Modelado de la Proteína P35 de Toxoplasma Gondii y Predicción de sus Epitopes

Juan Gabriel Costa1, Claudia Marina Lagier2, Iván Sergio Marcipar1

1Labortorio de Tecnología Inmunológica, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, Universidad Nacional del Litoral, Santa Fe, Argentina2Departamente de Química, Facultad de Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de Rosario, Rosario, Argentina

e.mail: jcosta@fbcb.unl.edu.ar

Fundamentación:El diagnóstico de la toxoplasmosis en la embarazada es de gran interés ya que si la infección es reciente puede afectar al feto, mientras que si es crónica no existe riesgo de transmisión transplacentaria. Para optimizar el diagnóstico de fase aguda nos propusimos utilizar antígenos que sean reconocidos específicamente por los anticuerpos en dicho estadío de la infección. Uno de ellos es la proteína transmembrana P35 (GRA8) de 267 aminoácidos (AA).El objetivo de este trabajo fue determinar cuales son las mínimas regiones de la proteína que pueden expresarse y ser reconocidas por los anticuerpos de fase aguda, para incorporarlos en un ensayo de diagnóstico. Para esto se modeló la estructura tridimensional de la proteína P35 y luego se predijo cuales son sus epitopes lineales y estructurales para linfocitos B (LB) mediante programas de predicción actualmente disponibles en la web.

Materiales y Métodos:Búsqueda de patrones: Mediante el servidor Swiss-Model (http://swissmodel.expasy.org/) se buscaron proteínas con porcentaje de identidad mayor al 25 % con la P35, pero no se encontraron. Por lo tanto, se procedió a modelar por threading. Las proteínas homólogas fueron halladas mediante el servidor PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/), encontrándose la proteína de cápside del Parvovirus B19 y la Oncoproteína c-Myc1, de 5,4 % y 16,7 % de identidad de secuencia respectivamente.Generación de la estructura: Se empleó el programa Modeller9v3 para generar las estructuras tridimensionales. Se armaron cinco modelos por cada uno de los seis alineamientos generales de patrones, dando un total de 30 estructuras bases. Paralelamente se emplearon los programas online de modelado automático I-TASSER (http://zhang.bioinformatics.ku.edu/I-TASSER) y ROBETTA (http://robetta.bakerlab.org/), cinco con cada uno. En ningún caso se cargaron proteínas patrón ni se definieron restricciones estructurales. Evaluación y refinado del modelo: De la mejor estructura obtenida se procedió a corregir el alineamiento y ajustar la hélice transmembrana mediante el programa PDBview. La calidad de cada modelo se analizó mediante los programas online ANOLEA (http://protein.bio.puc.cl/cardex/servers/anolea/index.html) y Verify3D (http://nihserver.mbi.ucla.edu/Verify_3D/). Finalmente se ajustaron los loops ubicados entre los AA 2 a 24, 107 a 117 y 247 a 266 mediante el programa online LOBO (http://protein.cribi.unipd.it/lobo/). También se empleó el programa UCSF Chimera para realizar una minimización de energía de 50 pasos luego del ajuste del alineamiento y otra de 100 pasos después del refinado de loops.Predicción de epitopes: Para encontrar los epitopes contra LB lineales y estructurales se emplearon los programas online ABCpred (http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/) y Discotope (http://www.cbs.dtu.dk/services/DiscoTope/), respectivamente.

Resultados:Modelado: La estructura final se muestra en la gráfica 1. El modelo obtenido tiene un 70,04 % de los AA con un score interno de Verify3D superior a 0,1 y un 85,02 % de los aminoácidos con valor inferior a 5 E/kT en el ANOLEA. En la grafica 2 se muestra el Mapa de Ramachandran de dicha estructura.Los modelos obtenidos por los programas de modelado automático se descartaron por tener valores en el ANOLEA y estructuras finales poco satisfactorias.Predicción de epitopes contra LB: Aminoácidos que conforman epitopes lineales: 65 - 84, 113 - 131 y 151 – 170. Gráficas 3 y 5.Aminoácidos que conforman epitopes estructurales: 34 - 38, 41, 50, 57, 61, 62, 68 - 71, 73 - 79, 81 - 83, 88 - 98, 104 - 132, 135, 142 - 144, 150, 157, 158, 191 - 195 y 197 – 200. Gráficas 4 y 6.

Conclusión: La predicción in silico podría permitir identificar en forma rápida y económica, epitopes útiles para desarrollar ensayos de inmunodiagnóstico altamente efectivos. En el caso de antígenos con estructuras aun no descriptas, la predicción de epitopes estructurales requiere de un modelado confiable de la proteína. En este trabajo mediante la utilización de programas libres se pudo obtener un modelo de la P35 de T. gondii y se predijo que la mayoría de las regiones antigénicas se encuentran en la región media y N terminal de la molécula. Actualmente, se están evaluado dichas regiones experimentalmente.

Gráfica 1: Estructura solución de la proteína de Toxoplasma Gondii P35

Gráfica 2: Mapa de Ramachandran de la estructura final de la proteína P35.

Gráfica 5: En rojo se muestran los epitopes lineales predichos para la proteína P35,

Gráfica 6: En rojo se muestran los epitopes estructurales predichos para la proteína P35,

Gráfica 3: Esquema de los epiitopes lineales predichos (en rojo) para la proteína P35.

Gráfica 4: Esquema de los epiitopes estructurales predichos (en rojo) para la proteína P35.

Referencias-. Kimberly L, Carolyn G, Gary E: Identification and molecular characterization of GRA8, a novel, proline-rich, dense granule protein of Toxoplasma gondii. Mol. and Bioch. Parasit 2000, 105:25-37