Praticas De Microbiologia 2 Curso Biologia Sp

Prácticas de Microbiología

2º Curso Biología

Departamento de Microbiología y Genética

Universidad de Salamanca

INTRODUCCIÓN GENERAL.

TÉCNICAS DE MICROBIOLOGÍA BÁSICA

OBTENCION Y MANTENIMIENTO DE CULTIVOS PUROS

El trabajo con microorganismos no se realiza con células aisladas, sino con poblaciones extensas y homogéneas del

microorganismo a estudiar, por lo que el microbiólogo utiliza técnicas que permiten obtener un cultivo puro, y luego

cultivar a gran escala dicho microorganismo.

Para obtener cultivos puros el microbiólogo ha de utilizar instrumentos estériles, es decir libres de otros

microorganismos no deseados (contaminantes). La esterilidad se consigue por diferentes métodos:

1 . Calor seco. Para el material de vidrio y de metal. Estos objetos se someten a una temperatura de 170°C durante al

menos 90', envueltos en papel o aluminio.

2 . Calor húmedo. Se utiliza para soluciones acuosas y plásticos. Este material se somete a una temperatura de

120°C durante 20' en una atmósfera de vapor de agua a elevada presión, que evita la ebullición. Se consigue en el

autoclave.

3 . Filtración. Para esterilizar soluciones termolábiles, a las que se hace pasar a través de un filtro con un tamaño de

poro que permite el paso de la solución, pero no de los microorganismos.

4 . Esterilización química. para esterilizar material (generalmente algunos tipos de plástico) que son termolábiles.

Se utilizan sustancias como el óxido de etileno, que se eliminan una vez finalizado el proceso de esterilización.

5 . Radiación. La radiación UV o las radiaciones α o γ pueden utilizarse para esterilizar habitaciones o algunos

plásticos.

Para poder estudiar los microorganismos en el laboratorio el microbiólogo también debe contar con medios de

cultivo que posean los nutrientes necesarios para el crecimiento de los mismos. Si los nutrientes están en forma de solución

acuosa hablamos de medios de cultivo líquidos, mientras que si añaden solidificantes, como la gelatina o el agar (2-3%),

obtenemos medios de cultivo sólidos. A veces se utilizan medios de cultivo semisólidos , si la concentración de agar es

0,6-1,5%. Los medios de cultivo se esterilizan mediante calor húmedo.

Para aislar un microorganismo de una mezcla de varios y obtener un cultivo puro del mismo, la técnica más utilizada

es la de siembra por estría en placa Petri, con medio de cultivo sólido, que permite obtener colonias separadas de

individuos que proceden por división de una única célula. Estas colonias nos sirven para iniciar un cultivo a gran escala. Otra

técnica consiste en obtener una suspensión de la mezcla de microorganismos y hacer diluciones seriadas que se vierten en

una placa Petri hasta conseguir colonias aisladas.

Una vez que se ha obtenido un cultivo puro, se puede mantener haciendo resiembras en tubos de agar inclinado o bien

congelando las células en glicerol (10-30%) a -70°C , en Nitrógeno líquido a -173°C, o mediante l iofil ización .

PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA

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EL MICROSCOPIO

El microscopio es el instrumento más necesario para un microbiólogo, ya que permite la observación de organismos que

no pueden ser apreciados en detalle a simple vista, es decir de los microorganismos. Existe una gran variedad de

microscopios que, según la fuente de iluminación utilizada, se agrupan en:

• Microscopios ópticos: La fuente de iluminación es la luz.

a. De campo claro. Permiten la observación de preparaciones, en su color natural o contrastadas mediante tinciones,

resaltadas sobre un fondo más brillante.

b. De campo oscuro. Permiten la observación de formas celulares que destacan brillantes sobre un fondo oscuro.

Este efecto se consigue utilizando diafragmas especiales.

c. De contraste de fases. Gracias a la utilización de diafragmas y objetivos especiales, que consiguen aumentar las

diferencias en el índice de refracción de las células y el medio que las rodea, permiten la observación de células vivas,

ya que no es necesario realizar ninguna tinción de las mismas.

d. De interferencia. Permiten observar células vivas sin teñir, obteniéndose una imagen en relieve de las mismas.

e. De fluorescencia. La fuente de iluminación proporciona luz ultravioleta que excita ciertas moléculas presentes en

las células (bien de forma natural o añadidas a la preparación) que emiten fluorescencia en el espectro visible.

• Microscopios electrónicos: La fuente de iluminación es un chorro de electrones y las lentes son

electroimanes.

a. De transmisión. Permiten la observación de muestras teñidas con sustancias que son resistentes al paso de

electrones y cortadas dando lugar a láminas finas, denominadas cortes finos. Los electrones no son visibles

directamente por lo que éstos se envían a una pantalla que emite fluorescencia más o menos intensa según el número

de electrones que inciden en ella. Las estructuras celulares que se tiñan más intensamente impedirán el paso de

electrones y por lo tanto no permitirán la emisión de fluorescencia, por lo que estas estructuras aparecerán oscuras en

un fondo más brillante. Se consiguen entre 10.000 y 100.000 aumentos.

b. De barrido. Permiten la observación de células enteras, sin necesidad de cortes finos, de modo que aparecen los

relieves originales y las superficies externas. Alcanzan entre 1.000 y 10.000 aumentos.

Durante las prácticas se empleará el microscopio óptico de campo claro, cuyos componentes fundamentales (mecánicos,

de iluminación y ópticos) se muestran en la Figura 1. La capacidad de un microscopio para observar diferentes estructuras se

refleja en el número de aumentos y en el límite de resolución (LR).

El número de aumentos de un microscopio resulta de multiplicar los aumentos que proporciona cada una de las lentes

presentes entre la fuente de iluminación y el ojo.

El límite de resolución (LR) se define como la distancia mínima a la que se deben encontrar dos puntos para que

puedan observarse como distintos. El microscopio es mejor cuanto menor sea el LR del mismo. El LR viene definido por

la fórmula:

LR = / 2nsen: Longitud de onda de la fuente de iluminación.

2nsen : Este valor se denomina apertura numérica y viene definido por dos valores:

2sen es un número que viene determinado por la construcción del microscopio y no se puede variar.

n es el índice de refracción del medio.


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Por lo tanto si queremos mejorar la capacidad de observación de un microscopio dado debemos incrementar el

número de aumentos y disminuir el límite de resolución (LR). Para conseguir lo primero, casi todos los

microscopios disponen de varias lentes que se pueden cambiar según el tamaño de la muestra a observar. Para disminuir el LR

podemos utilizar una fuente con menor longitud de onda (el caso extremo es el de los microscopios electrónicos) o bien

aumentar n, para lo que podemos intercalar entre la preparación y el objetivo un medio más denso que el aire. Normalmente se

utiliza aceite de inmersion. Es importante recordar que no todos los objetivos son impermeables al aceite, sólo si lo son

puede utilizarse este producto. En los microscopios que se utilizarán en las prácticas, ¡¡sólo puede utilizarse el aceite de

inmersión con el objetivo de 100 aumentos!! .

Figura 1. ESQUEMA DEL MICROSCOPIO


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Oculares

Objet ivos

Pletina móvil

Tornillos de enfoque

Condensador

FiltrosDiafragma

Fuente de iluminación

Soporte

OBSERVACION MICROSCOPICA

Para observar una muestra al microscopio óptico podemos recurrirá a:

a. Preparación húmeda. Se realiza colocando una gota de la suspensión de microorganismos entre un porta y un

cubreobjetos. Se observa directamente.

b. Preparación fijada. Se coloca una suspensión homogénea de microorganismos en una gota de agua sobre el

portaobjetos y se fija (mediante calor o agentes químicos) y después se tiñen mediante diferentes técnicas. Estas

preparaciones se observan sin cubreobjetos y, habitualmente, con objetivos de inmersión.

TINCIONES

Son técnicas que permiten observar microorganismos en función de la capacidad de los mismos para retener (o no)

determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la célula y del colorante. Estos colorantes pueden ser de

distintos tipos:

a. Catiónicos. Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las células y las tiñen.

Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina.

b. Aniónicos. Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tiñen las células, sino el

entorno. En este caso se habla de tinción negativa. Ejemplos: Eosina, Nigrosina.

c. Liposolubles. Se mezclan con los lípidos celulares y los tiñen. Ejemplo: Negro sudán.

Por otro lado las tinciones pueden realizarse siguiendo distintos métodos.

• Simples . Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las células tienen una composición química

diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. El

colorante tiñe las células (Azul de metileno, Safranina) o no (Nigrosina).

• Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen distinta composición química, y

por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tinción, lo que permite clasificar los microorganismos en

diferentes grupos, según su capacidad de tinción. En este apartado están dos tinciones de importancia taxonómica

y médica: la tinción de Gram y la de ácido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas tinciones utilizan más de

un colorante.

• Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composición química, de

modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes. Ej; tinción de esporas, de flagelos, de paredes celulares,

de corpúsculos metacromáticos. Pueden utilizarse uno o más colorantes.


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Práctica 1.

AISLAMIENTO Y RESIEMBRA DE MICROORGANISMOS.MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO.TINCIONES.

INTRODUCCIÓN

En esta práctica se va a proceder al aislamiento de microorganismos mediante estría en medio sólido y a la

resiembra de diversos microorganismos en tubos de agar inclinado. Por otro lado se aprenderá a manejar el microscopio

óptico de campo claro y se realizarán preparaciones húmedas de suspensiones de microorganismos y tinciones que

nos permitirán observar la forma y tamaño de distintos microorganismos, así como algunas estructuras especiales (esporas en

Bacillus y corpúsculos metacromáticos en Lactobacillus). También realizaremos tinciones diferenciales que nos

permitirán clasificar microorganismos en distintos grupos (tinción de Gram y de ácido-alcohol resistencia).

MATERIALESAsa de siembra, placas de medio sólido y tubos de agar inclinado (Agar Común: 0,8% Peptona,

0,3% Extracto de carne, 2% Agar, pH 7,2), mechero de alcohol. Microscopio óptico, portaobjetos,

cubreobjetos, colorantes. Suspensiones de microorganismos. Resiembras de microorganismos:

Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Micrococcus luteus, Serratia

marcescens. Suspensión de yogourt con Lactobacillus. Resiembra de Mycobacterium phlei.

1.AISLAMIENTO.A partir de una suspensión de microorganismos se realizarán estrías sucesivas en placas de medio sólido.

Las placas se incuban luego a 30ºC durante 24 horas.

2.RESIEMBRA.Mediante el asa de siembra se transfieren microorganismos desde unos tubos de agar inclinados con la

muestra a otros estériles. Luego se incuban a 30ºC durante 24 horas.

3.PREPARACION HUMEDA.Con una pipeta Pasteur se coloca una gota de la suspensión de microorganismos en un portaobjetos. Se

coloca un cubreobjetos encima y se observa con el objetivo 40 aumentos.

4.TINCIONES

Tinciones simples

• Azul de metileno (Tinción positiva). Permite teñir el interior celular. Tiñe microorganismos

procarióticos (vivos o muertos). Los eucarióticos sólo se tiñen si están muertos. Algunas estructuras, como los

corpúsculos metacromáticos, se tiñen más intensamente con este colorante que el resto de la célula.


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Procedimiento

1 . Extensión: poner una gota de agua en el portaobjetos y extender en ella la muestra

(Escherichia y Bacillus ) utilizando el asa de siembra.

2 . Fijación: pasar el portaobjetos varias veces por encima de la llama del mechero de

alcohol, sin permitir que llegue a hervir, hasta que se seque.

3 . Añadir Azul de metileno y esperar 2'.

4 . Lavar con agua

5 . Secar.

6 . Observar primero con el objetivo x40; luego se añade aceite de inmersión y se observa

con el objetivo x100.

• Nigrosina (Tinción negativa).Se trata de un colorante aniónico, que no penetra en el interior celular.

Proporciona una visión de la forma y el tamaño celulares al observarse los microorganismos brillantes sobre un

fondo oscuro.

Procedimiento

1 . Colocar una gota de Nigrosina sobre uno de los extremos del portaobjetos.

2 . Extender la muestra (Escherichia y Bacillus) en la gota con el asa de siembra.

3 . Realizar un frotis: con un segundo portaobjetos se extiende la muestra de modo que

cubra toda la superficie del primero.

4 . Secar al aire.

5 . Observar (primero x40 y luego x100 con aceite de inmersión).

Tinciones selectivas

• Tinción de corpúsculos metacromáticos. Vamos a observar los corpúsculos metacromáticos en

células de Lactobacillus, para lo que se toma una muestra de un yogourt con el asa de siembra y se coloca en un

portaobjetos (no es necesario poner agua) y se realiza una tinción con azul de metileno como se ha descrito

anteriormente. En esta preparación se observan dos microorganismos: Lactobacillus, con los corpúsculos

metacromáticos en su interior, y Streptococcus, cuyas células forman cadenas en forma de rosario.

• Tinción de endosporas. Las bacterias de los géneros Bacillus y Clostridium se caracterizan porque forman

endosporas. Las endosporas son formas de resistencia que garantizan la supervivencia de la especie ante

situaciones adversas (agotamiento de nutrientes, cambios de temperatura, acumulación de metabolitos tóxicos...).

Estas estructuras, que contienen una copia completa del genoma, se desarrollan en el interior de la célula

bacteriana, pudiendo alcanzar un diámetro considerablemente mayor que el de la célula. La célula acaba por lisarse

y morir dejando libre a la espora. Las endosporas germinarán cuando las condiciones ambientales vuelvan a ser

favorables. Algunas enfermedades muy conocidas son producidas por especies de los géneros Clostridium: y

Bacillus: C. tetani (tétanos), C. perfringens (gangrena gaseosa), C. botulinum (botulismo), B. anthracis

(antrax).


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Procedimiento

1 . Extensión (Bacillus).

2 . Fijación.

3 . Colocar un papel de filtro sobre la muestra y sujetarlo con una pinza. Empapar el papel

con Verde malaquita y pasarlo por encima de la llama del mechero para que haya emisión de

vapores. Cuando dejen de salir vapores volver a pasar la muestra por encima de la llama,

volviendo a empapar el papel con colorante si es necesario. Repetir hasta 5 minutos.

4 . Retirar el papel y lavar con agua.

5 . Safranina 1 minuto.

6 . Lavar con agua.

7 . Secar.

8 . Observar (x40, x100).

Tinciones diferenciales

• Tinción de Gram. De gran importancia en Microbiología porque permite hacer diferenciaciones

taxonómicas, separando dos grandes grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), según se comporten ante esta tinción.

El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen

una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano

más fina y una capa lipopolisacarídica externa. Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se

efectúa un lavado con etanol que arrastrará al colorante sólo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+)

el colorante queda retenido y las células permanecerán azules. Las células Gram (-) se teñirán después con

un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse.

Procedimiento

1 . Extensión de la muestra (Escherichia y Bacillus).

2 . Fijación.

3 . Cristal violeta 1-2 minutos.

4 . Tirar el exceso de colorante (¡NO lavar con agua!).

5 . Añadir lugol, esperar 1 minuto.

6 . Decolorar con etanol (20 segundos)

7 . Lavar con agua.

8 . Añadir Safranina (colorante de contraste), esperar 1 minuto.

9 . Lavar con agua.

10 . Secar.

11 . Observar (x40, x100).


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• Tinción de ácido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen). Se basa en que ciertos microorganismos no

son desteñidos por una mezcla de ácido y alcohol si han sido previamente teñidos con fucsina fenicada. Se dice

que son microorganismos ácido-alcohol resistentes. Una vez realizada la decoloración con esta mezcla se utiliza

un colorante de contraste (el Azul de metileno) para poder observar las células sensibles a la decoloración por

ácido-alcohol. Son microorganismos ácido-alcohol resistentes las micobacterias, por la específica

composición de su pared celular, y algunos actinomicetos, como Nocardia. Algunos microorganismos

patógenos son ácido-alcohol resistentes: Mycobacterimum tuberculosis (tuberculosis), M. leprae (lepra).

Procedimiento

1 . Extensión (Mycobacterium phlei y Micrococcus luteus).

2 . Fijación.

3 . Fucsina fenicada (con emisión de vapores durante 5 minutos).

4 . Quitar el papel de filtro y lavar abundantemente con agua.

5 . Añadir ácido-alcohol y esperar 30 segundos .

6 . Lavar con agua.

7 . Añadir Azul de metileno (colorante de contraste) y esperar 1-2 minutos.

8 . Lavar con agua.

9 . Secar.

10 . Observar (x40, x100).

Peptidoglicano

Gram(+)

Membrana Plasmática


Peptidoglicano

Espacio periplásmicoLipopolisacáridoy Proteína

Gram(-)


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Membranaexterna Gram(-)

EspacioPeriplásmico

Polisacárido O

Núcleo Polisacarídico

Proteína

Porina

Lípido A

Lipopolisacárido(LPS)

8 nm


Peptidoglicano

LipoproteínaFosfolípido

Interior

Exterior

Gram (-)

Gram (+)Proteína asociadaa la pared

Acidos Teicoicos

Acidos Lipoteicoicos

MembranaPlasmática

Peptidoglicano

Práctica 2.

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL AGUA

INTRODUCCIÓN

En el agua pueden encontrarse una gran variedad de microorganismos, los cuales afectan en mayor o menor medida a la

potabilidad del agua y a sus características organolépticas. Además de la flora normal (Bacillus, Pseudomonas, etc.), en el agua

pueden existir microorganismos contaminantes. Una de las fuentes principales de contaminación son las aguas residuales

que contienen heces que pueden ser vehículo de transmisión de patógenos.

Aparte del problema de transmisión de enfermedades, la contaminación del agua también acarrea otras consecuencias.

Por ejemplo, la degradación biológica por los microorganismos de grandes cantidades de residuos orgánicos vertidos al agua

hace disminuir rápidamente el oxígeno existente, creando un ambiente desprovisto de toda forma de vida que no sea anaeróbica:

mueren los peces, disminuye la vida vegetal y se produce el hedor característico debido a las actividades de los microorganismos

anaerobios.

OBJETIVO

El objetivo más importante de estos análisis es determinar si el agua está contaminada por heces humanas o de

otros animales.

ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO

La calidad del agua se determina principalmente por análisis bacteriológicos. Las pruebas que se realizan son:

1 . Recuento de aerobios totales

2 . Colimetría

3 . Estreptometría

4 . Clostridiometría

Estos ensayos siguen en líneas generales la normativa vigente (BOE 20 de Septiembre de 1.990).

MATERIALESMuestra de agua ( unos 100 ml). Medios de cultivo: Placas de YED (4), tubos de medio Caldo

Lactobiliado (3 EC concentrado y 6 EC simple), tubos de medio Caldo Azida de Rothe (3 AR

concentrado, 6 AR simple), medio Wilson Blair (1 tubo de agar WB fundido), placa de medio

Eosina Azul de Metileno (EMB). Tubos con 1 ml de agua estéril para diluciones. 1 tubo de vidrio

estéril. Pipetas estériles (de 1 y 10 ml). Parafilm™. Baño @80oC. Baño @60oC. Estufa

incubadora @37oC. Tabla estadística de “Número Más Probable” (NMP). Asa de vidrio, mechero


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de alcohol, alcohol de quemar.

1.Bacterias aerobias totales

Las bacterias que vamos a identificar en este ensayo son bacterias heterótrofas, aerobias y

anaerobias facultativas, mesófilas , capaces de crecer en un medio rico (YED). El ensayo se basa en

contar el nº de colonias capaces de crecer en una placa de medio rico, en la que se ha sembrado un volumen de

agua conocido, transcurrido un determinado tiempo de incubación a 37 °C. Este ensayo sólo nos indica la cantidad

de microorganismos de este tipo que hay en la muestra de agua, pero NO IDENTIFICA microorganismos

concretos. Al incubar a 37°C se seleccionan bacterias de origen fecal (adaptadas a vivir en el interior del cuerpo

de los animales). Si se hiciera el mismo ensayo a 22 °C nos daría una idea de la flora autóctona.

Procedimiento

1 . Sembrar 0,2 ml de la muestra original y 0,2 ml de las siguientes diluciones: 1/2, 1/4 y

1/8, en placas de YED.

2 . Incubar las placas a 37 °C durante 24 horas.

Resultados: Contar el número de colonias existentes en cada placa, seleccionar la placa que contenga entre 30

y 300 colonias para la realización de los cálculos. El resultado se expresa como microorganismos por ml de agua.

¡Hay que tener en cuenta las diluciones!.

2.Bacterias coliformes (Colimetría)

Son bacterias de morfología bacilar, Gram (-), aerobias o anaerobias facultativas, oxidasa

negativas, no esporógenas y capaces de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas a 37

°C en un tiempo máximo de 48 horas. Las bacterias coliformes de origen fecal se incluyen dentro de las

bacterias entéricas o "enterobacterias" y se caracterizan por habitar el tracto gastrointestinal del hombre

y otros animales. Este grupo incluye los géneros: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter. Las

heces pueden ser vehículos de transmisión de otras bacterias coliformes que son patógenas como Salmonella y

Shigella, algunas de cuyas especies causan infecciones intestinales como la fiebre tifoidea y la disentería bacilar.

Ya que los microorganismos patógenos son muy sensibles y se encuentran en bajas concentraciones se toma

como indicador de contaminación fecal la presencia en las aguas de los géneros arriba indicados y principalmente

de Escherichia coli. Se realizan dos pruebas, presuntiva y confirmativa; el ensayo se considera positivo si

dan positivas ambas pruebas.

Prueba presuntiva: El agua problema se siembra en el medio denominado caldo lactobiliado (EC),

que permite el enriquecimiento e identificación de bacterias coliformes. La lactosa existente es fermentada

produciendo ácido y gas que se detecta en la campana de Durham. La bilis inhibe el crecimiento de cocos Gram +

y bacilos formadores de endosporas y no inhibe a los bacilos entéricos Gram(-). Es un medio de

enriquecimiento y selectivo .


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Procedimiento

1 . Sembrar 10 ml de la muestra en 3 tubos con 10 ml de caldo lactobiliado concentrado

(ECC) con campana de Durham.

2 . Sembrar 1 ml de la muestra en 3 tubos con 10 ml de caldo lactobiliado simple (EC) con

campana de Durham.

3 . Sembrar 0,1 ml de la muestra en 3 tubos con 10 ml de caldo lactobiliado simple (EC)

con campana de Durham.

4 . Incubar a 37°C durante 22-26 horas.

Resultados: se consideran "tubos gas +" aquellos en los que aparece enturbiamiento y acumulación de

gas en la campana. Los "tubos gas -" se incuban otras 24 h. La interpretación se realiza según la tabla de

“número más probable” (NMP) adjunta. Esta tabla indica el número más probable de microorganismos presentes

en 100 ml de agua (NMP), teniendo en cuenta los tubos en que hay crecimiento así como las diluciones y

aplicando métodos estadísticos.

Prueba confirmativa:Procedimiento

1 . Siembra en estría en placas de EMB (medio selectivo y diferencial para coliformes) a

partir de "tubos gas+".

2 . Incubar a 37°C durante 24 h.

Resultados: En este medio los microorganismos fermentadores de lactosa forman colonias características

opacas y pigmentadas en rosa, azul o violeta con o sin brillo metálico (por ejemplo, E. coli forma colonias de

color verde-violeta oscuro metálico características sobre este medio). La prueba es + si aparecen este tipo de

colonias fermentadoras de lactosa. Una prueba confirmativa de la presencia de E. coli es sembrar los

microorganismos que han crecido en caldo lactobiliado a 37°C en este mismo medio pero incubando a 44°C. E.

coli es capaz de fermentar la lactosa en estas condiciones.

3.Estreptococos fecales (Estreptometría)

Son cocos Gram (+), anaerobios aerotolerantes, catalasa negativos y fermentadores de

glucosa con producción de ácido láctico a 37°C en un tiempo máximo de 48 h. Este grupo comprende

especies como Streptococcus faecalis, S. faecium, S. bovis y S. equinus. Los estreptococos fecales son

residentes normales del intestino del hombre y animales y reciben la denominación general de enterococos. El

ensayo incluye prueba presuntiva y confirmativa y se considera positivo si ambas pruebas son positivas.

Prueba presuntiva: El ensayo se basa en saber si existen microorganismos capaces de crecer a 37 °C en un

medio líquido glucosado con agentes inhibidores selectivos. El medio utilizado, denominado caldo azida de


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Rothe (AR) es un medio selectivo que contiene azida que inhibe la cadena de transporte de electrones del

metabolismo respiratorio de los microorganismos. Los estreptococos y otros microorganismos poseen un

metabolismo fermentativo y carecen de cadena de transporte de electrones por lo que no se ven afectados por la

azida.

Procedimiento

1 . Sembrar de la misma forma que en bacterias coliformes en medio selectivo para

estreptococos, caldo azida de Rothe (3 tubos ARC, 6 tubos AR) .

2 . Incubar a 37°C durante 24 h.

Resultados: Se consideran "tubos +" aquellos en que existe enturbiamiento y/o sedimento. Interpretación

según la tabla NMP (microorganismos/100 ml de agua)

Prueba confirmativa: Se trata de realizar una tinción de Gram del sedimento presente en los tubos con

objeto de reconocer al microscopio los estreptococos, que se observarán como cadenas de cocos Gram (+).

4.Clostridios sulfito-reductores (Clostridiometría)

Son bacterias de morfología bacilar, Gram(+), anaerobios estrictos, capaces de formar

esporas y con actividad sulfito reductora. Algunas especies de Clostridium habitan en el tracto intestinal

de animales, otras en el suelo, etc. El ensayo consiste en contar el número de bacterias anaerobias

formadoras de endosporas con capacidad sulfito reductora en un medio que contiene sulfito sódico y una

sal de hierro, denominado medio Wilson Blair (WB). Estas colonias aparecen de color negro debido a la

formación de sulfuro ferroso por reducción del sulfito.

Procedimiento

1 . Fundir previamente el medio Wilson-Blair (WB) y mantener en baño a 60 °C.

2 . Calentar la muestra de agua (10 ml que se echan en un tubo estéril) durante 10

minutos a 80 °C, para matar formas vegetativas e inducir la esporulación. Enfriar en el

grifo.

3 . Tapar bien el tubo con Parafilm™. Mezclar suavemente.

4 . Incubar a 37°C durante 24-48 horas.

Resultados: Contar el nº de colonias negras existentes en la totalidad del tubo (sin tener en cuenta las

colonias puntiformes). El resultado se expresa como nº de clostridios existentes en el volumen de agua sembrada.

(Ver normas vigentes).

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

El agua se considera potable si los valores obtenidos en los ensayos están dentro de los límites establecidos por la ley.

Las normas legales vigentes exigen:

• Aerobios totales: No existe límite legal pero los valores máximos recomendados son:

Aerobios a 37°C: 10 /ml. Aerobios a 22°C: 100 por ml.

• Coliformes: Coliformes totales: < 1 / 100ml. Coliformes fecales: < 1 / 100ml.


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• Estreptococos fecales: < 1 / 100ml.

• Clostridios sulfito reductores: < 1 / 20 ml.

COMPOSICIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS

Caldo lactobiliado (EC) Medio rico (YED)Biotona 20,0 g/l Extracto de levadura 10 g/lLactosa 5,0 g/l Glucosa 20 g/lFosfato de potasio 5,5 g/l Agar 20 g/lCloruro de sodio 5,0 g/lSales biliares 1,5 g/l

Caldo azida de Rothe (AR) Medio eosina-azul de metileno (EMB)Peptocomplex 15,0 g/l Eosina 0,4 g/lExtracto de carne 4,5 g/l Azul de metileno 0,065 g/lGlucosa 7,5 g/l Lactosa 5,0 g/lCloruro de sodio 7,5 g/l Peptona 10,0 g/lAzida sódica 0,2 g/l Fosfato de potasio 2,0 g/l

Sacarosa 5,0 g/lMedio Wilson Blair (WB) Agar 13,5 g/lPeptona 10,0 g/lSulfito sódico 0,5 g/lCitrato férrico 0,5 g/lAgar 15,0 g/l


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AerobiosTotales Presuntiva Confirmativa Presuntiva Confirmativa Clostridiometría Conclusión

Colimetría Estreptometría

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

Muestra 4

Control

Control


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Práctica 3.

DETERMINACIÓN DE ENTEROBACTERIAS

INTRODUCCIÓN

En esta práctica tratamos de simular un aislamiento de microorganismos a partir de una muestra (heces, agua o

alimentos contaminados...), para identificarlos posteriormente mediante un conjunto de pruebas. Concretamente, vamos a

realizar la determinación de bacterias pertenecientes al grupo de bacilos Gram (-) anaerobios facultativos, en el que se

incluyen las enterobacterias. Muchas de ellas forman parte de la flora normal del tracto digestivo del hombre pudiendo

producir enfermedades en determinadas circunstancias. Otros como Salmonella o Vibrio pueden causar enfermedades por la

ingestión de alimentos o agua contaminados. De ahí la necesidad de desarrollar pruebas que permitan aislar e identificar

rápidamente estos microorganismos.

IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

La correcta detección e identificación de los microorganismos presentes en muestras clínicas o de otros orígenes es

imprescindible para determinar el origen de las infecciones, seguir el curso de las enfermedades y decidir los tratamientos a

aplicar. Todos los puntos del proceso son importantes, desde la forma de tomar y mantener las muestras hasta su manipulación

en el laboratorio.

Se puede decir que en el proceso de identificación de microorganismos se ponen en juego todos los conocimientos

acumulados en Microbiología. La identificación de bacterias puede basarse en muchos caracteres: morfológicos, fisiológicos,

bioquímicos, de tipo serológico y de patogenicidad.

Morfológía celular: • Forma (bacilos, cocos) y agrupamiento (diplococos, racimos, rosarios).

• Tinción (Gram, ácido-alcohol resistentes...)

• Estructuras especiales: flagelos, endosporas

Morfológía de las colonias:

• Forma, color, consistencia, borde, sección...

Fisiología:

• Aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos

• Temperatura óptima de crecimiento

• Movilidad

Bioquímica:

• Presencia o ausencia de una enzima o de toda una ruta metabólica.

• Fermentación de carbohidratos

• Utilización de citratos como única fuente de carbono


- 16 -

Actualmente existen kits que agrupan muchas pruebas fisiológicas y bioquímicas en un formato sencillo y que produce

resultados rápidos. No obstante, todavía muchas pruebas requieren el empleo de métodos de cultivo tradicionales, selectivos,

diferenciales y de enriquecimiento.

GRUPO DE BACTERIAS GRAM (-) ANAEROBIAS FACULTATIVAS

Son bacilos o cocobacilos , pueden crecer en presencia o en ausencia de O2 son pues anaerobios facultativos.

En anaerobiosis obtienen la energía por fermentación. En este grupo se incluyen las familias Enterobacteriaceae y

Vibrionaceae.

FAMILIA Enterobacteriaceae

• Forma: bacilos, cocobacilos

• Movilidad: inmóviles o móviles por flagelos peritricos

• Catalasa (+)

• Oxidasa (-)

La mayoría de enterobacteriáceas pueden fermentar glucosa y otros azúcares. La capacidad o no para fermentar algunos

sustratos se utiliza para la identificación de las distintas especies. Por ejemplo, Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter

fermentan la lactosa, mientras que Salmonella, Shigella, Proteus no fermentan la lactosa.

FAMILIA Vibrionaceae

• Forma: bacilos ligeramente curvados.

• Movilidad: móviles por flagelos polares

• Catalasa (+)

• Oxidasa (+)

Las vibrionáceas crecen bien en medio alcalino. La mayoría son inofensivas y se encuentran en ambientes acuáticos.

Algunos son patógenos, como Vibrio cholerae que es el agente causal del cólera.

PROCESO EXPERIMENTAL

La práctica consistirá en la simulación del aislamiento e identificación de enterobacterias a partir de una muestra.

1. AISLAMIENTO

Para el aislamiento se utilizan medios que son selectivos para determinadas bacterias, donde podremos ver

la morfología, color y otras características de los distintos tipos de microorganismos presentes en la muestra.

Cada grupo de alumnos tiene una suspensión que contiene una mezcla de microorganismos (mezcla A o B). Se

llevarán a cabo inoculaciones en placas de medios sólidos (YED, Verde Brillante, EMB, TCBS) y en

medio líquido (Peptona alcalina), empleando las mezclas A o B.


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Procedimiento

1.1.- Cultivos en placas• Tomar una muestra de la suspensión microbiana con un asa de siembra estéril y sembrar

por estría los siguientes medios, con el fin de obtener colonias bien aisladas: 1 placa

de YED, 1 placa de Verde Brillante, 1 placa de EMB, 1 placa de TCBS.

• Incubar a 24 h a 37 °C. Observar la morfología de las colonias y determinar cuantos

microorganismos distintos hay en cada mezcla.

1.2.- Cultivos en medio líquido• Añadir con una pipeta Pasteur estéril varias gotas de la suspensión bacteriana en un tubo

de peptona alcalina.

• Incubar a 37 °C y observar la presencia o no de crecimiento bacteriano.

Características de los medios empleados

• Medio YED.

Es un medio complejo que lleva:

Extracto de levadura 10g/l

Glucosa 20 g/l

No es un medio selectivo, por lo tanto permite el crecimiento de muchos microorganismos.

• Medio EMB (Eosina-azul de metileno).

Es un medio complejo que lleva:

Lactosa 5 g/l

Sacarosa 5 g/l

Peptona 10 g/l

Difosfato potásico 2 g/l

Eosina (indicador de pH, cambia de incoloro a negro a pH ácido) 0,4 g/l

Azul de metileno (inhibe el crecimiento de bacterias Gram +) 0,065 g/l

pH 7,2.

Es un medio selectivo de enterobacterias. También es un medio diferencial ya que nos permite saber

por la morfología de la colonia si los microorganismos que crecen fermentan lactosa o sacarosa. Si las

bacterias fermentan lactosa o sacarosa, acidifican el medio y la eosina vira a negro dando lugar a la

aparición de colonias coloreadas. Las bacterias que no fermentan ni lactosa ni sacarosa originan colonias

incoloras.


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• Medio Agar Verde Brillante.

Es un medio complejo que consta de:

Lactosa 10 g/l

Sacarosa 10 g/l

Peptona 10 g/l

Extracto de levadura 3 g/l

NaCl 5 g/l

Rojo de fenol (indicador de pH) 0,08 g/l

Verde Brillante (colorante que inhibe el crecimiento de muchas bacterias) 0,0125 g/l

pH 6,9.

Está indicado para el aislamiento de Salmonella (no para S. typhi). Es un medio casi selectivo

puesto que Salmonella puede crecer mientras que otras bacterias son inhibidas por la presencia del

colorante verde brillante. Las colonias de Salmonella son blanco-rosáceas, con un halo rojo brillante. Si

crecen microorganismos fermentadores de lactosa o sacarosa dan colonias amarillo-verdosas con un halo

del mismo color pero más intenso. Algunas cepas de Proteus forman colonias rojas.

• Medio Agar TCBS.

El medio contiene:

Tiosulfato Sódico 10 g/l Extracto de levadura 5 g/l

Citrato férrico 1 g/l Citrato sódico 10 g/l

Bilis de vaca 5 g/l Peptonas 10 g/l

Sacarosa 20 g/l Azul de Timol 0,04 g/l

Azul de Bromotimol0,04 g/l

pH 8,6.

Es un medio utilizado para el cultivo y aislamiento selectivo de Vibrio cholerae y otros vibrios

enteropatógenos. Las colonias de Vibrio son grandes, de color amarillo o azul. Este medio inhibe

selectivamente enterobacterias, aunque algunas pueden crecer dando pequeñas colonias.

• Medio Peptona Alcalina.

Este medio contiene:

Peptona 10 g/l

NaCl 5 g/l

pH 9.

Por su pH alcalino sólo permite el crecimiento de Vibrio. Es un medio líquido, lo que se

observa es la existencia de crecimiento por turbidez del medio.

2. IDENTIFICACIÓN

Las siguientes pruebas se deben realizar con los distintos microorganismos obtenidos en los aislamientos

en placa. Se llevarán a cabo 5 pruebas individuales: Tinción de Gram, Prueba de la oxidasa, Test

de la Catalasa, Prueba de Kligler y Manita-movilidad. Además se llevará a cabo una prueba


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compuesta por varias reacciones bioquímicas, el API20E.

2.1 Tinción de Gram. La tinción de Gram es una tinción diferencial que nos permite clasificar las

bacterias en Gram(+) o Gram(-) según las características de su pared celular. Además permitirá observar la

morfología de los microorganismos aislados.

Procedimiento

• Realizar la tinción de Gram siguiendo el protocolo utilizado en la primera práctica.

• Fijarse bien en la morfología de las células.

2.2 Prueba de la Oxidasa. Se trata de determinar si un microorganismo posee citocromo c-

oxidasa. Para ello se utiliza un compuesto orgánico que puede ser reducido por el sistema citocromo-

oxidasa/citocromo c en presencia de oxígeno molecular, originando un producto coloreado fácilmente apreciable.

1-naftol + dimetilparafenilendiamina ---Oxidasa---> azul de indofenol

Procedimiento

• Tomar con el asa de siembra una colonia de la placa de EMB o TCBS (o bien hacer una

suspensión de una colonia en agua).

• Poner la colonia sobre la tira de papel en la zona que contiene el sustrato y extenderla

cuidadosamente con el asa de siembra.

• Esperar 20-60 segundos y observar si existe algún cambio en la coloración.

Resultado: Si la tira se pone de color azul oscuro, el microorganismo es oxidasa positivo.

2.3 Test de la Catalasa. Algunas bacterias poseen catalasa, una enzima capaz de destruir el agua

oxigenada generada en algunos procesos metabólicos. Esta enzima está presente en la mayoría de las bacterias que

contienen citocromos, bien aerobias o anaerobias facultativas.

2H2O2 ---Catalasa---> 2H2O + O2

Procedimiento

• Coger con cuidado una colonia con el asa de siembra (evitar coger agar).

• Poner la colonia directamente sobre un portaobjetos sin añadir agua.

• Echar sobre la colonia una gota de agua oxigenada pura o al 30 %.

• Observar si se forman burbujas de oxígeno.

Resultado: La aparición de burbujas indica que el microorganismo es catalasa positivo.

2.4 Test de Kligler. En este test se utiliza el medio de cultivo KIA ("Agar Hierro de Kligler") y

proporciona varios datos fisiológicos importantes para determinar si un microorganismo es: fermentador de


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glucosa , fermentador de lactosa, productor de gas, productor de ácido sulfhídrico. Es un medio

que requiere un procedimiento de inoculación especial.

Procedimiento

• Inocular los microorganismos aislados en un tubo de medio KIA con el asa de siembra.

La siembra se hará de la siguiente manera: sembrar la superficie por estría y sembrar

la parte interna del medio por picadura (es necesario pinchar suficientemente, sobre

todo para la detección de producción de sulfhídrico.

• Incubar 18-24 h a 37°C. Observar e interpretar los cambios producidos en el medio.

Características del medio KIA

La composición de este medio de cultivo es la siguiente:

Lactosa (1%)

Glucosa (0,1%),

Tiosulfato sódico

Rojo de fenol (indicador de pH)

Peptona

Cationes de metales pesados (Fe2+).

En él se obtiene la siguiente información fisiológica.

• Fermentación de glucosa y lactosa. El medio contiene una pequeña cantidad de

glucosa y una gran cantidad de lactosa. Los microorganismo capaces de fermentar cualquiera

de estos compuestos darán lugar a la formación de ácidos que bajan el pH del medio. Como

consecuencia el rojo fenol vira a amarillo. La sucesión de eventos metabólicos es la

siguiente (ver dibujo):

1. El microorganismo utiliza la fuente de carbono más asequible en el medio, la

glucosa . Pero como se encuentra en el medio en muy baja concentración se agota

rápidamente. Los productos de su degradación acidifican el medio que cambia de rojo

a amarillo.

2. Al agotarse la glucosa empieza a utilizar las peptonas, pero sólamente en

aerobiosis (se corresponde a la zona de la lengüeta del tubo). Este consumo da

lugar a residuos amoniacales, produciendo una basificación del medio. El indicador

vira a rojo en esta parte del tubo.

3. Posteriormente se produce el consumo de lactosa, en el caso de los


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microorganismos que sean capaces de utilizar este disacárido. Esto da lugar a un

descenso de pH por lo que cambiará el medio de rojo a amarillo.

La razón de que la lactosa se utilice después es debido al tipo de regulación de la ß-

galactosidasa, que es la enzima que hidroliza este disacárido para dar los correspondientes

monosacáridos. Se trata de una enzima inducible, lo que significa que existe un periodo de

latencia entre el agotamiento de la glucosa y la producción de las primeras moléculas de ß-

galactosidasa, de tal forma que después de un tiempo de consumo de peptonas se comienza a

utilizar lactosa.

• Producción de gas. La producción de gas se detecta por la formación en el medio de

burbujas de gas perfectamente visibles ya que cuartean el medio. El gas se origina mediante

la reacción catalizada por la formiato liasa a partir de ácido fórmico.

H-COOH --------formiato liasa-----> CO2 + H2

Por tanto, son “gas (+)” aquellos microorganismos que produzcan esta enzima.

• Producción de SH2. Algunas bacterias son capaces de llevar a cabo la siguiente reacción

a partir del tiosulfato añadido al medio:

2S2O32- + 4e- + 4 H+ -----tiosulfato reductasa-------> 2 SO32+ + 2 SH2

El ácido sulfhídrico se detecta porque reacciona con las sales de metales pesados (Fe2+)

presentes en el medio. Esto da lugar a la formación de sulfuro de hierro que se deposita

en gran parte del tubo, sobre todo en el fondo, oscureciendo el medio.

2.5 Manita-Movilidad. Se utiliza un medio semisólido para detectar la movilidad de las bacterias. Este

medio contiene manitol como fuente de carbono. Si el microorganismo es capaz de usar el manitol se produce

una acidificación del medio, lo que da lugar a un viraje del indicador de pH de rojo a amarillo.


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6 h 10 h24 h

Rojo Amarillo

Rojo

Amarillo

Rojo

Amarillo

Amarillo

Lac +Glc +

Lac -Glc +

Procedimiento

• Inocular por picadura un tubo de medio semisólido con cada uno de los distintos

microorganismos aislados.

• Incubar 18-24 horas a 37°C.

• Observar la zona de crecimiento del microorganismo y si ha habido cambio en la

coloración del medio.

Resultado: El test de la movilidad se hace mirando el desplazamiento del microorganismo. Si el crecimiento

se limita a la zona de la picadura, el microorganismo no es móvil. Si el crecimiento se produce por

todo el medio, el microorganismo es móvi l .

2.6 Batería de pruebas API20E.

La batería de pruebas API20E es un sistema de identificación rápida para bacterias de la familia

Enterobac ter iaceae y otras bacterias Gram(-). Básicamente consta de 23 tests bioquímicos estandarizados

y miniaturizados y una base de datos. Este sistema presenta las ventajas de ser rápido, eficaz y de permitir realizar

numerosas pruebas a la vez. Cada tira de API 20E contiene 20 microtubos o pocillos con distintos sustratos

deshidratados. Cada tubo es una prueba bioquímica distinta (ver tabla "sumario de los resultados con API 20E ").

Los microtubos se inoculan con una suspensión de microorganismos, en agua o solución salina, que

rehidrata los medios. Las tiras se incuban a 37°C y por efecto del metabolismo bacteriano se van a producir

cambios de color espontáneos o bien al añadir reactivos.

La lectura de las reacciones se hace mediante comparación con una tabla de lectura donde se indica si los


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Géneros Gas(OFG) SH2 Lac Urea Indol TCBS(1) Halofilia(2) Manita-Movilidad

Escherichia + - + - + + - +

Shigella - - - - - + - -

Salmonella + + - - - + - +

Citrobacter + + + - VAR + - +

Klebsiella + - + + - + - +

Enterobacter + - + + - + - +

Serratia + - + - - + - +

Proteus + + - + VAR + - +

Yersinia - - - VAR - + - +

1. Inhibición del crecimiento de colonias en TCBS

2. Crecimiento en 6% NaCl, prueba de halotolerancia

microorganismos deben considerarse positivos o negativos para cada reacción según el color aparecido.

Procedimiento

• Preparación de inóculo. Tomar una colonia bien aislada de cada microorganismo y

resuspenderla homogéneamente en 5 ml de solución salina (1% de ClNa) o 5 ml de agua

estéril.

• Inoculación de los pocillos. Cada pocillo tiene un tubo y una cúpula (ver dibujo).

Llenar el tubo y la cúpula de los pocillos | CIT | , | VP |, | GEL | con la

suspensión de bacterias.

Llenar los tubos, no la cúpula , de los demás pocillos.

Llenar con parafina las cúpulas de los pocillos ADH, LDC, ODC, URE,

H2S para obtener anaerobiosis.

• Poner la tira en la cámara de incubación. Previamente poner agua en los alveolos

de la cámara para proporcionar una atmósfera húmeda durante la incubación.

• Incubar a 37 °C durante 18-24 h.

Resultados: La lectura de los resultados se lleva a cabo por comparación de los colores de cada pocillo con los

de la tabla de lectura. Para la lectura se tienen en cuenta los siguientes criterios:

Si la glucosa es positiva y/o 3 o más tests son positivos se revelan los test que requieren

reactivos:

VP: Añadir una gota de KOH 40 % y una gota de α-naftol 6% y esperar 10 minutos. Positivo=

color rojo o rosa fuerte.

TDA: Añadir una gota de Cl3Fe 10 %. Positivo=color marrón oscuro.

IND: Añadir una gota de reativo de Kovacs. Positivo= aparece un anillo rojo en los dos

primeros minutos de la reacción.

Si la glucosa da negativo y los tests positivos son 2 o menos de 2, no hay que añadir

reactivos. Cuando ésto ocurre se hacen otros tipos de API como el API OF, el API M o el API 10S para

ver determinados metabolismos especiales.

Identificación: Del conjunto de reacciones y resultados se obtiene un perfil numérico. Los

pocillos están separados en grupos de tres: en total tenemos 7 tripletes (el test número 21 corresponde al test de

la oxidasa). A cada pocillo se le da el valor 0, 1, 2 o 4.

• Si la reacción es negativa se pone 0 .

• Si la reacción es positiva se pone: 1 si es el primer pocillo de un triplete, 2 si es el

segundo, 4 si es el tercero.

• Se suman los valores de cada triplete y se obtiene un código de 7 cifras.

• Con este código se busca en la tabla de identificación la especie de que se trata.


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Práctica 4.

DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO DE UN MICROORGANISMO

INTRODUCCIÓN

El crecimiento microbiano se define como un incremento en el nº de células, es decir, se refiere al

crecimiento de poblaciones. Este viene dado como consecuencia del crecimiento de cada célula individual y su división celular.

El crecimiento de un microorganismo depende de varios factores como:

• El microorganismo en sí. Así por ejemplo, en condiciones óptimas E.coli tiene un ciclo de vida de 15-20

minutos, mientras que Mycobacterium tuberculosis lo tiene de 18 horas.

• La composición del medio de cultivo. Las células crecerán más lentamente en un medio mínimo (MM)

que en un medio rico (MR) con todos los nutrientes. Dependiendo de la fuente de carbono y de la facilidad con que

la asimilen crecerán más o menos rápidamente (por ejemplo, crecen mejor con glucosa (Glc) como fuente de

carbono que con galactosa (Gal).

• Las condiciones de incubación. La temperatura de incubación, la concentración de CO2 en la atmósfera de

cultivo, la agitación, etc... son factores importantes.

• La procedencia y características del inóculo. La curva de crecimiento variará dependiendo de que se

parta de un cultivo estacionario o de uno en crecimiento exponencial, que se pase un cultivo crecido en MM+Glc

a MM+Gal o de MR a MM+Glc.

MEDIDA DEL CRECIMIENTO DE UNA POBLACIÓN MICROBIANA

Existen varios métodos para medir el crecimiento microbiana:

• Métodos directos. Son aquellos en los que se cuenta el nº total de células en un volumen conocido y así se

estima el nº total en la población. Entre ellos:

a. Recuento directo del nº de células al microscopio. Se utilizan portas especialmente diseñados

para el recuento celular y denominados cámaras de recuento. Existen varios tipos de cámaras de recuento,

una de ellas es la cámara Thoma que es la que nosotros utilizaremos. Este método tiene el inconveniente

de que no diferencia entre células viables y no viables. Es poco preciso.

b. Contadores electrónicos. Las células son suspendidas en un fluido conductor que pasa lentamente a

través de una abertura fina por la que pasa una corriente eléctrica. Cada célula que pasa produce un cambio

en la conductividad y estos cambios o pulsos convenientemente amplificados son registrados

electrónicamente dando una medida directa del nº de células en el medio. No diferencia entre células viables

y no viables ni entre células o partículas inertes.

c. Recuento de células viables. Haciendo diluciones apropiadas seguidas de siembra sobre placas Petri

podemos obtener crecimiento de colonias aisladas procedentes cada una de una única célula. Si se


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multiplica por el factor de dilución tendremos el nº de células en cultivo. Sólo detecta viables pero es un

método lento y caro por el elevado número de placas que hay que utilizar para que los resultados sean

significativos.

• Métodos indirectos. Son aquellos que utilizan parámetros distintos del nº de células, pero que pueden

relacionarse de forma directa con éste (masa celular, actividad metabólica, etc..). Ello es posible porque durante el

crecimiento de un cultivo hay un aumento ordenado de todos los constituyentes celulares y así la velocidad de

crecimiento de la población puede estimarse por la velocidad del incremento de cualquiera de estos parámetros.

Entre los métodos indirectos se encuentran:

a. Determinación del peso seco. Se trata de medir la masa celular presente en un cultivo y estimar el

nº de células proporcional a ésta.

b. Determinación del nitrógeno celular. Medir el contenido proteíco del cultivo.

c. Determinación del DNA

d. Determinación de una actividad metabólica según el tipo de microorganismo: consumo de

oxígeno (en aerobios), liberación de CO2 u otro producto de fermentación, aumento de la concentración de

alguna enzima constitutiva, incorporación en la célula de algún material radiactivo, etc.

e. Medida de la turbidez del cultivo. Se basa en la capacidad de las células y partículas en general de

absorber y/o dispersar la luz que incide sobre ellas. Un cultivo celular aparece turbio porque las células

dispersan la luz que atraviesa la suspensión. La turbidez es proporcional al número de células y puede

medirse utilizando un espectrofotómetro. El espectrofotómetro es un aparato que hace pasar la luz a través

de una suspensión celular y detecta la luz no dispersada.

Este instrumento mide la relación de intensidad de luz incidente con la intensidad del rayo

luminoso que sale después de atravesar la muestra. Cuanto mayor sea el nº de células mayor es la turbidez

del cultivo, la densidad óptica (D.O.) y menor la cantidad de luz no dispersada que emerge tras

atravesar la muestra. La D.O. del cultivo es pues proporcional a la densidad celular. Esto es así dentro de

ciertos límites puesto que a elevadas concentraciones pueden formarse agregados celulares o producirse un

efecto "pantalla" de unas células sobre otras. En el caso de S.cerevisiae la relación lineal entre la D.O. y


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Filtroo

Prisma

Muestracon

células

Fotocélula(mide la luz no dispersada)

Registrador

LuzIncidente

Luz no dispersada

el número de células se mantiene hasta un valor de D.O. de aproximadamente 0.4.

DILUCIONES

Con algunos de los métodos mencionados, medida de la turbidez por ejemplo, es necesario en algunos puntos diluir la

muestra. Es conveniente además hacer varias diluciones, generalmente seriadas en base de 10. Así para hacer una dilución de 10

veces se mezclaría 1ml de cultivo con 9ml de diluyente (medio de cultivo o agua). Si hacemos lo mismo con esta dilución

obtendríamos una dilución de 100 veces, si lo hacemos con esta última conseguiríamos una dilución de 1000 veces y así

sucesivamente. De esta forma obtendremos valores más exactos y reales.

CÁLCULO DEL TIEMPO DE GENERACIÓN

El tiempo requerido para que una célula microbiana se divida dando lugar a dos células se denomina tiempo de

generación, G y es pues el tiempo que necesita una población para duplicar el nº de células. Si consideramos que entre un

t iempo inicial , To, y otro f inal , Tf, han transcurrido n generaciones, tenemos que la expresión de G es:

G = (Tf-To)/n (A)

Donde: n = número de generaciones, y viene dado por el número de ciclos de división ocurridos en la

población en un tiempo dado.

Si inicialmente tenemos en el cultivo No células, trás una serie de divisiones tendremos:

después de la primera división No x 21

después de la segunda división No x 22

después de la tercera división No x 23

después de n divisiones No x 2n

Se trata de una progresión geométrica del número 2. Por tanto el número de células final (Nf) será:

Nf = No x 2n (B)

Operando convenientemente (aplicando logaritmos) a partir de esta fórmula obtendremos el valor de nlogNf = log(No x 2n)

logNf = logNo + n log2

n = (logNf - logNo)/log2 (C)

Conocido el valor de n, lo sustituimos en la ecuación (A) y obtenemos el valor de G


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El incremento de una población en el que el número de células se dobla cada cierto periodo de tiempo, el tiempo de

generación, se conoce como crecimiento exponencial y está representado por la ecuación (B), que nos da el nº total de

células a lo largo del tiempo.

Sin embargo, cuando seguimos el crecimiento de una población microbiana, midiendo por ejemplo su D.O. en función

del tiempo, obtenemos su curva de crecimiento, que nos viene dada por una gráfica del tipo:

El incremento en el número de células es lento al principio y después llega a ser de forma exponencial. Esta gráfica es

característica de un cultivo en un recipiente cerrado en el que los nutrientes son limitados. En la curva se distinguen cuatro

fases:

1. Fase de latencia. Fase de adaptación de las células a las nuevas condiciones del medio de incubación al que

han sido transferidas. Las células no crecen inmediatamente sino después de este tiempo de latencia. Las células

son metabólicamente activas, se adaptan al medio y eventualmente lo modifican. Para un mismo inóculo, esta

fase de latencia varia dependiendo del medio al que se transfieren y de las condiciones de incubación.

2. Fase de crecimiento exponencial. Fase en la que las células se están dividiendo regularmente a ritmo

constante. En condiciones apropiadas durante esta fase, el grado de desarrollo es máximo. Es en este periodo

donde puede calcularse el tiempo de generación de un microorganismo.

3. Fase estacionaria. El nº de células no se incrementa más porque los nutrientes del medio se van agotando y

posibles sustancias tóxicas pueden ir acumulándose. No hay incremento neto del nº de células, el nº de células

que se originan es igual al nº de las que mueren.


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Latencia Exponencial Estacionaria

Fases de Crecimiento

Muerte

ViablesTurbidez

(D.O.)

Tiempo

Aritmética

Nº de Células(escala aritmética)

Nº de Células(escala logarítmica)

Tiempo (horas)

Logarítmica

4. Fase de muerte celular. Las células mueren a una velocidad mayor a la que se originan debido al

agotamiento total de los nutrientes y/o excesiva acumulación de sustancias tóxicas. A veces la muerte va

acompañada de lisis celular y ésto disminuye la absorbancia del cultivo.

OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA

• Medir el crecimiento de una población microbiana (S.cereviasiae) utilizando dos métodos distintos:

Medir de la turbidez del cultivo (método indirecto) y

Recuento del nº de células al microscopio (método directo)

• Determinar el tiempo de generación de la población (S.cerevisiae).

MATERIALESMicroorganismo: Saccharomyces cerevisiae. Matraz de 250ml con 75ml de medio YED (extracto

de levadura y glucosa). Pipetas estériles, cámara de recuento (Cámara Thoma), microscopio óptico,

espectrofotómetro. Mecheros de alcohol, incubadores a 28 ºC.

Procedimiento

1. Para la determinación de la curva de crecimiento:

• Inocularemos el matraz que contiene el medio de cultivo con un preinóculo. Mediremos la D.O. a

600nm y comprobaremos que esta D.O. inicial (to) es aproximadamente de 0.05.

• Seguiremos la evolución de la turbidez del cultivo midiendo la D.O. a diferentes tiempos durante unas

12-24 horas. Tomaremos muestras a 0, 6, 9, y 11 hrs. Y en algunos de estos puntos haremos diluciones

para medir la D.O.

• Representaremos en una gráfica los valores de D.O. obtenidos a lo largo del tiempo. La curva obtenida

será la curva de crecimiento del cultivo.

2. Al mismo tiempo haremos una recta patrón usando la cámara de recuento y suspensiones celulares de D.O.

conocida. Utilizando esta curva patrón, calcularemos por extrapolación el nº de células que corresponden a los

valores de D.O. obtenidos en nuestras lecturas al espectrofotómetro y haremos una gráfica del nº de células en

función del tiempo.

• Recuento directo del número de células al microscopio. La cámara de recuento consiste en un

porta modificado con una hendidura de 0.1mm de profundidad. Está dividida en 16 cuadrados y éstos a su

vez divididos en 16 ó 25 celdillas. Cada celdilla tiene una superficie de 0.0025mm2 y una profundidad de

0.1mm. Por tanto el volumen de cada celdilla (Va) es de 0.00025mm3. Como hay 16 celdillas por

cuadrado, el volumen de éste (VA) es de 16 x Va = 0.004mm3. Como 1mm3 = 10-3 ml.

VA = 4 x 10-6 ml (volumen de un cuadrado)

De los cuadrados mayores se cuentan 4 al azar y se calcula la media (X) de células por cuadrado. Si este

nº de células lo dividimos por el volumen del cuadrado tendremos la concentración de células por ml de

medio:

X cel / 4 x 10-6 ml = X x 25 x 104 cel/ml


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Los valores de nº cel/ ml se representan gráficamente frente a su D.O. correspondiente para obtener la

curva patrón.

3. Por último, haremos un cálculo de la G de nuestro cultivo, S. cerevisiae, utilizando dos valores

consecutivos comprendidos dentro de la fase exponencial de crecimiento.


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D.O. (600nm)

Nº Células/ml


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Práctica 5.

ANTIBIÓTICOS

DEFINICIÓN

Los antibióticos son compuestos orgánicos de bajo peso molecular sintetizados por microorganismos, que a bajas

concentraciones inhiben el desarrollo o matan a otros microorganismos.

CARACTERÍSTICAS GENERALES

1. Inhiben el crecimiento (bacteriostáticos) o matan (bactericidas).

2. Son efectivos a bajas concentraciones.

3. Poseen toxicidad selectiva: actúan sobre el patógeno sin afectar al organismo hospedador.

4. Pueden actuar frente a procariotas o eucariotas.

5. Pueden ser de acción muy específica o de amplio espectro.

6. Solubles en agua.

7. Poseen estabilidad química.

8. Son productos del metabolismo secundario.

Es importante tener en cuenta la posibilidad de aparición de resistencia a determinados antibióticos en algunos

microorganismos durante el tratamiento de una infección.

MICROORGANISMOS PRODUCTORESSe encuentran tanto dentro del grupo de procariotas como en el de eucariotas.

A. Procariotas: Bacillus, Streptomyces, Nocardia

B. Eucariotas: Penicillium, Aspergillus, Cephalosporium

CLASIFICACIÓNHay muy diversas clasificaciones:

Según su origen• naturales: sintetizados por microorganismos.

• sintéticos: obtenidos completamente por síntesis química.

• semisintéticos: parte de compuesto sintetizada por microorganismos y otra parte sintetizada químicamente.

Según su estructura química• ß-lactámicos: penicilinas, cefalosporinas.

• macrólidos: eritromicina.

• aminoglucósidos: estreptomicina.


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• polipeptídicos: bacitracina.

• poliénicos: anfotericina B

• tetraciclinas

• derivados del benceno: cloranfenicol.

Según su mecanismo de acción• actúan sobre la pared celular bacteriana inhibiendo su síntesis: penicilinas.

• actúan sobre la membrana celular alterando su permeabilidad.

• inhiben la síntesis proteica.

• inhiben la síntesis de ácidos nucléicos: mitomicina.

OBJETIVOS

Se llevarán a cabo tres pruebas que permiten detectar la producción de antibiótico por unos microorganismos, valorar la

cantidad de antibiótico presente en una solución y determinar qué antibiótico entre varios es más efectivo contra un organismo

testigo.

MATERIALESTubos de YED sólido, baños entre 45 y 50 ºC, placas Petri, discos de papel, pinzas, alcohol,

mecheros, pipetas estériles, regla, papel semilogarítmico de 3 periodos, antibióticos: penicilina G

25, 50, 100 mg/ml y concentración desconocida; bacitracina: 1 mg/ml; cicloheximida: 2 mg/ml;

microorganismos: Streptomyces griseus, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica,

Bacillus subtilis.

1.PRUEBA DE PRODUCCIÓN DE ANTIBIÓTICOS

Mediante un bioensayo en medio sólido podemos determinar si un microorganismo produce algún antibiótico

capaz de inhibir el crecimiento de un organismo de prueba. Para ello se emplearán dos posibles microorganismos productores,

Streptomyces griseus y Yarrowia lipolytica. y un microorganismo sensible, Saccharomyces cerevisiae.

Procedimiento

1 . Tomar un tubo con medio YED sólido fundido y dejar enfriar hasta 45-50 ºC en un baño

a dicha temperatura.

2 . Añadir 1 ml de la suspensión de células de S.cerevisiae (organismo sensible).

3 . Tapar el tubo con Parafilm, invertir varias veces y verter en una placa Petri vacía.

4 . Cuando el medio esté sólido (después de unos 20’) colocar encima 2 tacos de

agar, cada uno con uno de los microorganismos a ensayar.

5 . Poner la placa a 4ºC durante 2 horas para permitir la difusión del antibiótico.

6 . Incubar la placa a 28ºC durante unas 15 horas para permitir el crecimiento del


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microorganismo sensible.

Resultado: Observar la existencia o no de halos de inhibición del crecimiento de Saccharomyces cerevisiae.

2.VALORACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ANTIBIÓTICO

La concentración de un antibiótico en una solución se puede determinar por comparación con el efecto de cantidades

conocidas del mismo antibiótico sobre un microorganismo sensible, Bacillus subtilis. Esta técnica se emplea en los procesos

de mejora de la producción de un determinado antibiótico por la especie productora. El proceso se lleva a cabo mediante

bioensayo en placa sobre un microorganismo sensible. Se valorará la concentración de Penicilina G en una solución frente a

una recta patrón generada con cantidades conocidas del mismo antibiótico.

Procedimiento



2 . Añadir 1 ml de la suspensión de células de B. subtilis (organismo sensible).


4 . Cuando el medio esté sólido (después de unos 20’) colocar encima discos de

papel impregnados en las soluciones que contienen 25, 50 y 100 µg/ml de Penicilina G,

y otro disco impregnado en la solución de concentración desconocida.




Resultado: Observar el tamaño de los halos de inhibición del crecimiento, medir los diámetros con una regla,

hacer la representación gráfica sobre papel semilogarítmico de 3 periodos y deducir la concentración de antibiótico

desconocida.

3.ANTIBIOGRAMA

El antibiograma se utiliza para comprobar cuál de una serie de antibióticos es más activo frente a un determinado

microorganismo, Bacillus subtilis en este caso. Se compararán tres antibióticos, Penicilina G (0,1 mg/ml),

Bacitracina (1 mg/ml) y Cicloheximida (2 mg/ml) .

Procedimiento



2 . Añadir 1 ml de la suspensión de células de B. subtilis (organismo sensible).



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4 . Cuando el medio esté sólido (después de unos 20’) colocar encima discos de

papel impregnados en las soluciones de los diferentes antibióticos (penicilina G, Bacitracina

y Cicloheximida).




Resultado: Observar la aparición o no de halos de inhibición del crecimiento y su tamaño. Indicar qué

antibiótico es el más efectivo frente a B. subtilis .


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Praticas De Microbiologia 2 Curso Biologia Sp