HistologíaCátedra Colegiada

Escuela de Odontología

Facultad de Cs. De la Salud

HISTOLOGIA GENERAL

Semestre Primavera 2013

Cátedra Colegiada

Profesor Coordinador: Dr. Manuel A. Maurelia Fuentes

Lic. Eduardo Tobar LagosDra. María Carolina Smok

HISTOLOGIA GENERAL

Semestre Primavera 2013

Cátedra Colegiada

Profesor Coordinador: Dr. Manuel A. Maurelia Fuentes

Lic. Eduardo Tobar LagosDra. María Carolina Smok

HISTOLOGÍA y sus métodos de estudio

• Histología. Definición• Historia• Microscopía• Histotécnica• Interpretación de cortes

HISTOLOGÍA- Ciencia que estudia los tejidos de los seres vivos

Anatomía

Macroscópica

Microscópica

Histo + LogíaTejidos Ciencia

- Correlación Estructura - Función

Proceso Patológico

Clínica

ANATOMÍA FUNCIONAL

Anatomía macroscópicaRegional (Topográfica)Sistémica Clínica

Anatomía microscópica (Histología)CitologíaHistología GeneralOrganología

METODOS DE ESTUDIOMORFOLOGÍA

Histología

Estudio de la composición y estructura de los tejidos orgánicos que constituyen el cuerpo: las células y su entorno, el material extracelular.

Átomos

Moléculas

Células

Tejidos

Órganos

Individuos

• Tejido: Conjunto organizado de células iguales, del mismo origen embrionario, más la sustancia que las rodean; desempeñando en conjunto una misma función.

• Material Histológico: muestra de tejido obtenida de un individuo sano con el fin de investigar su estructura y composición normales

• Material Anatomopatológico: muestra procedente de individuos enfermos utilizados para el diagnóstico o investigación etiológica de la enfermedad

Estudios Histológicos

• Vitales

• Supravitales

• Postvitales

• Preparación Histológica

• Extensión Citológica

• Impronta

Placa histológica:

• Superficie plana y delgada en donde se encuentra montada una preparación de tejido permanente. Se compone de tres partes:

• PORTAOBJETOS,

• Preparación Histológica (CORTE)

• CUBREOBJETOS.

Problema!!!:Tamaño celular

Límite Resolución Ojo Humano:- 576 megapixels- 0, 3 mm = 300 um

• Siglo XIII, monje franciscano Roger Bacon • Zacharias Jansen, en Middelburg, Holanda.

1595 . 2 lentes. • Galileo, occhiolino o microscopio compuesto

de una lente convexa y una cóncava, 1610• 1625: Giovanni Faber de Bamberg Accademia

dei Lincei: “microscopio”

Historia de la Microscopía y la Histología

Anton van Leeuwenhoek

(Delft, Países Bajos, 1632 – 1723.

Comerciante de telas

Desarrolló mejores lupas.

Aprendió soplado y pulido de vidrio.

1674: pequeñas lentes biconvexas montadas sobre platinas de latón, que se sostenían muy cerca del ojo, para observar objetos que montaba sobre la cabeza de un alfiler, ampliándolos hasta 300 X.

(Microscopio Simple)

* Confirmó la existencia de la circulación capilar (Malpighi):

Oreja de conejo.

Membrana de pata de rana.

*glóbulos rojos

*protozoos (“Animalículos”) en:

Saliva

Agua de charca

•bacterias (bacilos, cocos y espirilos):

Sarro

*espermatozoides

*Ciclo de los insectos: huevos-larvas-adultos.

Reinier de Graaf, Christiaan Huygens Gottfried Wilhelm Leibniz.

Robert Hooke

(Freshwater, 18 de julio de 1635 –

Londres, 3 de marzo de 1703)

Físico (Ley de Hooke)

* 1665 “Micrographía”, primera vez que se usa la palabra “Célula”.

Inventó:

Barómetros

Higrómetros

Anemómetros

telescopios

primer microscopio compuesto

(2 o más lentes)

Ventana de guillotina

Marcello Malpighi,

(1628, Bolonia-1694, Roma)• Fundador de la Histología• Epístolas anatómicas, 1662: papilas

linguales y cutáneas, capa más profunda de la piel

• De viscerum estructura: exercitatio anatómica, 1669: riñón, hígado y bazo.

• De Pulmones (1691): capilares, comunicación arterio-venosa y ramificaciones bronquiales

• Xavier Bichat: 21 tipos de tejidos, 1800• Jacob Schleiden- Theodor Schwann:

Teoría celular, 1835

1751Carl Zeiss, 1879.

• En 1866 el constructor de microscopios alemán de Jena Carl Zeiss (1816-88), nombra como Director de Investigación de su óptica al joven físico Ernst Abbe (1840-1905)

• En 1876 Abbe determinó los principios de la formación de la imagen en los microscopios compuestos, con lo que la construcción de microscopios llegó a la más alta resolución y a los límites teóricos de la luz visible (0,2 um).

Desde allí se avanzó en desarrollar nuevas técnicas de contraste:

• Rudolph Virchow: origen células, Patología, 1858

• Magnus Gustaf Retzius, Descripción de tejidos, Suecia, 1881

• Whilelm Von Waldeyer, Camillo Golgi, Santiago Ramón y Cajal, tinciones de tejido nervioso

• 1931: Microscopio electrónico de transmisión, Ernst Ruska, Alemania

• 1935: Microscopio electrónico de barrido, Max Knoll, Alemania

Microscopía

TIPOS DE MICROSCOPIOS

MICROSCOPIOS FOTÓNICOS (ÓPTICOS):

Microscopio de campo claro Microscopio de contraste de fase Microscopio de interferencia (Nomarski)Microscopio de interferencia diferencial (Jamin Lebedeff)Microscopio de fluorescenciaMicroscopio de barrido confocalMicroscopio de luz ultravioleta Microscopio de luz polarizada

MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS

Microscopio electrónico de transmisión (MET)Microscopio electrónico de barrido (MEB)

Microscopios Ópticos

• Microscopio de campo claro:

Para formar una imagen a partir de un corte histológico usa luz visible, por esto la muestra debe ser lo bastante fina como para que los haces de luz puedan atravesarla. También se usan métodos de tinción, según las necesidades, con el fin de aumentar los detalles en la imagen.

es el microscopio óptico compuesto utilizado en la mayoría de los laboratorios.

• Microscopio de contraste de fase: posibilita la observación de muestras sin colorear, por lo que resulta útil para estudiar especímenes vivos.

• Microscopio de interferencia: es una modificación del anterior que permite la cuantificación de masa en los tejidos.

• Microscopio de interferencia diferencial: también es una modificación del microscopio de contraste de fase, que permite estudiar las propiedades de superficie de las células.

• Microscopio de luz polarizada: es una modificación del microscopio de campo claro. Debido al fenómeno de birrefringencia se pueden observar sustancias cristalinas y moléculas fibrosas.

• Microscopio de fluorescencia: permite la observación de estructuras fluorescentes, ya sea naturales o artificiales.

• Microscopio de barrido confocal: se usa para estudiar la estructura de sustancias biológicas. Combina partes de un microscopio de campo claro con equipo fluorescente y un sistema de barrido que emplea un rayo láser. A través de una computadora se reconstruye la imagen tomada por planos, a una imagen tridimensional.

TÉCNICA HISTOLÓGICA

Inmunohistoquímica

- Se basa en la interacción ANTÍGENO – ANTICUERPO para la identificación de moléculas

Antígeno: Toda sustancia capaz de desencadenar una respuesta inmune

Anticuerpo: Sustancia capaz de unirse a un antígeno de manera específica

- Se colocan anticuerpos, de laboratorio, específicos para la molécula que queremos Identificar

- Una vez producida la interacción debe colorearse o demostrarse su presencia

Enzimas Radiación Fluorescencia

TÉCNICA HISTOLÓGICA

- Puede ser

a) Directa: El anticuerpo colocado esta marcado dando directamente la coloración

b) Indirecta: Se coloca un Auto-anticuerpo, el cual interactúa con el anticuerpo colocado inicialmente, de darse la reacción

TÉCNICA HISTOLÓGICAHibridación

- Capacidad de hebras monocatenarias de DNA o RNA de unirse a hebras complementarias

- Se aísla DNA o RNA de la célula a examinar, y se mezcla con una sonda Con nucleotidos conocidos, con un marcaje (fluorescencia, radiación)

- El fragmento de la sonda interactuara con su hebra complementaria identificandoSu presencia en la célula a estudiar

Problema!!!:Límite de resolución óptico: 0,2 um

Longitud de onda• Luz Visible: 385 nm-780 nm, x 540 nm• Luz Ultravioleta: 120 nm-385 nm, x 200 nm (LR

0,1 um)• Haz electrones: 0,005 nm (LR 0,3 nm)

• Microscopio de luz ultravioleta: sus resultados se registran fotográficamente ya que la luz U.V. no es visible y daña la retina. Se utiliza en la detección de ácidos nucleicos, que absorben esta luz.

Microscopio electrónico de transmisión (MET)

• utiliza un haz de electrones para producir la imagen. Permite la observación de detalles a escala macromolecular.

(500.000 aumentos)

Microscopio electrónico de barrido (MEB)

el haz de electrones no atraviesa la muestra, sino que choca contra su superficie. Permite una gran magnificación de las imágenes.

EL MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO

Sistema Mecánico• Pie ó Base• Vástago o columna • Tornillos de ajuste:1. Macrométrico 2. Micrométrico 3. Desplazamiento

Horizontal• Tubo • Cabezal• Platina - Pinzas• Subplatina

• Sistema Óptico

• De Observación :1. Condensador2. Ocular 3. Objetivos (4, 10, 40, 100)

• De iluminación1. Fuente de luz2. Diafragma3. Filtros

SISTEMA MECÁNICO

• Este sistema sostiene al sistema óptico y aloja los elementos necesarios para la iluminación y enfoque del preparado.

• Pie: brinda apoyo y estabilidad al aparato.

• Vástago: soporta la platina, tubo y tornillos de ajuste macro y micrométrico.

• Tornillo de Ajuste: provocan el desplazamiento del tubo o la platina en sentido vertical, lo que permite el enfoque.

• Tubo: en su extremo superior se halla el ocular, y en el inferior el objetivo. Se trata de un cilindro metálico cuyo interior se encuentra pintado de negro, lo que evita la reflexión de la luz. Normalmente tiene una longitud de 170 mm.

• Platina: es una plataforma horizontal sobre la cual se coloca y sujeta el preparado a observar, tiene un orificio central que permite el paso de la luz y un venier que posibilita la relocalización de los detalles de interés.

• Subplatina: sostiene al condenador y se ubica por debajo de la platina.

SISTEMA ÓPTICO de Observación

• Objetivo: está formado por un sistema de

pequeñas lentes ubicadas muy cercanas una de la otra, la que se halla en el extremo distal del objetivo se denomina lente frontal.

Los objetivos pueden ser objetivos:

- a seco (no hay ninguna sustancia interpuesta entre la lente frontal y el preparado),

- objetivos de inmersión (entre la lente frontal y el preparado se coloca una sustancia cuyo índice de refracción es muy similar al del vidrio).

• Ocular: es un tubo cilíndrico con un diafragma fijo en el centro y una lente en cada extremo, la superior se denomina lente ocular y la inferior lente colectora.

Sistema óptico de iluminación

• Condensador: Lente que concentra el haz de luz sobre el plano del objeto que se encuentra en la platina.

• Diafragma Debajo del condensador, “iris” que regula la cantidad de luz que llega al condensador.

• Fuente de Luz: es una lámpara que está ubicada en la parte inferior del aparato, que incide a través de espejos la muestra.

CARACTERISTICAS DE LOS OBJETIVOS

• ESCALA DE REPRODUCCIÓN (AUMENTO): relación lineal que existe entre el tamaño del objeto y su imagen, por ejemplo, 4:1, 40:1, 65:1.

• PODER DEFINIDOR: es la capacidad del objetivo de formar imágenes de contornos nítidos.

• LÍMITE DE RESOLUCIÓN: es la menor distancia que debe existir entre dos objetos para que puedan visualizarse por separado.

• PODER DE RESOLUCIÓN: es la capacidad de mostrar la imagen en sus detalles más finos. Está en relación inversa con el límite de resolución.

• PODER DE PENETRACIÓN: es la propiedad de permitir la observación simultánea de varios planos del preparado. Es inversamente proporcional a la escala de reproducción o aumento.

• DISTANCIA FRONTAL: es la distancia de la lente frontal al preparado colocado en la platina, cuando está enfocado. Disminuye cuando aumenta la escala de reproducción del objetivo.

• AUMENTO TOTAL: el producto entre el aumento del objetivo y el del ocular. Ejemplo: si tenemos colocado el objetivo cuya escala de reproducción es 40:1 y nuestro ocular tiene un aumento de 10x, entonces el aumento total será 40 x 10 = 400x.

Problema!!! • Mantención de las muestras

Y otro!!!!

• Color de los tejidos

Histotecnología (Técnica Histológica)

“Ciencia que estudia los fundamentos técnicos y la secuencia de manipulaciones necesarias para llevar a cabo el análisis de los tejidos de los seres vivos.”

“Los métodos para la obtención de preparaciones histológicas ocupadas en los estudios de microscopia óptica. “

Abarca varios procedimientos a los que se somete un tejido para proporcionar los cortes como se conocen, montados bajo un cubre objeto con imágenes de estructuras contrastadas, para su estudio bajo microscopia óptica o electrónica.

Preparación de los tejidos para su observación microscópica

FIJACIÓN

INCLUSIÓN

CORTE

COLORACIÓN

Procedimientos

* MUESTRA DEL TEJIDO

• Necropsia: Examen u obtención de tejido de un organismo muerto.  

• Biopsia:(del griego bios = vida y oasis = visión) Examen u obtención de tejido de un organismo vivo.

• incisional (de diagnóstico)• excisional (pieza quirúrgica)• por sacabocado • por punción y absorción • por raspado• por trepanación

La muerte es la interrupción irreversible de los procesos biológicos, y nada mas ocurrir comienzan los procesos degradativos en los tres niveles:

• Químico (desciendie el pH y se activan los sistemas hidrolíticos),

• Celular (se alteran las membranas y difunden los elementos), y

• Orgánico (actúan microorganismos).

Para paralizar estos procesos se usan dos procedimientos: 1- Congelación a -120 º C (no siempre aplicable por problemas técnicos y de procesamiento posterior)

2- Fijación, empleando sustancias químicas (fijadores) que mantiene la forma de las estructuras.

FIJACIÓN

INCLUSIÓN

CORTE

COLORACIÓN

A.- FIJACIÓN

Tratamiento del tejido con sustancias químicas que tienen varias finalidades:

• Conservar los tejidos de forma que muestren el mayor parecido posible a su estado in vivo.  

• Aumentar la dureza del tejido para facilitar la preparación de finas películas de éste.  

• Destruir bacterias y gérmenes que pudieran encontrarse en ellos.  

• Interrumpir los procesos celulares dinámicos que ocurren a la muerte de la célula.

• Esto se logra al inactivar ciertas enzimas celulares que de otra manera iniciarían la Autolisis y llevarían a la DEGENERACIÓN POSTMORTEM.

• La fijación mantiene las estructuras al estimular la formación de enlaces cruzados entre las proteínas

FIJACIÓN DE PROTEINAS

• es necesario evitar su hidrólisis, bloqueando los lugares susceptibles de hidrólisis mediante 4 sistemas:

A.- Reticularización o desnaturalización, creando redes estables empleando aldehidos como formaldehido , que se usa en solución acuosa al 2 % (formalina) para microscopía óptica, y glutaraldehido que se emplea al 2% en tampón, para microscopia electrónica.

Los agentes más usados para Microscopia de Luz son:

1.- Formaldehído al 5%, Formol al 10% o Formalina (Solución de Formaldehído especial)

• Puede usarse con amortiguadores o con otros fijadores.  

• Reacciona con los grupos aminos de las proteínas, formando enlaces transversales y conservando las estructuras de la célula.  

• Es el más usado es el Formol al 10%.

2.- Glutaraldehído al 2.5%, • Funcionan formando enlaces

transversales en las proteínas y manteniendo las estructuras de la célula.

• Una solución de Glutaraldehído al 2.5% en un tampón a pH 7.4, evita la violenta desnaturalización de las proteínas guardando detalles finos de la célula. Es el más usado en Microscopia Electrónica.

B.- Formación de sales insolubles, mediante productos como el acido pícrico empleado en la confección del fijador de Bouin; el cloruro de mercurio (muy tóxico) y el dicromáto potásico.

• El fijador de Bouin es una solución que contiene 75 ml de solución acuosa saturada de ácido pícrico, 25 ml de formol y 5 ml de ácido acético glacial.  

• El líquido de Helly es una solución con 2.5 g de bicromato de potasio, 5 g de cloruro de mercurio, 100 ml de agua y 5 ml de formol.

C.- Cambios en el estado coloidal, mediante el calor (no recomendable).

D.- Modificación del punto isoeléctrico, con ácido acético.

Para Microscopia Electrónica se usan:• Glutaraldehído al 2.5%, Paraformaldehído,

Tetróxido de osmio y Permanganato de Potasio

• Permiten conservar detalles estructurales finos, ya que otros fijadores como el formaldehído, son muy enérgicos en su acción con las proteínas.  

• Actúan como colorantes electrodensos, permitiendo observar al tejido con el haz de electrones.

FIJACIÓN DE LOS HIDRATOS DE CARBONO

• es necesario evitar que se disuelvan en agua, para ello hay que extraer el agua mediante fijadores cuya avidez por el agua sea mayor que ellos, así se emplea alcohol etílico (al 70% en agua), y acetona. Tienen el inconveniente que retraen los tejido y los endurecen para el procesamiento posterior.

FIJACIÓN DE LOS LIPIDOS

• es necesario evitar su oxidación (enranciamiento) bloqueando los lugares donde existen enlaces - CH=CH - mediante sustancias como tetróxido de osmio (acido ósmico),es el fijador ideal para microscopía electrónica, pues se fija en los dobles enlaces de las cadenas laterales de los lípidos de las membranas plasmáticas, y además el Os es un metal opaco a los electrones (sirve de tinción).

Tiempo para la Fijación

• La mejor fijación es cuando ha pasado el menor tiempo entre la muerte del tejido y la fijación.  

Tamaño de la Muestra  

El tamaño de la muestra debe de ser de 2-3 cm. variando el estudio para lo cual de va a utilizar.

FIJACIÓN

INCLUSIÓN

CORTE

COLORACIÓN

Deshidratación

B.- DESHIDRATACIÓN • Después que la muestra ha sido fijada se

elimina el fijador y se deshidrata.• Debido a que una gran parte del tejido

está constituida por agua, se aplica una serie gradual de soluciones acuosas de menor a mayor de agente deshidratante, por ejemplo, Alcohol Etílico o Acetona, iniciando con alcohol al 50 %

• luego con una solución de 60%, 70%, 80%, 90%,96% y alcanzando de manera paulatina el alcohol al 100 % para eliminar el agua.

• Esto se hace por que si se colocara el tejido en una solución al 100% de alcohol inmediatamente, el agua saldría muy rápido del tejido y se deformaría.

FIJACIÓN

INCLUSIÓN

CORTE

COLORACIÓN

Deshidratación

Aclaramiento

C.- ACLARAMIENTO ó DIAFANIZACIÓN

• Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una solución de una sustancia que es miscible tanto con el alcohol como con el medio de inclusión a utilizar (en la mayoría de los casos se utiliza como medio de inclusión parafina líquida).

• La sustancia comúnmente utilizada es el Xileno o Xilol.• También se pueden utilizar Tolueno, Benzol o Cloroformo como

medios de aclaramiento • Se coloca la muestra de tejido en un recipiente de Xilol, el Xilol solo

es soluble en alcohol al 100%. • Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna transparente o claro

en el xileno, esto se debe a que cambia su índice de refracción.

• El alcohol y el xileno disuelven los lípidos de la células y por lo cual al extraerse también se extraen las grasas y los lípidos de la célula.

FIJACIÓN

INCLUSIÓN

CORTE

COLORACIÓN

Deshidratación

Aclaramiento

D.- INCLUSIÓN ó IMPREGNACIÓN

los tejidos tienen que ser incluidos y envueltos por una sustancia de consistencia firme (medio de inclusión), para tener un objeto lo suficientemente duro para su manejo y corte.

• Así se puedan obtener cortes suficientemente finos para ser observados al microscopio, y distinguir entre sí las células superpuestas en un tejido y la matriz extracelular

• Las sustancias usadas son: gelatina y parafina.

• La inclusión se logra al infiltrar la parafina liquida ó cualquier medio de inclusión en estado líquido al tejido, que disuelve el medio de aclaramiento y penetra en el tejido.

• Por lo general se coloca la muestra de tejido en un recipiente y se le agrega la parafina fundida a 60º C, colocando la muestra en una estufa de 30 minutos a 6 horas manteniendo la temperatura a 60º C.

• Debido al calor, el xilol o el benzol se evaporan y los espacios anteriormente ocupados por ellos son ahora ocupados por la parafina.

• Después se coloca la pieza y un poco de parafina fundida en un molde de papel ó metal de forma rectangular y se deja solidificar a temperatura ambiente, formándose un bloque sólido de parafina con el trozo de tejido incluido, a este bloque se le denomina Taco.

FIJACIÓN

INCLUSIÓN

CORTE

COLORACIÓN

Deshidratación

Aclaramiento

E.- SECCIÓN O CORTE

• El taco ahora se puede cortar en secciones lo suficientemente delgadas como para permitir el paso de la luz. La mayor parte de los preparados para microscopia óptica tienen un grosor entre 3 a 10 um. Para estos cortes se utiliza un aparato llamado MICROTOMO.

Técnica de Congelación de Tejidos

• grasas o lípidos que se extraen en el proceso de aclaramiento

• enzimas que quedan inactivadas por el calentamiento de la inclusión

• Un tejido congelado, es los suficientemente duro para ser cortado.

• Muestra en Nitrógeno líquido (congelación rápida)

MICROTOMO DE CONGELACIÓN

ó CRIOSTATO

Ventajas:• los cortes que se obtienen son

muy rápidos• se puede utilizar en el diagnóstico

de material patológico, tomado en intervenciones quirúrgicas y el resultado se obtiene en el transcurso de una operación.

Cortes Gruesos

• Vibrátomo

• (Micrótomo de vibración

• 20 a 50 um

FIJACIÓN

INCLUSIÓN

CORTE

COLORACIÓN

Deshidratación

Aclaramiento

Montaje Portaobjetos

F.- MONTAJE en Portaobjetos

• Los cortes todavía no son aptos para su examen con el microscopio, puesto que los tejidos se hallan infiltrados en parafina y carecen de color.

• Los cortes se colocan sobre portaobjetos a los que se les ha agregado una pequeña cantidad de Albúmina, la cual actúa como adhesivo.

FIJACIÓN

INCLUSIÓN

CORTE

COLORACIÓN

Deshidratación

Aclaramiento

Montaje

Disolución de Parafina

Hidratación

G.- Disolución de Parafina e Hidratación

• La parafina se elimina en un solvente orgánico, de nuevo se incluyen en Xilol, y la muestra se rehidrata haciéndola pasar por una serie de graduaciones decrecientes de alcohol etílico hasta llegar a una solución 100% de agua.

FIJACIÓN

INCLUSIÓN

CORTE

COLORACIÓN

Deshidratación

Aclaramiento

Montaje Portaobjetos

Disolución de Parafina

Hidratación

• Ya rehidratado se TIÑE EL TEJIDO. Los colorantes más utilizados son la HEMATOXILINA Y la EOSINA.

H.- Coloración o Tinción

FIJACIÓN

INCLUSIÓN

CORTE

COLORACIÓN

Deshidratación

Aclaramiento

Montaje Portaobjetos

Disolución de Parafina

Hidratación

Deshidratación

Montaje Cubreobjetos

• Una vez teñido, se deshidrata de nuevo, de tal manera que pueda fijarse de modo permanente el cubreobjetos con un medio adecuado para el MONTAJE (por ejemplo una gota de Bálsamo de Canadá o similar).

• Los medios de montaje pueden ser miscibles ó no miscibles en agua, si son miscibles en agua ya no es necesaria la deshidratación después del teñido, se puede directamente.

• El cubreobjetos no solo protege el tejido, sino que se requiere para observar el corte con un microscopio.

I.- Deshidratación y Montaje del Cubreobjetos

Resultado!!!!:

Placas Histológicas

• PORTAOBJETOS

• CORTE O TEJIDO 

• CUBREOBJETOS  

Coloración

• Una estructura tisular o celular adquiera un color específico bajo la acción de una sustancia colorante

• Métodos Físicos

• Métodos Químicos

Colorantes

Pueden agruparse en 3 clases:• Colorantes que diferencian los componentes

ácidos y básicos de la célula.  

• Colorantes especializados que distinguen los componentes fibrosos de la matriz extracelular.  

• Sales metálicas que se precipitan en los tejidos y forman depósitos de metales con ellos(Impregnaciones).

FUNDAMENTOS QUÍMICOS DE LA COLORACIÓN H-E

(Tinción de Mayer)

• La EOSINA es un colorante ácido y sus propiedades tintoriales pueden ser explicadas sobre la base de lo que se sabe acerca de la acción de las anilinas ácidas.

• La HEMATOXILINA aunque no es un colorante básico, posee propiedades muy semejantes a las anilinas básicas.

Hematoxilina

• Un colorante básico es una molécula de anilina que tiene una o más cargas positivas en su porción coloreadas y su fórmula general se representa:

ANILINA+ Cl-

• Los COLORANTES BÁSICOS reaccionan con los GRUPOS ANIÓNICOS de los componentes texturales, que son los grupos FOSFATO de los ácidos nucleicos (ADN y RNA), los grupos SULFATO de los glucosaminoglucanos y los GRUPOS CARBOXILO de las proteínas. La reacción de estos grupos varía según el pH.

• Compuesto cristalino, extraído de un árbol tropical americano, el “palo campeche” (Haematoxylum campechianum).

C16 H14 O6

Solución de Ehrlich

la Hematoxilina no es un colorante básico en sentido estricto. Se la utiliza con un Mordiente (Intermediario),entre el componente textural y la anilina, y es debido a este que la coloración con hematoxilina se asemeja a la tinción que produce un colorante básico.

La unión en el complejo TEJIDO – MORDIENTE – HEMATOXILINA, no consiste en un simple enlace, y cuando la Hematoxilina se coloca en agua no se disocia del tejido, sino que permanece firmemente adherida.

A causa de esto, la Hematoxilina se presta para aquellos procedimientos tintoriales en los que a ella le sigue la Eosina u otros colorantes ácidos.

• Los colorantes básicos verdaderos no suelen usarse en secuencia en donde el colorante básico es seguido por uno ácido, por que la anilina básica tiende a disociarse del tejido durante los lavados posteriores en soluciones acuosas.

Eosina

• Un COLORANTE ÁCIDO lleva una carga negativa en la porción coloreada de la molécula y su fórmula general se representa:

• Na+ ANILINA-• Los colorantes ácidos se unen primariamente a

los componentes texturales por medio de enlaces electrostáticos de manera similar pero opuesta a la de los colorantes básicos.

• Las anilinas ácidas reaccionan con grupos catiónicos, como los GRUPOS AMINO IONIZADOS de las proteínas.

C20 H6 Br4 Na2 O5

Eosina Y

Rojo Ácido 87

Derivado del coáltar (Prodermina, Alquitrán de hulla)

Cualquier componente de los tejidos que reaccione con un colorante básico (o con Hematoxilina) se dice que es BASÓFILO y que presenta BASOFILIA. Estos componentes son:

• La Heterocromatina y los Nucleolos del Núcleo por los grupos Fosfato ionizados.  

• Ergatoplasma (parte del citoplasma) por grupos Fosfato ionizados.  

• Matriz del Cartílago por grupos Sulfato ionizados.

• Los componentes texturales que se tiñen de colorantes ácidos se dice que son ACIDÓFILOS y que presentan ACIDOFILIA. Son acidófilos:

• La mayor parte del citoplasma no especializado.  

• Filamentos Citoplasmáticos.  

• Fibras extracelulares.  

Todos estos debidos a grupos Amino ionizados.

Otras tinciones

Impregnaciones argénticas

• Reducción

• corte semifino, del epitelio vaginal de la rata, localice el estrato espinoso y, con gran aumento, los desmosomas que establecen las células epiteliales entre sí

Azul de Toluidina: púrpura a sustancia fundamental del cartílago y en los gránulos de los mastocitos (glucosaminoglucanos sulfatados y las nucleoproteínas)

• sección histológica de intestino delgado cortado en congelación y teñido con (PAS), e identifica el glicocálix

Método del ácido peryódico- Reactivo de Schiff (PAS) rojo estable a membranas basales y fibras reticulares (glucógeno, glicoproteínas y glicosaminoglicanos)

Orceína

Afinidad particular por DNA, fibras elásticas

Microscopia electrónica

• Medio de inclusión son resinas polimerizadas o epoxi

• cortes más delgados (ultra finos) de 25 a 100 nm. De espesor y de 0.5 mm. de lado medio.

• microtomo con hoja de vidrio o diamante(ultramicrótomo)

• montaje sobre rejillas de cobre con un diámetro de 3mm.

INTRODUCCIÓN A LA OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA • Organización del tiempo disponible • Reconocimiento del microscopio • Reconocimiento del preparado histológico • Acomodación del preparado • Inicio de la observación • Método para automatizar las tareas• Terminología adecuada• Interpretación tridimensional

TÉCNICA HISTOLÓGICAArtefactos

- Falla en la preparación histológica

- Errores en metodología (falla en el calculo de tiempos o selección de colorantes)

- Equipo inadecuado (cuchillas desafiladas)

- Reactivos con poca pureza

¿Cómo interpretar los cortes histológicos en estructuras?

Recordando que son estructuras tridimensionales que han sido

cortadas en diferentes direcciones y llevadas a un plano bidimensional

Corte longitudinal, se aprecian líneas en amarillo y beige y las fibras de la cáscara

Corte transversal, se observa al centro una figura geométrica y semillas. En la parte externa se observa la cáscara con una textura globular al interior y lisa al exterior.

Corte transversal, se aprecia el centro de la naranja, los gajos, las membranas que los separan y la cáscara que los recubre.

Corte longitudinal, se aprecia el interior del gajo, no se aprecia la membrana que lo recubre y una porción de cáscara.

Corte longitudinal, no se aprecia el centro de la zanahoria

Corte en diagonal, hace ver más alargado el centro de la zanahoria

Corte transversal, se ve más pequeño el centro de la zanahoria

Corte sagital, toma la forma del pimiento, si hubiera sido transversal, se observaría redondo.

Se pueden obtener interpretaciones erróneas al observar una imagen microscópica bidimensional puesto que se generalmente se estudian cortes aislados y la imagen obtenida dependerá del plano en el cual se realizó el corte de la estructura. De allí que se recomienda pensar en 3 dimensiones cuando se observan los cortes histológicos y adaptar la imagen a la forma macroscópica de la estructura.

Mismo objeto, vistas diferentes según sea la posición.

Planos de corte histológico:

CartílagoCorte longitudinal

Corte longitudinal: Es el corte que se hace paralelo a la mayor dimensión de la estructura.

Vaso sanguíneo, Corte transversal

Corte transversal: Es el corte que se hace de manera perpendicular al eje longitudinal de la estructura.

Corte Transversal, a MAYOR AUMENTO

Vaso, corte longitudinal

Conducto intercalarCorte longitudinal

Conducto intercalarCorte transversal

Corte tangencial: Es el corte que se realiza tocando apenas la superficie de la estructura; también se le denomina rasante.

Corte oblicuo: Cuando se corta la estructura en un ángulo que esté comprendido entre los dos planos anteriores (longitudinal y transversal).

Conclusión

• Las estructuras a observar en una placa histológica, depende del corte que tenga el tejido, así que de eso depende que una estructura como un conducto por ejemplo, se vea alargado, ancho, corto, redondo, triangular u de otra forma.

• Por esta razón es importante considerar siempre: 1) el órgano a estudiar, y 2) el plano del corte

• Para precisar el diagnóstico, también se debe contar con: 3) el aumento de la observación, y 4) la tinción.

Tejidos

Conjunto organizado de células iguales, del mismo origen embrionario,

más la sustancia que las rodean; desempeñando en conjunto una misma

función.

Tejidos

- células

- matriz extracelular: inexistente

abundante (estructuras y macromoléculas)

4 tipos:

• Epitelial

• Conectivo

• Muscular

• Nervioso

ORIGEN ORIGEN

FORMA FORMA

FUNCIÓN FUNCIÓN

Sociedades Histológicas

CONECTIVO

MUSCULAR NERVIOSO

EPITELIAL