Esther Vega, Ph.D. Microbiología Aplicada · deshidratación del “core” a mucha de la...

Esporas y su importancia

Esther Vega, Ph.D.Microbiología Aplicada

Organismos formadores deEsporas

• Bacillus• Clostridium• Desulfotomaculum• Sporolactobacillus• Alicyclobacillus• Thermoactinomyces• Sporosarcina

Inducción de la esporulación• Laboratorio- Limitación de nutrientes

– Se termina uno o más nutrientes durante elcrecimiento celular (C o N)

– Cambio de las células de un medio rico auno pobre

– Adición de un inhibidor de la síntesis de losnucléotidos de guanina

• Naturaleza

El proceso de esporulación puede tomar 8 horas.

Inducción de la esporulación

• ¿Cúal es la señal intracelular para lainiciación de la esporulación?– No es cAMP o GMP– ¿Nucléotidos de guanidina?

• La represión por carbono puede regular laesporulación

• Podría ser modulada de alguna forma por ladensidad celular

• Secreción de moléculas pequeñas al medio

Fenómenos asociados a laesporulación

• Síntesis de enzimas de degradación(amilasas, proteasas)

• Síntesis de antibíoticos• Síntesis de toxinas protéicas contra

insectos, animales o humanos• Desarrollo de motilidad• Desarrollo de competencia genética

Cambios morfológicos,bioquímicos y fisiológicos

durante esporulación

Vea figura diagrama entregado

Regulación de la expresióngenética durante esporulación

• Mutantes spo• Asporogenia puede ser causada por

mutaciones en uno o más de 75 locus

Estructura

Estructura- Exosporio

• No tiene similitud deestructura en celulavegetativa

• Varia en tamanoentre las especies

• Varios de suscomponentes noestan biencaracterizados

Estructura- “Coat” de laespora

• No tiene similitud de estructura en célulavegetativa

• Varía en complejidad entre las especies• Proteínas con enlaces S-S

– Contribuye a la resistencia a radiación• AA de composición inusual• Protege a la corteza de enzimas líticas• Barrera contra químicos como agentes

oxidantes• No role significativo en la resistencia de la

espora a calor o radiación

Estructura- “outer foresporemembrane”

• Membrana funcional• Función en la extrema

impermeabilidad de laespora a moléculaspequeñas

• Composición protéicadiferente a “innerforespore membrane”

Estructura- “inner foresporemembrane”

• Barrera de permeabilidada moléculas hidrofílicas ymayoría de moléculas de> 150 MW

• Contenido de fosfolípidossimilar a la célula

Estructura- corteza• Capa de peptidoglican• Similitudes y diferencias con

la pared celular– Acido diaminopimélico vs. Lisina– ~65% de los residuos de acido

murámico no tienen residuospeptídicos

– Muramic acid lactam vs. D-alanine

– Menor grado de “peptide cross-linking”

• Responsable de ladeshidratación del “core” amucha de la resistencia de laespora

Estructura- “germ cell wall”

• Estructura idéntica acélula vegetativa

Estructura – “Core”• DNA, ribosomas,

mayoría de las enzimas,DPA y cationesdivalentes

• SASP (10-20% de laproteína de la espora)

• Bajo contenido de agua– 0.4-1 g/g peso seco vs.

4 g/g célula vegetativa– Role en “spore

dormancy” y resistencia

Macromoléculas

• SASP – “small acid soluble proteins”– Principal responsable de la resistencia de

las espora• Provee resistencia a químicos a rompimiento

enzimático del DNA• Altera la fotoquímica del DNA

– Sintetizada en la “forespore” durante lafase III

Macromoléculas - SASP• Bacillus spp. – 3 tipos

de SASP– Tipo δ

• ~5% de la proteína de laespora, 75-100 aa

• Se degrada durante lagerminación por GPR-provee aa

• Codificada por un sólogene

• No se encuentra en lasesporas de Clostridium

– Tipo αβ• 3-5% de la proteína de

la espora,60-75 aa• Codificada por 7 genes• Se degrada durante la

germinación por GPR• Proteínas enlazadoras

de DNA (vivo, in-vitro)• Resistencia del DNA a

varios tratamientos

Moléculas pequeñas

• Los iones en el centro de la espora soninmóbiles

• El pH del centro es 1-1.5 unidades pordebajo que la célula vegetativa

• Hay pocos compuestos de energía

Tabla 3.3

“Dormancy”• No hay metabolismo

detectable– Bajo contenido de

agua– Pares de enzima-

sustrato• E.g. 3PGA-

Phosphoglyceratemutase (PGM), y SASP-GPR

• Estable por meses oaños pero degrada enlos primeros 15 a 30min de la germinación

Resistencia de la espora• Congelamiento y desecación

– SASP contribuye aestabilidad del DNA

• Presión– >resistencia presiones altas

que bajas; presiones bajaspromueven germinación

• δ-radiación– SASP no estan envueltas;

baja [] agua?; mecanismodesconocido

• Radiación UV– 7-50x más resistentes;

SASP• Químicos

– “spore coat”• Calor

– Saturación de DNA por αβSASP

– Mayor resistencia a calorseco que húmedo

– Baja cantidad de agua en elcentro (core)

Ciclo de esporulación ygerminación

Activación

• Requisitos para activación– Varia entre esporas de diferentes especies– pH bajo, químicos, calor subletal

• Reversible en algunas especies• Activación por calor

– Liberación de pequeñas cantidades deDPA (mayoría de las especies)

– Liberación de DPA – B. stearothermophilus

Germinación

• Ocurre durante los primeros 20-30 minluego de mezclar esporas congerminante

• Dormant spore Esporaactiva metabólicamente

Germinación• Excreción de minerales• Excreción de DPA

– Aumento en cantidadde agua

• Pérdida derefractibilidad,resistencia, “dormancy”

• Degradación de lacorteza– 2-3x en volúmen de

corteza– Enzímas líticas

• Reaccionesenzimáticas– Generación de ATP y

NADH de 3PGA– Degradación de SASP

por GPR y peptidasas– Catabolismo de aa– Iniciación de

catabolismo decompuestos exógenos

• Iniciación de la síntesisde RNA (mRNA?)

• Iniciación de la síntesisde proteínas

Germinantes• Germinante

– Específico por especie– Metabolismo de germinante no es requerido– Interacción con una proteína específica– Compuestos de interés

• Nucléosidos• aa• Azúcares• Sales• DPA• Aliquilaminas de cadenas largas

Crecimiento

• ~25 min luego de la iniciación de lagerminación de la espora hasta la primeradivisíon celular

• Requiere nutrientes exógenos (C,N)• ~90 min en medio rico• Se sintetizan aa, nucléotidos y otras

moléculas pequeñas• Comienza replicación DNA ~60 min luego

comienzo de germinación• Reparación DNA

Esporas en la industria dealimentos

• Formadores de esporas patógenos

C. botulinum

B. cereus

C. perfringes

C. butyricum

Alimentos enlatados de bajaacidez

• Definición del FDA yUSDA– pH>4.6 y aw>0.85– Excepciones: tomates, pH

4.7, alimentos ácidos• Procesamiento termal de

alimentos enlatados- U.S.Code of FederalRegulations (21 CFR,parts 108-114)– Llenado, equipo y

formulaciones– Reporte de desviaciones del

proceso o incidentes decontaminación

Alimentos enlatados de bajaacidez

• Esterilidad comercial– “Aplicación de calor que inactiva

microorganismos de significado para saludpública, al igual que microorganismos queno tengan significado para la salud públicapero capaces de reproducirse en elalimento bajo condiciones normales derefrigeración en almacenaje y distribución.”

Alimentos enlatados de bajaacidez

• Meta: esporas de C.botulinum

• Proceso 12D o“Botulinum cook”– “Tiempo requerido en

un proceso termal parala reducción de 12 logde esporas de C.botulinum

– Vegetales de bajaacidez y carnes nocuradas

• Tratamiento térmicomenor– Alimentos con carga

baja de esporas– Carnes curadas– Alimentos de Aw bajo– Alimentos con factores

antimicrobiales (e.g.sal)

Alimentos enlatados de bajaacidez

• Valor D: tiempo(min) necesariopara reduciruna poblaciónpor 1 log

• Medida de laresistencia deun organismo aunatemperaturaespecífica

Tabla 3.4

Alimentos enlatados de bajaacidez

• Valor z: aumento enla temperaturanecesario parareducir el valor Dpor 1 log

• Representa laresistencia relativade un organismo ainactivación adiferentestemperaturas

Formadores de esporasimportantes para la salud pública• C. botulinum- patógeno alimentario• C. perfringes- patógeno alimentario• B. cereus- patógeno alimentario• B. licheniformis- patógeno alimentario

esporádico• B. subtilis- patógeno alimentario esporádico• B. pumilus- patógeno alimentario esporádico• C. butyricum – toxina botulismo tipo E• C. barati- toxina botulismo tipo F• B. anthracis- ántrax intestinal

Daño alimentario por otrosformadores de esporas

• Tabla 3.6

HACCP yPrevención• La seguridad en el procesamiento térmico de

los alimentos de baja acidez es mejorada conla aplicación de HACCP

• HACCP: Control estricto en todos losaspectos de la seguridad en la producción dealimentos– Materia prima– Métodos de procesamiento– Ambiente en la planta– Personal– Almacenaje– Distribución

Bacillus thuringensis

Bacillus cereus

Clostridium

Bacillus anthracis

Clostridium butyricum

Bacillus cereus

Clostrium perfringes

Clostridium botulinum