TUGAS BIOKIMIA TEKNIK

ANALISIS DNA

PENERAPAN ANALISIS DNA DENGAN PCR-SSP (SINGLE STRAND

CONFORMATION POLYMORPHISM) PADA UDANG WINDU PENAUS

MENODON

DISUSUN OLEH

APRI CHRISTIANTO (0710923012)

ISNAINI FITRIAWATI (0701923015)

AULIA DEWI ROSANTI (0701923016)

LINDAYANI (0701923017)

MASYRIFATUL JANNAH (0701923018)

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2010

PENDAHULUAN

Pada zaman modern ini dengan analisis dan teknologi deoxyribonucleic acid

(DNA), kasus-kasus yang sulit terungkap menjadi lebih mudah terungkap dan

terpecahkan. Seperti kita ketahui, DNA adalah bahan dasar yang membangun seluruh

ciri genetik seseorang. DNA terdapat pada setiap sel manusia, dan seluruh sel

memiliki DNA yang sama satu dengan yang lainnya. Misalnya, DNA yang ada pada

sel kulit sama dengan DNA yang terdapat pada sel darah maupun DNA pada sel

rambut dan lain sebagainya. Selain itu, DNA bersifat unik yakni setiap DNA

seseorang berbeda dengan DNA orang yang lain. Karena sifat inilah DNA bisa

dipakai sebagai penanda identitas individu, garis keturunan, dan etnis. DNA terdapat

pada darah, sel kulit, otot, sel-sel otak, tulang, gigi, rambut, saliva, jantung, mukosa,

urine, dan pada seluruh sel manusia.

Analisis DNA manusia bertujuan untuk mengarakterisasi DNA seseorang

untuk mengidentifikasi susunan DNA-nya. Barang bukti DNA dapat diambil dari

barang bukti biologis, baik dalam keadaan utuh maupun tidak utuh lagi. Hal ini

berbeda dengan analisis sidik jari yang mudah rusak atau hilang dan akurasinya

sangat bergantung pada keutuhannya. Tes DNA dapat dilakukan hanya dengan

barang bukti DNA yang jumlahnya sedikit. Hal ini karena digunakannya teknik yang

disebut Polymerase Chain Reaction (PCR) atau reaksi polimerasi berantai.Teknik ini

ditemukan oleh seorang ahli biologi molekuler yang bernama Kary Mullis yang

bertujuan untuk menggandakan atau mengamplifikasi DNA, agar memiliki DNA

yang cukup jumlahnya untuk dikomparasi atau dibandingkan dalam suatu tes.

Penggunaan DNA dalam memecahkan suatu kasus dilakukan dengan

membandingkan DNA tersangka dengan barang bukti DNA yang didapatkan dari

tempat kejadian perkara. Hasil perbandingan tersebut dapat membantu menemukan

siapa pelaku kejahatan yang sebenarnya, baik pada kasus kejahatan maupun dalam

hal menentukan pelaku bom bunuh diri secara akurat.

DNA yang biasa digunakan dalam tes adalah DNA mitokondria dan DNA inti

sel. DNA yang paling akurat untuk tes adalah DNA inti sel karena inti sel tidak bisa

berubah sedangkan DNA dalam mitokondria dapat berubah karena berasal dari garis

keturunan ibu, yang dapat berubah seiring dengan perkawinan keturunannya. Dalam

kasus-kasus kriminal, penggunaan kedua tes DNA diatas, bergantung pada barang

bukti apa yang ditemukan di Tempat Kejadian Perkara (TKP). Keunikan DNA

mitokondria manusia adalah setiap anak memiliki DNA mitokondria yang sama

dengan DNA mitokondria ibunya. Oleh karena itulah analisis DNA mitokondria

umumnya dilakukan untuk mengidentifikasi keturunan dari garis keturunan ibu

(maternally linkage), dan sering pula digunakan dalam penelusuran orang hilang.

Hal yang sangat penting dalam pemecahan kasus dengan barang bukti DNA

adalah penanganan barang bukti secara tepat dan sesuai dengan prosedur standar. Hal

ini penting karena mengidentifikasi, mengoleksi, dan menyimpan agar tidak

terkontaminasi sehingga dapat dihindari tercampurnya DNA tersangka/pelaku dengan

DNA lain. Untuk menghindari kontaminasi barang bukti yang mengandung DNA,

diperlukan beberapa prinsip kehati-hatian yang harus dilakukan oleh orang yang

menanganinya. Di antaranya memakai sarung tangan, memakai peralatan yang

berlainan setiap menangani barang bukti berbeda, hindari berbicara, bersin dan batuk

di dekat barang bukti, hindari menyentuh wajah, hidung, dan mulut saat mengambil

sampel barang bukti, serta jaga barang bukti agar tidak lembap.

Dengan adanya barang bukti berupa DNA, dapat dicapai tujuan dari

pemecahan suatu kasus seperti pembuktian tindak kriminal, yaitu membuktikan

seorang tersangka atas kejahatan yang telah dilakukannya, membebaskan orang yang

tidak bersalah dari tuntutan hukum, membuktikan keabsahan hubungan atau ikatan

keluarga dari seseorang, mengidentifikasi orang tak dikenal seperti korban perang,

mempelajari populasi manusia, dan mempelajari penyakit keturunan.

PENGUMPULAN & CARA PENGIRIMAN BAHAN PEMERIKSAAN

ANALISA DNA

DNA Fingerprinting sangat pesat perkembangannya saat ini.Dimana

pemeriksaan DNA sangat membantu kasus Forensik,mis : Identifikasi, paternitas,

warisan dll. Tidak semua lab. mampu melakukan dalam pemeriksaan analisa DNA.

Semua bahan yang berasal dari tubuh manusia bisa digunakan dalam analisa

DNA, misalnya :

- Darah & bercak darah

- Sperma & bercak sperma

- Jaringan & sel

- Tulang & organ

- Rambut dengan akarnya (folikel)

- Urine, saliva & cairan amnion

CARA PENGUMPULAN/PENGAMBILAN BAHAN

A. Darah

1. Sampel darah cair

a. Darah dari seseorang

diambil dengan semprit, masukkan ke dalam tabung

yang ada EDTA +/- 1ml darah.

Beri label, simpan di pendingin atau dikirim ke lab.

b. Darah cair di TKP

ambil dengan semprit/pipet/kainmasukkan ke

tab.dengan EDTA.

bila membeku ambil dengan spaltel

beri label, simpan di pendingin atau dikirim ke lab.

Darah cair dalam air/salju/es

sesegera mungkin, ambil secukupnya dan masukkan

dalam botol

hindari kontaminasi, beri label, simpan atau kirim ke

lab.

2. Bercak Darah Basah

a. Dipakaian

Pakaian dengan noda ditempatkan pada permukaan

bersih dan dikeringkan.

Setelah kering masukkan kantong kertas/amplop

beri label, kirim ke kab.

b. Benda dengan bercak darah basah

Bila benda kecil biarkan kering, tapi pada benda besar

dan hisap bercak tersebut dengan kain katun dan

keringkan.

masukkan amplop, beri label dan kirim

3. Bercak darah kering

a. Pada benda yang dpt dipindahkan

Misal ; senjata, kain, benda tersebut kumpulkan

tiap item dimasukkan dalam kantong kertas

beri label, kirim ke lab.

b. Pada benda padat dengan permukaan kasar

Misal ; lantai, bercak dikerok kemudian dimasukkan

amplop

beri label, kirim

c. Pada benda besar yang tidak dpt dipindahkan

bercak digosok dengan kapas basah dengan saline/air

steril

kapas dikeringkan dan masukkan kantong plastik

4. Bercak darah kering pada karpet/benda yang dpt dipotong

Potong bagian yang ada nodanya

Tiap potongan beri label

sertakan potongan yang tidak ada nodanya sebagai kontrol.

kirim ke lab.

5. Percikan darah Kering

Gunakan celotape, tempelkan pada percikan noda

masukkan celotape tersebut dalam kantong plastik

kirim ke lab.

B. Sperma & Bercak Sperma

1. Sperma cair

Hisap dengan semprit/pipet kemudian dimasukkan tabung

Atau dengan kapas, kemudian dikeringkan

beri label, kirim

2. Bercak Sperma pada benda yang dipindah

misal celana, bila masih basah, keringkan

bila kering potong yang ada nodanya dan masukkan amplop

beri label, kirim ke lab.

3. Bercak sperma pada benda besar yang bisa dipotong

misal; karpet, potong bagian yang ada noda

masukkan dalam amplop, beri label, dikirim

4. Bercak pada benda tidak dapat dipindah & tidak menyerap

misal ; lantai, kerok bercaknya kemudian dimasukkan kertas

lipat

masukkan amplop, label, kirim

5. BB sperma pada korban kejahatan seksual

BB di vagina, mulut/anus korban

tiap item dalam wadah sendiri & berlabel

kirim ke lab.

C. Jaringan, Organ & Tulang

1. Jaringan, organ & tulang segar

ambil tiap bagian dengan pinset

tiap item dalam wadah sendiri & berlabel

simpan dipendingin, kirim

2. Jaringan, organ & tulang tak segar

ambil tiap bagian, tiap item wadah sendiri & berlabel.

Jaringan otot :min 25 mg o.k DNA sedikit

Jaringan Hati ; 15 mg

D. Urine, Saliva & Cairan Tubuh yang Lain

1. Sampel Cair

Urine/saliva di masukkan tempat steril

beri label, simpan pendingin, kirim

2. Bercak urine, saliva

Dugaan noda dikerok/potong kumpulkan

masukkan amplop, beri label, kirim

E. Rambut

Cabut beberapa helai rambut dengan akarnya

hati-hati bila tercampur dengan darah

Tempatkan pada wadah, beri label

kirim ke lab.

F. Pulpa Gigi

Cabut gigi yang masih utuh

masukkan dalam kantong plastik, beri label

G. Cairan Amnion

diambil oleh ahli dr.Sp.OG.dengan USG

Pada kehamilan > 14 minggu

Aspirasi I 0,5ml (buang karena kontaminasi maternal), aspirasi II 30

ml (min 10 ml)

cairan amnion masukkan dalam tab.steril, beri label, simpan

pendingin, kirim

LABEL

Dibuat dari kertas tebal, memuat :

Identitas pasien/korban.

Jenis dan Jumlah bhn pemeriksaan

Saat dan tempat pengambilan bahan

Saat pengepakan

TTD dan nama petugas penyegel

Stempel/cap dinas

Segel dinas

Label diikat pada wadah bahan pemeriksaan

CARA PENGEPAKAN/PEMBUNGKUSAN

DNA yang akan dianalisis khususnya untuk kasus Forensik perlu dijaga

keasliannya dengan tata caranya meliputi :

- Masukkan wadah bahan pemeriksa dalam kardus

- diatur supaya tidak tumpah

- Jaga suhu bahan-bahan pemeriksaan yang harus dingin (mis pemberian dry ice)

- Bungkus kardus dengan rapi

- Ikat kardus dengan tali tidak bersambungan

- Bungkus lagi dengan kertas bersih

- Tulis alamat lab. Yang dituju & pengirim dengan jelas

Sebuah sampel biologis yang diperoleh berisi beberapa unsur di samping

DNA. Molekul DNA harus dipisahkan dari materi sel lain sebelum diuji. Sel-sel

protein terbungkus melindungi DNA di dalam lingkungan sel dapat menghalangi

kemampuan analisa DNA. Sementara itu metode ekstrasi DNA dapat dikembangkan

untuk memisahkan protein-protein dan materi sel-sel yang lain dari molekul-molekul

DNA. Sebagai tambahan kuantitas dan kualitas DNA perlu diukur sebelum kelanjutan

lebih lanjut  dengan prosedur analitis untuk memastikan hasil yang optimal. Ada tiga

teknik utama yang digunakan saat ini untuk ekstrasi DNA pada laboratorium forensik

DNA: ektraksi organik, ekstraksi Chelex, dan FTA paper (gambar 3.1). Ekstraksi

eksak atau masam-macam prosedur isolasi DNA tergantung pada bukti-bukti tipe

biologis yang akan diuji. Sebagai contoh darah utuh harus diperlakukan dengan cara

yang berbeda dari suatu noda darah atau suatu fragmen tulang.

Ekstraksi organik, kadang-kadang dikenal sebagai ekstraksi zat asam karbol

choloform, telah digunakan untuk waktu yang lama dan telah digunakan untuk situasi

di mana baik  RFLP atau PCR dilakukan. Bobot molekular tinggi DNA, penting bagi

metoda RFLP, diperoleh secara paling efektif dengan ekstraksi organik.

Metoda Chelex dari ekstraksi DNA lebih cepat dibandingkan dengan metode

ekstraksi organik. Sebagai tambahan, metoda Chelex membutuhkan lebih banyak

langkah dan kebanyakan langkah itu digunakan untuk mengkontaminasi sampel ke

sampel. Bagaimanapun hal itu menghasilkan DNA tunggal sebagai hasil proses

ekstraksi dan oleh karena itu hanya bermanfaat untuk prosedur pengujian yang

berbasis PCR.

Semua contoh harus secara hati-hati ditangani dengan mengabaikan metoda

ekstraksi DNA untuk menghindari pencemaran sampel ke kesampel atau pengenalan

tentang tambahan DNA. Proses ekstraksi memungkinkan di mana DNA jadi lebih

peka pada pencemaran di laboratorium dibanding pada waktu lain dalam proses

analisa forensik DNA. Dengan suatu alasan laboratorium-laboratorium biasa

memproses sampel-sampel petunjuk  pada waktu yang berbeda dan kadang-kadang

dengan lokasi yang tidak sama dari dimana sampel tersebut diambil.

Metoda yang populer untuk persiapan peangambilan referensi sampel adalah

dengan menggunakan noda darah dengan mengoleskannya ke kain kapas, dikenal

dengan suatu carikan, dengan menghasilkan bulatan kira-kira 1 cm2 pada kain kapas

tersebut, dengan rata-rata 70.000-80.000 sel darah putih dan menghasilkan rata-rata

500ng DNA genomic. Hasil nyata akan bervariasi dengan jumlah sel-sel darah putih

yang akan menunjukkan sampel dan efisiensi proses ekstraksi DNA.

Gambar 3.1 Skema yang biasa digunakan untuk proses ekstrasi DNA

Ekstraksi DNA disimpan secara khusus pda suhu -20oC, atau bahkan pada

suhu -80oC pada penyimpanan dalam waktu lama, untuk menjaga aktifitas inti.

Nucleas-nucleas adalah enzim-enzim (protein) yang ditemukan di dalam sel-sel

turunan DNA untuk memungkinkan pendauran ulang menyangkut komponen-

komponen nucleotide. Nucleases memerlukan magnesium untuk bekerja dengan baik

sehingga salah satu pengujian untuk mencegah mereka dari mencerna DNA di dalam

darah adalah menggunakan tabung purple-topped yang berisi bahan pengawet darah

yang dikenal sebagai EDTA. EDTA meliputi, atau membalut, semua magnesium

bebas dengan begitu mencegah nucleases menhancurkan DNA di dalam contoh darah

yang dikumpulkan.

EKSTRAKSI ORGANIK (PHENOL-CLOROFORM)

Ekstraksi organik melibatkan penambahan beberapa bahan kimia. Pertama,

sodium Dodecylsulfate (SDS) dan Proteinase Kare ditambahkan untuk membuka

dinding sel sepanjang protein yang melindungi molekul DNA selagi mereka ada di

dalam kromosom. Selanjutnya campuran phenol/cloroform ditambahkan untuk

memisahkan protein dari DNA. DNA menjadi lebih dapat larut di dalam air yang

mengandung campuran organic-aqueous. Ketika proses sentrifuge, bekas

peninggalan protein dan selular yang tak dikehendaki dipisahkan dari tahap yang

mengandung air dan menggandakan molekul DNA  sehingga dapat ditransfer dengan

baik untuk dianalisa. Beberapa protokol melibatkan dialisa centricon 100 (Millipore,

Billerica, MA) dan konsentrasi di tempat timbulnya ethanol dan untuk memindahkan

heme inhibitors (Comey et al 1994). Sementara metoda ekstraksi bekerja dengan baik

untuk recovery bobot DNA dengan molekul tinggi, ini adalah waktu menggunakan

bahan kimia yang penuh resiko dan memerlukan contoh untuk ditransfer antara

banyak tabung (faktanya ini menaikkan resiko kesalahan dan kontaminasi).

PROSES PENARIKAN CHELEX

Sebuah prosedur alternatif untuk penarikan DNA yang telah terkenal

dikalangan ahli forensik adalah penggunaan dari suspensi resin kombinasi yang dapat

ditambahkan langsung pada sampel (misalnya, darah, bercak darah, atau semen).

chelex terdiri dari styrene divinylbenzene copolimers mengandung sepasang ion

iminodiacetate yang bereaksi sebagai grup-grup kombinasi dalam ikatan ion metal

polivalen seperti magnesium. Serupa dengan pengisian besi untuk menjadi sebuah

magnet, beberapa ion magnesium tertarik dan terlempar keatas. Dengan

memindahkan magnesium dari reaksi tersebut, DNA menghancurkan enzim-enzim

dikenal sebagai nukleus yang tidak diaktifkan dan molekul-molekul DNA yang

terlindungi.

            Pada sebagian besar protokol, sampel biologis seperti bercak darah

ditambahkan sampai dengan 5% suspensi chelex dan dididihkan selama beberapa

menit untuk memecah sel-sel dan melepaskan DNA. Sebuah permulaan, langkah

pencucian sebelumnya sangat membantu untuk menghilangkan kontaminasi dan

hambatan yang mungkin timbul seperti heme dan beberapa protein (Willard et.al.

1998). Pemanasan sampai temperatur 1000 C memecahkan DNA protein sel sama

seperti mengacaukan membran sel dan menghancurkan protein sel setelah

pemusingan didalam mesin sentrifuse untuk mendorong resin chelex dan sisa-sisa

selular kedasar tabung reaksi, cairan bagian atas setelah proses pengendapan

dihilangkan dan dapat ditambahkan langsung ke reaksi pengerasan PCR.

            Proses penarikan chelex untuk melindungi DNA dari bercak darah atau semen

yang mengandung bercak tidak efektif untuk RFLP karena chelex memecahkan DNA

rantai ganda dan lapangan rantai tunggal DNA dari proses pemisahan.

            Jadi itu hanya bisa diikuti dengan analisa dasar PCR. meskipun demikian,

proses penarikan chelex adalah suatu keuntungan bagi metode dasar pelepasan PCR

karena dapat menghilangkan penghalang dari PCR dan hanya menggunakan tabung

tunggal untuk pemisahan DNA yang mana mengurangi potensi laboratorium yang

menyebabkan kontaminasi.

            Penambahan darah utuh yang terlalu banyak atau bercak darah yang terlalu

besar pada solusi pelepasan chelex dapat menghasilkan beberapa penghanbatan PCR.

The AMPF/STR kit direkomendasikan secara manual 3 ul darah utuh atau bercak

darah kurang lebih 3 mm x 3 mm.

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik yang paling umum

digunakan oleh para peneliti bidang Biologi molekuler dan Genetika. Prinsip umum

kerja PCR adalah menggandakan potongan DNA tertentu dengan bantuan enzim.

Sejak ditemukan pertama kali mesin PCR (nama lainnya Thermal Cycler) oleh Karry

Mullis pada tahun 1984, kini hampir semua kegiatan di bidang biologi molekuler,

genetika, kedokteran hingga forensik tidak lepas dari PCR. Wajar jika The Royal

Swedish Academy of Sciences mengganjar Mullis dengan Hadiah nobel pada tahun

1993.

Prinsip kerja PCR adalah menggandakan potongan DNA tertentu dari

seluruh untaian DNA, baik yang berasal dari DNA sel inti (nukleus) maupun organel

sel seperti DNA mitokondria (mtDNA) atau Ribosom (rDNA). Untuk mendapat

potongan DNA, diperlukan Primer yang berfungsi untuk menandai dimana ujung

DNA yang akan digandakan. Primer biasanya berpasangan, yaitu Primer forward

untuk menandai ujung depan untai DNA dan Primer Reverse untuk menandai dari

ujung belakang. Karena DNA terdiri dari 2 untai pilinan ganda (double strand), maka

DNA Primer forward bekerja pada strand yang satu sementara Primer Reverse

bekerja pada untai pilinan yang satunya.

Komponen PCR

Selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase,

komponen lain yang dibutuhkan adalah:

1. Primer

Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida

pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai

atau polimerisasi DNA. Jadi jangan membayangkan kalau PCR mampu

menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang panjangnya kira-kira 3 juta

bp itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu

sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik tertentu bisa sampai

40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan

DNA template, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang

kita inginkan.

2. dNTP (deoxynucleoside triphosphate)

dNTP alias building blocks sebagai ‘batu bata’ penyusun DNA

yang baru. dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA,

yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.

3. Buffer

Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk

mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA

polymerase.

4. Ion Logam

Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor

bagi enzim DNA polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak

dapat bekerja. Ion logam monovalen, kalsium (K+).

Ada 3 tahap dalam kerja PCR, yaitu Denaturing, Annealing dan Extension.

1. Denaturing adalah proses memisahkan 2 untai pilinan DNA. Pada tahap ini,

ikatan hidrogen yang menyatukan kedua pilinan itu terlepas sehingga masing-

masing akan menjadi untai tunggal. Biasanya suhu Denaturing berkisar antara

92-94 derajat celcius.

2. Annealing adalah tahapan dimana primer forward dan reverse mencari

pasangannya di untai-untai DNA. Jika pas..... maka dia akan melekat. Suhu

Annealing biasanya berkisar antara 40-55 derajat Celcius. Suhu yang biasanya

umum dipakai adalah 50-52 derajat C.

3. Ekstensi/elongasi

Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim

DNA polymerase, biasanya 70-72oC. Pada tahap ini DNA polymerase akan

memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya, jika basa pada template

adalah A, maka akan dipasang dNTP, begitu seterusnya (ingat pasangan A

adalah T, dan C dengan G, begitu pula sebaliknya). Enzim akan

memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung. Lamanya waktu ekstensi

bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi, secara kasarnya

adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp.Biasanya ketiga tahap ini diulang

sebanyak 30 kali untuk mendapatkan 1.073.741.766 kopi / clone potongan

DNA.

Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan

berikut:

1. Pra-denaturasi

Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan

denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif

kalau dipanaskan terlebih dahulu).

2. Final Elongasi

Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit

untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang

secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir

PCR dilakukan dengan menggunakan mesin Thermal Cycler yang dapat

menaikkan dan menurunkan suhu dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus PCR.

Pada awalnya orang menggunakan tiga penangas air (water bath) untuk melakukan

denaturasi, annealing dan ekstensi secara manual, berpindah dari satu suhu ke suhu

lainnya menggunakan tangan. Tapi syukurlah sekarang mesin Thermal Cycler sudah

terotomatisasi dan dapat diprogram sesuai kebutuhan.

ELEKTROFORESIS

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul

bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.

Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan

dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang

ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang

bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari

suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan

bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut

tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk

molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait

dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:

F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan

listrik.

Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan,

mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA.

Jenis Elektroforesis

Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas

sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama

ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi

sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada

muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan,

konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut.

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi

molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat

dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan

berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju

perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis

gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai

teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-

metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau

immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang

(crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk

memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau

oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat

dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan

pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran

rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar

dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput

laut) yang sudah dimurnikan.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam

sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik

dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam

matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam

nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan

negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju

perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya),

zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam

nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen

(misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk

lurus dan bermuatan negatif.

Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan

(staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida,

perak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk

keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya

setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet.

Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.

Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan

tampak setelah proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari

"sumur" gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis

mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis

dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut

berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker) yang merupakan campuran molekul

dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul

dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang

paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan

pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding

terbalik terhadap logaritma ukuran molekul.

Perangkat elektroforesis gel

Hasil elektroforesis gel terhadap hasil PCR menggunakan primer mikrosatelit. Berkas

(band) mendatar merupakan sekumpulan DNA yang setiap kolomnya bergerak

dengan kecepatan berbeda. Semakin pendek DNA semakin cepat bergerak.

Analisis DNA : PENERAPAN ANALISIS DNA DENGAN PCR-SSP (SINGLE

STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM) PADA UDANG WINDU

PENAUS MENODON

Teknik analisis DNA dengan PCR-SSCP dilakukan untuk melihat perbedaan

keragaan dan jumlah fragmen serta berat molekul pasangan basa dari sampel uji

dalam hal ini adalah udang melalui gel poliakrilamid(Genegel Clean Excel 15/24)

elektroforesis(GenePhor) yang diopeerasikan secara terkontrol.

Bahan dan alat yang digunakan pada analisis DNA ini adalah beberapa bahan

dan alat antara lain : centrifus,autoclove, mikropipet, eppendorftube, tip, mesin PCR,

dan mesin elektroforesis GenePhor. Dan bahan yang digunakan adalah genom DNA,

genom hasil amplifikasi (PCR produk), kit untuk purifikasi (QlAquick purification ),

Genegel Clean poliakrilamid, Qiagen kit, Agarose 1%, enzim restriksi, dan DNA

silver staining kit.

Gambar: Elektroforesis Genephor

Gambar: Bahan-bahan yang digunakan dalam analisis SSCP

METODOLOGI

TEKNIK ANALISIS DNA DENGAN PCR-SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism) PADA UDANG WINDU, PENAUS

MONODON

Persiapan sampel

Amplifikasi PCR

Gel Elektroforesis

Pewarnaan Polykriamid gel dengan silver staining

Pada persiapan sampel dilakukan beberapa metode yaitu ekstraksi sampel udang.

Ekatraksi ini dilakukan dengan mengambil sampel udang(daging, mata, kaki renang

atau PL) sebanyak ± 20 mg dan kemudian dimasukkan ke dalam eppendorf tube yang

telah berisi chelex 100 sebanyak 10% dalam TE buffer, pH 8,0 sebanyak 250 µL ,

selanjutnya digerus dan diidi dengan PK(Proitenase K) sebanyak 5 µL serta di

flushing. Kemudian sampel diinkubasi selama 2,5 jam pada suhu 55⁰C dan diinkubasi

lagi pada suhu 89⁰C selama 8 menit. Setelah inkubasi sampel disentrifugasi dengan

kecepatan 13.000 rpm selama 7 menit. Supernatan yang terbentuk dilapisan atas

diambil sebanyak ± 200 µL dan supernatant ini yang merupakan genom DNA.

Langkah kedua adalaha Purifikasi dimana purifikasi genom DNA ini menggunakan

Kit QlAquick Purification(Cat. No. 28104 QIAGEN) dan metode ini mengikuti

manual yang telah ada dalam kit(kemasan). Genom DNA hasil ekstraksi diambil

sebanyak 100 µL dimasukkan ke dalam eppendorf tube ditambah 500 µL binding

buffer(PBI). Dengan finger vortex, larutan akan tercampur dan di-flushing

selanjutnya dibiarkan selama 5 menit pada suhu ruang. Larutan tersebut dimasukkan

ke dalam column QlAquick purification dan disentrifus (1 menit) dengan kecepatan

13.000 rpm. Larutan yang ter-filter dibuang dan ke dalam column ditambahkan

larutan wash buffer(PE) sebanyak 750 µL, selanjutnya disentrifus selama 1 menit

dengan kecepatan 13.000 rpm. Larutan yang ter-filter dibuang dan disentrifus lagi

dengan waktu dan kecepatan yyang sama. Angkat column yang berisi filter QlAquick

dan dimasukkan ke dalam eppendorf tube yang telah steril. Tahap selanjutnya

menambahkan larutan elution buffer (EB) sebanyak 30 µL yang diteteskan pada

bagian tengah filter column dan disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm selama 1

menit. Larutan yang telah terfilter merupakan genom DNA yang murni dengan

konsentrasi tinggi sebagai bahan amplifikasi PCR.

Langkah ketiga adalah Amplifikasi PCR. Pada amplifikasi PCR ini dapat

menggunakan metode Taq PCR Core kit atau Ready To Go (RTG) beads. Pada

metode Taq PCR Core kit komposisi larutannya terdiri atas H2O, 10X buffer, dNTP,

primer (foward dan reverse), Q-solution, Tag polimerase, dan genom DNA,

sedangkan dengan metode Ready To Go beads hanya terdiri atas H2O, primer

(Foward dan Reverse) dan genom DNA. Genom DNA yang telah dicampur

dimasukkan ke dalam mesin PCR dengan 32 siklus dan memerlukan waktu .

Hasil PCR amplifikasi difragmentasi dengan agarose gel 1 % dalam elektroforesis

Mupid-2 dengan arus listrik sebesar 50 volt selama 25 menit. Untuk memperjelas

fragmen DNA dilakukan perendaman dengan pewarnaan ethidium bromide selama 10

menit.

Langkah keempat adalah pemotongan DNA dengan Enzim. Hasil amplifikasi PCR

yang sudah di fragmentasi dan menunjukkan pita tunggal dipotong dengan enzim

restriksi Hae III dan Hinf I dengan komposisi larutan seperti terlihat pada Tabel 1.

Template DNA hasil amplifikasi PCR diambil sebanyak 4 µL dan dimasukkan ke

dalam eppendorf tube volume 600 µL, ditambahkan 2 µL RE dan di flushing

kemudian diinkubasi dalam incubator selama 3,5 jam dengan suhu 37 C. Setelah⁰

selesai proses inkubasi, eppendorf tube dimasukkan ke dalam freezer -20 C untuk⁰

menghentikan aktifitas enzim dalam pemotongan.

Langkah kelima adalah Gel Elektroforesis. Langkah-langkah dalam gel elektroforesis

yaitu sebagai berikut :

1. Gel poliacrilamid (Genegel Clean Excel 15/24), dibuka bungkusnya,

selanjutnya gel diambil dan direkam selama 1 jam dalam larutan gel

rehydration buffer dalam wadah staining (dish containing).

2. Setelah gel rehydrasi (warna agak kebiruan), gel diangkat dan dibersihkan

cairan yang masih menempel dengan menggunakan tissu tidak berserabut

(kimwrap).

3. Gel ditempatkan pada mesin GenePhor yang dimediasi oleh larutan ddH2O

(±3 mL) agar gel tidak melekat langsung pada chamber GenePhor.

4. Sebelum sampel uji dielektroforesis, ke dalam restriction tube (hasil

pemotongan DNA) ditambahkan 4 µL loading dye dan di-flushing.

Selanjutnya sampel uji dimasukkan ke dalam sumuran yang ada pada

polyakrilamid gel (6-7µL)

5. Buffer strip disiapkan 2 lembar dan dibasahi dengan larutan gel electrode

buffer ± 1,5 mL setiap strip, selanjutkan dimasukkan pada tempatnya yang

berfungsi sebagai jembatan (bridge) buffer yang dapat mengalirkan arus listrik

dari positif ke negatif.

6. GenePhor ditutup dengan sempurna sehingga elektrode menyentuh buffer

strip dengan baik.

7. Fragmentasi gen dalam polyakrilamid gel dikondisikan pada suhu 150C

selama 45 menit. Alat yang digunakan dalam running gel elektroforesis adalah

GenePhor seperti yang terlihat pada gambar dibawah ini.

Langkah terakhir adalah pewarnaan polyakrilamid gel dengan silver staining. Pada

proses ini, setiap tahap perendaman gel polyakrilamid dilakukan dengan

menggunakan alat untuk menggoyang (shaking) agar larutan merendam seluruh

permukaan gel polyakrilamid

1. Gel polyakrilamid hasil elektroforesis direndam dalam larutan fixing selama

90 menit. Larutan fixing merupakan campuran 24 ml ethanol absolute dengan

76 mL MiliQue(MQ) water steril dan ditambah 25 mL larutan fixing 5x.

2. Selanjutnya pewarnaan dengan larutan staining yang merupakan campuran

100 mL MQ water steril dan 25 mL larutan staining selama 30 menit.

3. Perendaman dengan larutan developing selama 8-10 menit dengan system

menggoyang. Larutan terdiri atas 100 mL MQ water steril, 25 mL sodium

karbonat, 125 µL formaldehyde. Campuran larutan developing ini sangat peka

terhadap cahaya sehingga perlu dilakukan penutupan dengan aluminum foil.

4. Untuk menghentikan proses pewarnaan dilakukan perendaman dalam larutan

stoping (100 mL MQ water dan 25 mL larutan stoping) selama 30 menit.

Campuran larutan ini juga sangat peka terhadap cahaya sehingga harus ditutup

dengan aluminum foil.

5. Preservasi gel dilakukan dengan cara gel polyakrilamid dikering-anginkan

pada suhu ruang dengan posisi vertical. Setelah gel kering dilakukan scoring

atau pembacaan pita.

Hasil dan Pembahasan

Ekstraksi genom DNA

Hasil dari ekstraksi sampel udang adalah genom yang relative

bervariasi kualitas maupun kuantitasnya. Seringkali pada sampel dari organ

mata dan kaki renang menghasilkan genom DNA yang berwarna (merah muda

atau kehitaman) oleh adanya pigmen sel. Secara kuantitas ekstraksi genom

DNA menghasilkan nilai yang cukup tinggi 150-600ng/µl yang merupakan

genom DNA total. Hal ini sudah sangat cukup untuk amplifikasi PCR karena

dalam reaksi hanya diperlukan 15-50 ng/µl.

Genom adalah keseluruhan bahan geneetik yang membawa semua

informasi pendukung kehidupan pada suatu makhluk hidup, baik yang

merupakan gen ataupun bukan. Pada semua akhluk hidup, genom mencakup

semua informasi genetic yang dibawa DNA baik di inti sel (nucleus),

mitokondria, maupun plastid. Dengan demikian ekstraksi genom DNA

merupakan langkah awal yang sangat menentukan keberhasilan dari analisis

PCR.

Purifikasi dengan menggunakan kit Qiaquik purification

Proses purifikasi genom DNA menggunakan kit QIAquick

purification dihasilkan genom DNA murni dengan kosentrasi DNA yang

tinggi yang digunakan sebagai template amplifikasi.

Amplifikasi PCR

Amplifikasi PCR menggunakan laritan dari metode Taq PCR Core

kit atau Ready To Go (RTG) beads menghasilkan pita tunggal yang

selanjutnya dapat dipotong dengan bebebrapa enzim restriksi. Pita tunggal

dari hasil amplifikasi PCR mempunyai berat molekul yang bervariasi, sesuai

dengan target region dari primer yang digunakan. Penggunaan masing-masing

metoda pada dasarnya sama, hanya pertimbangan efisien waktu dan biaya.

Pada metode Taq PCR Core kit, proses penyiapan reaksi lebih lama tetapi

biaya lebih murah, sedangkan dengan RTG beads, proses penyiapan reaksi

cepat namun mahal.

Pemotongan DNA dengan Enzim Restriksi.

Enzim restriksi yang digunakan untuk memotong DNA adalah Hae

III dan HinfI. Dari udang yang digunakan dapat diketahui polimorfisme DNA

dari masing-masing sampel, seperti terlihat pada gambar dibawah. Dari

gambar terlihat bahwa penggunaan enzim restriksi berbeda akan memberikan

daerah pemotongan yang berbeda pula. Pada pemotongan dengan enzim Hae

III (ine 1-20) nampak adanya polimorfisme pada line 4-12, sedangkan lainnya

bersifat monomorfis. Pada pemotongan dengan enzim Hinf (line 20-24)

menunjukkan pola monomorfis.

Gel Elektroforesis dan Pewarnaan polyakrilamid gel dengan silver staining

Hasil analisis SSCP pada udang windu, Penaeus monodon terlihat

bahwa Fragmentasi pita DNA pada polyakrilamid cenderung lebih banyak dan

bervariasi, sehingga memudahkan dalam mencirikan sifat polimorfisme. Hal

ini berhubungan dengan sususnan molekul yang sangat kecil dan tersusun

sangat kompak dalam lembaran gel sehingga polyakrilamid dapat

memfragmentasi DNA lebih sensitive dibandingkan dengan agarose gel.

Pita DNA yang telah mengalami pemotongan dengan enzim

restriksi terlihat sangat jelas dalam fragmentasi pada polyakrlamid. Mobilitas

dari DNA double-stranded di dalam gel elektroforesis bergantung pada

ukuran rantai dan panjangnya tetapi secara relative tidak terikat pada

nukleutida urutan tertentu.

Analisa DNA dengan metode single strand conformation

polymorphisme mempunyai keuntungan untuk mengetahui DNA

polimorfisme, demikian pula variasi urutan gen yang lebih spesifik dapat

dipisahkan atau lebih sensirif. Sedangkan bebebrapa factor lainnya yang

berpengaruh terhadap pola pita DNA yang terekspresi dengan baik pada

teknik SSCP ini diantranya adalah:

1. Kosentrasi DNA sampel yang berkualitas dari proses ekstraksi dan

purifikasi, hasil amplifikasi PCR dan pemotongan dengan enzim

restriksi .

2. Optimasi penggunaan buffer, baik dalam proses polyakrilamid gel

rehydrasi dan proses running dengan electrode buffer.

3. Proses penyiapan larutan untuk pewarnaan dengan silver staining kit

yang harus sesuai dengan prosedur yang ada, karena ada tahapan

penggunaan larutan yang peka terhadap sinar cahaya. Dengan

demikian tahapan [elaksanaan analsis dengan SSCP harus dilakukan

dengan teliti dan cermat untuk mendapatkan hasil yang optimal.

Kesimpulan

Teknik analisis DNA menggunakan metode SSCP dengan gel poliakrilamid

untuk udang dapat menghasilkan fragmentasi yang cukup jelas, perbedaan jumlah

fragmen dan berat molekul pasangan basa antar fragmen. Pemotongan dengan enzim

restriksi Hae III menunjukkan perbedaan polymorfisme pada udang windu,

P.monodon

DAFTAR PUSTAKA

Anonymous1, 2010, Elektroforesis, http://id.wikipedia.org/wiki/Elektroforesis,

diakses 28 November 2010

Anonymous2, 2010, Elektroforesis Gel,

http://id.wikipedia.org/wiki/Elektroforesis_gel, diakses 28 November

2010

Anonymous3, 2010, Biologi Molekuler,

http://id.wikipedia.org/wiki/Biologi_molekular, diakses 28 November

2010

Dontigney, E., 2010, DNA Electrophoresis Method, http://www.ehow.com/how-

does_5246239_dna-electrophoresis-method.html, diakses 28

November 2010

Lewis, M., 2010, Agarose Gel Electrophoresis (basic method),

http://www.methodbook.net/dna/agarogel.html, diakses 28 November

2010