Cromatografiacutea de liacutequidos de

alta resolucioacuten

HPLC

INSTITUTO TECNOLOGICO DE MERIDA

INSTRUMENTACION ANALITICA

Jorge Carlos Vaacutezquez Saacutenchez

bull Objetivo

bull Que es la cromatografiacutea

bull Utilidad de la cromatografiacutea

bull Empleo

bull Tipos de cromatografiacutea

bull Diagrama de bloques

bull Fase moacutevil y estacionaria

bull Sistema de pretratamiento de fases

bull Equipo de filtracioacuten para HPLC

bull Lenguaje del Analista

bull Vaacutelvula de inyeccioacuten

bull Eluyentes usados en HPLC

bull Teoriacutea cineacutetica o dinaacutemica

bull Detectores empelados en HPLC

bull Anaacutelisis cuantitativos

bull Cuantificacioacuten cromatografica

bull Meacutetodos de cuantificacioacuten

Iacutendice

Objetivo

bull Conocer que estudia la cromatografiacutea de liacutequidos de alta

resolucioacuten y su campo de aplicacioacuten

Que es la cromatografiacutea

bull Teacutecnica de separacioacuten en la cual los componentes de la muestra se

distribuyen entre dos fases de diferente naturaleza como consecuencia de

la variacioacuten de velocidad que se establece al ser arrastrados por una fase

moacutevil liacutequida o gaseosa a traveacutes de una fase estacionaria

Teacutecnicas Antiguas de Cromatografiacutea de Liacutequidos

Recipiente para

abastecimiento

del solventeUnioacuten de vidrio

esmerilado

Relleno previo para proteger

el empaque de la caiacuteda del

liquidoColumna empacada

Llave

Tapoacuten de hule

A la bomba

Matraz de succioacuten

bull Objetivo

bull Que es la cromatografiacutea

bull Utilidad de la cromatografiacutea

bull Empleo

bull Tipos de cromatografiacutea

bull Diagrama de bloques

bull Fase moacutevil y estacionaria

bull Sistema de pretratamiento de fases

bull Equipo de filtracioacuten para HPLC

bull Lenguaje del Analista

bull Vaacutelvula de inyeccioacuten

bull Eluyentes usados en HPLC

bull Teoriacutea cineacutetica o dinaacutemica

bull Detectores empelados en HPLC

bull Anaacutelisis cuantitativos

bull Cuantificacioacuten cromatografica

bull Meacutetodos de cuantificacioacuten

Iacutendice

Objetivo

bull Conocer que estudia la cromatografiacutea de liacutequidos de alta

resolucioacuten y su campo de aplicacioacuten

Que es la cromatografiacutea

bull Teacutecnica de separacioacuten en la cual los componentes de la muestra se

distribuyen entre dos fases de diferente naturaleza como consecuencia de

la variacioacuten de velocidad que se establece al ser arrastrados por una fase

moacutevil liacutequida o gaseosa a traveacutes de una fase estacionaria

Teacutecnicas Antiguas de Cromatografiacutea de Liacutequidos

Recipiente para

abastecimiento

del solventeUnioacuten de vidrio

esmerilado

Relleno previo para proteger

el empaque de la caiacuteda del

liquidoColumna empacada

Llave

Tapoacuten de hule

A la bomba

Matraz de succioacuten

Objetivo

bull Conocer que estudia la cromatografiacutea de liacutequidos de alta

resolucioacuten y su campo de aplicacioacuten

Que es la cromatografiacutea

bull Teacutecnica de separacioacuten en la cual los componentes de la muestra se

distribuyen entre dos fases de diferente naturaleza como consecuencia de

la variacioacuten de velocidad que se establece al ser arrastrados por una fase

moacutevil liacutequida o gaseosa a traveacutes de una fase estacionaria

Teacutecnicas Antiguas de Cromatografiacutea de Liacutequidos

Recipiente para

abastecimiento

del solventeUnioacuten de vidrio

esmerilado

Relleno previo para proteger

el empaque de la caiacuteda del

liquidoColumna empacada

Llave

Tapoacuten de hule

A la bomba

Matraz de succioacuten

Que es la cromatografiacutea

bull Teacutecnica de separacioacuten en la cual los componentes de la muestra se

distribuyen entre dos fases de diferente naturaleza como consecuencia de

la variacioacuten de velocidad que se establece al ser arrastrados por una fase

moacutevil liacutequida o gaseosa a traveacutes de una fase estacionaria

Teacutecnicas Antiguas de Cromatografiacutea de Liacutequidos

Recipiente para

abastecimiento

del solventeUnioacuten de vidrio

esmerilado

Relleno previo para proteger

el empaque de la caiacuteda del

liquidoColumna empacada

Llave

Tapoacuten de hule

A la bomba

Matraz de succioacuten

Teacutecnicas Antiguas de Cromatografiacutea de Liacutequidos

Recipiente para

abastecimiento

del solventeUnioacuten de vidrio

esmerilado

Relleno previo para proteger

el empaque de la caiacuteda del

liquidoColumna empacada

Llave

Tapoacuten de hule

A la bomba

Matraz de succioacuten

Utilidad de la Cromatografiacutea de liacutequidos de alta resolucioacuten

bull Determinaciones cuantitativas exactas

bull Determinacioacuten de compuestos no volaacutetiles (alto Peso Molecular

bull iones metaacutelicos) o termolaacutebiles

bull El poder de la cromatografiacutea de liacutequidos permite efectuar la separacioacuten

identificacioacuten y cuantificacioacuten de las especies solubles

Empleo

bull Aplicabilidad a sustancias de intereacutes general (industria salud

bull medioambiente)

bull Aminoaacutecidos proteiacutenas aacutecidos nucleicos hidrocarburos carbohidratos

faacutermacos terpenoides plaguicidas antibioacuteticos esteroides etc

bull Separacioacuten y determinacioacuten de especies en diversos materiales orgaacutenicos

inorgaacutenicos y bioloacutegicos

Diagrama de bloques que muestra los componentes de un

aparato de HPLC

Fase moacutevil y Fase estacionaria

bull Fase moacutevil es un disolvente liquido que contiene la muestra como

mezcla de solutos

bull Fase estacionaria es donde se retienen los componentes

provenientes de la fase moacutevil y esta compuesto de un material poroso

que tiene afinidad por las partiacuteculas

1 Soacutelidos muy porosos con capacidad adsorbente Gel de siacutelice (SiO2)

Aluacutemina(Al2O3)

Sistemas de pretratamiento de fases

moacuteviles1 Para eliminacioacuten de gases disueltos y soacutelidos en suspensioacuten

2 desgasificacioacuten por vaciacuteo

3 calentamiento

4 agitacioacuten

5 inyeccioacuten de gas de arrastre de baja solubilidad (Helio)

6 Filtros para polvo y partiacuteculas soacutelidas en suspensioacuten

Equipo de filtracioacuten HPLC

Es imprescindible filtrar y desgasificar

todos los estaacutendares y muestras antes de

introducirlos en el hplc

Lenguaje del Analista

bull Eluato es el liquido que sale de la columna de CL

bull Elucioacuten Es la migracioacuten de los solutos a lo largo de la columna hacia la salida

de esta

bull Eluyente es la fase moacutevil que ocasiona la elucioacuten

bull Elucioacuten isocratica es una corrida cromatografica en la cual permanece

constante la composicioacuten de la fase moacutevil(contrario al gradiente de elucioacuten)

bull Gradiente de elucioacuten en una teacutecnica de CL en la cual varia en forma continua la

composicioacuten de la fase moacutevil durante la elucioacuten Algunas veces se cambia la

composicioacuten en etapas y en este caso el termino gradiente se puede cuestionar

bull Tiempo de retencioacuten tR tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el

sistema cromatograacutefico Esta retencioacuten se ejerce en funcioacuten de las

caracteriacutesticas moleculares de cada compuesto

bull TEORIacuteA CINEacuteTICA O DINAacuteMICA

bull La eficacia de la columna para separar los componentes de la muestra vendraacute

dada por dos factores

bull 1 La diferencia de la velocidad de migracioacuten de los solutos de la mezcla que

origina la separacioacuten fiacutesica entre los picos

bull 2 La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada plato teoacuterico que

traeraacute consigo un ensanchamiento del pico cromatograacutefico

bull Todos los detectores producen una sentildeal que se relaciona con la concentracioacuten

de las especies en disolucioacuten

bull El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia

de una determinada sustancia en la muestra

bull Se utiliza un estaacutendar interno para comparar los tiempos de retencioacuten y la

respuesta del detector con la concentracioacuten

Detectores empleados en HPLC

bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes

bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura

bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones

es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad

entre la fase moacutevil y el componente de la muestra

bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la

sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten

bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3

el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se

conoce como deteccioacuten indirecta

bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas

o complejos capaces de ser oxidados o reducidos

Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los

caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor

variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de

informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la

columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas

significativo el deterioro de la cuantividad

bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un

componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La

determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de

ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para

realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten

obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea

del pico

Cuantificacioacuten cromatografica

bull Disponer de patrones adecuados

bull Cromatograma reproducibles

bull mi = Ki Ai

bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna

bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i

bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i

Meacutetodos de cuantificacioacuten

bull Estaacutendar o patroacuten externo

1 Estaacutendar o patroacuten

externo

2 Curva analiacutetica o

calibracioacuten

3 Adicioacuten de estaacutendares

4 Estaacutendar interno

Empleo

bull Aplicabilidad a sustancias de intereacutes general (industria salud

bull medioambiente)

bull Aminoaacutecidos proteiacutenas aacutecidos nucleicos hidrocarburos carbohidratos

faacutermacos terpenoides plaguicidas antibioacuteticos esteroides etc

bull Separacioacuten y determinacioacuten de especies en diversos materiales orgaacutenicos

inorgaacutenicos y bioloacutegicos

Diagrama de bloques que muestra los componentes de un

aparato de HPLC

Fase moacutevil y Fase estacionaria

bull Fase moacutevil es un disolvente liquido que contiene la muestra como

mezcla de solutos

bull Fase estacionaria es donde se retienen los componentes

provenientes de la fase moacutevil y esta compuesto de un material poroso

que tiene afinidad por las partiacuteculas

1 Soacutelidos muy porosos con capacidad adsorbente Gel de siacutelice (SiO2)

Aluacutemina(Al2O3)

Sistemas de pretratamiento de fases

moacuteviles1 Para eliminacioacuten de gases disueltos y soacutelidos en suspensioacuten

2 desgasificacioacuten por vaciacuteo

3 calentamiento

4 agitacioacuten

5 inyeccioacuten de gas de arrastre de baja solubilidad (Helio)

6 Filtros para polvo y partiacuteculas soacutelidas en suspensioacuten

Equipo de filtracioacuten HPLC

Es imprescindible filtrar y desgasificar

todos los estaacutendares y muestras antes de

introducirlos en el hplc

Lenguaje del Analista

bull Eluato es el liquido que sale de la columna de CL

bull Elucioacuten Es la migracioacuten de los solutos a lo largo de la columna hacia la salida

de esta

bull Eluyente es la fase moacutevil que ocasiona la elucioacuten

bull Elucioacuten isocratica es una corrida cromatografica en la cual permanece

constante la composicioacuten de la fase moacutevil(contrario al gradiente de elucioacuten)

bull Gradiente de elucioacuten en una teacutecnica de CL en la cual varia en forma continua la

composicioacuten de la fase moacutevil durante la elucioacuten Algunas veces se cambia la

composicioacuten en etapas y en este caso el termino gradiente se puede cuestionar

bull Tiempo de retencioacuten tR tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el

sistema cromatograacutefico Esta retencioacuten se ejerce en funcioacuten de las

caracteriacutesticas moleculares de cada compuesto

bull TEORIacuteA CINEacuteTICA O DINAacuteMICA

bull La eficacia de la columna para separar los componentes de la muestra vendraacute

dada por dos factores

bull 1 La diferencia de la velocidad de migracioacuten de los solutos de la mezcla que

origina la separacioacuten fiacutesica entre los picos

bull 2 La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada plato teoacuterico que

traeraacute consigo un ensanchamiento del pico cromatograacutefico

bull Todos los detectores producen una sentildeal que se relaciona con la concentracioacuten

de las especies en disolucioacuten

bull El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia

de una determinada sustancia en la muestra

bull Se utiliza un estaacutendar interno para comparar los tiempos de retencioacuten y la

respuesta del detector con la concentracioacuten

Detectores empleados en HPLC

bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes

bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura

bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones

es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad

entre la fase moacutevil y el componente de la muestra

bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la

sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten

bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3

el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se

conoce como deteccioacuten indirecta

bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas

o complejos capaces de ser oxidados o reducidos

Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los

caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor

variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de

informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la

columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas

significativo el deterioro de la cuantividad

bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un

componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La

determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de

ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para

realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten

obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea

del pico

Cuantificacioacuten cromatografica

bull Disponer de patrones adecuados

bull Cromatograma reproducibles

bull mi = Ki Ai

bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna

bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i

bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i

Meacutetodos de cuantificacioacuten

bull Estaacutendar o patroacuten externo

1 Estaacutendar o patroacuten

externo

2 Curva analiacutetica o

calibracioacuten

3 Adicioacuten de estaacutendares

4 Estaacutendar interno

Diagrama de bloques que muestra los componentes de un

aparato de HPLC

Fase moacutevil y Fase estacionaria

bull Fase moacutevil es un disolvente liquido que contiene la muestra como

mezcla de solutos

bull Fase estacionaria es donde se retienen los componentes

provenientes de la fase moacutevil y esta compuesto de un material poroso

que tiene afinidad por las partiacuteculas

1 Soacutelidos muy porosos con capacidad adsorbente Gel de siacutelice (SiO2)

Aluacutemina(Al2O3)

Sistemas de pretratamiento de fases

moacuteviles1 Para eliminacioacuten de gases disueltos y soacutelidos en suspensioacuten

2 desgasificacioacuten por vaciacuteo

3 calentamiento

4 agitacioacuten

5 inyeccioacuten de gas de arrastre de baja solubilidad (Helio)

6 Filtros para polvo y partiacuteculas soacutelidas en suspensioacuten

Equipo de filtracioacuten HPLC

Es imprescindible filtrar y desgasificar

todos los estaacutendares y muestras antes de

introducirlos en el hplc

Lenguaje del Analista

bull Eluato es el liquido que sale de la columna de CL

bull Elucioacuten Es la migracioacuten de los solutos a lo largo de la columna hacia la salida

de esta

bull Eluyente es la fase moacutevil que ocasiona la elucioacuten

bull Elucioacuten isocratica es una corrida cromatografica en la cual permanece

constante la composicioacuten de la fase moacutevil(contrario al gradiente de elucioacuten)

bull Gradiente de elucioacuten en una teacutecnica de CL en la cual varia en forma continua la

composicioacuten de la fase moacutevil durante la elucioacuten Algunas veces se cambia la

composicioacuten en etapas y en este caso el termino gradiente se puede cuestionar

bull Tiempo de retencioacuten tR tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el

sistema cromatograacutefico Esta retencioacuten se ejerce en funcioacuten de las

caracteriacutesticas moleculares de cada compuesto

bull TEORIacuteA CINEacuteTICA O DINAacuteMICA

bull La eficacia de la columna para separar los componentes de la muestra vendraacute

dada por dos factores

bull 1 La diferencia de la velocidad de migracioacuten de los solutos de la mezcla que

origina la separacioacuten fiacutesica entre los picos

bull 2 La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada plato teoacuterico que

traeraacute consigo un ensanchamiento del pico cromatograacutefico

bull Todos los detectores producen una sentildeal que se relaciona con la concentracioacuten

de las especies en disolucioacuten

bull El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia

de una determinada sustancia en la muestra

bull Se utiliza un estaacutendar interno para comparar los tiempos de retencioacuten y la

respuesta del detector con la concentracioacuten

Detectores empleados en HPLC

bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes

bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura

bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones

es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad

entre la fase moacutevil y el componente de la muestra

bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la

sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten

bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3

el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se

conoce como deteccioacuten indirecta

bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas

o complejos capaces de ser oxidados o reducidos

Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los

caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor

variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de

informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la

columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas

significativo el deterioro de la cuantividad

bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un

componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La

determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de

ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para

realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten

obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea

del pico

Cuantificacioacuten cromatografica

bull Disponer de patrones adecuados

bull Cromatograma reproducibles

bull mi = Ki Ai

bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna

bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i

bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i

Meacutetodos de cuantificacioacuten

bull Estaacutendar o patroacuten externo

1 Estaacutendar o patroacuten

externo

2 Curva analiacutetica o

calibracioacuten

3 Adicioacuten de estaacutendares

4 Estaacutendar interno

Fase moacutevil y Fase estacionaria

bull Fase moacutevil es un disolvente liquido que contiene la muestra como

mezcla de solutos

bull Fase estacionaria es donde se retienen los componentes

provenientes de la fase moacutevil y esta compuesto de un material poroso

que tiene afinidad por las partiacuteculas

1 Soacutelidos muy porosos con capacidad adsorbente Gel de siacutelice (SiO2)

Aluacutemina(Al2O3)

Sistemas de pretratamiento de fases

moacuteviles1 Para eliminacioacuten de gases disueltos y soacutelidos en suspensioacuten

2 desgasificacioacuten por vaciacuteo

3 calentamiento

4 agitacioacuten

5 inyeccioacuten de gas de arrastre de baja solubilidad (Helio)

6 Filtros para polvo y partiacuteculas soacutelidas en suspensioacuten

Equipo de filtracioacuten HPLC

Es imprescindible filtrar y desgasificar

todos los estaacutendares y muestras antes de

introducirlos en el hplc

Lenguaje del Analista

bull Eluato es el liquido que sale de la columna de CL

bull Elucioacuten Es la migracioacuten de los solutos a lo largo de la columna hacia la salida

de esta

bull Eluyente es la fase moacutevil que ocasiona la elucioacuten

bull Elucioacuten isocratica es una corrida cromatografica en la cual permanece

constante la composicioacuten de la fase moacutevil(contrario al gradiente de elucioacuten)

bull Gradiente de elucioacuten en una teacutecnica de CL en la cual varia en forma continua la

composicioacuten de la fase moacutevil durante la elucioacuten Algunas veces se cambia la

composicioacuten en etapas y en este caso el termino gradiente se puede cuestionar

bull Tiempo de retencioacuten tR tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el

sistema cromatograacutefico Esta retencioacuten se ejerce en funcioacuten de las

caracteriacutesticas moleculares de cada compuesto

bull TEORIacuteA CINEacuteTICA O DINAacuteMICA

bull La eficacia de la columna para separar los componentes de la muestra vendraacute

dada por dos factores

bull 1 La diferencia de la velocidad de migracioacuten de los solutos de la mezcla que

origina la separacioacuten fiacutesica entre los picos

bull 2 La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada plato teoacuterico que

traeraacute consigo un ensanchamiento del pico cromatograacutefico

bull Todos los detectores producen una sentildeal que se relaciona con la concentracioacuten

de las especies en disolucioacuten

bull El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia

de una determinada sustancia en la muestra

bull Se utiliza un estaacutendar interno para comparar los tiempos de retencioacuten y la

respuesta del detector con la concentracioacuten

Detectores empleados en HPLC

bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes

bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura

bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones

es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad

entre la fase moacutevil y el componente de la muestra

bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la

sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten

bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3

el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se

conoce como deteccioacuten indirecta

bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas

o complejos capaces de ser oxidados o reducidos

Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los

caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor

variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de

informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la

columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas

significativo el deterioro de la cuantividad

bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un

componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La

determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de

ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para

realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten

obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea

del pico

Cuantificacioacuten cromatografica

bull Disponer de patrones adecuados

bull Cromatograma reproducibles

bull mi = Ki Ai

bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna

bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i

bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i

Meacutetodos de cuantificacioacuten

bull Estaacutendar o patroacuten externo

1 Estaacutendar o patroacuten

externo

2 Curva analiacutetica o

calibracioacuten

3 Adicioacuten de estaacutendares

4 Estaacutendar interno

Sistemas de pretratamiento de fases

moacuteviles1 Para eliminacioacuten de gases disueltos y soacutelidos en suspensioacuten

2 desgasificacioacuten por vaciacuteo

3 calentamiento

4 agitacioacuten

5 inyeccioacuten de gas de arrastre de baja solubilidad (Helio)

6 Filtros para polvo y partiacuteculas soacutelidas en suspensioacuten

Equipo de filtracioacuten HPLC

Es imprescindible filtrar y desgasificar

todos los estaacutendares y muestras antes de

introducirlos en el hplc

Lenguaje del Analista

bull Eluato es el liquido que sale de la columna de CL

bull Elucioacuten Es la migracioacuten de los solutos a lo largo de la columna hacia la salida

de esta

bull Eluyente es la fase moacutevil que ocasiona la elucioacuten

bull Elucioacuten isocratica es una corrida cromatografica en la cual permanece

constante la composicioacuten de la fase moacutevil(contrario al gradiente de elucioacuten)

bull Gradiente de elucioacuten en una teacutecnica de CL en la cual varia en forma continua la

composicioacuten de la fase moacutevil durante la elucioacuten Algunas veces se cambia la

composicioacuten en etapas y en este caso el termino gradiente se puede cuestionar

bull Tiempo de retencioacuten tR tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el

sistema cromatograacutefico Esta retencioacuten se ejerce en funcioacuten de las

caracteriacutesticas moleculares de cada compuesto

bull TEORIacuteA CINEacuteTICA O DINAacuteMICA

bull La eficacia de la columna para separar los componentes de la muestra vendraacute

dada por dos factores

bull 1 La diferencia de la velocidad de migracioacuten de los solutos de la mezcla que

origina la separacioacuten fiacutesica entre los picos

bull 2 La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada plato teoacuterico que

traeraacute consigo un ensanchamiento del pico cromatograacutefico

bull Todos los detectores producen una sentildeal que se relaciona con la concentracioacuten

de las especies en disolucioacuten

bull El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia

de una determinada sustancia en la muestra

bull Se utiliza un estaacutendar interno para comparar los tiempos de retencioacuten y la

respuesta del detector con la concentracioacuten

Detectores empleados en HPLC

bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes

bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura

bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones

es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad

entre la fase moacutevil y el componente de la muestra

bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la

sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten

bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3

el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se

conoce como deteccioacuten indirecta

bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas

o complejos capaces de ser oxidados o reducidos

Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los

caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor

variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de

informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la

columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas

significativo el deterioro de la cuantividad

bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un

componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La

determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de

ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para

realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten

obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea

del pico

Cuantificacioacuten cromatografica

bull Disponer de patrones adecuados

bull Cromatograma reproducibles

bull mi = Ki Ai

bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna

bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i

bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i

Meacutetodos de cuantificacioacuten

bull Estaacutendar o patroacuten externo

1 Estaacutendar o patroacuten

externo

2 Curva analiacutetica o

calibracioacuten

3 Adicioacuten de estaacutendares

4 Estaacutendar interno

Equipo de filtracioacuten HPLC

Es imprescindible filtrar y desgasificar

todos los estaacutendares y muestras antes de

introducirlos en el hplc

Lenguaje del Analista

bull Eluato es el liquido que sale de la columna de CL

bull Elucioacuten Es la migracioacuten de los solutos a lo largo de la columna hacia la salida

de esta

bull Eluyente es la fase moacutevil que ocasiona la elucioacuten

bull Elucioacuten isocratica es una corrida cromatografica en la cual permanece

constante la composicioacuten de la fase moacutevil(contrario al gradiente de elucioacuten)

bull Gradiente de elucioacuten en una teacutecnica de CL en la cual varia en forma continua la

composicioacuten de la fase moacutevil durante la elucioacuten Algunas veces se cambia la

composicioacuten en etapas y en este caso el termino gradiente se puede cuestionar

bull Tiempo de retencioacuten tR tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el

sistema cromatograacutefico Esta retencioacuten se ejerce en funcioacuten de las

caracteriacutesticas moleculares de cada compuesto

bull TEORIacuteA CINEacuteTICA O DINAacuteMICA

bull La eficacia de la columna para separar los componentes de la muestra vendraacute

dada por dos factores

bull 1 La diferencia de la velocidad de migracioacuten de los solutos de la mezcla que

origina la separacioacuten fiacutesica entre los picos

bull 2 La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada plato teoacuterico que

traeraacute consigo un ensanchamiento del pico cromatograacutefico

bull Todos los detectores producen una sentildeal que se relaciona con la concentracioacuten

de las especies en disolucioacuten

bull El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia

de una determinada sustancia en la muestra

bull Se utiliza un estaacutendar interno para comparar los tiempos de retencioacuten y la

respuesta del detector con la concentracioacuten

Detectores empleados en HPLC

bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes

bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura

bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones

es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad

entre la fase moacutevil y el componente de la muestra

bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la

sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten

bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3

el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se

conoce como deteccioacuten indirecta

bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas

o complejos capaces de ser oxidados o reducidos

Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los

caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor

variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de

informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la

columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas

significativo el deterioro de la cuantividad

bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un

componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La

determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de

ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para

realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten

obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea

del pico

Cuantificacioacuten cromatografica

bull Disponer de patrones adecuados

bull Cromatograma reproducibles

bull mi = Ki Ai

bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna

bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i

bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i

Meacutetodos de cuantificacioacuten

bull Estaacutendar o patroacuten externo

1 Estaacutendar o patroacuten

externo

2 Curva analiacutetica o

calibracioacuten

3 Adicioacuten de estaacutendares

4 Estaacutendar interno

Lenguaje del Analista

bull Eluato es el liquido que sale de la columna de CL

bull Elucioacuten Es la migracioacuten de los solutos a lo largo de la columna hacia la salida

de esta

bull Eluyente es la fase moacutevil que ocasiona la elucioacuten

bull Elucioacuten isocratica es una corrida cromatografica en la cual permanece

constante la composicioacuten de la fase moacutevil(contrario al gradiente de elucioacuten)

bull Gradiente de elucioacuten en una teacutecnica de CL en la cual varia en forma continua la

composicioacuten de la fase moacutevil durante la elucioacuten Algunas veces se cambia la

composicioacuten en etapas y en este caso el termino gradiente se puede cuestionar

bull Tiempo de retencioacuten tR tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el

sistema cromatograacutefico Esta retencioacuten se ejerce en funcioacuten de las

caracteriacutesticas moleculares de cada compuesto

bull TEORIacuteA CINEacuteTICA O DINAacuteMICA

bull La eficacia de la columna para separar los componentes de la muestra vendraacute

dada por dos factores

bull 1 La diferencia de la velocidad de migracioacuten de los solutos de la mezcla que

origina la separacioacuten fiacutesica entre los picos

bull 2 La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada plato teoacuterico que

traeraacute consigo un ensanchamiento del pico cromatograacutefico

bull Todos los detectores producen una sentildeal que se relaciona con la concentracioacuten

de las especies en disolucioacuten

bull El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia

de una determinada sustancia en la muestra

bull Se utiliza un estaacutendar interno para comparar los tiempos de retencioacuten y la

respuesta del detector con la concentracioacuten

Detectores empleados en HPLC

bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes

bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura

bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones

es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad

entre la fase moacutevil y el componente de la muestra

bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la

sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten

bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3

el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se

conoce como deteccioacuten indirecta

bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas

o complejos capaces de ser oxidados o reducidos

Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los

caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor

variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de

informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la

columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas

significativo el deterioro de la cuantividad

bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un

componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La

determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de

ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para

realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten

obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea

del pico

Cuantificacioacuten cromatografica

bull Disponer de patrones adecuados

bull Cromatograma reproducibles

bull mi = Ki Ai

bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna

bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i

bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i

Meacutetodos de cuantificacioacuten

bull Estaacutendar o patroacuten externo

1 Estaacutendar o patroacuten

externo

2 Curva analiacutetica o

calibracioacuten

3 Adicioacuten de estaacutendares

4 Estaacutendar interno

bull Tiempo de retencioacuten tR tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el

sistema cromatograacutefico Esta retencioacuten se ejerce en funcioacuten de las

caracteriacutesticas moleculares de cada compuesto

bull TEORIacuteA CINEacuteTICA O DINAacuteMICA

bull La eficacia de la columna para separar los componentes de la muestra vendraacute

dada por dos factores

bull 1 La diferencia de la velocidad de migracioacuten de los solutos de la mezcla que

origina la separacioacuten fiacutesica entre los picos

bull 2 La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada plato teoacuterico que

traeraacute consigo un ensanchamiento del pico cromatograacutefico

bull Todos los detectores producen una sentildeal que se relaciona con la concentracioacuten

de las especies en disolucioacuten

bull El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia

de una determinada sustancia en la muestra

bull Se utiliza un estaacutendar interno para comparar los tiempos de retencioacuten y la

respuesta del detector con la concentracioacuten

Detectores empleados en HPLC

bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes

bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura

bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones

es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad

entre la fase moacutevil y el componente de la muestra

bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la

sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten

bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3

el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se

conoce como deteccioacuten indirecta

bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas

o complejos capaces de ser oxidados o reducidos

Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los

caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor

variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de

informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la

columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas

significativo el deterioro de la cuantividad

bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un

componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La

determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de

ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para

realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten

obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea

del pico

Cuantificacioacuten cromatografica

bull Disponer de patrones adecuados

bull Cromatograma reproducibles

bull mi = Ki Ai

bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna

bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i

bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i

Meacutetodos de cuantificacioacuten

bull Estaacutendar o patroacuten externo

1 Estaacutendar o patroacuten

externo

2 Curva analiacutetica o

calibracioacuten

3 Adicioacuten de estaacutendares

4 Estaacutendar interno

bull TEORIacuteA CINEacuteTICA O DINAacuteMICA

bull La eficacia de la columna para separar los componentes de la muestra vendraacute

dada por dos factores

bull 1 La diferencia de la velocidad de migracioacuten de los solutos de la mezcla que

origina la separacioacuten fiacutesica entre los picos

bull 2 La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada plato teoacuterico que

traeraacute consigo un ensanchamiento del pico cromatograacutefico

bull Todos los detectores producen una sentildeal que se relaciona con la concentracioacuten

de las especies en disolucioacuten

bull El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia

de una determinada sustancia en la muestra

bull Se utiliza un estaacutendar interno para comparar los tiempos de retencioacuten y la

respuesta del detector con la concentracioacuten

Detectores empleados en HPLC

bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes

bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura

bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones

es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad

entre la fase moacutevil y el componente de la muestra

bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la

sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten

bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3

el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se

conoce como deteccioacuten indirecta

bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas

o complejos capaces de ser oxidados o reducidos

Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los

caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor

variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de

informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la

columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas

significativo el deterioro de la cuantividad

bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un

componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La

determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de

ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para

realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten

obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea

del pico

Cuantificacioacuten cromatografica

bull Disponer de patrones adecuados

bull Cromatograma reproducibles

bull mi = Ki Ai

bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna

bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i

bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i

Meacutetodos de cuantificacioacuten

bull Estaacutendar o patroacuten externo

1 Estaacutendar o patroacuten

externo

2 Curva analiacutetica o

calibracioacuten

3 Adicioacuten de estaacutendares

4 Estaacutendar interno

bull Todos los detectores producen una sentildeal que se relaciona con la concentracioacuten

de las especies en disolucioacuten

bull El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia

de una determinada sustancia en la muestra

bull Se utiliza un estaacutendar interno para comparar los tiempos de retencioacuten y la

respuesta del detector con la concentracioacuten

Detectores empleados en HPLC

bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes

bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura

bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones

es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad

entre la fase moacutevil y el componente de la muestra

bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la

sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten

bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3

el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se

conoce como deteccioacuten indirecta

bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas

o complejos capaces de ser oxidados o reducidos

Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los

caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor

variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de

informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la

columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas

significativo el deterioro de la cuantividad

bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un

componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La

determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de

ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para

realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten

obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea

del pico

Cuantificacioacuten cromatografica

bull Disponer de patrones adecuados

bull Cromatograma reproducibles

bull mi = Ki Ai

bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna

bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i

bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i

Meacutetodos de cuantificacioacuten

bull Estaacutendar o patroacuten externo

1 Estaacutendar o patroacuten

externo

2 Curva analiacutetica o

calibracioacuten

3 Adicioacuten de estaacutendares

4 Estaacutendar interno

Detectores empleados en HPLC

bull Detector espectrofotomeacutetrico puede ser un tubo fotomultiplicador o un arreglo de diodos Con este se puede efectuar un anaacutelisis simultaacuteneos en muacuteltiples longitudes de onda ya sea en la regioacuten visible o en la ultravioleta Cuando la oacuteptica permite que el detector y la fuente de radiacioacuten esteacuten a 90 grados es posible efectuar determinaciones fluorescentes

bull Detector de iacutendice de refraccioacuten totalmente mide la diferencia entre el eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra Mientras mayor sea la diferencia entre los iacutendices de las dos especies mayor seraacute la pendiente Son limitantes la baja sensibilidad la imposibilidad de usarse con programacioacuten de eluyentes y la afectacioacuten producida por cambios de temperatura

bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones

es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad

entre la fase moacutevil y el componente de la muestra

bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la

sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten

bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3

el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se

conoce como deteccioacuten indirecta

bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas

o complejos capaces de ser oxidados o reducidos

Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los

caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor

variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de

informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la

columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas

significativo el deterioro de la cuantividad

bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un

componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La

determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de

ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para

realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten

obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea

del pico

Cuantificacioacuten cromatografica

bull Disponer de patrones adecuados

bull Cromatograma reproducibles

bull mi = Ki Ai

bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna

bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i

bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i

Meacutetodos de cuantificacioacuten

bull Estaacutendar o patroacuten externo

1 Estaacutendar o patroacuten

externo

2 Curva analiacutetica o

calibracioacuten

3 Adicioacuten de estaacutendares

4 Estaacutendar interno

bull Detector de conductividad posee respuesta universal con respecto a los iones

es simple y econoacutemico Su sentildeal es proporcional a la diferencia de conductividad

entre la fase moacutevil y el componente de la muestra

bull Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoatofenolato) la

sentildeal seraacute positiva y proporcional a la concentracioacuten

bull Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3

el componente produce una disminucioacuten de la sentildeal y esto es por lo que se

conoce como deteccioacuten indirecta

bull Detector electroquiacutemico Es muy sensible y selectivo hacia las especies ioacutenicas

o complejos capaces de ser oxidados o reducidos

Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los

caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor

variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de

informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la

columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas

significativo el deterioro de la cuantividad

bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un

componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La

determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de

ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para

realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten

obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea

del pico

Cuantificacioacuten cromatografica

bull Disponer de patrones adecuados

bull Cromatograma reproducibles

bull mi = Ki Ai

bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna

bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i

bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i

Meacutetodos de cuantificacioacuten

bull Estaacutendar o patroacuten externo

1 Estaacutendar o patroacuten

externo

2 Curva analiacutetica o

calibracioacuten

3 Adicioacuten de estaacutendares

4 Estaacutendar interno

Anaacutelisis cuantitativosbull Altura del pico su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los

caacutelculos al efectuar la cuantificacioacuten Las desventajas son la mayor

variabilidad de la altura con respecto al aacuterea del pico y la perdida de

informacioacuten cuando el pico se sale de la escala La sobrecarga de la

columna altera todos los tipos de integracioacuten pero en este caso es mas

significativo el deterioro de la cuantividad

bull Aacuterea de pico su empleo se basa en el hecho de que la concentracioacuten de un

componente en la muestra es directamente proporcional a su aacuterea La

determinacioacuten por aacuterea de pico es independiente de los efectos de

ensanchamiento Por lo tanto es el paraacutemetro analiacutetico mas adecuado para

realizar el anaacutelisis cuantitativo Los programas de computo actuales permiten

obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetriacutea

del pico

Cuantificacioacuten cromatografica

bull Disponer de patrones adecuados

bull Cromatograma reproducibles

bull mi = Ki Ai

bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna

bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i

bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i

Meacutetodos de cuantificacioacuten

bull Estaacutendar o patroacuten externo

1 Estaacutendar o patroacuten

externo

2 Curva analiacutetica o

calibracioacuten

3 Adicioacuten de estaacutendares

4 Estaacutendar interno

Cuantificacioacuten cromatografica

bull Disponer de patrones adecuados

bull Cromatograma reproducibles

bull mi = Ki Ai

bull mi = masa del compuesto inyectado en la columna

bull Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i

bull Ai = aacuterea del pico de elucioacuten del compuesto correspondiente al compuesto i

Meacutetodos de cuantificacioacuten

bull Estaacutendar o patroacuten externo

1 Estaacutendar o patroacuten

externo

2 Curva analiacutetica o

calibracioacuten

3 Adicioacuten de estaacutendares

4 Estaacutendar interno

Meacutetodos de cuantificacioacuten

bull Estaacutendar o patroacuten externo

1 Estaacutendar o patroacuten

externo

2 Curva analiacutetica o

calibracioacuten

3 Adicioacuten de estaacutendares

4 Estaacutendar interno

bull Curva analiacutetica o calibracioacuten

bull

00383

02196

03523

04894

08199

y = 04846x + 00689Rsup2 = 09765

0

01

02

03

04

05

06

07

08

09

0 02 04 06 08 1 12 14 16

Are

a

Concentracion

CURVA 1

Series1 Linear (Series1) Linear (Series1)

Adicioacuten de estaacutendares

Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos

Adicioacuten de estaacutendares

Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos

Estaacutendar o patroacuten interno factores de respuesta relativos