t i o n

b y

s e v e r a l s u r -

f a c t a n t s w a s d e t e r m i n e d . T h e

s u r f a c t a n t s t e s t e d i n c l u d e d

s o d i u m

d o d e c y l

s u l f a t e ,

Tw e en 8 0

( p o l y o x y e t h y l e n e s o r b i t a n

m o n o o l e a t e ) ,

a n d

c e t y l p y r i d i n i u m

c h l o r i d e ,

e a c h

i n

0 . 1

M

s o d i u m

p h o s p h a t e

b u f f e r

( p H

5 . 2 ) .

None

o f

t h e

s u r f a c t a n t s

t e s t e d

s o l u b i l i z e d

l e o n a r d i t e

s i g n i f i c a n t l y . T h e r e f o r e ,

b i o -

s o l u b i l i z a t i o n i s

p r o b a b l y

n o t d u e

t o s u r f a c t a n t

a b i l i t y .

When

T A B L E 1 . C o a l

l e a c h i n g b y s y r i n g a l d a z i n e

o x i d a s e

a s s a y

b u f f e r s a

A 3 5 0

o f

f i l t r a t e

f r o m :

B u f f e r

a n d

c o n t r o l

T e x a s

B e u l a h

B e u l a h

L e o n a r d i t e

T e x a s

e a h

s t a n d a r d

l i g n i t e

z a p

no 3

n o . 3

0 . 1 M s o d i u m 3 . 9

0 . 6 5

0 . 0 7 1

0 . 0 6 9

p h o s p h a t e

0 . 1

M s o d i u m

c i t r a t e

1 4 . 5 b

0 . 8 4

1 . 4 5 5

2 . 7 4

0 . 1 M s o d i u m

a c e t a t e

3 . 4 8 0 . 0 4 7 0 . 0 3 7

0 . 0 3 6

W a t e r 2 . 6 2 0 . 2 8 0 . 1 6 3

0 . 0 5 1

A

4 0 0 - m g

s a m p l e

o f

c o a l

w as

a d d e d

t o 4 m l o f b u f f e r o r

w a t e r .

T h e

m i x t u r e

was

i n c u b a t e d

f o r

2

d a y s .

C o a l was

r e m o v e d

b y f i l t r a t i o n ,

a n d

t h e

o p t i c a l

d e n s i t y

o f

t h e f i l t r a t e

w as

m e a s u r e d a t 3 5 0

nm .

b

E s t i m a t e d

b y d i l u t i n g

a n

a l i q u o t

o f t h e

s o l u t i o n

i n

w a t e r .

2 8 4 5


4/6


5/6

E X T R A C E L L U L A R

SOLUBILIZATION O F L E O NA R DI T E

I

c o

N

o

n

:

U . 4

V .

U 2 -

0.3

z

0 . 2

o

C D

0 . 1

E

E

._

1 0

20 30

40

5 0 6 0

70

F r a c t i o n

Number

1 . t

E

E

c

2 1

. 4

m

N

.

0 ,

w

co

J

_

1.75-

_ 1 . 2 5

E

o

_ 1 . 0 0

E

3

C

_

0 . 7 5

. Z

._

'D

0.50 . '

cn0 . 2 5 c

._

F I G .

4 . C h r o m a t o g r a p h y

o f


a c t i v i t y

on

D E A E - c e l l u l o s e . C r u d e

p r e p a r a t i o n was

d i l u t e d 1 : 1 0

w i t h water a n d

t h e n a p p l i e d

t o a D E A E - c e l l u l o s e c o l u m n ( 1 . 5

b y

2 8 cm;

M a t r e x -

C e l l u f i n e

A M ; A m i c o n ) p r e v i o u s l y

e q u i l i b r a t e d w i t h 0 . 0 1 M s o d i u m

p h o s p h a t e ( p H 7 . 0 ) .


o x i d a s e

a n d l e o n a r d i t e - b i o s o l -

u b i l i z i n g

a c t i v i t i e s

were

e s t i m a t e d

as

d e s c r i b e d

i n

M a t e r i a l s

a n d

M e t h o d s .

T h e

e l u t i o n

p r o f i l e

o f

p r o t e i n

was

d e t e r m i n e d

s p e c t r o p h o -

t o m e t r i c a l l y b y

i t s

A 2 8 0 .

P r o t e i n was e l u t e d

w i t h a

g r a d i e n t o f

0

t o 0 . 3

M

s o d i u m c h l o r i d e , a n d

3 m l o f

e l u a t e was

c o l l e c t e d .

S a l t

c o n c e n -

t r a t i o n was

d e t e r m i ne d b y m e a s u r i n g i o n i c

s t r e n g t h .

b e c a u s e t h e s e

enzymes ar e

g l y c o p r o t e i n s a n d ar e a d a p t e d

f o r f u n c t i o n i n

an

e x t r a c e l l u l a r m i l i e u

c o n t a i n i n g p r o t e a s e s .

H i g h


o x i d a s e

a c t i v i t y i n t h e p u r i f i e d c e l l -

f r e e


s u g g e s t e d

t h a t t h i s a c t i v i t y

may b e

r e l a t e d

t o


a c t i v i t y .

T h e p u r i f i e d

prepara-

t i o n

c o n t a i n i n g l e o n a r d i t e - b i o s o l u b i l i z i n g

a c t i v i t y

was r e -

c h r o m a t o g r a p h e d

on D E A E - c e l l u l o s e . A

g r a d i e n t

o f

1 0 0

m l

o f 0 . 0 1

M s o d i u m

p h o s p h a t e

( p H 7 . 0 )

a n d

1 0 0

m l

o f 0 . 3 M

s o d i u m

c h l o r i d e - 0 . 0 1

M

s o d i u m p h o s p h a t e

( p H 7 . 0 )

was

u s e d

t o

e l u t e a d s o r b e d

p r o t e i n s

f r o m

t h e c o l u m n . L e o -

n a r d i t e - b i o s o l u b i l i z i n g

a c t i v i t y

e l u t e d

w i t h


o x i d a s e

a c t i v i t y .

A 2 8 0 p a r a l l e l e d t h e e l u t i o n

p a t t e r n s o f


o x i d a s e

a n d


a c t i v i -

t i e s . The

c o e l u t i o n

o f


o x i d a s e a n d

l e o n a r d i t e -


a c t i v i t i e s , a l o n g

w i t h p r o t e i n , i s

s t r o n g

e v i -

d e n c e

t h a t


o x i d a s e

a c t i v i t y

i s

r e s p o n s i b l e

f o r


a c t i v i t y ( F i g .

4 ) .

The c o n c e n t r a t i o n

o f

p r o t e i n

i n t h e

p e a k

f r a c t i o n

f r o m t h e


c o l u m n was e s t i m a t e d

t o b e

0 . 2

m g / m l .

By

u s i n g

t h e

c o n c e nt r a t i o n o f

p r o t e i n

c a l c u l a t e d

f r o m t h e

b i u r e t

assay

a n d t h e m o l e c u l a r

mass f o r


o x i d a s e o f

6 4 , 0 0 0

d a l t o n s

( 1 ) ,

t h e c o n c e n t r a t i o n

o f

p r o t e i n

i n

t h e

p e a k

f r a c t i o n s

( F i g . 4 ,

f r a c t i o n

4 1 )

was

d e t e r m i n e d

t o

b e

ap p r o x -

i m a t e l y

7

F . M .

T o

p r o d u c e

t h e c o l o r

e q u i v a l e n t

t o

t h a t

g i v e n

b y

t h e

f r a c t i o n s

c o n t a i n i n g b i o s o l u b i l i z i n g a c t i v i t y ,

t h e

con-

c e n t r a t i o n

o f

c h e l a t o r

s h o u l d

b e

on

t h e

o r d e r

o f

0 . 1

M,

o r

more t h a n

1 0 , 0 0 0 t i m e s

g r e a t e r

t h a n t h e

p r o t e i n

c o n c e n t r a -

t i o n . The c o n c e n t r a t i o n o f

p r o t e i n

i n t h e

a c t i v e f r a c t i o n s

was

t o o

l o w f o r

t h e

p r o t e i n t o

b e an

e f f e c t i v e

m e t a l

i o n

c h e l a t o r .

Each

p e p t i d e

c h a i n w o u l d

h a v e

t o c h e l a t e

a t l e a s t

5 , 0 0 0

d i v a l e n t

i o n s ,

w h i c h

carry

a t

l e a s t 1 0 0 t i m e s

more

n e g a t i v e

c h a r g e s

t h a n

t h e

p o s i t i v e l y c h a r g e d

s i d e

c h a i n s

i n

t h e

amount o f

p r o t e i n

p r e s e n t ( 3 ) .

A

s e c o n d

c h r o m a t o g r a p h y p r o c e d u r e

s u p p l i e d

a d d i t i o n a l

i n f o r m a t i o n

a b o u t

t h e

r e l a t i o n s h i p

b e t w e e n l e o n a r d i t e -

b i o s o l u b i l i z i n g a c t i v i t y

a n d


o x i d a s e

a c t i v i t y .

The

p u r i f i e d p r o t e i n

p r e p a r a t i o n ( 2 . 8 g

o f

p r o t e i n )

was

p r e c i p i t a t e d b y a d d i n g s o l i d

ammonium s u l f a t e t o s a t u r a t i o n .

T h e

p r e c i p i t a t e was

c o l l e c t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t

8 , 0 0 0 x g,

d i s s o l v e d i n

0 . 5

m l

o f

0 . 0 5 M ammonium

b i c a r b o n a t e ,

a n d

a p p l i e d t o t h e g e l

f i l t r a t i o n c o l u m n ( G C - 2 0 0 M a t r e x - C e l l u f i n e

[ A m i c o n ]

e q u i l i b r a t e d

w i t h

0 . 0 5

M

ammonium

b i c a r b o n a t e ) .

F r a c t i o n s ( 1 . 5 m l )

were

c o l l e c t e d

a n d

a s s a y e d

f o r s y r i n g -

a l d a z i n e o x i d a s e a c t i v i t y

( F i g .

5 ) .


o x i d a s e

a c t i v i t y c o u l d b e

r e a d i l y d e t e c t e d , b u t l e o n a r d i t e - b i o -

s o l u b i l i z i n g a c t i v i t y

c o u l d

n o t

b e d e t e c t e d

i n

t h e

c o l u m n -

e l u t e d f r a c t i o n s . The

i n a b i l i t y

t o

d e t e c t l e o n a r d i t e b i o -

s o l u b i l i z a t i o n was e x p e c t e d b e c a u s e

o f t h e d i l u t i n g e f f e c t

o f

g e l p e r m e a t i o n c h r o m a t o g r a p h y .

F r a c t i o n s

f r o m t h e

c o l u m n

w i t h

A 2 8 0

were c o m b i n e d i n t h r e e p o o l s ,

l y o p h i l i z e d ,

a n d

d i s s o l v e d

i n a

s m a l l

v o l u m e o f

0 . 0 1 M

ammonium b i c a r b o n -

a t e .

O n l y t h e

f i r s t

o f

t he t h r ee

p o o l s o f f r a c t i o n s ( F i g . 5 )

c o n t a i n e d

s i g n i f i c a n t


a n d

s y r i n g -

a l d a z i n e o x i d a s e

a c t i v i t i e s .

The

c o e l u t i o n

o f s y r i n g a l d a z i n e

o x i d a s e a n d


a c t i v i t i e s f r o m t h e g e l

f i l t r a t i o n c o l u m n

i s

a d d i t i o n a l e v i d e n c e t h a t

t h e s e t w o a c t i v -

i t i e s

r e s u l t f r o m t h e

same

p r o t e i n .

T h e e l u t i o n p o s i t i o n

o f

t h e

a c t i v i t i e s

c o r r e s p o n d s

t o

a p r o t e i n h a v i n g a

m o l e c u l a r

mass

o f

a t l e a s t

5 0 , 0 0 0 d a l t o n s .

C y a n i d e

a n d

a z i d e

ar e

e f f e c t i v e i n h i b i t o r s

o f l a c c a s e

a c t i v i t y

( 1 ) ,

a n d

b o t h

i n h i b i t

c e l l - f r e e


o f

l e o n a r d i t e .

C y a n i d e

a t

1

mM i n h i b i t s

C .

v e r s i c o l o r

s y r i n g -

a l d a z i n e o x i d a s e

a c t i v i t y

b y 40

a n d

l e o n a r d i t e - b i o s o l u b i -

l i z i n g a c t i v i t y b y 1 0 % ,

w h e r e a s a z i d e

a t 0 . 0 1

mM

i n h i b i t s


o x i d a s e

a c t i v i t y

b y 7 0

a n d


a c t i v i t y b y

3 0 % .


a n d

l e o n a r d i t e ,

t h e s u b -

s t r a t e s u s e d

i n t h e

assays,

ar e d i f f e r e n t

e n o u g h

c h e m i c a l l y

t h a t

t h e

d i f f e r e n c e i n

i n h i b i t i o n

i s

e x p e c t e d .

T h e r e

may

b e a

d i f f e r e n c e

b e t w e e n

t h e

r a t e - l i m i t i n g

s t e p s o f

t h e

t w o reac-

t i o n s o r , more

l i k e l y ,

t h e r e

may

b e

t w o o r more

p a r t i a l l y

r a t e - l i m i t i n g s t e p s i n

t h e

c a t a l y t i c r e a c t i o n s e q u e n c e

w h i c h

ar e

a f f e c t e d

d i f f e r e n t l y b y

t h e

i n h i b i t o r s .

The

e f f e c t s

o f

c y a n i d e

a n d a z i d e on

t h e


r e a c t i o n

ar e

f u r t h e r

e v i d e n c e

t h a t t h e

r e a c t i o n i s

c a t a l y z e d b y

en-

zym e s.

0 . 7

0 . 6

E

0 . 5

D

a l 4

v

0 . 4

c

o

0 . 3

0 . 2

0 . 1

5 1 0

1 5 20

2 5 30

35

F r a c t i o n Numb e r

7 . 0

1

6

5 . 0

E

6

5 . 0 E n

c

4 . 0 X

x

3 . 0

._

to

2 . 0 X

C

1 . 0

u n

40

45

50

F I G . 5 . G e l

p e r m e a t i o n

c h r o m a t o g r a p h y

o f c r u d e


c o n t a i n i n g


a c t i v i t y .

T h e

c r u d e


c o n t a i n i n g l e o n a r d i t e - b i o s o l u b i l i z i n g a c t i v i t y ( 2 . 8

mg

o f

p r o t e i n )

was

f i r s t

p r e c i p i t a t e d

b y

s a t u r a t i n g

t h e

s o l u t i o n

w i t h

am m oniu m s u l f a t e .

The

p r e c i p i t a t e

was c o l l e c t e d

b y c e n t r i f u g a t i o n

a t

3 , 0 0 0

x

g .

Th e

p r e c i p i t a t e

was

s u s p e n d e d

i n 0 . 5 ml o f 0 . 0 5

M a m m o n i u m

b i c a r b o n -

a t e ,

a n d t h i s s o l u t i o n

was

a p p l i e d

t o a

g e l

f i l t r a t i o n column

( 1

b y

4 0

c m ;

GC-200

M a t r e x - C e l l u f i n e ;

A m i c o n ) .

F r a c t i o n s

( 1 . 5 m l )

w e r e

c o l l e c t e d

a t

2 - m i n

i n t e r v a l s .


o x i d a t i o n

( 0 )

and

p r o -

t e i n

A 2 8 0 )

were

d e t e r m i n e d

f o r i n di v i du a l f r a c t i o n s .

1 . 4

1 . 2

x

1 . 0

1

0 . 8

a

i

0 . 4

7

o~~~~~~~~~r

%

0 . 2

I

\

I

1

2

3 P o o l e d

F r a c t i o n s

l

b

I

I

_

I

9 ~

c

V O L .

5 3 ,

1 9 8 7

2 8 4 7


6/6

A P P L . E N V I R O N .

M I C R O B I O L .

S e v e r a l

l i n e s

o f

e v i d e n c e d e m o n s t r a t e

t h a t l e o n a r d i t e


i s

c a t a l y z e d

b y a C . v e r s i c o l o r

s y r i n g a l d a -

z i n e

o x i d a s e .

B o t h s y r i n g a l d a z i n e

o x i d a s e

a n d

b i o s o l u b i l -

i z i n g a c t i v i t i e s

ar e r e d u c e d

b y p r e i n c u b a t i o n

a t

6 0 C b u t

n o t

a t

5 3 C .

A

s h a r p d e c l i n e

i n

a c t i v i t y w i t h

a

s m a l l

i n c r e a s e i n

t e m p e r a t u r e i n d i c a t e s

an e n z y m a t i c

a c t i v i t y .

B o t h a c t i v i t i e s

were i n h i b i t e d

t o v a r i o u s d e g r e e s

b y s u r f a c t a n t s ,

a z i d e , a n d

c y a n i d e .

T h e tw o

a c t i v i t i e s c o e l u t e d

d u r i n g c h r o m a t o g r a p h y

on


a n d

g e l

f i l t r a t i o n

c o l u m n s .

T h e

accumu

l a t e d e v i d e n c e

s t r o n g l y s u g g e s t s

t h a t t h e a g e n t r e s p o n s i b l e

f o r

l e o n a r d i t e


i s an

enzyme a n d

t h a t t h e

enzyme h a s a


o x i d a s e

a c t i v i t y .

T h e


a c t i v i t y

o f

C .

v e r s i c o l o r

c an

p o s s i b l y

b e

u s e d

as t h e

f i r s t

s t e p i n a l o w - t e m p e r a t u r e ,

l o w - p r e s s u r e

a p p r o a c h

t o c o a l

b e n e f i c i a t i o n .

T h e r e s u l t s

p r e s e n t e d h e r e

show

t h a t b i o s o l u b i l i z i n g

a c t i v i t y

i s a s s o c i -

a t e d w i t h

a

s p e c i f i c

e n z y m a t i c

a c t i v i t y .

F u t u r e w o r k

w i l l

f o c u s on

e n h a n c i n g t h e

p r o d u c t i o n o f

t h e

enzyme a c t i v i t y

b y

b o t h

s e l e c t i o n t e c h n i q u e s

a n d m a n i p u l a t i o n

o f f u n g a l

c u l t u r a l

p a r a m e t e r s .

A s e c o n d area o f

r e s e a r c h

w i l l

b e

t h e

e x a m i n a -

t i o n o f t h e

u s e o f t h e e x t r a c e l l u l a r

m a t e r i a l f o r

s o l u b i l i z i n g

l i g n i t e s

a n d c o a l s .

ACKNOWLEDGMENT

T h i s p r o j e c t

was

f u n d e d

b y a

c o n t r a c t

w i t h

t h e

E l e c t r i c Power

R e s e a r c h

I n s t i t u t e .

L I T E R A T U R E

CITED

1 . B o l l a g ,

J . - M . , a n d A . L e o n o wi c z .

1 9 8 4 .

C o m p a r a t i v e

s t u d i e s

o f

e x t r a - c e l l u l a r

f u n g a l l a c c a s e s .

A p p l . E nv i r o n.

M i c r o b i o l .

4 8 :

8 4 9 - 8 5 4 .

2 .

C o h e n ,

M.

S . ,

a n d P .

D . G a b r i e l e . 1 9 8 2 .

D e g r a d a t i o n

o f c o a l b y

t h e

f u n g i P o l y p o r u s

v e r s i c o l o r

a n d P o r i a

m o n t i c o l a .

A p p l .

E n v i r o n .

M i c r o b i o l .

4 4 : 2 3 - 2 7 .

3 .

F a h r a e u s ,

G . ,

a n d B . R e i n h a m m a r .

1 9 6 7 . L a r g e

s c a l e

p r o d u c t i o n

a n d p u r i f i c a t i o n

o f

l a c c a s e

f r o m c u l t u r e s o f

t h e

f u n g u s P o l y p o r u s

v e r s i c o l o r a n d

s o m e p r o p e r t i e s

o f l a c c a s e

A . A c t a

C h e m . S c a n d .

2 1 : 2 3 6 7 - 2 3 7 8 .

4 . F o w k e s ,

W.

W . , a n d

C .

M.

F r o s t .

1 9 6 0 .

L e o n a r d i t e :

a

l i g n i t e

b y p r o d u c t .

B u r e a u o f M i n e s ,

U . S . D e p a r t m e n t

o f I n t e r i o r

r e p o r t n o .

5 6 1 1 . G o v e r n m e n t

P r i n t i n g

O f f i c e , W a s h i n g t o n ,

D . C .

5 . K n u d s o n ,

D . L . ,

a n d S .

A . F a r n u m .

1 9 8 5 .

S u b b i t u m i n o u s

c o a l

c h a r a c t e r i z a t i o n ,

p .

1 . 1 - 1 . 2 6 .

I n

P r o c e e d i n g s

o f

t h e

T e n t h

A n n u a l

EPRI C o n t r a c t o r s

C o n f e r e n c e

o n

C l e a n

L i q u i d

a n d

S o l i d F u e l s ,

A p r i l

2 3 - 2 5 , 1 9 8 5 ,

P a l o A l t o ,

C a l i f .

E l e c t r i c

P o w e r

R e s e a r c h I n s t i t u t e ,

P a l o A l t o ,

C a l i f .

6 . L e o n o w i c z , A . ,

a n d K .

G r z y w n o w i c z .

1 9 8 1 .

Q u a n t i t a t i v e

e s t i m a -

t i o n o f

l a c c a s e

f o r m s

i n

s o m e

w h i t e - r o t f u n g i u s i n g

s y r i n g a l -

d a z i n e a s

a s u b s t r a t e . Enzyme

M i c r o b .

T e c h n o l .

3 : 5 5 - 5 8 .

7 . R o b i n s o n ,

H .

W . ,

a n d C .

G . H o g d e n .

1 9 4 0 .

T h e b i u r e t

r e a c t i o n

i n

t h e

d e t e r m i n a t i o n

o f

s e r u m p r o t e i n s .

I I .

M e a s u r e m e n t s

m a d e

b y

a D u b o s c q

c o l o r i m e t e r

c o m p a r e d w i t h

v a l u e s o b t a i n e d

b y

t h e

K j e l d a h l

p r o c e d u r e .

J . B i o l .

C h e m . 1 3 5 : 7 2 7 - 7 3 1 .

8 . S t r a n d b e r g ,

G . W . , a n d

S . N .

L e w i s .

1 9 8 7 .

T h e s o l u b i l i z a t i o n

o f

c o a l

b y

a n e x t r a c e l l u l a r p r o d u c t

f r o m

S t r e p t o m y c e s

s e t o n i i

7 5 V i 2 . J . I n d .

M i c r o b i o l . 1 : 3 7 1 - 3 7 5 .

9 . W a r d ,

H .

B . 1 9 8 5 . L i g n i t e - d e g r a d i n g

f u n g i

i s o l a t e d f r o m

a

w e a t h e r e d o u t c r o p

s y s t e m .

S y s t e m . A p p l .

M i c r o b i o l . 6 : 2 3 6 -

2 3 8 .

1 0 .

W i l s o n ,

B .

W . ,

E .

J .

L e w i s ,

D .

L . S te wa r t,

a n d

S .

M.

L i .

1 9 8 5 .

M i c r o b i a l

c o n v e r s i o n

o f

c o a l ,

p .

3 1 . 1 - 3 1 . 8 . I n


o f

t h e

T e n t h

A n n u a l

EPRI

C o n t r a c t o r s '

C o n f e r e n c e

o n

C l e a n

L i q u i d

a n d

S o l i d

F u e l s ,

A p r i l 2 3 2 5

1 9 8 5 , P a l o A l t o ,

C a l i f .

E l e c t r i c

P o w e r R e s e a r c h I n s t i t u t e ,

P a l o

A l t o , C a l i f .

1 1 . W i l s o n , B .

W . ,

E .

J . L e w i s , D .

L . S t ew ar t ,

S .

M.

L i ,

R .

M .

B e a n ,

E . K . C h e s s ,

J . P y n e , M.

C o h e n ,

a n d H . A r o n s o n . 1 9 8 6 .

M i c r o b i a l

p r o c e s s i n g

o f

f u e l s ,

p . I V 8 8 - I V 9 8 . I n


o f

t h e D e p a r t m e n t

o f E n e r g y C o a l

L i q u e f a c t i o n

C o n t r a c t o r s

M e e t i n g , P i t t s b u r g h , P a . ,

N o v e m b e r 1 9 - 2 1 ,

1 9 8 5 . N T I S , S p r i n g -

f i e l d ,

V a .

2 8 4 8

PYNE E T AL.

Documents

Appl. Environ. Microbiol. 1987 Pyne 2844 8