Research Collection
Doctoral Thesis
Derivate der Chlorophyll-Reihe
Author(s): Etter, Rolf
Publication Date: 1980
Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-000189172
Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted
This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For moreinformation please consult the Terms of use.
ETH Library
Diss. ETH 6 J84
Derivate der Chlorophyll-Reihe
Abhandlung
zur Erlangung
des Titels eines Doktors der Naturwissenschaften
der
EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE
ZÜRICH
vorgelegt von
ROLF ETTER
dipl.Chem. ETH
geboren am 6. Juni 1951
von Birwinken (TG) und Langrickenbach (TG)
Angenommen auf Antrag von
Prof. Dr. A. Eschenmoser, Referent
Prof. Dr. K. Wüthrich, Korreferent
Für Anni
Meinem verehrten Lehrer,
Herrn Prof. Dr. A. Eschenmoser,
unter dessen Leitung ich die vorliegende Promotionsarbeit an
diesem ungewöhnlich vielseitigen Projekt ausführen durfte,
danke ich für die grosszügige Unterstützung und sein grosses
Verständnis.
Besonders danken möchte ich meinen Kollegen von der
"Grünen Gruppe"
Bernhard Jaun
Franz Thönen
Eri Walter
Engelbert Zass
Durch den regen Gedankenaustausch und die gute Zusammenarbeit
haben sie wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen.
Im übrigen gilt mein Dank all jenen, die mich bei der Ausfüh¬
rung dieser Arbeit unterstützt haben, besonders Fräulein Dr.
D. Felix und Herrn Dr. J. Schreiber für die vielen praktischen
Hinweise sowie Marco Bonetti für die Reproduktion der Abbil¬
dungen .
Leer - Vide - Empty
Dem Stipendienfonds zur Unterstützung von Doktoranden auf dem
Gebiet der Chemie sowie dem Schweizerischen Nationalfonds
danke ich für die finanzielle Unterstützung.
Leer - Vide - Empty
INHALTSVERZEICHNIS
ALLGEMEINER TEIL
1. Einführung 9
1.1. Nomenklatur 13
1.2. Strukturen und Verbreitung der verschiedenen
natürlichen Chlorophylle 15
2. Partialsynthese von Chlorophyll a-Derivaten aus
den Phäophorbiden 25
2.1. Einleitung und Problemstellung 25
2.2. Reinheitskriterien 28
2.3. Reinigung von Phäophytin a 29
2.4. Komplexierung von Phäophytin a mit "BHT-Mg-J"
zu Chlorophyll a 33
2.5. Cetyl-chlorophyllid a 42
2.6. Einige Beobachtungen zum Mechanismus des
Magnesiumeinbaus 4 7
3. Untersuchungen an Reaktionszentren 51
3.1. Einleitung 51
3.2. Problemstellung 53
133.3. Synthese von [2- C]-6-Aminolävulinsäure 56
3.4. Einbauversuche 6 0
3.5. Untersuchungen der Stabilität ausgebleichter
Reaktionszentren 64
3.6. Schlussfolgerungen 68
EXPERIMENTELLER TEIL
4. Einleitung 71
4.1. Allgemeines 71
4.2. Qualität der verwendeten Materialien 7 3
4.3. Messung und Darstellung der analytischen Daten 75
4.4. Dry-Box8 0
4.5. Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie 82
Leer - Vide - Empty
5. Chlorophyll a-Derivate 86
5.1. Reinigung von Phäophytin a 86
5.2. Komplexierung von Phäophytin a zu Chlorophyll a 99
5. 3. Synthese von Cetyl-chlorophyllid a 127
5.4. Beobachtungen zur Komplexierung 159
6. Reaktionszentren 164
136.1. Synthese von [2- c] -6-Aminolävulinsäure 164
6.2. Untersuchungen an Reaktionszentren (RC) 178
LITERATURVERZEICHNIS191
Leer - Vide - Empty
- 9 -
ALLGEMEINER TEIL
1. EINFÜHRUNG
Der Begriff "Photosynthese" umfasst die Gesamtheit der Vorgänge
in chlorophyllhaltigen Organismen, die Lichtenergie als trei¬
bende Kraft für die Synthese der für das Zellwachstum benötig¬
ten Biomoleküle benützt. Die Photosynthese bildet die Grund¬
lage der Energieversorgung der heutigen Biosphäre und stellt
zusammen mit der Atmung den sowohl in qualitativer als auch
quantitativer Hinsicht wichtigsten Energieumwandlungsprozess
dar. Nicht nur die ausserordentliche Bedeutung und die Einzig¬
artigkeit dieser Naturvorgänge, sondern auch die Hoffnung,
durch ein tieferes Verständnis der mit hoher Quantenausbeute
ablaufenden Primärprozesse die Natur in technischen Vorgängen
zu imitieren, führten in den letzten Jahren zu der sehr hohen
Aktivität und den relativ raschen Fortschritten in der Photo¬
syntheseforschung.
Die bei verschiedenen Bakterienklassen, Algen und höheren
Pflanzen verwirklichte photosynthetische Kohlendioxid-Assimi¬
lation wird vereinfacht in der von van Niel [l] aufgestellten
Gleichung dargestellt:
C02 + 2 H2A m- (CH20) + H20 + 2 A
In phototrophen Bakterien kann H„A ein breites Spektrum von
Substraten wie z.B. Schwefelwasserstoff (Chromatiaceae, Chloro-
biaceae) oder verschiedene organische Substanzen (Rhodospirilla-
ceae) bedeuten, während in Sauerstoffproduzierenden Organismen
wie Algen und grünen Pflanzen Wasser als Reduktionsmittel dient.
(CH„0) symbolisiert allgemein Kohlenstoff auf der Oxidations-
stufe der Kohlehydrate (vielfach Glukose).
- 10 -
Dieser Kohlenstoff dient dem Organismus einerseits direkt als
Zellbaustein und als Ausgangsmaterial für weitere essentielle
Biomoleküle (Lipide, Fette, Proteine, Nukleinsäuren, etc.),
anderseits deckt er den Grossteil des Energievorrats der Zelle.
Diese Energie wird bei der Atmung, summarisch als
(CH20) + 02 *- H20 + C02
beschrieben, wieder freigesetzt, und dient auch den hetero-
trophen Organismen als Energiequelle.
Für die intermediäre Energiekonservierung wird während der
Photosynthese ATP gebildet. Diese ATP-Synthese kann durch einen
cyclischen Elektronentransport angetrieben, oder aber an einen
"offenen" Elektronenfluss gekoppelt sein [2-4]. Eine aktuelle
Übersicht über die Theorien zum Mechanismus der ATP-Synthese
findet man in [5-7] .
Die folgende, sehr kurze Zusammenfassung über einzelne Aspekte
der Photosynthese soll nur einen groben Überblick vermitteln.
Detaillierte Besprechungen der einzelnen Gebiete findet man
in [8-12] .
Die Photosynthese, sowohl in Prokaryonten als auch in Eukaryon-
ten, ist stets an Membranen gebunden, in denen die photosyn¬
thetisch wirksamen Pigmente und die Hauptbestandteile der Elek-
tronentransportkette eingebettet sind. Diese Membranen bilden
abgeschlossene Systeme, sogenannte Thylakoide. In den Eukaryon-ten sind sie mit einer zusätzlichen Membran umgeben und bilden
Chloroplasten, während sie in den prokaryotischen Zellen im
Cytoplasma verteilt sind (Blaualgen) oder mit der Cytoplasma-
membran verbunden sind (Purpurbakterien). Detailliertere Be¬
schreibungen findet man z.B. in [13] oder in Lehrbüchern der
Biochemie [14-16] .
Der wichtigste Unterschied zwischen der Photosynthese der
Pflanzen und Blaualgen einerseits und entwicklungsgeschichtlich
- 11 -
älteren photosynthetischen Prozessen der Bakterien anderseits
besteht in der Möglichkeit der ersteren, Wasser zu oxidieren
und Sauerstoff freizusetzen, was erst das Entstehen der auf
Atmung beruhenden Lebensformen erlaubte. Diese Oxidation wird
dadurch ermöglicht, dass zwei verschiedene Photosysteme (als
PS I und PS II bezeichnet) miteinander gekoppelt sind, während
in den Bakterien wahrscheinlich nur ein dem PS I ähnliches
Photosystem vorhanden ist. Eine ausführliche Darstellung ver¬
mitteln neuere Ubersichtsartikel [17,18].
Die photosynthetischen Einheiten bestehen aus zwei strukturell
und funktionell verschiedenen Untereinheiten, einem Komplex
von Lichtsammler- (Antennen-) Pigmenten einerseits und einem
"aktiven" Protein-Pigment-Komplex anderseits. Die Pigmente der
Antennen, die mengenmässig den weitaus grössten Teil darstel¬
len, dienen dazu, Licht zu absorbieren und die Anregungsener¬
gie in geeigneter Form an die durch eine längerwellige Absorp¬
tionsbande (relativ zur Antenne) gekennzeichneten Reaktions¬
zentren weiterzuleiten. Über den Mechanismus der mit hoher
Quantenausbeute ablaufenden Energieübertragung ist man sich
noch nicht völlig im klaren [19] • In den Reaktionszentren fin¬
det dann der eigentliche Primärprozess der Photosynthese, die
Elektronenübertragung von Chlorophyll auf einen Akzeptor, statt.
Während es bis anhin nicht gelang, Reaktionszentren (RC) grüner
Pflanzen zu isolieren, lassen sich bakterielle RC in einzelnen
Fällen von den umgebenden Antennenpigmenten abtrennen. Nachdem
es Goedheer 1960 [20] gelungen war, die Antennenpigmente selek¬
tiv zu oxidieren, konnten Reed und Clayton 1968 [21] die RC
von Rhodopseudomonas sphaeroides durch Behandlung von Chroma-
tophoren mit Detergentien weitgehend von den übrigen Pigmenten
abtrennen. Die heute bekannten Methoden erlauben eine weitge¬
hende Reinigung bakterieller RC, wobei hauptsächlich die schwe¬
felfreien Purpurbakterien Rhodospirillum rubrum und Rhodopseu¬
domonas sphaeroides gut untersucht sind [22-28].
Auf die Struktur und die physikalischen Eigenschaften der Reak-
- 12 -
tionszentren sei hier nicht näher eingegangen, es sei auf Kapi¬tel 3 S. 51, auf einige neuere Ubersichtsartikel [26-28], so¬
wie auf eine in unserer Arbeitsgruppe durchgeführte Untersu¬
chung von E. Walter [2 9,30] verwiesen.
Die für die Photosynthese absolut notwendigen Pigmente sind
die Chlorophylle. Sie sind die wichtigsten Bestandteile so¬
wohl der Antennen als auch der Reaktionszentren. Eine beson¬
dere Stellung nimmt Chlorophyll a ein: Es ist dasjenige Pig¬ment, das in allen Sauerstoffproduzierenden Organismen vor¬
kommt, und es ist in den grünen Pflanzen auch quantitativ der
bedeutendste Farbstoff.
- 13 -
1.1. Nomenklatur
Chlorophylle sind Magnesiumkomplexe von Porphyrinen oder ihren
Di- und Tetrahydroderivaten. Das in dieser Arbeit verwendete
Numerierungssystem nach IUPAC [31,32] wird in Schema 1 der äl¬
teren, in der Literatur aber weit verbreiteten Numerierung
nach Fischer [33] (in der modifizierten Form von Boxer [34] )
anhand Phäophytin a (_1) gegenübergestellt.
IUPAC [31] Fischer [33] ,
erweitert nach Boxer [34]
Phäophytin a 1J*
R = Phytyl
P31 P71 P111 P151
Phytol 12_
Schema 1: Numerierung der C-Atome in Phäophytin a (.1)
- 14 -
Die folgenden Bezeichnungen werden im Sinne Fischer's ver¬
wendet:
3Chlorophyllid: freie Säure von Chlorophyll an C-17
Alkylchlorophyllid: Alkylester von Chlorophyllid
Phäophytin: metallfreier Ligand von Chlorophyll3
Phäophorbid: an C-17 nicht veresterter, metallfreier
Ligand
Alkylphäophorbid: Alkylester eines metallfreien Liganden
Chlorin: Dihydroporphyrin
Bakteriochlorin: an den Ringen B und D hydriertes Tetra-
hydroporphyrin2
Allomere: an C-13 O-substituierte Oxidationsprodukte2Das Präfix 'pyro' bezeichnet Derivate, deren C-13 Carboxy-
methylgruppe durch ein Proton ersetzt ist.
Die Chlorophylle sind mit andern, in der Elektronentransport-kette benötigten bzw. für den Sauerstofftransport notwendigen
Porphyrinen eng verwandt. Im Gegensatz zu Häm in den Cytochro-
men, das kovalent an Proteine gebunden ist, beruht die Bindungvon Chlorophyll an die Membranen im wesentlichen auf hydro¬
phoben Wechselwirkungen. Die Chlorophylle unterscheiden sich
von den andern, biologisch wirksamen Porphyrinen hauptsächlichin folgenden Eigenschaften:
Vorhandensein des isocyclischen Ringes (Ring E)
Magnesium als Zentralatom (im Gegensatz zu Eisen
in Häm)
Meistens Ester eines langkettigen Alkohols (Phytol,
Geranylgeraniol, Farnesol, u.a.)
- 15 -
1.2. Strukturen und Verbreitung der verschiedenen natür¬
lichen Chlorophylle
1.2.1. Chlorophylle in (^-produzierenden Organismen
Die verschiedenen Chlorophylle der Eukaryonten und der sauer-
stoffproduzierenden Prokaryonten unterscheiden sich nur gering¬
fügig. Chlorophyll c stellt in zweierlei Hinsicht eine Ausnah¬
me dar: Es handelt sich im Gegensatz zu den andern Chlorophyl-
len (Chlorine) um ein Porphyrin, dessen wichtigster physikali¬
scher Unterschied zu den Chlorinen die nur schwache Extinktion
im Rotbereich ist, zudem wird es stets als freie Säure und
nicht als Ester isoliert [40,41]. Die Strukturformeln der na¬
türlichen Chlorophylle sind in Schema 2 zusammengefasst, die
dort angegebenen Literaturstellen beziehen sich auf die Struk¬
turaufklärung .
Chlorophyll a (2) ist bei weitem das wichtigste Pigment der
Photosynthese, es kann in Extrakten aller Gefässpflanzen,
Moosen, Algen sowie in den Cyanobakterien (blaugrüne Algen;
Prokaryonten!) und Prochlorophyta, d.h. in allen sauerstoff¬
produzierenden Organismen gefunden werden [4 4]. Während Chloro¬
phyll a (2) in den Cyanobakterien als einziges Chlorophyll
vorkommt, ist es in Gefässpflanzen und Moosen, sowie in eini¬
gen Klassen von Algen von Chlorophyll b (_3_) begleitet. Das
Verhältnis von 2_ zu _3 variiert zwischen 2:1 und 3:1 [45,46] .
In den am meisten verbreiteten Klassen von Algen, vor allem
Kiesel- und Braunalgen, wird zusätzlich zu Chlorophyll a
Chlorophyll c, meist ein Gemisch aus den beiden Pigmenten
Chlorophyll c (4a.) und Chlorophyll c„ (_4b) gefunden. Einzig
in der Klasse der Kieselalgen (Dinophyceae) sowie in zwei Aus¬
nahmen bei andern Klassen kommt 4_b in Abwesenheit von _4_a vor.
Das Verhältnis von 4a zu 4b beträgt meistens ca. 1:1 [47].
Das Verhältnis von 2 zu 4 variiert von ca. 1,5 bis 6 (Ausnah¬
me: Xanthophyceae ca. 40-80). Chlorophyll d wird aus diversen
Spezies der Rotalgen (Rhodophyceae) neben Chlorophyll a iso¬
liert [48] .
- 16 -
C02R
Chlorophyll a 2
R = Phytyl
[35-39]
Chlorophyll c, 4_a
R = Äthyl
Chlorophyll c2 _4b
R = Vinyl
[40,41]
Chlorophyll b 3.
R = Phytyl
[35,36]
Chlorophyll d 5_
R = Phytyl
[42,43]
Schema 2: natürlich vorkommende Chlorophylle in Eukaryonten
- 17 -
Chlorophyll e, über dessen Vorkommen in Methanolextrakten
zweier Spezies der Xanthophyceae berichtet wurde [50], konnte
aus reinen Algenkulturen nie isoliert werden. Es handelte
sich möglicherweise um ein Zersetzungsprodukt von Chlorophyll
c [51].
Eine Übersicht über die Verbreitung der verschiedenen Chloro-
phylle vermittelt Tabelle 1.
Tabelle 1: Verbreitung der Chlorophylle in sauerstoffprodu¬zierenden Organismen 1)
Klasse: Chi a Chi b Chi c, c^ Chi d
Gefässpflanzen + + - - [50]
Bryobionta + + - - [50]
Rhodophyceae + - - + [48,51]
Cryptophyceae + - + + - [51,49]
Dinophyceae + - + - [51,49]
Rhaphidophyceae + - + - [51]
Chrysophyceae + - + + - [51,4 9]
Haptophyceae + - + + - [51,49]
Bacillariophyceae + - + + - [51,49]
Xanthophyceae + - + + - [51,4 9]
Phaeophyceae + + + - [51,49]
Prasinophyceae + + - - [51]
Euglenophyceae + + - - [51]
Chlorophyceae + + - - [51]
Cyanophyceae + - - - [51]
Prochlorophyta + + - - [52,53]
1) Einteilung der Algen nach [5l].
- 18 -
Die Alkoholkomponenten der Chlorophylle a, b und d sind Phy-2)
toi. Im Gegensatz dazu wird Chlorophyll c stets als freie
Säure isoliert [40,41].
Für einen geringen Teil von Chlorophyll a wird eine zentrale
Funktion als Bestandteil der Reaktionszentren sowohl in Photo-3)
System I als auch in Photosystem II nachgewiesen bzw. an¬
genommen. Die übrigen Chlorophylle sowie weitere Pigmente wie
Carotinoide, Xanthophylle und Phycobiline werden als akzesso¬
rische Pigmente bezeichnet und bilden zusammen mit der Haupt¬
menge des Chlorophylls a die Lichtenergie sammelnden Antennen.
Trotz der grossen Verbreitung dieser akzessorischen Pigmenteund deren zweifellos günstigen Effekt für eine optimale An¬
passung an die Umwelt dürften sie, was die Primärreaktion der
Energieumwandlung betrifft, entbehrlich sein [57].
2) Aus Haferkeimlingen konnten durch Dünnschichtchromatographie, Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) der entsprechenden Phäophytine a,sowie durch Gaschromatographie der entsprechenden Alkohole auch Geranyl-geranyl-, Di- und Tetrahydro-geranylgeranyl- und Phytylester nebenein¬ander nachgewiesen werden [54-56], was interessante Schlüsse auf dieBiosynthese zulässt.
3) Anteil von P700 ca. 0,25 % des gesamten Chlorophyll a-Gehalts [58].
- 19 -
1.2.2. Chlorophylle in Prokaryonten
Es sind nur wenige sauerstoffproduzierende Prokaryonten be¬
kannt: Die blaugrünen Algen enthalten Chlorophyll a als ein¬
ziges Chlorophyll, während in den Prochlorophyta Chlorophyll
b neben Chlorophyll a gefunden wird [52,53]. In den übrigen
phototrophen Bakterien kann teilweise sogar in einzelnen Kul¬
turen ein weites Spektrum von Bakteriochlorophyllen nachge¬
wiesen werden.
Die Bakteriochlorophylle a und b (6) und (7_) sind Bakterio-
chlorine und tragen eine Acetylgruppe an C-2. Ihr VIS-Spektrum
ist gegenüber denjenigen der Chlorine bathochrom verschoben.
4)Bei den Bakteriochlorophyllen c, d und e {8) , (_9_) und (10)
handelt es sich um Chlorine, die sich von den in grünen Pflan¬
zen vorkommenden Pigmenten hauptsächlich durch das Fehlen der
2
Carboxymethylgruppe an C-13 und die formal hydratisierte
Vinylgruppe an C-3 unterscheiden. Sie treten meist als Gemisch
mit homologen Seitenketten an C-8 und C-12 auf. Die Bakterio¬
chlorophylle c und e tragen überdies in der elektrophilen
[59,60] Mesoposition C-20 eine Methylgruppe.
Eine Übersicht über die Strukturen der Bakteriochlorophylle
vermitteln die Schemata 3 und 4.
Bakteriochlorophyll a (6) ist das wichtigste Pigment der Pur¬
purbakterien und wurde auch in Extrakten aller phototrophen
grünen Bakterien mindestens in kleinen Mengen (verglichen mit
dem Gesamt-Pigmentgehalt) nachgewiesen. Erst kürzlich konnte
6_ in kleiner Konzentration auch in einem Stamm eines aeroben,
heterotrophen Bakteriums entdeckt werden [61]. Bakteriochloro¬
phyll b (7_) wird nur in wenigen Spezies der Rhodospirillaceae
gefunden. Vor kurzem gelang in phäophytinisierten Extrakten
4) Die Bezeichnungen Bakteriochlorophyll c und Bakteriochlorophyll d
wurden von Jensen et al. [80] eingeführt und ersetzen die früher ge¬
bräuchlichen Namen Chlorobiura-Chlorophyll-660 und Chlorobium-Chloro-
phyll-650.
- 20 -
Bakteriochlorophyll a 6_ Bakteriochlorophyll b 1_R = Phytyl od. R = Phytyl
Geranylgeranyl
[62-66] [67]
Schema 3: Strukturen der Bakteriochlorophylle a und b
einiger dieser Organismen der Nachweis von Bakteriophäophytina (_11) /
der Autor schloss daraus auf das Vorkommen von S_ in
vivo [79] .
In den Chlorobineae, den grünen phototrophen Bakterien,kommendie Bakteriochlorophylle c, d und e als Hauptpigmente vor. Mit
wenigen Ausnahmen [79] wurden sie stets als Gemisch von Homo¬
logen extrahiert [69,73,75,80]. Bakteriochlorophyll e wurde
als Gemisch von mindestens drei Komponenten isoliert [77].
Tabelle 2 gibt Auskunft über die Verbreitung der Bakterio¬
chlorophylle in den phototrophen Bakterien.
Die Bakteriochlorophylle zeigen eine verwirrende Vielfalt von
Alkoholkomponenten. In phäophytinisierten Extrakten aller un¬
tersuchten Rhodospirillaceae [81], Chromatiaceae [82] und
Chlorobiaceae [82]isolierten Pfennig et al. ein mit Phytol(12) verestertes Bakteriophäophytin a (Bakteriophäophytin a
= 11_.) - In einzelnen Arten der Chromatiaceae konnten sie auch
- 21 -
C02R
Bakteriochlorophyll c
Rl
äthyl
äthyl
n-propyl
isobutyl
R2
methyl
äthyl
äthyl
äthyl
R: meist Farnesyl
[68-73]
Bakteriochlorophyll d
R-, R,
äthyl methyl
n-propyl methyl
isobutyl methyl
äthyl äthyl
n-propyl äthyl
isobutyl äthyl
R: meist Farnesyl
[69,71,72 ,74,75]
C02R
Bakteriochlorophyll e
R, R,
äthyl methyl
n-propyl methyl
isobutyl methyl
äthyl äthyl
n-propyl äthyl
isobutyl äthyl
R: Farnesyl , Phytyl od
[72,76-78]
Schema 4: Strukturen der Bakteriochlorophylle c,d,e
- 22 -
geringe Mengen des mit Geranylgeraniol veresterten Bakterio-
phäophytins a (Bakteriophäophytin a = 11 ) nachweisen,Gg Gg
während sie in den untersuchten Stämmen von Rhodospirillum6)rubrum hauptsächlich 11 neben nur wenig 11 fanden
. Die—Gg —PAutoren vermuteten deshalb, dass Bakteriochlorophyll a in
den RC (P870) von R. rubrum vorkommt [82]. Sorgfältige Unter¬
suchungen von E. Walter in unserem Arbeitskreis an gereinig¬ten RC von R. rubrum G 9 zeigten aber, dass diese Bakterio-
chlorophyll a neben Bakteriophäophytin a enthalten [2 9,3 0].Bakteriochlorophyll b wurde in Rhodopseudomonas viridis und
Thiocapsa pfennigii stets als Phytylester neben geringen Men¬
gen 6_ gefunden [79,82]. Bakteriochlorophyll c ist vorwie¬
gend mit Farnesol verestert. Durch Verwendung von HPLC gelangkürzlich zusätzlich der Nachweis folgender Alkoholkomponentenaus einem phäophytinisierten Extrakt von Chlorobium limicola
[83,73]: 2,6,10-trans-Geranylgeraniol, 10,14-Tetrahydro-Ge-ranylgeraniol, trans-Phytol (1_2) , sowie auch die nicht iso-
prenoiden Alkohole 4-Undecyl-2-furanmethanol und cis-9-Hexa-
decen-1-ol. In Chloroflexus aurantiacus wurde Stearylalkoholals hauptsächliche Alkoholkomponente identifiziert [79]. Wäh¬
rend in Bakteriochlorophyll d bis anhin nur Farnesol nachge¬wiesen wurde [68], ist Bakteriochlorophyll e meist mit Far¬
nesol verestert, es wurden aber auch mit Phytol und Cetyl-alkohol (_13) veresterte Verbindungen identifiziert [79] .
5) Die aufgezeichneten Verbindungen sind exakt identifiziert [71,73].Holt et al. [69] fanden aber ein Gemisch von 6 Komponenten und ver¬muteten aufgrund von Abbaustudien auch das Vorkommen einer Äthylgrup¬pe an C-20, was jedoch eher unwahrscheinlich scheint. Hauptsächlichanhand biosynthetischer Überlegungen vermutet Kenner [7l] in den nochunbekannten Strukturen 8-äthyl-12-isopropyl, 8-n-propyl-12-isopropylund 8-isobutyl-12-isopropyl oder eher 8-n-propyl-12-methyl und 8-iso-butyl-12-methyl Substituenten. Auch diese Vorschläge werden angezwei¬felt [73] , möglicherweise unterscheiden sich die zwei gesuchten Struk¬turen nur in der Alkoholkomponente von den übrigen 4 Verbindungen.
6) Katz et al. [84] und Brockmann et al. [85,86] hatten schon früher11 aus R. rubrum extrahiert.—<;g
- 23 -
Tabelle 2: Verbreitung der Chlorophylle in Prokaryonten
Bakteriochlorophylle
Chlorobineae:
Chlorobiaceae:
Chlorobium limicola
C. 1. thiosulfatophilum LI
C. 1. thiosulfatophilumNCIB 8346
Chlorobium vibrioforme
C. v. thiosulfatophilum
Pelodictyon luteolum
Chlorobium phaeovibroidesChlorobium phaeobacteroides
(Chloropseudomonas ethylicum)
Chloroflexaceae:
Chloroflexus aurantiacus
Chloronema giganteumChloronema spiroideum
Rhodospirillineae:
Chromatiaceae:
alle Arten
Rhodospirillaceae:
Rhodospirillum rubrum
Rhodospirillum tenue
Rhodospirillum photometricum
Rhodospirillum molischianum
Rhodopseudomonas gelatinosa
Rhodopseudomonas palustris
Rhodopseudomonas acidophilaRhodomicrobium vaniellii
Rhodopseudomonas viridis
Thiocapsa pfennigii
Rhodopseudomonas capsulata
Rhodopseudomonas spaeroides
Rhodopseudomonas globiformis
Rhodopseudomonas sp.
Rhodocyclus purpureus
Cyanophyceae
Prochlorophyta
++
+ - ++ - - 80 r77
+ — - ++ — _80,77_
+ - ++ - - "80"
+ - - ++ - "77"
+ - - ++ - "77"
+ - - ++ - ~11~
+ - - - ++ "77,78,+
+ - ++ -
++ "77,78][80]
+
+
+
- ++
++
++
-
8)
8)
~79
89
~89"
,88]
++
++
++ —
++ -
++ -
++ -
++ -
++ -
+ ++
+ ++
++ -
++ -
++ -
— ++
[80,82]
80
81"
80"
80"
80~.
'80"
81""81"7 9", 9 0 ,
[79,82]"80"
"80""81
"80'
++---- [81]
Chlorophyll a [9 2]
Chlorophylle a und b [52,5 3]
Es bedeutet: ++ Hauptpigment, + in geringen Mengen gefunden
nicht nachgewiesen
- 24 -
Nur die Bakteriochlorophylle a und b scheinen für die bak¬
terielle Photosynthese essentiell zu sein, die übrigen Bak¬
teriochlorophylle betrachtet man als akzessorische Pigmente,deren Vorkommen nicht als absolut notwendig für die Primär¬
reaktionen erachtet wird [57] . Es sei jedoch ausdrücklich auf
die Bedeutung von Bakteriophäophytin hingewiesen, das in den
RC von Rhodospirillum rubrum [2 3,29,30] als auch von Rhodo-
pseudomonas sphaeroides [22,93-96] vorkommt und wahrschein¬lich eine fundamentale Rolle als intermediären Elektronen¬
akzeptor spielt [97,98].
7) Einteilung nach Pfennig [92] .
8) 9 wurde nur in Zellsuspensionen anhand der Absorption nachgewiesen,es fehlen Angaben über den Gehalt an Bakteriochlorophyll a.
- 25 -
2. PARTIALSYNTHESE VON CHLOROPHYLL A-DERIVATEN AUS DEN
PHAOPHORBIDEN
2.1. Einleitung und Problemstellung
Für die Synthese des Cyclo-chlorophyllid-enols 1_6_, das als
Modellsystem für die Untersuchung von im ß-Ketoester-System
enolisierten Chlorophyllen diente [99-105], hatte in unserer
Arbeitsgruppe die Notwendigkeit bestanden, ein schonendes
Verfahren zur Einführung von Magnesium in die metallfreien
Liganden zu entwickeln. Die in der Literatur beschriebenen
Methoden für den Magnesiumeinbau in Porphyrin-und einfache
Chlorin-Liganden Hessen sich auf die empfindlicheren Chloro¬
phyllderivate nicht übertragen, da sie viel zu drastische
Bedingungen erfordern. Eine Übersicht über die früher verwen¬
deten Reagenzien findet sich in [103].
Der Durchbruch war H.P. Isenring [101] mit dem Auffinden des
Reagenzes 2,6-Di-tert-butyl-4-methyl-phenoxy-magnesium-Jodid
("BHT-Mg-J"; 1_4) gelungen, mit dem sich erstmals eine voll¬
ständige Komplexierung der freien Liganden der Chlorophyll a-
Reihe erreichen Hess und schwierige und verlustreiche Rei¬
nigungsoperationen vermieden werden konnten. So Hess sich
das Cyclo-phäophorbid-enol L5 mit 7 Mol-Äquivalent 1_4_ in
CHC1^/CH Cl^/Äther (45° C, 5 Min.) in das entsprechende Magne¬
sium-Derivat 1^6_ umwandeln, das in 76 % Ausbeute kristallin
isoliert wurde [100,101] (Schema 5). Methyl-phäophorbid a 20_
konnte entsprechend (CH Cl„/Äther, 12 C, 6 Min., 4-facher
Überschuss an "BHT-Mg-J") laut UV/VIS-Spektrum quantitativ in
Methylchlorophyllid a (1_7) umgesetzt und das Rohprodukt ohne
vorherige Reinigung in 73 % Ausbeute kristallisiert werden
[100,101] .
Die Bedeutung des Verfahrens wird durch seine Anwendung zur
Darstellung der Dimeren (RC-Chlorophyll-Modelle) von Pyro-
chlorophyllid a [106] und Chlorophyll a [107], sowie von
- 26 -
Schema 5
Bis(pyro-chlorophyllid)cyclophan [108] verdeutlicht.
E. Zass [103] gelang es, das Reagenzsystem zu modifizieren
und durch Zusatz von "BHT-Li" auch für die Komplexierung von
Chlorophyll b- und Bakteriochlorophyll a-Derivaten zu ver¬
wenden.
Die Partialsynthese von Chlorophyll a durch Magnesiumeinbauin Phäophytin a schien als weitere Anwendung und Test für die
Methode lohnend. Auch schien das Verfahren für die präpara-tive Herstellung von Chlorophyll a von Interesse, zumal Iso¬
lierung und Reinigung aus Pflanzenextrakten schwierig sind
[44,109]. Es bestand auch die Hoffnung, aus partialsyntheti-schem Chlorophyll a Kristalle für eine Röntgenstrukturanalysezüchten zu können, war es doch Isenring gelungen, durch Magne¬siumeinbau in die entsprechenden Phäophorbide hergestelltesMethyl- und Äthyl-chlorophyllid a für diesen Zweck zu kri¬
stallisieren [101,110-112].Zudem stellt die erfolgreiche Komplexierung von Phäophytin a
die letzte Stufe der Totalsynthese von Chlorophyll a dar.
- 27 -
•NH N=/
\\HN-
y/
C02CH3
C02CH3c02CH3
o
C02CH3C02Phytyl
*\\
\ .
MgV
O
C02CH3C02Phytyl
18
Woodward 1960 H. Fischer
Schema 6
Mit der Totalsynthese von Chlorin e -trimethylester (1_8) durch
Woodward et al. [113-115] war formal auch die Totalsynthese
von Chlorophyll a (2_) erreicht: Die letzten Stufen zur Dar¬
stellung von Phäophytin a (Schema 6) durch Bildung des iso-
cyclischen Fünfrings [116,117] und Veresterung des Phäophor-
bids a mit Phytol [118] sind aus den Arbeiten Fischer's be¬
kannt, die Synthese von optisch aktivem Phytol ist von Wee-
don et al. [119,120] beschrieben worden .Die Einführung
von Magnesium in Phäophytin a durch Behandlung mit Phytyloxy-
magnesium-bromid wurde von Fischer und Goebel beschrieben
[12 3]• Das entstandene Chlorophyll a war jedoch mit über¬
schüssigem Phytol verunreinigt und die analytischen Unter¬
suchungen mussten sich den damaligen Methoden gemäss auf ein
qualitatives VIS-Spektrum und auf einen positiven Phasentest,
sowie auf einen Vergleich des durch Dekomplexierung zurückge¬
wonnenen Phäophytins a mit dem Ausgangsmaterial anhand der
HCl-Zahl beschränken.
9) Über eine Totalsynthese von Methyl-phäophorbid a nach dem Konzept
Fischer's berichteten Strell et al. [l21,122j.
- 28 -
Die Partialsynthese von Chlorophyll a aus Phäophytin a durch
die schonende Komplexierung mit "BHT-Mg-J", verbunden mit
einer umfassenden Charakterisierung des Produkts war daher
wünschbar.
2.2. Reinheitskriterien
Infolge der hohen Labilität, speziell der metallhaltigen Ver¬
bindungen, ist die Reinheitsprüfung von Chlorophyll-Derivatonbesonders wichtig. Bei den üblicherweise verwendeten Krite-
1 13rien wie UV/VIS-, IR-, H-NMR- und C-NMR-Spektren sowie
Elementaranalyse liegt die Erfassungsgrenze für die meisten
Nebenprodukte viel zu hoch: Beispielsweise metallhaltigeAllomere können mittels UV/VIS-Spektroskopie nicht erfasst
werden, da sie mit Chlorophyll a fast deckungsgleiche Spektren1 13
ergeben; durch H-NMR und C-NMR lassen sich infolge der
hohen Komplexizität der Systeme Anteile unter 10 % kaum nach-10)
weisen
Durch analytische Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel(Startzone: Kieselgur, Trennzone: Kieselgel, vgl. S. 99)
liess sich zwar eine gute Trennung erreichen: So konnten zum
Beispiel Chlorophyll a (20 oder Cetylchlorophyllid a (2J7) bei¬
nahe ohne Zersetzung von Verunreinigungen abgetrennt werden.
Die für die Optimierung von Einbau und Reinigung notwendige
Quantifizierung war jedoch nicht möglich.
10) Die Massenspektroskopie liess sich selbst für die metallfreien Ver¬bindungen nicht anwenden, denn Versuche mit Phäophorbiden und Pyro-phäophorbiden ergaben keine reproduzierbaren Massenspektren; dieTemperaturabhängigkeit der Aufnahmen z.B. bei Cetyl-phäophorbid aliess auf eine Zersetzung schon vor dem Verdampfen schliessen [l24](Ausnahme: Methyl-phäophorbid a).
- 29 -
Als günstigste analytische Methode schien deshalb die Hoch¬
druck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC), die mit einem
UV/VIS-Detektor dank der hohen Extinktionskoeffizienten der
Substanzen sehr empfindlich ist (Nachweisgrenze je nach Re-
tentionszeit 0,1-0,5 %), rasch und mit kleinen Substanzmen¬
gen arbeitet und deren Trennleistung diejenige der Dünn¬
schichtchromatographie um ein mehrfaches übertrifft.
Aufgrund der Erfahrungen mit HPLC an corrinoiden Liganden
[12 5] hatten J. Schreiber und E. Walter [2 9,3 0] Trennsysteme
mit Kieselgel als stationärer Phase für Alkyl-bakterio-
phäophorbide entwickelt, die sich mit Erfolg auch auf die
Chlorophyll b-Derivate übertragen Hessen [10 3] . Systeme ähn¬
licher Fliessmittelzusammensetzung konnten dann auch auf
Alkyl-phäophorbide a und unter den entsprechenden Vorsichts-
massnahmen auch auf Alkylchlorophyllide a angewendet werden.
Die Leistungsfähigkeit zur Trennung von Derivaten der Chloro¬
phyll a-Reihe wird in Abb. 14, S. 85 gezeigt. Die Nützlichkeit
der HPLC im Bereich der Chlorophyll-Derivate wird auch durch
ihre Anwendung in anderen neueren Arbeiten [56,73,83,126-128]
unterstrichen.
2.3. Reinigung von Phäophytin a
Orientierende Vorversuche von Isenring zur Darstellung von
Chlorophyll a (_2) durch Einführung von Magnesium in Phäophy¬
tin a (1_) hatten laut UV/VIS-Spektroskopie erwartungsgemäss
zur vollständigen Komplexierung geführt. Das isolierte Pro¬
dukt enthielt jedoch 10-20 % einer unbekannten, farblosen
Verunreinigung, die Isenring als eine aus dem eingesetzten
Phäophytin a stammende, phytolähnliche Substanz vermutete
(vgl. [101] ,S. 192). Für die in dieser Arbeit geplante Dar¬
stellung von analysenreinem 2_ war deshalb zuerst die Reini¬
gung des Edukts 1 notwendig:
- 30 -
o
co2CH3C02Phytyl
O
C02CH3C02Phytyl
1RIS
Schema 7
Phäophytin a (1) wurde durch Chromatographie an Kieselgel(vgl. [101]) aus einem Phäophytin a/b-Gemisch (Spinatextrakt)der Fa. Sandoz AG
11)in ca. 50 Ausbeute laut DC fast rein
erhalten. Laut HPLC (Detektorwellenlänge: 280 nm) bestand das
2eluierte Material aus einem Gemisch der beiden an C-13 epi-meren Phäophytine a (Schema 7), wobei das "natürliche" Epi-mere mit der thermodynamisch günstigeren trans-Konfiguration
2der beiden Seitenketten an C-13 und C-17 überwog (LR:1S_ =
81:19). Die qualitativen UV/VIS-Spektren der beiden separat
aufgefangenen Substanzen sind praktisch deckungsgleich, LR
wandelt sich im verwendeten HPLC-Lösungsmittel wieder in ein
Gemisch von LR und 1S_ um. Zudem konnten duch HPLC auch far¬
bige Nebenprodukte (ca. 4 %) neben farblosen Verunreinigun¬
gen nachgewiesen werden.
Reinigungsversuche durch die "klassische" Methode der Salz-
säurefraktionierung [129] brachten nur teilweisen Erfolg. Man
extrahierte eine Ätherlösung von Phäophytin a mehrmals mit
11) Herrn Prof. H.H. Inhoffen danke ich für das grosszügige Geschenk.
- 31 -
wässriger Salzsäure, deren Konzentration von 24 bis 32 % ge¬
steigert wurde. Die Porphyrinderivate lassen sich so auf¬
grund ihrer unterschiedlichen Basizität und Verteilungskoef¬
fizienten trennen [129] .Die Anreicherung von 1_ in den Frak¬
tionen höherer Salzsäurekonzentration war jedoch von einer
partiellen Hydrolyse des Phytylesters begleitet (Startfleck
im DC), so dass eine anschliessende Chromatographie notwendig
geworden wäre.
Im Gegensatz zu Phäophytin b [10 3] liess sich Phäophytin a
durch erneute Säulenchromatographie nicht befriedigend rei¬
nigen.
Durch mehrmaliges Umfallen aus heissem Aceton/Methanol gelang
es, die farblosen Verunreinigungen weitgehend abzutrennen, wo¬
bei die porphinoiden Verunreinigungen laut HPLC-Analyse nur
unvollständig entfernt wurden. Durch Entgasen der verwende¬
ten Lösungsmittel und Arbeiten unter Inertgas konnte die vor¬
her beobachtete Allomerisierung eingeschränkt werden, zudem
reicherten sich die Allomeren in der Mutterlauge an. Der Rei-
nigungseffekt zeigte sich am deutlichsten in den UV/VIS-Spek-
tren: Die spezifischen Extinktionen der Mutterlauge betrugen
nur ca. 55 % derjenigen des durch dreimaliges Umfallen er¬
haltenen Niederschlages. Bei dieser Reinigungsoperation rei¬
cherte sich das unnatürliche Epimere im Niederschlag an: Das
beobachtete Verhältnis _1R:3-S = 73,5:26,5 entspricht also nicht
] 2)der Gleichgewichtszusammensetzung
"
.In Aceton und Äther
stellte sich das Verhältnis innerhalb ca. 24 bzw. 48 Std. auf
84:16 bzw. 80:20 ein. Da sich beim Magnesiumeinbau überwie-
2
gend das "natürliche" 13 -Epimere von 2_ bildet (vgl. S. 34),
konnte auf die schwierige und aufwendige, mittels HPLC prin¬
zipiell mögliche Epimerentrennung verzichtet werden.
12) Man vergleiche dazu das Verhalten von Phäophytin b und Bakteriophäo-
phytin a, wo beim Umfallen die "natürlichen" Epimeren angereichert
werden ( [l03] S. 68 und [29] S. 31).
- 32 -
So gereinigtes 1 ergab eine befriedigende Verbrennungsana¬lyse. Die chemischen Verschiebungen im H-NMR-Spektrum (Abb.16 S. 98) stimmen innerhalb 0,05 ppm mit den Literaturdaten
[130] überein. Die Signale der C-Atome des Phäophorbid-Ge-13
rüsts im C-NMR-Spektrum weichen von denjenigen in Methyl-phäophorbid a (vgl. auch [131,34]) um höchstens 0,1 ppm ab.
Eine Ausnahme stellt das Signal bei 172,8 ppm (bzw. 173,3 ppm3in 2_0) dar, das den Atomen C-16 und C-17 zugeordnet wird
[34]. Die chemischen Verschiebungen der Alkoholkomponentesind in guter Übereinstimmung mit denjenigen von Phytylace-tat [132], Im IR-Spektrum (CHCl ; Abb. 15 S. 97) zeigen Sxch
-1nur im Bereich von 3030 bis 2 930 cm (C-H-Streckschwingun-gen) Unterschiede zu Methyl-phäophorbid a. Die Bandenlagenstimmen auch mit den für Phäophytin a beschriebenen überein
[133] .
Die Extinktionskoeffizienten in Äther: e (667,5) = 52'700,e (408,5) = 106'500 (Abb. 1, S. 36) liegen tiefer als die in
der Literatur [134] angegebenen Werte: e (667) = 61'000,e(409) = 129'000, was mit einer durch HPLC nicht erfassbaren
Verunreinigung von ca. 16 % erklärt werden könnte. Ein Ver¬
gleich der Extinktionskoeffizienten in Dioxan (genauer als
in Äther wegen der geringeren Verdunstung) mit andern, kri¬
stallinen Phäophorbid a-Derivaten fällt folgendermassen aus:
_,... , , . Methyl- Cetyl-Phaophytm a...
,,.-, ,..u i~ ^phäophorbid a
phäophorbid a
e(669): 52'200 54'400 53'900
e(412): HO'100 114'100 112'900
Diese Daten deuten auf einen Gehalt an nicht-porphinoiden Ver¬
unreinigungen von ca. 4 % hin, da man bei Chlorophyll-Deri¬vaten keinen Einfluss der Alkoholkomponente auf die Extink¬
tionkoeffizienten findet (vgl. auch [135]).
- 33 -
2.4. Komplexierung von Phäophytin a mit "BHT-Mg-J" zu
Chlorophyll a
Die ersten Vorversuche unter den Bedingungen von Isenring
[101] (4,6-facher Überschuss an "BHT-Mg-J" in CH Cl2/Äther,
Magnesiumkonzentration: 0,14 Mol/1, 10 bis 12 C, ca. 7 Min.)
ergaben trotz der Verwendung von entgastem Methylenchlorid
stets Nebenprodukte (je ca. 2-5 %) mit t = 8,2 Min. und
20,7 Min. (HPLC: System II, 81 ml/Std., t„ von 2R = 17,4
Min.), bei denen es sich wahrscheinlich um metallhaltige
Allomere handelte. Die demjenigen von 2_ sehr ähnlichen UV/
VIS-Spektren der durch HPLC aufgetrennten Proben und das ver¬
stärkte Auftreten dieser Verunreinigungen nach Eindringen
von Luft in das Reaktionsgefäss (Ans. 13, S. 105) stützen die¬
se Annahme. Bei der ersten Verunreinigung (t = 8,2 Min.)R
dürfte es sich in Analogie zu dem von Isenring ( [101] ,S.
174) bei der Komplexierung von Methyl-phäophorbid a beobach-
2teten Nebenprodukt um 13 -(Di-tert-butyl-4-methyl-phenoxy)-
Chlorophyll a = "BHT-Allomer" handeln, das sich laut HPLC
unter den Epimerisierungsbedingungen für Chlorophyll a nicht
veränderte. Durch rigoroses Entgasen des für das Grignard-
Reagens verwendeten Äthers gelang es, die Anteile dieser Ne¬
benprodukte auf je ca. 0,5-2 % zu senken. Die Verwendung
eines höher konzentrierten Einbaureagenzes (Magnesiumkonzen¬
tration in der Einbaulösung 0,56 statt 0,14 Mol/1) und damit
eines grösseren Überschusses bewirkte bei gleichzeitiger Ver¬
kürzung der Reaktionszeit auf 5 Min. vollständigere Komple¬
xierung (ca. 99,5 % statt ca. 96 %; HPLC).
Für präparative Ansätze wurden die in Schema 8 aufgezeigten
Reaktionsbedingungen angewendet. Nach Aufarbeitung mit Äther/
Phosphatpuffer bei 0 C wurde eine Komplexierung von über
99 % beobachtet, wobei der Anteil an Verunreinigungen laut
HPLC weniger als 5 % betrug. Für ein einwandfreies Gelingen
der Reaktion ist der Ausschluss von Sauerstoff trotz der An¬
wesenheit von BHT (Antioxidans') von entscheidender Bedeutung.
- 34 -
O
C02CH3CC^Phytyl
19 Mol Äquivalent
"BHT-Mg-J" (14)
Et O/CH Cl 72:28
5 Min./H-12° C
c(l) = 0,030 Mol/1
o
co2CH3C02Phytyl
1R + IS2R
Schema 8
Die Sauerstoffempfindlichkeit wurde in Ansatz 13 deutlich,als bei der periodischen Probenentnahme eindringende Luft
innerhalb 10 Min. zur Oxidation der Hälfte des Chlorophyllsführte!
Bei allen Komplexierungsversuchen trat eine überaus signi¬fikante Verschiebung der Epimerenverhältnisse ein: Ausgehendvon einem Verhältnis 1R:_1S_ = 73,5:26,5 wurde ein Verhältnis
2JR:2jS = 98,4:1,6 gefunden, während die Gleichgewichtslagebei ca. 88:12 bis 79:21 liegt (vgl. S. 42). Die stark bevor¬
zugte Entstehung des natürlichen Epimeren kann durch die
Bildung eines exo-Magnesium-Komplexes des 3~Ketoestersystemsim isocyclischen Ring und bevorzugte, kinetisch kontrollier¬te Protonierung zu 2R erklärt werden (vgl. 2.6, S. 47).
Die Reinigung des durch Absublimieren im Hochvakuum vom BHT
befreiten Rohprodukts (weniger als 5 % Verunreinigungen laut
HPLC) wurden unter striktem Sauerstoffausschluss in der Dry-Box (Stickstoffatmosphäre, Sauerstoffgehalt < 5 ppm) ausge¬
führt. Nach anfänglich erfolglosen Kristallisationsversuchenzur Reinigung des Rohprodukts gelang es, in Anlehnung an die
- 35 -
Versuche von Iriyama et al. [136,137] ,die Hauptmenge der
Verunreinigungen durch Fällen aus Dioxan/H„0 abzutrennen und
13)laut HPLC eine Reinheit von über 98 % (ZR + 2j3) zu er¬
reichen. Die trotz der mit den Literaturdaten [130-132] über-
1 13einstimmenden H-NMR- und C-NMR-Spektren völlig falschen
Werte der Verbrennungsanalyse und die zu niedrigen Extink¬
tionskoeffizienten konnten vorerst nicht erklärt werden. Aus
dem Wasser oder Dioxan stammende Verunreinigungen oder schwer
entfernbare, mit den verwendeten Mitteln nicht nachweisbare
Nebenprodukte wurden aufgrund von Blindproben (Durchführung
der Reaktion und der Aufarbeitung unter Verwendung aller
Reagenzien, aber ohne Zugabe von Phäophytin a) ausgeschlossen.
Bei weiteren Ansätzen zeigte sich dann, dass das Rohprodukt
einen farblosen, in organischen Lösungsmitteln und Wasser un¬
löslichen, sehr fein verteilten Festkörper enthielt, der
beim Aufarbeiten nur zusammen mit Chlorophyll a in die Äther¬
phase gelangte. Es dürfte sich dabei um ein Magnesiumphos¬
phat handeln (vgl. [138]). Infolge der überwiegend sehr fei¬
nen Verteilung liess sich die Verunreinigung nicht durch die
üblicherweise angewendete Filtration durch Watte entfernen,
sondern konnte nur durch Zentrifugieren der Dioxanlösung vor
der Fällung mit H~0 abgetrennt werden.
Das so in 73 % Ausbeute isolierte, als sehr feines Pulver
aus Dioxan/H 0 ausgefallene Chlorophyll a (Reinheit laut HPLC
ca. 99 %, ZR:_2S ca. 92:7) enthielt nach Trocknen am HV bei
RT ca. 0,75 Mol Dioxan und 0,25 Mol H„0. Dieser Lösungsmittel-
1
gehalt ist sowohl mit dem H-NMR-Spektrum als auch mit der
Elementaranalyse vereinbar.
Der Vergleich der UV/VIS-Spektren von 1_ und 2_ in Äther (Abb.
1 und 2) zeigt die erwartete bathochrome Verschiebung und die
stärkere Strukturierung der Soret-Bande, sowie die hypso-
13) Die in Dioxan rasche Epimerisierung führte zu einem Verhältnis 2R:2S
ca. 95:5 im Niederschlag.
- 36 -
chrome Verschiebung der Rotbande von _2 relativ zum metall¬
freien Edukt 1.
—i—
700
200400
Abb. 1 (oben) UV/VIS-Spektrum von Phäophytin a (1)
c = 8,69-10~6 Mol/1 in Äther
Abb. 2 (unten): UV/VIS-Spektrum von partialsynthetischem
Chlorophyll a (2)
c = 7,61-10~6 Mol/1 in Äther
Die für den Lösungsmittelgehalt korrigierten Extinktionskoef¬
fizienten in verschiedenen Lösungsmitteln stimmen gut mit den
Literaturdaten [134 ,135] überein und liegen ca. 4 % unter
den von Isenring für Methyl-chlorophyllid a gefundenen Werten
[lOlJ. Bei den Vergleichen ist zu beachten, dass Seely und
Mitarbeiter [135] nicht die absoluten Extinktionskoeffizien¬ten bestimmten, sondern als Basis die Werte von kristallinem
Äthyl-chlorophyllid a in Aceton [13 9] verwendeten. Die Spek¬tren in apolaren Lösungsmitteln sind vom Wassergehalt abhän-
- 37 -
gig und werden durch Aggregation sehr stark beeinflusst
[140-14 3]. Die breiten Absorptionsbanden und die niedrigen
Extinktionskoeffizienten in (trockenem) Benzol sind auf die¬
sen Effekt zurückzuführen.
Beim Vergleich der IR-Spektren von 1_ und 2_ (Abb. 15, S. 97
und Abb. 19, S. 118) fallen das Verschwinden der N-H-Banden
bei 34 00 cm sowie die Veränderungen im Bereich der C=0-
Streckschwingungen von 1750-1600 cm auf, wo sich die ur¬
sprünglich 3 Banden in ein System von 4 Peaks aufspalten.
Ausführliche Diskussionen der IR-Spektren und ihrer Lösungs¬
mittel- (Aggregations-) Abhängigkeit findet man in [133,141,
145-147]. Die Spektren in CHC1 (Abb. 19, S. 118), CCl und
KBr sind in guter Übereinstimmung mit den bekannten Daten
[148] , [145-147] und [149] .
Das H-NMR-Spektrum in Aceton-d, (Abb. 20, S. 118) stimmt mit
Ausnahme der Lösungsmittelsignale mit dem in [150,151]
überein, das Spektrum in Deuterochloroform/Deuteromethanol
88:12 ist mit demjenigen in [130] vereinbar, die chemi¬
schen Verschiebungen der Protonen im Chlorophyllid-Skelett
weichen auch nicht mehr als 0,06 ppm von denjenigen in Me-
thyl-chlorophyllid a ab [101].
Die C-NMR-Spektren in Aceton-d, und in CDC1_/CD.0D (Abb. 21
1 A \
und 22, S. 119) entsprechen den Literaturdaten [34] bzw.
14)[132] ,
wobei die Abweichungen 0,2 ppm selten übersteigen.
Die Kristallisation der Chlorophylle stellt ein schwieriges
Problem dar. Aus zahlreichen Untersuchungen [152-157] geht
die Notwendigkeit der Anwesenheit von Wasser [149-158] hervor,
Kristallisation aus Aceton/H„0 [149] schien am günstigsten,
nachdem schon Isenring [101] auf diese Art (allerdings verun¬
reinigte) Kristalle erhalten hatte, die ein ausgezeichnetes
14) Die untersuchten Chlorophyll-Proben waren nach den Methoden von
Strain et al. [l44,44] , Irijama et al. [l25] oder Jacobs et al. [l37]durch Extraktion von Spinatblättern oder Blaualgen gewonnen und durch
Chromatographie an Puderzucker von Carotinoiden und nötigenfalls von
Chlorophyll b abgetrennt und gereinigt worden.
- 38 -
Pulverdiagramm [159] ergaben. Nach erfolglosen Kristallisa¬
tionsversuchen auch aus Hexan/Äther/Wasser, Dioxan/Wasserund THF/Wasser gelang nach wiederholten Bemühungen die Kri¬
stallisation aus Aceton/H„0 7:1 durch sehr langsames (5 Wo¬
chen) Eindunsten in der Dry-Box. Das in Klümpchen kristalli¬
sierte Material ergab ein Pulverdiagramm mit deutlich ge-15)
trennten Linien und wurde unter dem Polarisationsmikro¬
skop bei 500-facher Vergrösserung eindeutig als kristallin
erkannt. Die grössten Kristalle zeigten Ausdehnungen von ca.
1,5x6jj und waren somit für eine Röntgenstrukturanalyse lei¬
der ungeeignet.
2Die Anreicherung des natürlichen Epimeren mit (13 -R)-Kon¬
figuration bei der Kristallisation wurde durch HPLC nachge¬wiesen. Das Kristallisat bestand aus 98,8 % _2R, 0,5 % 2S^ und
ca. 0,7 % Nebenprodukten (umgefälltes Ausgangsmaterial: 91,4 %
2R, 7,4 % 2_S und 1,2 % Verunreinigungen; Gleichgewicht 2R: 2S
= 79:81). Der Lösungsmittelgehalt der Kristalle ist nicht be¬
kannt. Die Tendenz des koordinativ ungesättigten Magnesiums,
polare Lösungsmittel zu koordinieren [141,143,145,160] und
die Beobachtungen bei der Röntgenstrukturanalyse von Äthyl-und Methyl-chlorophyllid a [158,110-112] lassen vermuten,dass 2 Mol HO koordiniert sind (evtl. auch Aceton). Die
unter dieser Annahme (MG = 929,54) berechneten Extinktions¬
koeffizienten liegen in allen untersuchten Lösungsmitteln
(Äther, Dioxan, Aceton) ca. 4,5 % höher als diejenigen des
umgefällten Materials.
Die in verschiedenen Arbeitsgruppen [161,162] gemessenen CD-
Spektren in Äther zeigten bedeutende Abweichungen voneinan¬
der, die mit unterschiedlicher Qualität der verwendeten Chlo-
15) Die Lagen der Reflexe sind identisch mit den in der von Kratky [l59]beschriebenen Pulveraufnähme (Chlorophyll a von H.P. Isenring herge¬stellt und kristallisiert; nicht gereinigt, spektroskopischer Gehaltca. 88 % [lOl]) .
- 39 -
rophyll-Proben begründet wurden [162]. Prokhorenko et al.
[162] fanden in einer Chlorophyll-Probe, die nach der von
Houssier et al. [161] verwendeten Vorschrift hergestellt wor¬
den war, Epimere und Allomere als Verunreinigungen. Leider
wurde die Reinigungsmethode für das verwendete Chlorophyll
a in [162] nicht beschrieben, sondern auf eine Dissertation
verwiesen.
Die Messung der CD-Spektren wurde wegen dieser Unterschiede
mit besonderer Sorgfalt durchgeführt. Die Chlorophyll-Proben
epimerisierten in den verwendeten Lösungsmitteln relativ lang¬
sam, so dass der Gehalt an Epimer (^2_S) während der Aufnahme
des CD-Spektrums in Äther (Abb. 25, S. 12 3) ca. 2-3 % und in
Aceton (Abb. 24, S. 123) ca. 1-1,4 % betragen haben dürfte
(vgl. S. 40 und exp. Teil S. 125). In den gleichen Lösungsmit¬
teln gelöste und in der Dry-Box aufbewahrte Proben von 2_R wa¬
ren während mindestens 14 Tagen stabil; d.h. ausser Epimeri-
sierung (vgl. S. 125) konnten durch HPLC keine Veränderungen
festgestellt werden.
Das in Äther aufgenommene CD-Spektrum (Abb. 25, S. 123) zeigte
sehr deutliche Unterschiede zu den publizierten Daten (Tabelle
3). Diese Unterschiede können nicht mit Differenzen im Epime¬
rengehalt der einzelnen Lösungen erklärt werden: Aufgrund des
in [162] beschriebenen Spektrums von 2_S erwartet man nämlich
bei hohem Epimerengehalt ein grosses Verhältnis Ae (432)/Ae (399)
gepaart mit einem grossen Verhältnis | Ae (432) | / | Ae (656) | .
Tabelle 3: CD-Spektren von Chlorophyll a in Äther
Diese Arbeit [l6l] [162] _2_S [162]
nm Ae nm Ae nm Ae nm Ae
656 -7,6 661 -13,8 656 -12,7 656 -18,3
432 +9,3 428 + 11,0 432 + 12,5 432 +28,5
399 +7,0 400 +6,9 392 + 7,6 392 -10,4
16) E.G. Sud'ina, Dissertation, Odessa (1959)
- 40 -
Da die Zusammensetzung des Kristallisats nicht der Gleichge¬wichtszusammensetzung entsprach, bot sich Gelegenheit, die
Epimerisierungsgeschwindigkeit in verschiedenen Lösungsmit¬teln zu untersuchen. Durch Einengen von Proben der verschie¬
denen Lösungen von ^2R und ihre anschliessende Untersuchungdurch HPLC wurden die Epimerenverhältnisse in Abhängigkeitder Zeit bestimmt. Die Resultate sind in Abb. 3 graphischdargestellt.
_! , ( ,
100 200 Std.
Abb. 3: Epimerisierung von 2_R in verschiedenen Lösungsmittelnbei RT. Aufgezeichnet ist der Anteil von ^S am Gesamt-
Chlorophyll-Gehalt (in %)
1 Äther 3 Aceton/H20 5 Dioxan/H 0
2 Aceton 4 Dioxan 6 MeOH
Die Gleichgewichtslagen und besonders die Epimerisierungsge-schwindigkeiten sind sehr stark von den Lösungsmitteln abhän¬
gig.
Die Epimerisierung erfolgt über eine Enolat- oder in nicht¬
basischen Lösungsmitteln wahrscheinlicher über eine Enol-
Zwischenstufe 1£ [145,147,163] (Schema 9).
- 41 -
C02Phytyl C02Phytylu n
C02Phytyl
2R ü 2S
Schema 9
In den aprotischen Lösungsmitteln nimmt die Epimerisierungs-
geschwindigkeit mit zunehmender Polarität (zunehmender Di¬
elektrizitätskonstante: Dioxan, Äther, Aceton) ab. Durch Zu¬
satz von H„0 wird die Epimerisierung stark verlangsamt.
Diese Tendenz stimmt mit der Beobachtung überein, dass in Fäl¬
len, wo die Ausbildung einer intramolekularen Wasserstoff¬
brücke möglich ist, die Enolisierung in apolaren Lösungs¬
mitteln gefördert wird [164]. Es bestehen aber (scheinbar)
1 r -i
gegensätzliche Beobachtungen ( H-NMR) von Katz et al. |_16 3J ,
wonach Chlorophyll a in THF um ein Mehrfaches schneller epi-
merisiert als in Benzol. In trockenen, apolaren (Magnesium
nicht koordinierenden) Lösungsmitteln ist jedoch die Möglich-2
keit der Bildung von Aggregaten durch Koordination der 13 -
Carbonyl-Gruppe mit dem Magnesiumatom anderer Chlorophyll-
Moleküle zu beachten [147,141,165].' Die ausserordentlich
rasche Epimerisierung in Methanol kann jedoch nicht erklärt
werden.
Die Gleichgewichtszusammensetzungen in verschiedenen Lösungs¬
mitteln sind in Tabelle 4 zusammengestellt.
- 42 -
Tabelle 4: Epimerengleichgewichte von Chlorophyll a
2R : _2S
Dioxan 88 : 12
Äther 79 : 21
Aceton 79 : 21
Methanol 83 : 17
2.5. Cetyl-chlorophyllid a
Da es nicht gelungen war, Einkristalle von Chlorophyll a in
der für eine Röntgenstrukturanalyse benötigten Grösse zu er¬
halten, wurde versucht, ein Chlorophyll-Derivat mit möglichstähnlichen Eigenschaften wie 2_ kristallin herzustellen. Cetyl-
chlorophyllid a (2_7) schien dafür am günstigsten: Wegen der
gleichen Kettenlänge von Phytol (J^2) und Cetylalkohol (13)dürften sich vergleichbare Kristalle ergeben und dank dem
Fehlen der Doppelbindung und der Methylgruppen erwartete man
eine bessere Kristallisierbarkeit. Zudem wurde Cetylalkoholauch als natürliche Alkoholkomponente in Bakteriochlorophylle (1_0) gefunden [7 9] . Die Synthese von 2_7 wurde auf dem in
Schema 10 aufgezeichneten Weg durchgeführt.
Methyl-phäophorbid a (2J)) ist aus Phäophytin a (1) durch Um-
esterung in methanolischer Schwefelsäure leicht und in guterAusbeute zugänglich und lässt sich im Gegensatz zu 1. durch
Kristallisation gut reinigen. Das so hergestellte 2^) besteht
nur aus einem Epimeren ( H-NMR), obwohl die Gleichgewichts¬lage 20R:20S bei ca. 86:14 [166] liegt.Da Phäophorbid a (21.) nicht völlig problemlos kristallisier¬te und der Reinigungseffekt nicht ganz überzeugte, wurde auf
die direkte Hydrolyse des ebenfalls nicht leicht zu reinigen¬den 1_ (vgl. S. 30) verzichtet und der Weg über 20_ gewählt.Die Bildung von Pyro-phäophorbid a, die wahrscheinlich über
- 43 -
1R + IS
MeOH/H2S04
C02CH3
O
C02CH3
24-proz. HCl/
Et 0
± 1
Rückfluss,
30 Min.
C02H
O
C02CH3
+ 24
20R 21R + 21S
C16H33OHPhosgen/Pyridin
0-20°C/2 Std.
O
C02CH3C02^16H33
2 7R + 2 7S
19 Mol-Äquivalent
"BHT-Mg-J" (14:)-m
Et20/CH2C12 72:28
5 Min./ll-12°C
O
C02Cri3C02C16H33
2 3R -r 2 3S
Schema 10
3die konkarrierende Hydrolyse der 13 -Esterfunktion, qetolgt
von einer spontanen Decarboxy1ierung der entstandenen '-Keto-
sciure erfolgt, iiess sich bei der Verseifunq von 2_0 (24-proz,
HCl/Äther; Rücki'iuss, 30 Min.) nicht völlig vermeiden. Neben
einem Gemisch von 21R und 21S ais Hauptprodukte wurden stets
- 44 -
ca. 10 % Pyro-phäophorbid a (2J5) und ca. 5 % Edukt 20_ gefun¬den (DC) .
Da bei der Darstellung des bisher unbekannten Cetyl-chloro-phyllid a eine eindeutige Identifikation und Reinheitskon¬trolle nötig war, wurden zu Vergleichszwecken auch die metall¬
freien Derivate der Pyro-Reihe ausgehend von Methyl-pyro-phäophorbid a (24) hergestellt (Schema 11).
C02CH3
/ O
C02CH3
Collidin
Rückfluss,
10 Min.
C02CH3
20R24
24-proz. HCl/Et 0
Rückfluss/30 Min.
C16H33OH
Phosgen/Pyridin
0-20°C/2 Std.
C02Ci6H33 C02H
2625
Schema 11
- 45 -
Da für die Veresterung von ^1 wegen der hohen Oxidations-
empfindlichkeit der Chlorine viele der modernen, auf einem
Redox-Mechanismus beruhenden Veresterungsmethoden (vgl. z.B.
[167]) nicht in Betracht kommen, versuchte man zuerst die
Kondensation über die Aktivierung des Alkohols zu erreichen.
Weder die Umsetzung von ^L mit Cetylalkohol in Gegenwart von
Dimethylformamid-dineopentylacetal, noch die Veresterung von
21 mit Dimethylformamid-dimethylacetal [168] gelangen in be¬
friedigender Ausbeute. Bei den in Analogie zu der von Wasie-
lewski et al. [107] beschriebenen Darstellung des Phäophor-
bid a-äthylenglykol-monoesters ausgeführten Versuchen zu
Veresterung mittels Chlorameisensäure-methylester in Gegen¬
wart von Äthyldiisopropylamin bildete sich zwar das entspre¬
chende gemischte Anhydrid _22_, das sich auch aus dem Reaktions¬
gemisch isolieren liess, die anschliessende Umsetzung zu 2_3
war jedoch zu langsam. Sie liess sich auch durch Umsetzung von
22 mit 1_3 unter Zusatz von 4-Dimethylaminopyridin [169] oder
3,3,6,9,9-Pentamethyl-2,10-diaza-bicyclo[4,4,0] -l-decen-2-
oxid [170,171] nicht erreichen. Da auch die Versuche zur
Veresterung von ^L mit 13 in Trifluoracetanhydrid nicht zum
Ziel führten, griff man auf die Methode von Fischer [118],
der Cetylpnäophorbid als erster hergestellt hatte, zurück und
setzte 2\_ mit 1_3 in Pyridin mit Phosgen zu 2_3 um. Nach HC1-
17)Fraktionierung und Säulenchromatographie an Kieselgel
18)wurde der Ester in 62 % Ausbeute als Gemisch der beiden
Epimeren 23R und 23S (ca. 88:12) isoliert. Cetyl-phäophorbid
a konnte aus heissem Aceton/Methanol als Epimerengemisch kri-
1 13stallisiert werden. Die UV/VIS-, IR-, H-NMR- und C-NMR-
Spektren sind denjenigen von Methyl-phäophorbid a (2_0) und
Cetyl-pyro-phäophorbid (2_6_) sehr ähnlich.
17) Durch die Abtrennung der Hauptmenge an überschüssigem 1_3_ wurde die
nachfolgende Chromatographie erleichtert.
18) Reinheit laut HPLC über 99 %; insbesondere konnte die Abwesenheit
des entsprechenden Pyro-Derivates nachgewiesen werden.
- 46 -
Man führte das Magnesium unter den für Phäophytin a optimier¬ten Bedingungen, allerdings in kleineren Ansätzen, ein und
beobachtete dabei die analoge Anreicherung des "natürlichen"
Epimeren von Cetyl-chlorophyllid a (2_7) , aber einen etwas
höheren Anteil an Allomer (ca. 1 %). Umfallen aus Dioxan/H„0 unter den Bedingungen wie für 2^ ergab einen vergleichba¬ren Reinigungseffekt, wobei auch hier Epimerisierung (von
27R;27S = 98:2 im Rohprodukt zu 93:7 im Niederschlag) eintrat.
Die sehr hohe Ähnlichkeit der UV/VIS-, IR-, H-NMR- und 13C-NMR-Spektren mit denjenigen von Chlorophyll a beweist die
Strukturzuordnung. Die Extinktionskoeffizienten liegen jedochetwas tiefer als diejenigen von 2^. Die Signallagen der Pro¬
tonen des Chlorophyllid-Skeletts weichen nicht mehr als 0,0513ppm von denjenigen in _2 ab, die Abweichungen im C-NMR-
Spektrum liegen innerhalb 0,1 ppm.
Durch Kristallisation aus Aceton/H„0 unter den für 2^ ange¬
wandten Bedingungen wurde ein amorph scheinendes Pulver er¬
halten, dessen Kristallinität sich unter dem Polarisations¬
mikroskop aber zweifelsfrei zeigte (grösste Kristalle ca. 30p).Das Pulverdiagramm ist besser aufgelöst als dasjenige von
Chlorophyll a und weist auf eine vergleichbare Kristallstruk¬
tur hin. Durch HPLC wurde jedoch ein sehr hoher Allomerenge-halt nachgewiesen, dessen Entstehung auf Verunreinigung(Sauerstoff) der Dry-Box-Atmosphäre zurückgeführt werden muss.
Ein weiterer Kristallisationsversuch mit frisch hergestelltem
Cetyl-chlorophyllid a gelang ohne starke Allomerisierung, die
entstandenen Kristalle mit grössten Abmessungen von ca. 20ywaren jedoch für eine Röntgenstrukturanalyse ungeeignet.
- 47 -
2.6. Einige Beobachtungen zum Mechanismus des Magnesium¬
einbaus
Nach der Einführung von Magnesium in das Epimerengemisch von
Phäophytin a wurde in allen Versuchen jeweils nur ein sehr ge¬
ringer Anteil des unnatürlichen Epimeren (S-Konfiguration an
2C-13 ) gefunden. Die gleiche Tendenz war auch beim Magnesium¬
einbau in Phäophytin b festgestellt worden [1031 .Die beim
Einbau beobachtete Farbänderung der Lösung von graubraun nach
gelbgrün deutete auf das Entstehen eines im ß-Ketoestersystem
des isocyclischen Rings enolisierten Zwischenproduktes hin.
Mit einem vergleichbaren Enolat wird auch die charakteristi¬
sche Farbe des Molisch1sehen Phasentests [172] erklärt.
Das VIS-Spektrum der Reaktionslösung (Phäophytin a: 0,75 mM,
BHT-Mg-J: 0,5 M in CH Cl2/Äther, 0,2 mm-Zelle) zeigt mit der
Aufspaltung der Soret-Bande das charakteristische Merkmal
eines enolisierten Chlorophyll-Derivates ( [101] , vgl. auch
[105]). Eine hohe Ähnlichkeit besteht zu den peripheren
Magnesiumkomplexen, die Scheer und Katz [173,174] durch Um¬
setzung von Methyl-phäophorbid a mit Mg(C10.)„ in trockenem
Pyridin erhalten hatten. Eine sehr gute Übereinstimmung ergibt
sich auch mit den Spektren eines peripheren Magnesiumkomplexes
28 (Schema 12), in CH2C12, den B. Jaun [104] durch Umsatz
einer Lösung von Magnesium-methoxid und Hydroxy-trimethyl-2 3
benzochinon 1:1 mit 13 ,17 -Cyclo-chlorophyllid-enol a (17)
dargestellt hatte.
Der im Reaktionsgemisch vorliegende Komplex wird daher wahr¬
scheinlich am besten durch die Formel 2_9 beschrieben (Schema 12) :
Die Spektren der Reaktionslösung nach verschiedenen Reaktions¬
zeiten sind in Abb. 4, S. 49 wiedergegeben.
- 48 -
C02Phytyl O-Mg
2829
Schema 12
Sowohl die Lage als auch das Verhältnis der optischen Dichten
der Soret-Maxima sind mit denen in 2_8 praktisch identisch.
Geringe Unterschiede ergeben sich bei den Schultern zwischen
450 nm und 520 nm, sowie bei der Rotbande, deren Maximum in
28 bei 682 nm liegt, gegenüber 662 nm im Spektrum der Reak¬
tionslösung.
Die Möglichkeit zur Ausbildung eines Enolats scheint die Ein¬
führung von Magnesium zu erleichtern, wurden doch bei allen
in unserer Arbeitsgruppe untersuchten Derivaten der Chloro¬
phyll a-, Chlorophyll b- und Bakteriochlorophyll a-Reihe für
Verbindungen mit intaktem ß-Ketoestersystem höhere Einbauge¬schwindigkeiten mit "BHT-Mg-J" als für die entsprechenden
Pyro-Derivate gefunden [101,103]. Diese Beobachtungen stehen
im Gegensatz zu den Befunden von Scheer et al. [174] , die
bei Versuchen zum Magnesiumeinbau im System Mg(CIO.)„/Pyridineine Komplexierung des ß-Ketoestersystems der metallfreien
Verbindungen erreichten [173,174], wodurch aber der Metall¬
einbau verhindert wurde. Die Einführung von Magnesium gelangmit Mg(CIO.)„/Pyridin nur in die Pyro-Derivate [106,174].
- 49 -
Abb. 4
800 nm
u-
- 0D,
12- /\
-V \
i \
10-
J V/' '1
08-
7
\^f
06- \J\
04-
02-
\
\\
7 V
oo-
I ' l 1' 1 1
Abb. 5
300 400 500 600 700 800 nm
Abb. 4: Komplexierung von _1
Beginn der Aufnahme (10 nm/Sek.)
I Min. 45 Sek.
19 Min. nach Mischen (RT)
Abb. 5: Komplexierung von 2^
Beginn der Aufnahme (10 nm/Sek.)
5 0 Sek.
. 2 Min. 40 Sek.
15 Min. nach Mischen (RT)
- 50 -
Die Darstellung peripherer Magnesiumkomplexe bereits metall¬
haltiger Verbindungen gelang Scheer und Katz [16 3] nicht.
Im Gegensatz dazu liess sich der Magnesium-exo-Komplex aus¬
gehend von Chlorophyll a mit "BHT-Mg-J" 14_ ohne Schwierigkei¬ten erzeugen. Die entsprechenden VIS-Spektren sind mit den
durch Umsetzung von Phäophytin a unter gleichen Bedingungenerhaltenen Aufnahmen fast identisch. Abb. 5 zeigt die nach
unterschiedlicher Reaktionsdauer gemessenen Spektren.
Die Bildung des peripheren Komplexes könnte somit vor oder
nach der Einführung des zentralen Magnesiumatoms erfolgen.In Analogie zur angenommenen stereoselektiven Protonierungvon 29_ zu _2R nach dem Magnesiumeinbau würde man auch eine
solche des entsprechenden peripheren Magnesiumkomplexes von
Phäophytin a zu LR erwarten. Die Untersuchungen des Epime-renverhältnisses im nicht komplexierten 1. nach einer Reak¬
tionsdauer von ca. 2 bis 2 0 Sek. ergaben ausgehend von einem
Verhältnis LR:1£> unter dem Gleichgewichtsverhältnis ein Ver¬
hältnis 1R:1_S über der Gleichgewichtszusammensetzung (Tabellen
16, 17, S. 163). In einzelnen Fällen (nach 2 und 5 Sek. bei
10 C) war die Abnahme von JLS stärker als die Zunahme von 2R;es wurde also die postulierte Vergrösserung des Gehalts an LR
oezüglich der Gesamtmenge an Porphyrinderivaten beobachtet.
Diese Resultate (höchstens 71 % -> 79 %) sind aber nicht sehr
signifikant. Die Geschwindigkeit der Komplexierung des Zentrums
und des ß-Ketoestersystems scheinen nicht stark unterschiedlich
zu sein und erlauben somit nicht, eine stereoselektive Proto¬
nierung des Phäophytin a-exo-Komplexes zu beobachten.
- 51 -
3. UNTERSUCHUNGEN AN REAKTIONSZENTREN
3.1. Einleitung
Über die Eigenschaften und Funktion bakterieller Reaktions¬
zentren (RC) existieren verschiedene umfassende Ubersichts-
artikel [26-28] ,es soll hier deshalb eine sehr kurze Zusam¬
menfassung genügen:
Die auf grüne Pflanzen und photosynthetische Bakterien einfal¬
lende Lichtenergie wird durch ein System von Lichtsammler-
(Antennen-) Pigmenten aufgefangen und auf die Reaktionszen¬
tren (P700 des Photosystems I in grünen Pflanzen, P870 bzw.
P96 0 in phototrophen Bakterien, die Bakteriochlorophyll a bzw.
b enthalten) übertragen, die durch ein längerwelliges Absorp¬
tionsmaximum relativ zur Antenne gekennzeichnet sind. Die RC
sind von den Antennen sowohl funktionell als auch strukturell
verschieden und lassen sich prinzipiell von ihnen abtrennen.
Während aber die Anreicherung von Reaktionszentren der Gefäss-
pflanzen sehr schwierig ist, und bis anhin höchstens Ver¬
hältnisse von P700 zu Chlorophyll a ca. 1:20 erreicht wurden
[175], gelingt es in einigen Fällen, bakterielle Reaktions¬
zentren von den Antennenpigmenten vollständig abzutrennen
[21,24,176-179]. Für die Untersuchung der Primärprozesse sind
die RC aus Bakterien auch deshalb sehr gut geeignet, weil de¬
ren Photosyntheseapparat bedeutend einfacher ist als derje¬
nige der höher entwickelten grünen Pflanzen [28] und sich
durch die Züchtung von geeigneten Mutanten einzelne Eigen¬
schaften besser untersuchen lassen.
Die Reaktionszentren der hauptsächlich untersuchten Organis¬
men Rhodospirillum rubrum und Rhodopseudomonas sphaeroides
scheinen sich nicht sehr stark zu unterscheiden. Die durch Be¬
handlung mit dem Detergens Lauryldimethylaminoxid (LDAO) von
den Membranen abgelösten Partikel bestehen aus drei Unterein-
- 52 -
heiten mit Molekulargewichten von 21'000, 24'000 und 28'000,die in einer Natriumdodecylsulfat-Lösung dissoziieren [24].Durch sorgfältige Behandlung mit LDAO und Natriumdodecylsul-fat lässt sich das grössere, pigmentfreie Protein unter Er¬
haltung der Photoaktivität im Komplex der beiden andern Pro¬
teine abtrennen [24]. Die Aminosäurezusammensetzung der RC in
den beiden Organismen sind sehr ähnlich [25] . Pigmentanaly¬sen sowohl in R. sphaeroides [22,95,96] als auch in R. rubrum
[23] ergaben ein Verhältnis von Bakteriochlorophyll a {6)/
Bakteriophäophytin a (_11) 2:1, wobei die RC 4 Moleküle 6_und 2 Moleküle 2J- enthalten [22,23,95]. Daneben enthalten
die RC im allgemeinen 1 Mol Ubichinon und 1 Mol Nicht-Häm-
Eisen [24,180,181] .
Die folgende Reaktionssequenz der photosynthetischen Energie¬
umwandlung scheint wahrscheinlich: Die von den Antennen auf
die RC übertragene Lichtenergie führt zu einer Ladungstren¬
nung und damit zur Ausbildung eines Radikalkations und eines
Radikalanions. Wahrscheinlich dient ein Assoziat von 2 Bak¬
teriochlorophyll a (oder b)-Molekülen [182,183] als Elektro-
nendonor: ESR- und ENDOR-Spektren des entstandenen Radikal-
Kations deuten auf eine Delokalisation über beide Pigmentmo¬leküle hin [184,185]. Als intermediärer Akzeptor wird Bakte¬
riophäophytin aufgrund von Messungen der VIS-Spektren im Pico-
sekundenbereich vorgeschlagen [97,98]. Als Primärakzeptordient wahrscheinlich ein Ubichinon-Eisen-Komplex [186].
In isolierten RC (R. rubrum, R. sphaeroides) ist die Absorp¬tionsbande im Bereich von 870 nm durch Belichtung reversibel
ausbleichbar [176,181,187] (Oxidation des photoaktiven P870).
Die hauptsächlichsten Veränderungen im VIS/NIR-Spektrum sind:
Entstehen einer schwachen Absorptionsbande bei 1245 nm, Aus¬
bleichen der Bande bei 870 nm, Verschiebung des Maximums von
802 nm auf 800 nm, Erhöhung der Absorption im Bereich von
770 nm und Abnahme des Extinktionsmaximums bei 600 nm (vgl.auch Abb. 10, S. 68). Die beschriebenen Veränderungen lassen
- 53 -
sich auch durch chemische Oxidation mit K Fe(CN), [178,188]
(vgl. auch Abb. 9, S. 66) oder mit HO [189] erreichen.
Dank der Erfolge bei der Isolierung und Reinigung der Reak¬
tionszentren aus der carotinoidarmen Mutante R. rubrum G 9
in der Arbeitsgruppe von Prof. Bachofen am Institut für Pflan¬
zenbiologie der Universität Zürich konnten uns RC für eigene
Untersuchungen zur Verfügung gestellt werden. Die Vorschrif¬
ten zur Herstellung der RC-Präparationen sowie ihre Zusammen¬
setzung sind in [190,179] beschrieben; die wichtigsten Daten
sind auch auf S.178 zusammengestellt. Die von E. Walter durch¬
geführte Pigmentanalyse solcher Proben ergab ein Verhältnis
von Bakteriochlorophyll a /Bakteriophäophytin a von ca.
2:1 [29,30].
3.2. Problemstellung
Die Funktion der einzelnen Bestandteile der Reaktionszentren
ist noch nicht völlig geklärt und zum Teil umstritten, ins¬
besondere fehlen detaillierte Strukturinformationen. Wir ha-
13ben die Frage untersucht, ob durch C-NMR-DifferenzSpektro¬
skopie Informationen über die aktive Form der Pigmente gewon¬
nen werden könnten.
Für die Untersuchung der Konstitution und allfälliger symme¬
trischer Anordnungen der Chlorophylle und Phäophytine im ak-
13tiven Protein-Pigment-Komplex ist die Anreicherung an C
notwendig, einerseits um überhaupt eine genügend hohe Kon-
13zentration äquivalenter C-Kerne und damit ein akzeptables
Signal/Rauschen-Verhältnis zu erhalten (maximal erreichte RC-
-4Konzentration 4-10 Mol/1) und anderseits um die Signale der
interessierenden Porphyrine im Verhältnis zu den Protein¬
signalen zu verstärken. Wir interessierten uns besonders für
die Frage nach der Bedeutung des 3-Ketoestersystems im iso-
cyclischen Ring, besitzen doch alle bis anhin in Reaktions-
- 54 -
Zentren gefundenen Chlorophylle und Phäophytine diese intakte
3-Ketoester-Struktur. Die Frage, ob diese funktionelle Gruppeim P870 allenfalls in ihrer Enolform vorliegt, sollte, paral¬lel zu den in unserem Arbeitskreis durchgeführten Untersuchun-
19)gen der in ihrer Enolform stabilen Cyclochlorophyllidesowohl der Chlorophyll a- als auch der Bakteriochlorophyll a-
r -i2Reihe [_99-106j , durch Beobachtung der Hybridisierung (sp
3 2oder sp ) des 13 -Kohlenstoffatoms der Pigmente in den RC
angegangen werden. Zu diesem Zweck wird eine möglichst hohe,13 2spezifische Anreicherung von C in Stellung 13 der Porphy¬
rine benötigt.
Da sich die Pigmente, obwohl nicht kovalent an die Proteine
gebunden, nicht reversibel aus diesen herauslösen lassen, ist13die angestrebte Anreicherung an C nur durch Einschleusen
eines entsprechend markierten Chlorophyll-Vorgängers auf bio¬
logischem Wege in wachsende Bakterienzellen und anschliessen¬
de Isolierung der gebildeten RC denkbar.
13Die Wahrscheinlichkeit, durch Messung des C-NMR-Spektrumsder unbelichteten, in ihrer neutralen Form vorliegenden RC
direkt interpretierbare Signale zu erhalten, ist allerdings13auch bei einer sehr hohen spezifischen C-Anreicherung der
Pigmente wegen der zu erwartenden hohen Proteinabsorptioneneher gering (vgl. Abb. 7 und 8, S. 63). Durch die Differenz¬
spektroskopie (neutraler Eduktzustand minus ausgebleichter,oxidierter Produktzustand) bietet sich für die Untersuchungvon P870 eine einzigartige Chance, die in der Art der photo¬synthetischen Primärreaktion selbst, nämlich in der mit der
lichtinduzierten Elektronenabgabe verbundenen Multiplizitäts-
änderung verbunden ist.
19) Die Ergebnisse lassen die Beteiligung einer monomeren Enolform von
Chlorophyll am Primärprozess der Photosynthese unwahrscheinlich er¬
scheinen [|l04j .
- 55 -
Die durch die Ausbildung des paramagnetischen Zentrums zu er-
wartende Verbreiterung der Signale der mit dem ungepaarten
13Elektronenspin gekoppelten C-Kerne dürfte im Idealfall prak¬
tisch zum Verschwinden der Absorptionen führen. Die Signale
der am Primärprozess beteiligten Moleküle würden eliminiert,
während man nur einen geringen Einfluss auf die Proteine und
weitere Komponenten (Detergens, Puffer) der Lösung erwartet.
Im Differenzspektrum der beiden Zustände würden die Signale
der sich nicht verändernden Bestandteile der Lösung verschwin¬
den, während die Absorptionen der an der Lichtreaktion direkt
teilnehmenden Pigmente, die vom diamagnetischen Eduktzustand
in den paramagnetischen Produktzustand übergehen und somit die
zentrale photosynthetische Einheit P870 bilden, erhalten blie¬
ben.
13Das so erhaltene C-NMR-Differenzspektrum würde also genau
die an der Primärreaktion beteiligten Chlorophylle und Phäo-
phytine in ihrem diamagnetischen Eduktzustand aufzeigen.
Es sei jedoch auf einige denkbare Schwierigkeiten hingewiesen,
welche die Interpretation eines solchen NMR-Experimentes er¬
schweren würden. Möglicherweise wird sich die Ausbildung eines
Radikalkations im Protein auch auf die Signale der umgebenden
Aminosäuren auswirken. Ebenso kann nicht ausgeschlossen werden,
dass die Signale der Chlorophylle und Phäophytine mindestens
teilweise erhalten bleiben, sich aber durch den Einfluss des
Kationradikals verschieben. Beide Möglichkeiten würden das an¬
gestrebte Differenzspektrum erheblich komplizieren. Ausserdem
darf aber auch nicht ausser Acht gelassen werden, dass die
durch das hohe Molekulargewicht bedingte lange Korrelations¬
zeit eine Verbreiterung der C-Signale schon, im diamagneti¬
schen Edukt bewirkt.
13Für die Abschätzung der Durchführbarkeit dieser geplanten C-
NMR-Differenzspektroskopie mussten vorab folgende Fragen be¬
antwortet werden:
- 56 -
Kann die benötigte, hohe, spezifische Markierung der
Chlorophylle und Phäophytine überhaupt erreicht werden?
Sind die RC im neutralen Zustand über die Dauer der Auf-13
nähme eines C-NMR-Spektrums stabil?
Reicht die Stabilität der RC im belichteten oder im die¬
sen simulierenden chemisch oxidierten Zustand für die13
vermutete Dauer der C-NMR-Messung aus?
133.3. Synthese von [2- C]-6-Aminolävulinsäure
Die Biosynthese der Chlorophylle dürfte auf dem in Schema 13
dargestellten Weg erfolgen. Eine ausführliche Zusammenfassungder Resultate der Biosyntheseforschung an Porphyrinen befin¬
det sich in [191] (vgl. auch [71]).Die gewünschte Markierung liesse sich theoretisch durch Ver-
13füttern von [9- C]-PBG erreichen. Orientierende Einbauver¬
suche mit [ C]-PBG verliefen jedoch erfolglos. Da die2
Markierung von C-13 prinzipiell auch durch den Einbau des
13biosynthetisch früheren Vorläufers [2- c] -ALA möglich ist
r 14-iund diesbezügliche Vorversuche mit |_4- C]-ALA hohe Einbau-
13raten ergaben, wurden Fütterungsexperimente mit [2- C]-6-Aminolävulinsäure ins Auge gefasst.
Von den über 20 beschriebenen Synthesen für 6-Aminolävulin¬
säure (_3_0) [198-223] eignet sich nur diejenige von Pichat et
al. [203] für eine Markierung in 2-Stellung. A.I. Scott et al13[223] synthetisierten so [2- C] -6-Aminolävulinsäure (30a)13in ca. 53 % Ausbeute bez. [2- c]-Bromessigsäure. Wir streb¬
ten die Synthese von 30a auf einem neuen, in Schema 14 auf-
20) Sämtliche Einbauversuche wurden von Dr. H. Zürrer, Institut für
Pflanzenbiologie der Universität Zürich, durchgeführt.
- 57 -
o
H3NCO.
CQ2HC02H
-C02.
CO„H ,/^u2CO~H
C02H \__NH HN-/
C02H F NH HN-
-C02H
-Aminolävulinsäure
ALA
PorphobilinogenPBG
co2H 0O2H
Uroporphyrinogen III
co2h co2h co2ch3
Protoporphyrin IXMagnesium-
Protoporphyrin IX
co2h
o
co2ch3
C02Phytyl C02RC02CH3
Protochlorophyllid a Chlorophyll a Bakteriochlorophyll a
Schema 13: Chlorophyll-Biosynthese
- 58 -
HoC
31
Cl1. Cl2/Na2C03
2. KJ/Aceton, Rf
11 % 32
Phthalimidkalium/o
DMA / 75-100 C, 2 Std
O
N
O
H2NHCl
33
35a
24 %
13
O
C02H
|2- c] -Malonsäuredimethylester/
Natriumhexamethyldisalazanat/
THF/Benzol / 53° C, 2 Std.
OsO /NaJO
Dioxan/Wasser, 20 Std.
13[ cjMalonsäure -> 37a: 55
HCl/HOAc 1:1
Rf, 16 Std.
99 %
30a
Schema 14
- 59 -
gezeichneten Weg an. Die Synthese wurde an nicht-markiertem
Edukt optimiert und dann auf die Herstellung von 30a ange¬
wendet :
Das Dijodid _3J-, das nach der von M.G. Bonetti [226] in unse¬
rem Labor optimierten Vorschrift nach [224,225] aus Methallyl-
chlorid hergestellt worden war, konnte durch Kondensation mit
Phthalimidkalium in _3_2 übergeführt werden. Die bescheidene
Ausbeute von 2 3,5 % erklärt sich einerseits durch die hohe
Reaktionsgeschwindigkeit von _3_3 mit Phthalimidkalium zu 3-
Phthalimido-2-phthalimidomethyl-propen-l (_3_4_) und mit der ge¬
ringen Stabilität des Jodids anderseits (-> Zersetzung) ,was
durch die etwas höheren Ausbeuten bei kleineren Ansätzen
(kürzere Aufarbeitungs- und Reinigungszeit) unterstrichen
wird. Der Tendenz zur zweifachen Alkylierung von Malonestern
konnte durch Verwendung eines zweifachen Überschusses an
r 13 n
|_2- Cj-Malonsäuredimethylester und destillativer Rückgewin¬
nung des unverbrauchten Edukts begegnet werden. Die Anwendung
von Natrium-hexamethyldisilazanat [227] als Base erlaubte
eine sehr glatte Umsetzung zu 35a, so dass im H-NMR-Spektrum13
des Rohprodukts ausser ca. 3-5 Mol-% [2- c]-Bis-(2-methyli-
den-3-phthalimido-propyl)-malonsäuredimethylester (36a) keine
Nebenprodukte festgestellt werden konnten. Die anschliessende
Oxidation mit OsO./NaJO. wurde direkt mit dem Rohprodukt13
durchgeführt und ergab [2- c]-2-Methoxycarbonyl-4-oxo-5-
phthalimido-valeriansäure-methylester (37a), der direkt durch
Kristallisation gereinigt werden konnte. Die Ausbeute bezüg¬
lich verbrauchter Malonsäure betrug 55 %.
Die anschliessende Hydrolyse erfolgte unter den in [223] be¬
schriebenen Bedingungen durch Kochen am Rückfluss in Salz¬
säure/Eisessig 1:1 während 16 Stunden und ergab nach Abtren-
13
nen der entstandenen Phthalsäure laut DC einheitliche [2- c]-13
ö-Aminolävulinsäure (30a), in deren C-NMR-Spektrum keine
Verunreinigungen nachgewiesen werden konnten.
- 60 -
20)3.4. Einbauversuche
Bei Versuchen zur Verfütterung von [4- C]-ALA an wachsende
Zellkulturen von Rhodospirillum rubrum gelang es, die Pigmenteradioaktiv zu markieren. Da aber die spezifischen molaren
Einbauraten bei hoher Konzentration des Vorläufers im Nähr¬
medium das theoretische Maximum von 8 überstieg und auch in
andern Zellbestandteilen Radioaktivität gemessen wurde, muss-
te angenommen werden, dass die [4- C]-ALA teilweise abge¬baut und dann unspezifisch vom Organismus aufgenommen worden
war.
13Die Verfütterung von [2- C]-ALA unter vergleichbaren Bedin¬
gungen verlief trotzdem erfolgversprechend (Wachstumsbedin¬
gungen siehe [2 9], S. 242). Die Pigmente der gesamten Zellen
(RC und Antennen) wurden von E. Walter extrahiert und phäo-13phytinisiert [2 9], S. 244). B. Jaun ermittelte einen C-
2Gehalt in Stellung 13 von 43,8 ± 1,5 % durch Integration
13 1des C-Satelliten im H-NMR-Spektrum.
13Aus der Integration der C-Signale (Pulsabstand 20 Sek.;
1 2vollständige Relaxation) wurde für die Positionen 2,3,12 12 17
, 8,
12,
17 und 18 ein gleich hoher Markierungsgradbestimmt. Die übrigen Stellen im Makrocyclus zeigten einen13C-Gehalt von ca. 1,2 %, was ungefähr dem natürlichen Vor-
13kommen entspricht. Der Anteil an C im Geranylgeranylrestlag mit 2,5 % ca. doppelt so hoch, was einen teilweisen Ab-
13bau von [2- C]-ALA und Einbau auf einer einfacheren Stufe
13beweist (Abb. 6). Eine detaillierte Beschreibung des C-
NMR-Spektrums der extrahierten Pigmente findet sich in [2 9] ,
S. 244.
Für die Entscheidung, ob das geplante NMR-Experiment zu
brauchbaren Resultaten führen dürfte, ist es wichtig, das
Intensitätsverhältnis der Signale der Chlorophylle zu denje¬nigen der Proteine abzuschätzen. Mit diesem Ziel wurde das
zu erwartende Spektrum des Proteins berechnet und mit dem zu
- 61 -
...,,... | ,,,,,,,, |. . | | | , , , , .
|.
,, , , | , ! | ,
5000
,1 r -1 *- >
1000 C 181, .
TC2'
1 C32 H100 I cJ
25
I/
C 32C-172
S
CDCI3—'
HywdfA^>li**AJvjJuL180 160 140 120 p-
80 60 40 20 0
Abb,13C-NMR-Spektrum von markiertem Bakteriophäophytin a,
13spezifischer C-Gehalt 44 %, in CDC1
erwartenden Spektrum der Chlorophylle verglichen. Das vermu¬
tete Spektrum des Proteins wurde in Abb. 7 wie folgt aufge¬
zeichnet :
1. Aus der von Steiner et al. [25] ermittelten Aminosäuren¬
zusammensetzung wurde unter Annahme eines Molekularge¬
wichts der RC-Proteine von 73'000 die Zahl der einzelnen
Aminosäuren pro RC berechnet (z.B. 42 Valin-Einheiten pro
RC). Die Höhe des Signals, hervorgerufen durch eine Ami-
13nosäure mit natürlichem C-Gehalt wurde für alle H-sub-
stituierten C-Atome als identisch betrachtet und in Abb.
7 willkürlich mit 0,14 mm festgesetzt. Für quaternäre C-
Atome wurde 1/3 dieser Signalintensität angenommen, d.h.
die entsprechende Höhe in Abb. 7 beträgt 0,04 7 mm.
2. Die chemischen Verschiebungen der Signale des Proteins
wurden von Wüthrich ( [192], S. 17 5) übernommen. Sie waren
anhand von Tetra- und Pentapeptiden in D~0 gemessen worden.
3. Für die zu erwartende Linienbreite wurde ein Wert von 25
Hz, entspricht 1 ppm bei 25 MHz, angenommen (die erwar-
- 62 -
teten Signalintensitäten wurden über alle Aminosäuren
innerhalb 1 ppm aufsummiert).
Das erwartete Spektrum, hervorgerufen durch ein Bakteriophäo-
phytin pro RC wurde in Abb. 7 (oben) unter der Annahme glei¬cher Einbauraten in die Pigmente der Antennen und der RC auf¬
gezeichnet (der experimentell ermittelte Markierungsgrad be¬
zieht sich auf die Pigmente der gesamten Zelle, d.h. über¬
wiegend auf diejenigen des Lichtsammlersystems). Für die Ab¬
schätzung der Signalintensitäten wurde somit ein spezifi-13
scher C-Gehalt der markierten Zentren von 4 4 % angenommen.
Die chemischen Verschiebungen entsprechen denjenigen von
Bakteriophäophytin a in CDC1_. Es ist zu beachten, dass die
RC-Proteine 6 Pigmente (4 Chlorophylle und 2 Phäophytine)
enthalten, die bei symmetrischer Anordnung durch Überlagerungder Signale zu höheren Intensitäten führen könnten.
Das experimentell ermittelte Spektrum unmarkierter RC (Abb.
8) stimmt mit dem berechneten (Abb. 7) relativ gut überein,wobei jedoch zu beachten ist, dass bei der Abschätzung des
Spektrums die Signale von Puffer und Detergens (Tris und
LDAO), deren Konzentrationen in den verschiedenen RC-Präpa-rationen stark variieren, nicht berücksichtigt wurden. Der
zusätzlich beobachtete Signalhaufen bei ca. 70 ppm dürfte
von Kohlehydraten stammen. Diese Interpretation wurde durch
den Nachweis von Zuckern in den RC-Präparationen gestützt
[19 3] .
- 63 -
III III.I
200 150 100 50
200 150 100 50
Abb. 7 (oben): Strichspektrum von Bakteriophäophytin a
13(44 % C, 1 Molekül pro RC)
berechnetes Spektrum der Proteinsignale
der RC
13Abb. 8 (unten): gemessenes C-NMR-Spektrum unmarkierter RC
- 64 -
3.5. Untersuchungen der Stabilität ausgebleichter
ReaktionsZentren
Die sehr hohe Einbaurate von [2- c]-ALA war die wichtigste13Voraussetzung für weitere Versuche in Hinblick auf ein C-
NMR-Differenzspektrum. Nachdem es E. Walter gelungen war,
Puffer- und Detergenskonzentrationen zu finden, bei denen
sich die RC (im unbehandelten Zustand) während 2 Tagen bei
ca. 1 C (Aufnahmetemperatur) in der wässrigen Lösung kaum
veränderten, mussten Bedingungen gefunden werden, unter de¬
nen sich die RC auch in oxidiertem Zustand über längere Zeit
nicht zersetzen.
Die RC lassen sich sowohl durch Licht als auch chemisch oxi-
dieren. Die an sich günstiger scheinende lichtinduzierte Aus¬
bleichung wirft jedoch apparativ bedeutende Probleme auf:
Die sehr hohe optische Dichte einer NMR-Probe (OD(802) ca.
501) verhindert eine gleichmässige Durchleuchtung der gesam¬
ten Lösung. Durch seitliche Einstrahlung würde zwar eine mög¬lichst grosse Oberfläche belichtet, eine solche Bestrahlungwürde aber bedeutende Änderungen im Probenraum des NMR-Ge-
rätes bedingen. Eine Bestrahlung von oben müsste, um einen
vernünftigen Anteil an oxidierten RC zu ergeben, mit einer
stetigen Durchmischung gekoppelt sein. (Ein Quarz- oder Glas¬
stab, der zugleich als Lichtleiter dient, dürfte durch Be¬
rühren der langsam rotierenden Probe wahrscheinlich genügen.)
Es wurden deshalb vorerst Versuche zur chemischen Oxidation
der RC durchgeführt. Ziel der ersten Vorversuche war, mög¬lichst vollständige Oxidation bei gleichzeitig hoher Stabili¬
tät der Lösung zu erreichen. Die Auswahl der Oxidationsmittelwar sehr beschränkt, mussten sie doch den folgenden Forderun¬
gen so weit wie möglich genügen:
13- Keine eigenen C-Absorptionen
- Sowohl im oxidierten als auch im reduzierten Zustand dia-
- 65 -
magnetisch oder höchstens schwach paramagnetisch, um Störun¬
gen der NMR-Signale zu vermeiden
- Redox-Potentiale in der Nähe derjenigen der RC (möglichst
grosse Pufferwirkung und möglichst geringe Oxidation der
Proteine!)
- definiertes, von der Lösung möglichst unabhängiges Redox¬
potential (Fremdionen, Ionenstärke, Detergens, Puffer).
Die bekannte [178,188] Oxidation der RC mit K Fe(CN) hat den
Nachteil, dass das Redoxpotential des Oxidationsmittels (430
mV [184]) unter demjenigen der RC (450-490 mV [27]) liegt
und es deshalb in sehr grossem Überschuss eingesetzt werden
muss. In einem ersten Versuch wurde eine konzentrierte RC-
Lösung (Lösung 2) bis zu einem Oxidationsgrad von 76 % mit
II 4-K.Fe(CN), umgesetzt und dann das entstandene Fe (CN)r mit
3 6 6
H 0 wieder oxidiert. Man erreichte so einen Oxidationsgrad13
von 84 %. Innerhalb von 38 Stunden (Aufnahme des C-NMR-
Spektrums) reduzierte sich die Probe jedoch wieder vollstän¬
dig! Anschliessende elektrochemische Oxidation der Lösung
führte nur zu einem kurzfristigen Erfolg, denn nach Beendi¬
gung der Oxidation trat erneut rasche Reduktion ein. Inner¬
halb von 4 Tagen bei 0 C entstanden weitere Veränderungen,
die als irreversible Zersetzung der RC interpretiert wurden.
— 6
Die stufenweise chemische Oxidation einer 1,85"10 M RC-
Lösung führte zu den bekannten Änderungen im VIS/NIR-Spektrum,
selbst mit einem 200-fachen Überschuss an K^Fe(CN)r liess3 6
sich jedoch keine vollständige Oxidation erreichen (Abb. 9).
Durch Oxidation unterschiedlich konzentrierter Proben mit
K Fe(CN), und Nachoxidation mit KJ/J~-Lösung (das Ferricya-
nid/Ferrocyanid-Gemisch sollte als Potentialpuffer wirken)
wurde zwar ein Oxidationsgrad von 93 % bzw. 96 % bei vergleich¬
barem molarem Überschuss an Oxidationsmittel erreicht, wobei
die konzentriertere, etwas stärker oxidierte Lösung jedoch
instabiler war und deutlich stärkere Extinktionsabnahme des
Maximums bei 800 nm innerhalb 44 Std. zeigte (Proben 3/1.,
- 66 -
Abb. 9: 1,85*10 M RC-Lösung
unbehandelt
nach Oxidation mit 0,3, 1, 3 bzw. 10 yl0,2 N KFe(CN) -Lösung3 b
nach anschliessender Reduktion mit KBH„
3/2.) . Eine durch Verdünnen der konzentrierten, oxidierten Lö¬
sung mit HO entstandene Probe (3/2J zersetzte sich wenigerrasch als die Stammlösung.Die Stabilität einer konzentrierten, nur mit K.Fe(CN)_ oxi-
3 6dierten Probe war bedeutend geringer als aus Vorversuchenvon E. Walter (sogar bei höherem Oxidationsgrad) mit verdünn¬ten Proben zu erwarten war. Möglicherweise hatte die stark er¬
höhte Ionenstärke einen negativen Einfluss auf die Haltbarkeitder Probe. Durch Verdünnen der oxidierten Probe mit H„0 konn¬te die Zersetzung deutlich vermindert werden.
Direkte Oxidation mit KJ/J_ ergab erwartungsgemäss (möglicheReaktion von Jod mit den Proteinen) keine stabile Lösung.Günstigere Resultate bezüglich Stabilität der Proben wurdedurch die Oxidation mit einer 1:1 Mischung aus 0,2 N KJ/J„-und 0,2 N K_,Fe (CN) r-Lösung erreicht.3 6
Da das Ziel, eine "saubere" chemische Oxidation zu einem in-
13nerhalb der anzunehmenden Messzeit für das C-NMR-Spektrumstabilen Produkt nicht erreicht wurde, untersuchte man dieStabilität der RC unter andauernder Beleuchtung. Die Messung13des C-NMR-Spektrums unter Einstrahlung würde apparativ einen
- 67 -
grossen Mehraufwand bedeuten, hätte aber den Vorteil eines
stärker realitätsbezogenen Experiments.
Die ersten diesbezüglichen Versuche wurden unter Beleuchtung
mit 368 nm-Licht (Emissionsmaximum der Quecksilberdampflampe)
durchgeführt. Die hohe Intensität des eingestrahlten Lichts
bewirkte einerseits eine vollständige Ausbleichung der Ab¬
sorptionsbande bei 867 nm, anderseits jedoch eine sehr ra¬
sche Zersetzung der RC. Diese Instabilität ist für die Auf-
13nähme des C-NMR-Spektrums (zu vermutende Dauer ca. 48 Std.)
prohibitiv.
Man versuchte deshalb, die Ausbleichung durch weniger inten¬
sive und längerwellige Strahlung zu erreichen. Versuche mit
der sehr schwachen Emissionsbande der Quecksilberdampflampe
bei 690 nm brachten eine fast vollständige, aber sehr langsam
eintretende Ausbleichung der Bande bei 868 nm. Die so verfüg¬
bare Lichtintensität dürfte jedoch zur Ausbleichung einer kon-
zentrierteren Lösung bei weitem nicht ausreichen. Die VIS/NIR-
Spektren einer RC-Lösung unter Einstrahlung mit 368 nm-Licht
bei Verwendung von Gelbfiltern und unter Einstrahlung mit 690
nm-Licht ohne Filter sind in Abb. 10 wiedergegeben.
Um eine höhere Lichtintensität zu erreichen, wurde die Mög¬
lichkeit untersucht, die Proben durch Einstrahlung des gesam¬
ten Wellenlängenbereichs oberhalb 540 nm bzw. 630 nm auszu¬
bleichen. Die verdünnten Lösungen waren unter diesen Bedin¬
gungen nicht stabil genug, für konzentriertere Lösungen er¬
wartete man aber bei gleicher Lichtintensität eine bedeutend
geringere Zersetzung. Bestrahlung einer konzentrierten Probe
in einem NMR-Rohr (10 mm Durchmesser) ergab jedoch leider ent¬
gegen der Erwartung eine vergleichbar rasche Zersetzung. Die
Stabilität der behandelten Probe dürfte für ein NMR-Experi-
ment nicht ausreichen.
- 68 -
10-
00
o.o- ;~—=-=-='-"""'
1 ' 1 ' 1 ' 1 ' I ' 1 ' 1 ' 1 ' 1500 600 700 800 900 1000 H00 1200 1300 nm
Abb. 10: 1,85'ICT M RC-Lösung
— — unbehandelt
unter Bestrahlung mit Licht von 368 nm
Wellenlänge (Gelbfilter in Referenz- und
Messstrahl)
-. • unter Bestrahlung mit 690 nm-Licht (ohne
Filter)
nach Reduktion mit KBH.
3.6. Schlussfolgerungen
Die Frage nach der Durchführbarkeit der geplanten C-NMR-
Differenzspektroskopie konnte anhand der beschriebenen Ver¬
suche nicht abschliessend beantwortet werden. Auf die Ausfüh¬
rung musste hauptsächlich deshalb verzichtet werden, weil kei¬
ne genügende Stabilität der RC im oxidierten Zustand erreicht
werden konnte. Die grosse Bedeutung einer direkten Beobach-13
tung von P870 durch C-NMR-Differenzspektroskopie würde je¬doch weitere, verstärkte Anstrengungen in dieser Richtungrechtfertigen. Für solche Arbeiten sollten die folgendenErfahrungen und Vorschläge berücksichtigt werden:
1. Die Qualität der einzelnen RC-Präparationen und damit die
Stabilität gegenüber Oxidationsmitteln war stark unter¬
schiedlich (Lösungen 1, 2, 3). RC-Präparationen einheit¬
licherer Qualität wären für weitere Untersuchungen von
- 69 -
grossem Vorteil.
Einfrieren und Auftauen hatten keinen negativen Einfluss
auf die Qualität der RC.
Konzentriertere Proben zersetzten sich bei gleichem Ver¬
hältnis von RC zu Oxidationsmittel rascher als verdünnte.
Ursache der Instabilität der durch einen grossen molaren
Uberschuss an K Fe(CN) oxidierten Lösung könnte minde¬
stens teilweise in der stark erhöhten Ionenstärke liegen.
Versuche, weniger Ferricyanid einzusetzen und das ent¬
standene Ferrocyanid durch ein stärkeres Oxidationsmittel
(H 0„, Jod) wieder zu oxidieren waren wenig erfolgreich.
Das beste Resultat wurde bei gleichzeitiger Addition von
Ferricyanid und Jod erreicht.
13Für die C-NMR-Differenzspektroskopie wäre eine lichtin¬
duzierte Oxidation vorzuziehen, die beiden Messungen wä¬
ren dann unter sonst identischen Bedingungen möglich.
Die Stabilität aller lichtinduziert gebleichten RC-
Proben war ungenügend.
Die Geschwindigkeit der Rückreaktion nach lichtinduzier¬
ter Ausbleichung schien mit zunehmender Dauer der Experi¬
mente abzunehmen. Offenbar verarmten die Lösungen an Re¬
duktionsmittel, was bedeutet, dass diese Oxidation -
Reduktion keinen sauberen Kreisprozess bildete, sondern
dass ein Teil der Elektronen irreversibel "verloren ging"
Um eine möglichst homogene Beleuchtung der Probe zu er¬
reichen, sollte bei einer Wellenlänge mit möglichst ge¬
ringer Extinktion der Lösung eingestrahlt werden. Die
beste Möglichkeit wäre die Beleuchtung mit Licht von ca.
870 nm Wellenlänge (hohe Absorption des Edukts, geringe
Absorption des Produkts). Dadurch könnten auch mögliche
Photoreaktionen der oxidierten RC auf ein Minimum be¬
schränkt werden.
- 70 -
13Vielleicht würde sich auch die Untersuchung der C-NMR-
Spektren nur der reduzierten RC lohnen. Die störenden
Signale der Proteine könnten prinzipiell durch Verfüttern12
eines an C angereicherten Nährmediums unterdrückt wer¬
den. Bedeutend einfacher wäre jedoch die Anzucht der Bak-21)
terien in D„0. Die so gebildeten, deuterierten Amino¬
säuren würden infolge der stark erhöhten Relaxationszeit13der D-substituierten C-Kerne gegenüber den H-substitu-
ierten Atomen und der dadurch erreichten Sättigung zu be¬
deutend geringeren Intensitäten der Signale führen. Die
r 13 iunverdaut eingebauten, H-substituierten [2- Cj-ALA-Mo-leküle würden Signale der Pigmente mit unverminderter In¬
tensität erzeugen.
21) Katz et al. züchteten Kulturen von R. rubrum in DO und erreichteneine H-Markierung verschiedener Gruppen durch Verfütterung von Bern-steinsäure-H-4 L195J . Man vergleiche dazu auch die Anzucht von mehr¬fach markierten Algen [l96,197_| •
- 71 -
EXPERIMENTELLER TEIL
4. EINLEITUNG
4.1. Allgemeines
Die Glasgeräte wurden für Versuche mit Porphyrinderivaten ge¬
nerell mit Chromschwefelsäure gereinigt, anschliessend mehr¬
mals mit Ionentauscherwasser, mit einem Aceton/Methanol-Ge-
misch und mit destilliertem Aceton gespült und bei 120 C im
Trockenschrank getrocknet.
Die Herstellung von Magnesium-Reagens und der Einbau des Magne¬
siums wurde in gedämpftem Licht durchgeführt. Man arbeitete
stets mit Lösungsmittelgemischen auf, deren organische und
wassrige Phasen während mindestens 15 Minuten durch Einleiten
eines kräftigen StickstoffStromes entgast worden waren. Nach
Entfernen des Lösungsmittels am Rotationsverdampfer bei 10-
20 C wurde jeweils mit Argon begast.
"Entgasen durch Absaugen" bedeutet, dass unter intensivem magne¬
tischen Rühren entweder am Wasserstrahlvakuum oder am Hoch-
-3Vakuum (hier bis auf einen Enddruck < 2*10 Torr, gemessen
zwischen Pumpe und Kühlfalle) die Luft und ein Teil des Lö¬
sungsmittels abgesaugt wurde.
Unter "Entgasen durch Einfrieren" wird das Einfrieren des Lö¬
sungsmittels in einem höchstens zu einem Drittel gefüllten-3
Rundkolben mit flüssigem Stickstoff, evakuieren auf < 2*10
Torr und raschem Auftauen der abgeschlossenen Probe in heis-
sem Wasser verstanden. Dieses Verfahren wurde 3 bis 5 mal
- 72 -
wiederholt, bis beim erneuten Evakuieren der Probe kein Druck¬
anstieg mehr zu beobachten war. Für grosse Lösungsmittelmengen(> 100 ml) war es möglich, das Verfahren auf 2 bis 3 maligesEinfrieren abzukürzen, indem man am Anfang einen Teil (= 10 %)des Lösungsmittels in die Kühlfalle absaugte.
Die Oxidationsversuche der Reaktionszentren wurden in grösst-möglicher Dunkelheit ausgeführt, um eine unkontrollierte
lichtinduzierte Ausbleichung zu unterdrücken. Dazu stand ein
Dunkelraum mit stufenlos auf das absolut benötigte Minimum
einstellbarer Beleuchtung zur Verfügung.
Abkürzungen Chi a Chlorophyll a
Chi a' 132(S)-Chlorophyll a
Phäo a Phäophytin a
2Phäo a1 13 (S)-Phäophytin a
DC DünnschichtchromatogrammHPLC Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie
-3HV Hochvakuum (< 2-10 Torr)
WV Wasserstrahlpumpen-Vakuum
RV Rotationsverdampfer
MG Molekulargewicht
Smp. Schmelzpunkt
RT Raumtemperatur
konz. konzentriert
M, mM molar, millimolar
- 73 -
4.2. Qualität der verwendeten Materialien
DünnschichtChromatographie
Cellulose DC-Alufolien, Schichtdicke 0,1 mm (Merck),
Laufstrecke ca. 8 cm
Kieselgel DC-Fertigplatten Kieselgel 60 F254, Schicht¬
dicke 0,25 mm (Merck), Laufstrecke ca. 8 cm
Silgur DC-Fertigplatten Silgur-25 UV 254, Schicht¬
dicke 0,25 mm (Macherey - Nagel & Co); Kom¬
binationsschicht Kieselgur/Kieselgel, Lauf¬
strecke auf Kieselgel ca. 8 cm
Säulenchromatographie
Kieselgel Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,2 mm (Merck)
Alox W 200 Aluminiumoxid basisch W 200 Akt. Super I
(Woelm). Verwendet zum Trocknen und Reini¬
gen von Lösungsmitteln
Hochdruck-Flüssigchromatographie
Partisil 5 (Whatman / Reeve-Angel)
Lösungsmittel und Reagenzien
Lösungsmittel * Die mit * bezeichneten Lösungsmittel wurden
entweder durch Einfrieren oder durch Ab¬
saugen am HV entgast
Aceton Merck, zur Analyse
Äther destilliert, vor Gebrauch über Alox W 200
filtriert (nur für Aufarbeitung)
Fluka, puriss. p.a., absolut, vor Gebrauch
zweimal über LAH destilliert
Äthylacetat destilliert
Benzol Merck, zur Analyse, über Calciumhydriddestilliert
BHT "Butylhydroxytoluol" = 2,6-Di-tert-butyl-4-
methyl-phenol; Fluka, purum, vor Gebrauch
im HV bei 60-70° C sublimiert
Calciumhydrid Fluka, purum, pulverisiert
Cetylalkohol Fluka, puriss.
Chloroform Merck, zur Analyse, stabilisiert mit Äthanol
vor Gebrauch durch Alox W 200 filtriert
- 74 -
Dirnethoxyäthan
Dirnethy1formamid
Dioxan
Essigsäure
HMPA
Hexan
Kaliumborhydrid
Kaiiumferricyanid
LAH
Methanol
Magnesium
Methylenchlorid
Natriumhydrid
Natriumsulfat
Pentan
Phosphatpuffer
Phosgen
Pyridin
Salzsäure
Schwefelsäure
Tetrachlorkohlen¬
stoff
Tetrahydrofuran
Deuterochloroform
Fluka, purum, über Natriumhydrid destilliert
Fluka, puriss. p.a., über Calciumhydrid de¬stilliert
Fluka, puriss. p.a., zweimal über Kaliumdestilliert. Für die Verwendung in derDry-Box wurde unmittelbar vor Gebrauch durchAlox W 200 filtriert
,-2
Merck, zur Analyse, 100 %
Hexamethylphosphorsäuretriamid:Fluka, purum, destilliert bei 10"^ Torr
destilliert
Fluka, purum p.a.
Kaliumhexacyanoferrat III, Fluka, puriss.
Lithiumaluminiumhydrid: Fluka, puriss. p.a.
Fluka, puriss. p.a., über Magnesium de¬stilliert
Fluka, purum, für Grignard
destilliert, vor Gebrauch durch Alox W 200filtriert
Fluka, prakt. Dispersion 55-60 % in Öl
Merck, zur Analyse, wasserfrei
über Natriumhydrid destilliert
gesättigte wässrige Lösung von NaH„P0.
Fluka, purum, 20 % in Toluol
Fluka, puriss. p.a., dest. über KOH
Merck, zur Analyse, mind. 37 %
Merck, zur Analyse, 95-97 %
destilliert (zur Chromatographie)Merck, zur Analyse
Fluka, puriss. p.a., zwei- bis dreimalüber Kalium destilliert
Merck Sharp & Dohme, Canada, Isotopen¬reinheit 99,8 %, vor Gebrauch durch AloxW 200 filtriert
Hexadeuteroaceton Fluka, puriss., 99,5 Atom-% D
Tetradeutero-
methanol
Tetramethylsilan
Merck, Methanol d4, Deuterierungsgradmind. 99,5 %, Uvasol
Ciba-Geigy, mind. 99,8 %, GC
- 75 -
4.3. Messung und Darstellung der analytischen Daten
Prof. J.F.M. Oth hat mir in grosszügiger Weise das ÜV/VIS/NIR-
Gerät Cary-17 sowie die für die Untersuchung der RC benötig¬
ten Zusatzapparaturen zur Verfügung gestellt. Ich möchte ihm
an dieser Stelle dafür herzlich danken.
Für die Aufnahme der MS-Spektren danke ich Herrn Prof. J.
Seibl und Frau L. Golgowski, für die IR- und UV/VlS-Spektren
(Cary-14) den Herren R. Dohner und H. Hediger.
Besonderen Dank schulde ich Frl. B. Brandenberg und Herrn
1 13K. Hiltbrunner für die Aufnahme der H- und C-NMR-Spektren.
Ihre Hilfsbereitschaft waren mir bei der Ausführung meiner
Arbeit von grossem Nutzen.
Herrn Dr. A. Thoma danke ich für die Aufnahme der CD-Spektren.
Schmelzpunkte
-2
Porphyrinderivate in abgeschmolzenen Röhrchen (ca. 10 Torr),
übrige Substanzen in offenen Kapillaren in einer Apparatur
nach Dr. Tottoli bestimmt, nicht korrigiert.
Elementaranalysen
Mikroanalytisches Laboratorium der ETH Zürich. Herrn D.
Manser danke ich für die Ausführung.
H-NMR-Spektren
Aufgenommen auf einem VARIAN Spektrometer HA-100 oder XL-100
(100 MHz). Gelegentlich erwähnte Routinespektren wurden auf
einem HITACHI PERKIN-ELMER R 24 A (60 MHz) gemessen.
- 76 -
Die chemischen Verschiebungen 6 in ppm beziehen sich auf
Tetramethylsilan als internen Standard. Der Signaltyp wird
bezeichnet mit: s = Singlett, d = Dublett, t = Triplett, q =
Quartett, bs = verbreitertes Singlett, b = breites Signal von
komplexer Struktur, Kopplungskonstanten J sind in Hertz ange¬
geben. Die Integrale bestimmte man durch elektronische Inte¬
gration und normierte durch Aufsummieren der Signalflächenund Division durch die insgesamt erwartete Protonenzahl.
Die in den tabellarisch wiedergegebenen Spektren durch ein¬
gerückte 6-Werte bezeichneten Signale wurden den entsprechen¬den epimeren Verbindungen zugeordnet.
C-FT-NMR-Spektren
Aufgenommen auf einem VARIAN-Spektrometer XL-100. Die ange¬
gebenen chemischen Verschiebungen (6-Werte) aus den breit-
bandentkoppelten Spektren beziehen sich, falls nicht anders
spezifiziert, auf Tetramethylsilan als internen Standard. Die
Multiplizitäten der Signale aus den off-resonance-entkoppel-ten Spektren sind bezeichnet mit: S = Singlett, D = Dublett,T = Triplett, Q = Quartett. Unsichere Zuordnungen sind mit
einem Fragezeichen versehen.
Die Messung sämtlicher Porphyrinderivate erfolgte in einer
10 mm-Mikrozelle (Inhalt: 1 ml), die in der Dry-Box abge¬füllt wurde. Trotz möglichst dichtem Verschliessen der Probe
war es nicht immer möglich, Luftzutritt und damit Allomeri-
sierung der metallhaltigen Verbindungen vollständig zu ver¬
hindern.
Massenspektren
Aufnahmen auf einem Massenspektrograph Hitachi RMU 6M.
Direkte Probenzuführung bei der jeweils angegebenen Einlass¬
temperatur, lonisierungsenergie 70 eV.
-II-
IR-Spektren
Aus PERKIN ELMER Gitterspektrographen PE 125, PE 257 oder
PE 283 gemessen. Konzentrationsangaben in Gewichtsprozent
(mg/100 yl), die Schichtdicken sind jeweils angegeben. Ban¬
denlagen in cm .Die abgeschätzten Bandenintensitäten wur¬
den mit s = stark, m = mittel, w = schwach, Seh = Schulter
bezeichnet.
CD-Spektren
Aufgezeichnet auf einem Dichrographen JOBIN-YVON MARK III.
Bereich 750 bis 230 nm, Bandbreite 2 nm, Aufnahmegeschwin¬
digkeit 6 nm pro Min., Schichtdicke 1 cm. Angaben von Ae in
l'Mol •cm
Vor und nach der Aufnahme der CD-Spektren wurde jeweils das
UV/VIS-Spektrum der Probe gemessen.
UV/VIS-Spektren
Für die Messungen standen die unten aufgeführten Spektrophoto-
meter zur Verfügung. Aufnahmen auf Cary 14 oder Cary 17, so¬
fern bei den Spektren gegenteilige Angaben fehlen.
PERKIN-ELMER PE 402:
Für qualitative Routineaufnahmen.
Aminco-Spektrophotometer DW 2:
Für die Aufzeichnung der Spektren der Zwischenprodukte beim
Magnesiumeinbau im Wellenlängenbereich von 300 bis 800 nm.
Bandbreite 3 nm.
Cary 14:
Für analytische Spektren.
- 78 -
Cary 17:
Die Untersuchung der Reaktionszentren (RC) wurde auf einem
Cary-Spektrophotometer Modell 17 durchgeführt. Für die Unter¬
suchung der chemischen Oxidation der RC verwendete man je nach
Konzentration Zellen mit Schichtdicken von 10, 1 oder 0,2 mm.
Die Untersuchung der lichtinduzierten Ausbleichung (Cary 17)
erfolgte in 10 mm-Fluoreszenzzellen. Die verwendete Seiten¬
beleuchtungseinrichtung war von Prof. J.F.M. Oth gebaut wor¬
den (Abb. 11): Die Lichtquelle bestand aus einer 200 W
Quecksilber-Höchstdrucklampe (Osram HBO 200 W) und einem
Gitter-Monochromator (Bausch & Lomb, 200-700 nm, 1200 Kerben
pro mm). Zur Bestrahlung verwendete man die Emissionsbanden
bei 368 und 690 nm. Zudem wurden Versuche unternommen, bei
denen man mit dem gesamten Wellenlängenbereich der Lichtquel¬le oberhalb 540 nm oder 610 nm einstrahlte. Als Filter dien¬
te eine gesättigte wässrige Kaliumbichromatlösung (Schicht-
-3dicke 1 cm, Transmission T = 0,5 bei 560 nm, T < 10 unter¬
halb 540 nm) bzw. zusätzlich ein rotes Farbglasfilter mit
einer Absorptionskante bei 6 30 nm (Spindler & Hoyer, RG 6 30,T = 0,5 bei 630 nm, T < 10~3 unterhalb 610 nm).
Die in einem Quarzkryostaten fixierte Fluoreszenzküvette konn¬
te mit kaltem Stickstoff (eisgekühlter Wärmeaustauscher) ge¬kühlt werden. Da sich die Referenzküvette nicht kühlen liess,glichen sich die Absorptionen von H„0 nicht vollständig aus.
Dieser Effekt wurde in den abgebildeten Spektren durch Sub¬
traktion der experimentellen Basislinie korrigiert.Das (für Tieftemperaturmessungen benötigte) Spiel der UV-Zelle
erlaubte eine geringe Drehung der Küvette, so dass durch Re¬
flexion und Streuung eine Verschiebung der Basislinie möglichwar. Um diesen Effekt auszugleichen, wurde diese Verschiebungelektronisch so kompensiert, dass der isosbestische Punkt
bei 930 nm erhalten blieb.
Um Streulichtfehler möglichst klein zu halten, verwendete man
bis ca. 325 nm den IR-Detektor (Bleisulfidzelle, die geringe
- /y -
L1
Abb. 11: Schema der Seitenbeleuchtungsapparatur
LI: Lichtquelle des Messgerätes
L2: Lichtquelle der Seitenbeleuchtung(Osram HBO 200 W)
Ml: Monochromator des Messgerätes
M2: Monochromator bzw. Filterkombination der
Seitenbeleuchtung
K: Quarzkryostat mit Probenküvette
-3F: Gelbes Farbglasfilter (T < 10 unterhalb
480 nm), verwendet beim Belichten mit 368 nm
D: Detektor
-3
Empfindlichkeit des Detektors gestattet eine hohe Intensität
des Messstrahls). Zur Vermeidung der Streulichteffekte beim
Beleuchten mit 368 nm wurde ein gelbes Farbglasfilter (T < 10
unterhalb 480 nm) in Mess- und Referenzstrahl eingesetzt; beim
Ein- bzw. Ausschalten der aktinischen Lichtquelle ergab sich so
keine Änderung der Basislinie mehr.
Beim Beleuchten bei 690 nm trat auch ohne Filter infolge der
geringen Intensität des eingestrahlten Lichtes keine Verschie¬
bung der Basislinie auf.
Beim Bestrahlen mit dem gesamten Wellenlängenbereich oberhalb
540 nm bzw. 610 nm konnte infolge der grossen Intensität des
- 80 -
Streulichts verglichen mit derjenigen des Messstrahls das
Spektrum nicht gleichzeitig aufgezeichnet werden. In diesen
Fällen wurde die Messung unmittelbar (ca. 3 Sek.) nach Be¬
leuchtung mit grosser Bandbreite unter Einstrahlung bei 690
nm durchgeführt.
4.4. Dry-Box
Für die Arbeiten unter Inertgas stand eine Dry-Box der
Vacuum Atmospheres Company, Los Angeles zur Verfügung (Dry-Lab DL 001-S-P/Dry-Train HE 493); Stickstoffatmosphäre, ge¬schätzter Sauerstoffgehalt < 5 ppm.
Sämtliche in der Dry-Box verwendeten Lösungsmittel wurden
unmittelbar nach der Destillation durch Einfrieren entgast.Dafür verwendete man einen Kolben mit Kernschliff und Tropf¬spitze und einen Hahnen mit Hülsenschliff (Abb. 12), um so
das Eindringen von Schliffett in die Lösungsmittel zu ver¬
hindern. Aceton und Wasser wurden im HV bei RT destilliert
und in einem mit flüssigem Stickstoff gekühlten Kolben aufge¬fangen (Abb. 13) und anschliessend durch Einfrieren entgast.
Sämtliche für analytische Zwecke verwendeten Lösungen von
metallhaltigen Porphyrinderivaten (ausser für HPLC) wurden in
der Dry-Box hergestellt und abgefüllt. Das für die Trocknungvon Lösungsmitteln verwendete Alox brachte man unmittelbar
vor Gebrauch in die Dry-Box, um den Kontakt mit den Lösungs¬mitteldämpfen in der Stickstoffatmosphäre möglichst kurz zu
halten. Das Alox adsorbierte jedoch immer Lösungsmitteldämpfe(vor allem CH„Clp), die dann mit den zu trocknenden Lösungs¬mitteln von der Säule gewaschen wurden. Daher gelang es nie,
NMR-Lösungen in CDC1., in der Box so herzustellen, dass in den
Spektren kein Methylenchloridsignal sichtbar wurde.
- 81 -
HV
Abb. 12 Abb. 13
Zentrifugieren:
Alle Proben wurden ausserhalb der Dry-Box auf einer Labor¬
zentrifuge (ca. 2500 U/Min.) während mindestens 15 Min. zen-
trifugiert. Dazu wurden die Zentrifugengläser mit einer Se¬
rumkappe dicht verschlossen. Nach dem Zentrifugieren wurden
-3sie in einem evakuierten Glasrohr (< 2-10 Torr) wieder in
die Dry-Box zurückgebracht.
- 82 -
4.5. Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
Die verwendete Apparatur wurde von Dr. J. Schreiber entworfen
und gebaut. Für seine Hilfe und seine praktischen Ratschlägemöchte ich ihm nochmals herzlich danken.
Die Apparatur sei kurz durch die folgenden Angaben charakte¬
risiert; eine ausführliche Darstellung findet man in [2 9].
Säulendimensionen:
Adsorbens:
mobile Phasen:
System I
System II
System III
Druck:
Flussrate:
Detektoren:
7 x 24 0 nm
Partisil 5: gepackt nach der 'slurry-
packing' Methode
22)Pentan/CH2C12100:20:2,25:0,1
/DME/HMPA
22)/DME/HMPA/H 0Pentan/CH2C1?
100:20:2:0,1:0,025
Pentan/CH Cl /CH CN
100:40:20
35-45 atm; gemessen zwischen Pumpe und Säule
70-100 ml/h; die Flussrate ist bei den be¬
schriebenen Chromatogrammen jeweils angegeben
Laboratory Data Control, UV-Monitor,23)
Detektorwellenlänge 280 nm
(LDC-Detektor)
PERKIN-ELMER LC-55 Spektrophotometer
Detektorwellenlänge variabel, meistens ver¬
wendete Wellenlänge 280 nm (PE-LC-55)
22) Für die Trennung von magnesiumhaltigen Derivaten ist es unumgänglich,stets frisch über Alox filtriertes Methylenchlorid einzusetzen. Schonnach einmaliger Verwendung von unbehandeltem Methylenchlorid mussteeine deutliche Qualitätsverminderung der Säule festgestellt werden.Im Chromatogramm wurde eine Verunreinigung festgestellt, deren Peak-form auf die Entstehung während der Chromatographie hinwies.
- 83 -
^)
0 J
V t„-tR o
to
to
Auswertung der Chromatogramme
theoretische Bodenzahl N
Kapazitätsverhältnis k' =
t = Retentionszeit der KomponenteR
t = Totzeit; gemessen als Retentionszeit von Pentan
a = Standardabweichung der Gausskurve
halbe Signalbreite in 60 % Peakhöhe
Die Retentionszeiten hängen im wesentlichen von der Flussge¬
schwindigkeit und der Zusammensetzung der mobilen Phase, so¬
wie in geringerem Mass von der Temperatur ab. Auch bei kon¬
stanter Zusammensetzung der Lösungsmittel (gleiche Charge)
und unverändertem Hubraum der Pumpe gelang es normalerweise
nicht, eine Konstanz der Retentionszeiten über einige Stunden
24)zu erhalten (Abweichungen bis ca. 5 %) .
Man chromatogra-
phierte deshalb am Anfang und Ende einer Trennserie Phäophy-
tin a (Epimerengemisch) als Referenz.
Durch Aufzeichnung der optischen Dichte in Abhängigkeit der
Zeit (und damit des Elutionsvolumens) wurde die quantitative
Zusammensetzung der Proben unter folgenden Annahmen ermittelt:
23) Infolge der benützten Zellenkonstruktion reagiert der Detektor auch
auf Unterschiede in den Brechungsindices. Es werden deshalb teilweise
auch Substanzen, die im verwendeten Wellenlängenbereich nicht absor¬
bieren, sowie Druckunterschiede angezeigt.
24) Mögliche Ursachen: Temperaturunterschiede oder wahrscheinlicher sehr
langsame Einstellung des Gleichgewichtes des Wasser- oder HMPA-Ge-
haltes zwischen stationärer und mobiler Phase.
- 84 -
1. Die Flächenintegrale wurden durch das Produkt von Peak-
höhe und Halbwertsbreite approximiert. Wenn die Halbwerts¬
breite der Epimeren infolge der geringen Konzentration
nicht ausgemessen werden konnte, setzte man einen aus meh¬
reren Messungen gemittelten Wert für das Verhältnis der
Halbwertsbreiten ein:
(Chi a)/(Chl a1) =1,3
(Phäo a)/(Phäo a') = 1,1
(Chi a)/(Phäo a) =1,4
2. Die molaren Extinktionskoeffizienten der metallhaltigenDerivate (Chi a, Chi a' und Allomere) unterscheiden sich
höchstens geringfügig und wurden für die Berechnung als^ 4.- u u 25)identisch angesehen
Entsprechendes gilt für die metallfreien Derivate
3. Das Verhältnis der Extinktionen von Phäophytin a und Chlo¬
rophyll a wurde durch die Auftrennung eines Gemisches be-
27)kannter Zusammensetzung ermittelt. Ein Teil einer Lö¬
sung aus 790,6 ug Phäophytin a (0,907 yMol) und 942,2 yg
Chlorophyll a (0,977 yMol) (beides Epimerengemische; die
Flächen der Epimerensignale wurden zu denjenigen der
Hauptpeaks addiert) ergaben Signale mit den Flächenver¬
hältnissen
0,715 : 1 (PE-LC-55; 280 nm; vgl. Abb. 14)
0,676 : 1 (LDC-Monitor; 280 nm)
25) Die gute Übereinstimmung der qualitativen UV/VIS-Spektren zwischenChi a und Chi a' (vgl. auch [l63j und Q?28j und zwischen Chi a undden Allomeren (vgl. z.B. [229J, S. 91) lassen grosse Unterschiede derExtinktionskoeffizienten unwahrscheinlich erscheinen.
26) Qualitativ gute Übereinstimmung der UV/VIS-Spektren zwischen Phäo aund Phäo a' (vgl. Fussnote 36)) sowie zwischen Methylphäophorbid a
(20) und 132-Methoxy-methyl-phäophorbid a (vgl. S. 130 bzw. [230]).27) Infolge der grossen Bandbreite des Messstrahls kann nicht einfach
der molare Extinktionskoeffizient bei 280 nm eingesetzt werden.
- 85 -
Daraus errechnet man ein Verhältnis der "Aquivalentflachen"
von Phäophytin a zu Chlorophyll a von:
1 : 1,11 für den PE-LC-55
1 : 1,37 für den LDC-Monitor
Die Trennleistung sei anhand der Auftrennung des Standardge¬
misches aufgezeigt (Abb. 14)
System II; 72,8 ml/h; PE-LC-55
N'R
k'
A Phäo a' 9025 9,5' 0,75
B Phäo a 9112 10,5' 0,94
C Chi a" 9757 12,1' 1,23
D Chi a 10845 15,1' 1,75
B D
0 10 20 30 Min.
Abb. 14: Chromatogramm einer Mischung aus Phäophytin a',
Phäophytin a, Chlorophyll a' und Chlorophyll a
(Molverhältnis der metallfreien zu den metallhal¬
tigen Derivate 1:1,08), System II
- 86 -
5.1.
CHLOROPHYLL A-DERIVATE
Reinigung von Phäophytin a
Pflanzenextrakt
1R + IS
C55H74N4°5871,22
5.1.1. Chromatographie des Pflanzenextraktes [101,231]
2 8)Als Ausgangsmaterial stand ein roher Spinatextrakt zur
Verfügung, der neben Phäophytin a und Phäophytin b noch ge¬ringe Mengen Carotinoide, farblose Verunreinigungen und allo-merisierte Derivate enthielt.
50 g Extrakt wurden an 2,5 kg Kieselgel (aufgezogen in CCl.)getrennt: Säule: 10 cm x 80 xm, Extrakt in ca. 200 ml CH-Cl«
28) Herrn Prof. Dr. H.H. Inhoffen danken wir für die Überlassung einergrösseren Menge dieses Extraktes. (Ursprung: Sandoz AG Basel,Dr. A. Stoll).
- 87 -
aufgetragen; eluiert mit CC1./Aceton 95:5; Tropfgeschwindig-
keit ca. 200 ml/h.
Die Chromatographie wurde vorsichtshalber im Dunkelraum aus¬
geführt. Die einzelnen Fraktionen untersuchte man mittels
UV/VIS-Spektroskopie und DC auf Kieselgel. Die schwach ge¬
färbten Carotinoide wurden praktisch mit der Front eluiert.
Von den nachfolgenden Porphyrinderivaten zeigte Phäophytin a
(_1) den grossten Rf-Wert. Es wurde praktisch quantitativ,
mit wenig Mischfraktionen, von den übrigen Derivaten abge¬
trennt. Nach Elution des Phäophytins a konnten auf der Säule
keine getrennten Zonen mehr gesehen werden; man erhielt auch
keine einheitlichen Fraktionen mehr. Als zweites Hauptprodukt
fiel Phäophytin b an, das aber in allen Fraktionen noch von
weiteren farbigen Substanzen begleitet war.
Die laut DC nur schwach verunreinigten Fraktionen von Phäo¬
phytin a (_1) wurden vereinigt, am RV eingeengt und während
2 4 Stunden am HV bei RT getrocknet. 2 0,1 g (40 %) Phäophytin
a blieb als violettblaue, klebrige, schmierige Masse. Misch¬
fraktionen, die hauptsächlich 1. enthielten (4,3 g), wurden
später für die Umesterung zu Methylphäophorbid a (2_0) ver¬
wendet.
Die Phäophytin b-Fraktionen wurden ebenfalls vereinigt und am
HV getrocknet. Es blieben 9,1 g = 18,2 % einer an Phäophytin
b (1_6_) angereicherten braunen, klebrigen Masse.
Phäophytin a-Fraktionen:
DC: Kieselgel, Methylenchlorid/Acetonitril 95:5
Rf = 0,62, sehr schwache Verunreinigungen zwischen
0,7 und 0,5 erkennbar 29)
29) Die sehr schwachen Substanzflecken sind nur wegen ihrer tiefroten
Fluoreszenz unter der UV-Lampe (366 nm) deutlich erkennbar
- 88 -
Kieselgel, Methylenchlorid/Aceton 95:5Rf = 0,63, sehr schwache Verunreinigungen haupt¬sächlich bei Rf = 0,55 29)
Kieselgel, Hexan/Aceton 70:30Rf = 0,41, geringe Verunreinigung bei Rf = 0,35 29)
UV/VIS: Methylenchlorid, qualitativ auf PE 402
Amax: 667 (0,43), 610 (0,08), 537 (0,09)507 (0,10), 414 (1,00)
HPLC:- System I, 80 ml/h, LDC-Monitor
t^ in Min., (relative Peakhöhe ou')
4,1 (0,5), 4,4 (0,6), 4,7 (0,7), 5,1 (0,3), 5,7 (0,2),8,1 (0,8), 9,4 (0,4), 9,9 (25,8; IS), 11,0 (2,3),11,6 (100,0; 1R), 14,1 (0,4)
Aus den angegebenen Werten errechnet man ein Ver¬hältnis von Phäo a' zu Phäo a von 19:81.
Phäophytin b-Fraktionen:
DC: Kieselgel, Methylenchlorid/Acetonitril 95:5Rf = 0,57, Hauptverunreinigungen bei 0,45 und 0,39
Kieselgel, Methylenchlorid/Aceton 95:5Rf = 0,57, Hauptverunreinigungen bei 0,5 und 0,46
Kieselgel, Hexan/Aceton 70:30Rf = 0,39, Hauptverunreinigung bei 0,3
UV/VIS: Methylenchlorid, qualitativ auf PE 402
Ämax: 655 (0,20), 600 (0,05), 554 (0,05),525 (0,07), 439 (1,00), 417 (0,40)
5.1.2. Vorversuche zur Reinigung der Phäophytin a-Fraktionen
HCL-Fraktionierung [12 9] :
106,9 mg Phäophytin a wurden in 150 ml Äther (entgast durch
Einleiten von Argon während 10 Min.) gelöst. Anschliessend
30) Da die Strukturen und damit auch die Absorptionskoeffizienten der
Verunreinigungen nicht bekannt sind, können die Mol-Verhältnissenicht ermittelt werden. Man beschränkte sich deshalb auf die An¬gabe der relativen Höhe der Peaks.
- 89 -
extrahierte man nacheinander je zweimal mit 30 ml 20, 22,
24, 26, 28, 30 und 31,8 proz. wässriger Salzsäure (ätherge¬
sättigt bei 0° C). Die entsprechenden salzsauren Phasen wur-
31)den vereinigt und auf je 240 ml eisgekühlte Pufferlösung
gegossen, diese mit je 150 ml Äther ausgezogen, die organi-31)
sehen Phasen nochmals mit 100 ml Pufferlösung gewaschen,
mit Na„SO getrocknet und eingeengt.
Keine der 7 Fraktionen war DC-rein (Kieselgel, Hexan/Aceton
80:20). Die Verunreinigungen hatten sich zwar in den ersten
Fraktionen angereichert, in den Fraktionen mit höherer Salz¬
säurekonzentration trat jedoch im Dünnschichtchromatogramm
ein "Startfleck" (wahrscheinlich durch Hydrolyse des Esters
entstandenes Phäophorbid a) auf. Die Ausbeuten und die Er¬
gebnisse der HPLC-Analysen sind in Tabelle 5 zusammengefasst.
Die Fraktionen mit 2 0 und 22 Prozent HCl sowie die Äther¬
fraktionen waren fast farblos und wurden nicht untersucht.
Tabelle 5: Ergebnisse der HCl-Fraktionierung (HPLC, System I
LDC-Monitor; relative Höhe)
t 24 % 26 % 28 % 30 % 31,8 % HCl-Konz.K.
(Min.) 2,5 mg 6,8 mg 21,8 mg 35,0 mg 28,6 mg Menge
5,3 13,7 0,2 - 0,9 -
7,4 3,2 0,2 - - -
8,2 1,7 2,2 1,1 0,6 0,3
9,0 0,2 0,1 - - -
9,5 - 0,3 - - 0,3
10,0 40,4 49,7 35,2 28,9 21,6
11,0 3,6 3,9 2,3 2,0 1,3
11,7 100 100 100 100 100
13,5 1,2 - - - -
14,2 0,7 0,7 - 0,4 0,6
31) Phosphatpuffer, 1:1 mit HO verdünnt.
- 90 -
Säulenchromatographie:
Vorversuche zu einer nochmaligen Säulenchromatographie an der
230-fachen Menge Kieselgel mit Hexan/Aceton 80:20 oder an der32)250-fachen Menge Lichrosorb 10 mit Pentan/Aceton 85:15
unter Zusatz von BHT als Antioxidans ergab nur einzelne Frak¬
tionen mit weitgehend reinem Material in geringer Ausbeute.
Da es aussichtslos schien, die Hauptverunreinigung (HPLC:t = 11,0 Min., vgl. Tab. 5) abzutrennen, wurden keine weite¬re
ren Versuche in dieser Richtung unternommen.
Umfallen:
Die diversen Versuche zur Reinigung von Phäophytin a wurden
nach der folgenden allgemeinen Vorschrift ausgeführt: Je ca.
33)100 mg Phäophytin a wurden in Lösungsmittel 1 in einem
50 ml-Birnkolben mit Zweihalsaufsatz, Hahn mit Argonballonund Glasstopfen bzw. Serumkappe (vgl. Abb. 18, S. 108) in der
Wärme gelöst. Unter stetigem Erwärmen spritzte man das Lö-33)
sungsmittel 2 langsam zu und liess dann die Lösung auf RT
abkühlen. Anschliessend filtrierte man unter Stickstoff durch
eine Nutsche D 3, trocknete den Rückstand am HV bei RT und
untersuchte Festkörper und Mutterlauge mittels HPLC. Die Be¬
dingungen sind in Tabelle 6 zusammengefasst und die Resul¬
tate der HPLC-Analysen in Tabelle 7 zusammengestellt.
32) Merck, Lichrosorb Si 60, mittlere Korngrösse 10 \m (Kieselgel).
33) Durch Einleiten von Argon während ca. 15 Min. von Sauerstoff weit¬gehend befreit.
- 91 -
Tabelle 6: Bedingungen zum Umfallen des Epimerengemisches
von Phäophytin a
Nr,
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Menge Lm 1 Lm 2 Ausb. Bern.
110.2 mg
109.3 mg
99,0 mg
104.4 mg
109.3 mg
97,2 mg
102,2 mg
104.4 mg
9 2,3 mg
12 0,1 mg
4 0,6 mg
6 2,3 mg
5 ml CH Cl
5 ml
7 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
CH2C12
CH2C12Aceton
Aceton
CHC1
EtOAc
Et20
C2H4C12
CH2C12Aceton
CH„C1„
25 ml MeOH
25 ml
20 ml
30 ml
10 ml
30 ml
30 ml
20 ml
30 ml
30 ml
30 ml
30 ml
Hexan
MeOH
MeOH
H20MeOH
MeOH
MeOH
MeOH
CH CN
CH CN
EtOH
62 mg
74,7 mg
quant.
57,0 mg
61,6 mg
65,2 mg
4 7,3 mg
26,4 mg
19,0 mg
17,2 mg
N 1
N 2 a)
b)
b)
c)
d)
e,d)
f,g)
Bemerkungen;
a) Nach dem Abfiltrieren ausgefallenes Produkt.
b) Es bildete sich auch nach einigen Stunden bei 4 C kein
Niederschlag.
c) Die Pigmente wurden fast quantitativ gefällt, die über¬
stehende Lösung war nur noch schwach gefärbt.
d) Die Fällung der Farbstoffe wurde erst durch partielles
Einengen der Lösung am WV erreicht.
e) Die Mutterlauge aus Versuch 7 wurde als Ausgangsmaterial
eingesetzt.
Niederschlag aus Versuch 8 diente als Ausgangsmaterial.f)
g) T = 4° C statt RT.
2
MMMMCOMH'Ok£>CO-JCTiCn>fc>I—'
IIIIIIII-IIIIII-°IIIII
CnCO
OOOOOOOO IIfI—IIf———f1^1I--I-II CnUlM*»00COvO<T\
OO^OOf-'l"-1OH-1O -f—1—1^1—f—II-II•>-I-II *»*»0>Mv£)O*>Cncn<Ti
^OOOH-'OOOOOOOOO*>WH
OltONJCnCOloWHW<lCo00M~-JCOOM
OOOOOOOO I——I—II--IIII-II*-IIII MMOCOMCOI—'>P>
IIIIIIIIIIII-I-IIIIIIMM
OOOOOooooi-'oo -I—f^—IIIII-I---I--- CTiCOMCnCOMCO^JMcoooco
ot-1ol-1OOH'OOOOOOOOOOOOOnJU)WvJU00CO4^00MV£00>^00lO-«JM
CO00*>•
OOOOOOOoooooooo -J———^1^^——^1^——-^————III-I MMMH'MMMPK)HHHMWCO
ooCDCDoooooooooooooooOOOcnCn-Jcncncnco>fc»coco*»Cocow*>*»*»cncocoMM
WU1<_n|—i|—i|—tfa.1—iMCOCOMMMMMMMMCO -J~0OO<T>COMUlMMMCn--J00-JO--]vj^0J ..-.-0-----,>vJ,,„,„,^,---.. cocno*»cnv^>ocofc^oinißuioooi«)simcncn
WWMMMM'MMM'MMMMMI—1MMMMMMM
M*»**>.Cn~0OMCnOOCOMMMU3~-JMCOO>£>COCn
MMMMh-1\->!-•y-1MMMMMMMI-1h-1MMh-1[-•i-1 CDCDOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO CDCDOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO
IIIIIIIIIIIIIIIIII
OOOOOOOOOOOOooooooo
,&.£>tt^cTicncn-cncn*»*>4^..PiLH-j^cococn£»
OOO
CO00Cn
III
Vr+•-3
1PJrr(D
*»M
M
Mro
-j
.fc.
•feffi
vt-<o
£>
-&~JCD
l-(
D.cnC
>hCOo
tr
cCn3—Hi
-JOj:M
M
(Dcn3
Ol&(D
H(D
^JH-
**3ife.H-
iQn-fD
CO13
M^2*JD:
0\D>ü
«*trO><
rt
H-
öUD
^*JCn«
pj*-rt
MW-
O0
«*3o(D
3
^_^_
MCO
M*<
^cn
ort
0)3
MH
•^1
CO
Cn
M
M
(D
>T3
(ü
£DPf
0:
fD
S
3
-Z6-
- 93 -
5.1.3. Präparative Fällung von Phäophytin a
1,876 g Phäophytin a wurden in einem 250 ml-Kolben mit Zwei-
34)halsaufsatz und Hahn mit Argonballon in 30 ml Aceton in
34)der Wärme gelöst. Man gab 100 ml heisses Methanol im Argon-
Gegenstrom zu und liess anschliessend langsam auf 4 C abküh¬
len. Der dabei gebildete, voluminöse, graubraune Niederschlag
wurde unter Stickstoff abfiltriert. Die beschriebene Fällung
wurde zweimal wiederholt. Man trocknete den amorphen Nieder¬
schlag während 2 Tagen am HV bei RT und erhielt eine etwas
spröde violettblaue Masse (Fraktion I).
Die Mutterlaugen der drei Fällungen wurden vereinigt, am RV
eingeengt und am WV kurz getrocknet. Anschliessend fällte man
wie beschrieben noch einmal aus 10 ml Aceton und 30 ml Methanol
um (Fraktion II).
Die Mutterlauge dieser letzten Fällung ergab beim Einengen
ein graubraunes, hochviskoses Gemisch.
Der Reinigungseffekt wurde anhand HPLC und VIS-Spektroskopie
ermittelt:
Laut HPLC zeigte sich vor allem eine sehr starke Zunahme des
Allomergehaltes, sowie eine Anreicherung der Verunreinigungen
mit niedrigeren t -Werten als Phäo a1 in Fraktion II und vor
allem in der Mutterlauge.
In den VIS-Spektren manifestierte sich der in Fraktion II und
in der Mutterlauge stark erhöhte Gehalt an farblosen (wahr¬
scheinlich phytolähnlichen) Verunreinigungen in einer starken
Abnahme der relativen Extinktionen.
Fraktion I: 1,142 g (60,9 %)
UV/VIS: 393,5 yg in 50 ml Äther*, c = 7,87 mg/1
E(668) = 0,474 (60,3 1/g) ,definiert als 100 %
E(409,5) = 0,960 (122,0 1/g), definiert als 100 %
34) entgast durch mehrmaliges Absaugen am WV.
- 94 -
Fraktion II: 0,392 g (20,9 %)
UV/VIS: 296,8 yg in 50 ml Äther*, c = 5,94 mg/1E(668) = 0,323 (54,4 1/g), entspr. 90,3 %E(409,5) = 0,654 (110,2 1/g), entspr. 90,3 %
Mutterlaugen: 0,225 g (12,0 %)
UV/VIS: 464,0 yg in 50 ml Äther*, c = 9,28 mg/1E(668) = 0,305 (32,9 1/g), entspr. 54,6 %E(409,5) = 0,626 (67,5 1/g), entspr. 55,3 %
Die angegebenen Prozentzahlen beziehen sich auf den Gesamt¬
gehalt an Phäophytin a-Derivaten (inkl. Allomer; Annahme:
e(Allomer) = e (Phäo a)).
HPLC; System I, 80 ml/h, LDC-Detektor: Tabelle 8
Tabelle 8
t (Min.) Frakt. I
relative Peakhöhe
Frakt. II Mutterl.
4,4 0,5 - 1,6
4,6 0,5 0,7 2,3
5,0 -- 4,4
5,5 -- 1,4
6,1 -- 0,9
6,8 -- 0,7
8,8 1,0 0,1 0,5
10,1 0,7 1,1 0,7
10,7 39,6 41,1 46,5 Phäo a,36)11,6 1,9 2,5 2,8
35)
12,3 100 100 100 Phäo a36)
12,8 -- 3,7
15,2 1,2 5,0 11,6 Allomere
32,3 -- 0,9
Für Frakt. I ergibt sich ein Molverhältnis von
Phäo a zu Phäo a1 von 7 3,5 zu 2 6,5
- 95 -
5.1.4. Analytische Daten von Phäophytin a (Fraktion I,
Epimerengemisch/ 1R _£_ LS - 73,5 : 26,5)
Smp. 123-125o
DC29)
bei 0,30
Silgur: Hexan/Aceton 70:30
Rf = 0,40; schwache Verunreinigung
Kieselgel: Methylenchlorid/Aceton 95:5
Rf = 0,35; schwache Verunreinigung 29) kej_ o,27
Kieselgel: Hexan/Aceton 70:30
Rf = 0,35; schwache Verunreinigung29)
bei 0,27
HPLC: Tabelle 8, vgl. auch Abb. 26, S. 124
UV/VIS: 324 ug in 50 ml, c = 7,44-10~ Mol/1
Dioxan* 669 (52'200), 631,5/min (4'400), 611 (8'100),
581/min (1'700), 559 (3'400), 551/min (2'800),
537 (9'900), 524/min (4'700), 506 (11'800), 483/min
(4'200), 471,5 (4*300), 455/min (3'300), 412
(HO'100), 400/Sch (92'100), 380/Sch (60*900),
330/min (19*600), 323,5 (20'600), 295/min (12'400),
274 (15*900), 260/min (15*200)
35)
36)
Bei dieser Verunreinigung handelte es sich nicht, wie ursprünglich
vermutet, um Pyrophäophytin a: 10 mg 1_ (gefällt) wurden in 3 ml
Collidin während 15 Min. am Rückfluss gekocht. (Bedingungen für die
Decarboxylierung von Methylphäophorbid a (20) optimiert.) Nach Auf¬
arbeiten isolierte man ein Produkt mit folgenden Eigenschaften:
DC:
IR:
Kieselgel; Hexan/Aceton 80:20
Hauptfleck Rf = 0,31, schwache Verunreinigungen bei 0,26 und
0,19 (vgl. 1_: Rf = 0,26)
(PE 257, CHCl3): Gleiche Bandenlagen wie _1_. Das IR-Spektrum
unterscheidet sich von demjenigen von 1_ hauptsächlich durch die
stark verminderte Intensität der Bande bei 1723 nm (ca. 60 %)
HPLC: System I, LDC-Monitor (vgl. auch Tabelle 8) t in Min. (rel.
Peakhöhe): 8,8 (0,5), 10,7 (100,0), 11,6 (1,3?, 15,2 (0,5).
Pyrophäophytin a wird mit der gleichen Retentionszeit eluiert
wie 1S_ (Mischchromatogramm) .
Die VIS-Spektren der beiden durch HPLC getrennten Epimeren Phäo a
und Phäo a' sind praktisch deckungsgleich:
Xmax
664 (0,49), 608 (0,07), 534 (0,08), 506 (0,10), 410 (1,00)
- 96 -
378,5 yg in 50 ml, c = 8,69-10~6 Mol/1 (Abb. 1, S. 36)
Äther* 667,5 (52'700), 629,5/min (4'100), 609,5 (7'800),580,5/min (1'600), 559,5 (2'900), 547,5/min (2'200),533 (lO'lOO), 521,5/min (4'500), 504,5 (11'700),481/min (3'800), 470 (4'100), 452/min (3'100), 408,5(106'500), 398/Sch (92'600), 377,5/Sch (61'600), 328/min (18'000), 320 (19'200), 290,5/min (9'600), 273(10'600), 264,5/min (lO'OOO)
IR: 5 %, 0,1 mm (Abb. 15)
CHC1., 3390w, 3030w, 3005w, 2960s, 2930s, 2870m, 1735s,1700s, 1620m, 1583w, 1555m, 1540Sch, 1500m, 1465w,1452m, 1437m, 1410w, 1400w, 1380w, 1367m, 1348m,1295m, 1165m, 1122m, lllOw, 1091w, 1058w, 1033m,985m, 970Sch, 925Sch, 910w, 897w, 853w, 841w, 820w
"H-NMR: 0,09 Mol/1
ppm
in CDC1 * (Abb. 16)
Anz. Protonen
beob. theor.
9,32
9,28
s
0,7 H (1 H) HC-10
9,14
9,10
s
0,8 H (1 H) HC-5
8,50
8,44
s
0,7 H (1 H) HC-20
7,81 d- d (J= 18 ;12) 0,8 H (1 H) HC-317,20
CHC136,25
6,14
s
2,7 H(1 H) HC-132
6,14 d- d (J=18 ;D (1 H) HzC-326,05 d- d (J=12 ;D
_ (1 H) HEC-325,0-5,3 b 1,3 H (1 Hl HC-P24,3-4,6 b (1 H) HC-184,56 d (J = 8) 3,1 H (2 H) H2C-P14,1-4,3 b (1 H) HC-173,87
3,82
s
2,9 H (3 H) H3CO-C-I333,61
3,57
s
7,5 H(3 H) H3C-I21
3,46 q (J = 7) (2 H) H2C-8l3,29 s (3 H) H3C-2I3,02 s 2,9 H (3 H) H3C~7\1,7-2,8 b
9,3 H
(4
(2
H)
H)H2C-171,172H2C-P4
1,81 d (J = 7) (3 H) H3C-I811,58 t (J =7) (3 H) H3C-821,57 s 25,4 H (3 H) U3C-P3i0,9-1,5 b (19 H) H2C~P
,0,83
0,7-0,9
d
b
(J=6)~
11,9 H(6
(6
H)
H)H3C-P71,PlliH3C-P151,P16
0,44 b 1,7 H (1 H) HN-1,5
-1,7
b
b
~
1,3 H(1 H) HN
- 97 -
Die Signallagen stimmen mit den Literaturdaten [13 0"1
innerhalb 0,05 ppm überein. Nach Aufnahme des Spek¬
trums bestand die Lösung laut HPLC aus einem Epimeren-
gemisch .1R:.1S = 76,5:23,5. Die Integrale der Epimeren-
signale sind mit diesem Wert vereinbar.
C-NMR: 0,11 Mol/1 in CDC1-
189,5
172,8
172,0
169,5
161,1
155,3
150,7
149,5
144,8
142,7
141,8
137,8
136,2
135,9
131,6
128,8
122,4
117,7
105,1
104,1
97,2
92,9
78,2
76,9
75, 6
65,7
S C-13
S C-16, 173S C-19
S C-133S C-13
S C-6
S C-9
S C-14
S C-8
S C-P3
S C-l
S C-ll
S C-3
S C-4,C-7
S C-2
D+S C-31,C-12T C-32D C-P2
S C-15
D C-10
D C-5
D C-20
CDC1-
C-132 (2S)
64.6 D C-13
61.4 T C-Pl
52.7 Q CH30-C-13351.1 D C-17
50,0 D C-18
39,7 T C-P4
39.2 T C-P14
37,2 3?T C-P8,P10,P12
36.5 T C-P6
32.7 D C-Pll
32.5 D C-P7
31.2 T C-171
29.8 T C-172
27.8 D? C-P15
24.9 T C-P5
24.7 T? C-P13
24.3 T C-P9
23.0 Q C-P15,P16
22.6 Q C-181
19,6 2Q C-P71,P11119.1 T C-81
17.2 Q C-82
16,2 Q C-P31
11,9 2Q C-21,12110.8 Q C-71
Die Zuordnung der Signale erfolgte in Analogie zu den
publizierten Spektren von Methyl-phäophorbid a [131,34] und Phytylacetat [132].
4000 Vcm 500 400
Abb. 15: IR von Phäophytin a in CHCl.
- 98 -
Abb. 16: H-NMR von Phäophytin a in CDCl.
Analyse: CrrH_ .N.O.-55 74 4 5
ber. :
gef. :
C 75,82C 75,95
H 8,56 N 6,43 %
H 8,64 N 6,35 %
5.1.5. Epimerisierung von Phäophytin a
Zur Bestimmung der Epimerisierungsgeschwindigkeit und der
Gleichgewichtslage wurden in der Dry-Box je ca. 1 mg _1 gelöst.Man engte die entnommenen Proben am WV rasch ein und untersuch¬
te sie anschliessend mittels HPLC. Im folgenden sind hinter
den Reaktionszeiten (bei RT) die entsprechenden Anteile von
IS an der Gesamtmenge (1R+1S) aufgeführt:
HPLC: System II, PE-1C-55 Detektor.
Epimerisierung in Aceton:5 Min. (25,6), 65 Min. (22,6), 225 Min. (18,5),8 1/2 h (16,7), 23 V2 h (16,3), 33 V2 h (16,2), 48(16,0), 57 V2 h (17,1), 198 h (16,2)Gleichgewicht: 1R:1S = 84:16
Epimerisierung in Äther15 Min. (26,7), 30 Min. (25,8) ,
60 Min. (26,1) ,120 Min. (25,4), 4 h (24,5), 8 VA h (23,6), 24 h(23,4), 48 h (21,7), 145 h (19,6), 224 h (19,7)360 h (21,4)
Gleichgewicht: 1R:1S = 80:20
- 99 -
5.2. Komplexierung von Phäophytin a zu Chlorophyll a
5.2.1. Versuche zur Komplexierung und Reinigung
Die Komplexierungsversuche von Phäophytin a (1R+1S) wurden nach
der folgenden allgemeinen Vorschrift ausgeführt; die Reaktions¬
bedingungen sind in Tabelle 9 zusammengestellt.
Ca. 50 mg _1 wurden in einem 25 ml-Kolben, versehen mit einem
Zweihalsaufsatz, Hahn mit Argonballon und Serumkappe (vgl.
Abb. 18, S. 108) in CH Cl gelöst und dann auf ca. 10-11° C
abgekühlt. Unter intensivem magnetischem Rühren wurde eine
0,2 bis 1,0 M Lösung "BHT-Magnesiumjodid"3 )
in Äther/CH Cl
zugespritzt und während der angegebenen Zeit gerührt. An¬
schliessend goss man die Lösung rasch auf ein eisgekühltes
Gemisch aus einem organischen Lösungsmittel (meist Äther) und
Phosphatpuffer (mit H_0 verdünnt), schüttelte, wusch die or¬
ganische Phase zweimal mit eisgekühltem H„0 und einmal mit
gesättigter Natriumchloridlösung, trocknete mit Na_S0., trenn¬
te einen Teil der Lösung für die UV/VIS-, DC- und HPLC-Unter-
suchungen ab und engte ein. Für Reinigungsversuche sublimier-
te man das BHT ab, bevor die Ansätze in die Dry-Box gebracht
wurden. Die Ansätze 14 bis 22 wurden nach der in 5.2.3. (S.
109) beschriebenen Vorschrift ausgeführt (Tab. 9).
Die UV/VIS-Spektren in Äther (Lage und Verhältnis der Extink¬
tionen) der Rohprodukte entsprachen den Literaturdaten [135] .
Durch Dünnschichtchromatographie (Silgur, Hexan/Aceton 70:30)
wurden normalerweise nur noch sehr geringe Mengen Edukt und
wenig Allomer neben ZR nachgewiesen. Bei raschem Arbeiten be¬
obachtete man höchstens einen schwachen Startfleck; während
der Trennung zersetzte sich die Probe nur sehr geringfügig.
37) BHT-Magnesiumjodid: Durch Umsetzung einer 1 bis 2,7 M ätherischen
Lösung von ÄthylmagnesiumJodid mit 1,1 Mol-Äquivalent Di-tert-butyl-
4-methyl-phenol in CH2C12 bei RT hergestellt und innerhalb 10 bis 45
Min. verwendet.
- 100 -
Die Resultate der HPLC-Untersuchungen sind in Tabelle 10 zu-
sammengefasst. Die darin oben genannten Retentionszeiten be¬
ziehen sich auf System I (LDC-Monitor; Ans. Nr. 1). Da die
Trennung nicht völlig befriedigte (E und F wurden nicht unter¬
schieden) , wechselte man im Laufe der Arbeit (ab Versuch 17)zu System II. Die unten aufgeführten Retentionszeiten bezie¬
hen sich auf System II (LDC-Monitor, 81 ml/h) und wurden für
Ansatz Nr. 21 gemessen.
Peak A stammt von BHT. Seine Höhe ist hauptsächlich von den
Trocknungsbedingungen abhängig und wurde deshalb nicht ausge¬messen. Bei Verbindung B handelt es sich um ein metallhalti¬
ges Chlorin, das in Lösung (unter Epimerisierungsbedingungen3 8)für ^S_ und _2R) nicht epimerisiert
. Es könnte sich, in Ana¬
logie zu dem von Isenring bei der Komplexierung von Methyl-39) 2phäophorbid a (2_0) gefundenen Nebenprodukt
, um 13 - (Di-
tert-butyl-4-methyl-phenoxy)-Chlorophyll a (BHT-Allomer) han¬
deln. Die Peaks C, D und E sind Verunreinigungen des Edukts
(t_, = 8,8, 10,1 bzw. 11,6 Min. in Tabelle 8), die beim Einbau
scheinbar weder komplexiert noch sonstwie verändert werden.
Peak G konnte aufgrund von Retentionszeit und Mischchromato-
gramm (Ans. Nr. 18) als LR identifiziert werden. Bei den Sub¬
stanzen F und H handelt es sich um Chi a' (^S_) bzw. Chi a (2R) .
Substanz I ist wahrscheinlich ein weiteres Allomer (neben B);38es zeigt ebenfalls das Spektrum eines metallhaltigen Chlorins
Bemerkungen zu einzelnen Ansätzen:
Sämtliche Reinigungsversuche wurden in der Dry-Box durchge¬führt. Man filtrierte das gelöste Rohprodukt jeweils mindestenseinmal durch Watte.
38) Vgl. Reinigungsversuch von Ansatz Nr. 5, S. 103.
39) Vgl. [lOl] ,S. 174.
- 101 -
-p
u
Q)-H
si(0
u
-p -p
X •H
0) g
c•H
S
Eh UO
in
ao
a
CN
4-1
CM
UCM
SCu
Eh
m
a a
0
COl Ö>-H
+psi
g
Vi
CM
rH
ooooouoooooooCMCM CM CMCMCMCMCMCMCMCMCMCM
-p+J+J-P-Pffi-P-P-P-P-P+J-PHWWWWUP4WWWHWW
CM
hr^hOoocooomc^iDoorH rH rH rH
CM CM CM CM CM CM CM
OOiHHHrHrHHEHEHEHEHrH
rH rH I I I I I I PS PS PS PS I
rH H H H rH rH H
H rH rH rH H rH rH
HrlrHHrlH(N(NfM(N(NOHD
OOOOOOOO IM
CM CM CM CM CM CM CM CMC
-p+J-p-P-P-P-P-P 0)
Hwwwwwwwm
minic)in>inLnininLT)
cm cm cm m in
HrltNHrHrlH - -
I I H I rH rH rH rH rH
rH rH H rlH
ininminini/iininin
ooooooooooooo
- * * *******
ocMrHocnnrHHCMCMr~r~rHcinn + rnnLninini/i^^H
ooooooooo
*********
r^ncor^r^r-~r^r^r~
KOKDKDKDKDKDKDKDKD
CTi
OOOCTiOOOOOOOOO
o
kd r- vd
********
\£>KOKD<DKD<DKDKDCV
rH rH rH rH
*********
HrHrHrHrHHrHHrH
ooo ooooooooo
+ + + + + + + + + + + + +
*********
0(OWOhMTi(TiOOCOnoiOOOCTi^DOOOOCOOOCOOOOOCM
CMCNCMCMCMCMCMCMCM
+ + + + + + + + +
*********
rooooocicocoronro
CMCMCMCMCMCMCMCMCN
iHrHOOrHrHOOOOOOO
Q>lrHrHOrHrHrHrHCMCMr-r--1<Ntncinnfiininininf^n
CMCMCMCMCMCMCNCMCM
ininm^wHffioco
innco'rj.oooor^cor-
ooooooooooooo
«3co^^cocoininLniriHHo
roooromnrococnoo
(NClC?iLn^'^,'*'<3,Tjl
ooooooooooooo
r^-sfoocNrHrHcocor-rH^ocM
ooooooooooooo
cMiMnnronnro
Hcrii/ifoinrovocoin
rHlHrHrHrHrHrHrHrH
ooooooooooooo
kd r- LD ITl KD 00
ooooooooo
incMir>r-»rHr^or>rorH
oujcgrg^nnoociMCioininininmuiminin^mTH
r--ix>CMO'*oooLn'sr
i/iininm^iDiriin^
rHrHHrHrHHrHrHH
HCN|f1^inVD>COffiOH(MnHrlrlH
'sTLOVOr^OOCTiOrHCM
rHrHrHrHrHrHCMCMCM
- 102 -
HH
g
-p
>1CO
ecü
-pw
CO
g0)
-p
CO
>1CO
gd)
-p
co
>iCO
Di«
oo 00 1X3 KD LT) 00 >X> *tf >X> KDV »fc ». V
« CN
CNrH rA CN ^ O rH H O rA rH
CN
H
00 cn *r KD 00 U0 rH LO o LT) LT) 00 o 00 00 <T\ r~ 00 00 KD CTl o 00 <T\ "*
*
00 r-
^LH oo CN KD cn O CN O rH O O CN CN CN <* LT) o 00 o o CN <-i O o o o orHrH CN LT)
CN
o o o O o O o o o O o o O o o O o O O O O o O O O O o o ^rK00 o o O o O o o o O o O O o o O o o O O O o o o o O o o r^rH o o o o o o o o O O O O o O O o o O O O o o o o O o o rHrH rH rH rH r^ rH rH H H H rH <H rH r-\ rH rH rH rH rH rH H H H H rH t-\ rH
00 r^ rH * r~- 00 lo r^ CTl IX) 00 CN o o LO CN LT) in >X> 00 LT) CN »x> r^ LH KD KDOtfc
o 00 ** <sT KD CN CN rH o CN rH r-{ r-i ^f CN CN rH rH O O o O o o O r-\ CNHH
rH "tf rH 00 CN CTi CTi CTl
rH
rHEm
rj- "tf CN CN CN CN rH "tf 00CN •-i r-i r^ r~ oo KD O KD r- 00 m oo >X> CTl CT) 00 CN LT) co rH
o KP •rf <tf KD 00 00 00 oo ^p ^r «* LO LT) 00 LT) *x> oo 00 orH
CN
co o rH O CTi CN oo rH OW
rH CN 00 CN rH CN rH CN CN
*tf r~ KD oo KD ^ KD T OO r- LT) 00 00 oo M< t^ 00 KD rr 00 00 *#Q v*. V *> *. h. *. *fc. «b *fc •» •fc *« •h •h hCT! o CN o O o o o 00 o O o o r^ KD O o O o o o o
r— t-~ r- r~ r^ <X> KD co ^ o o o LT) r~- 00 00 oo r^ 00 r^ O •** CN CN rH <x> oo <y\Ur- o o o o o o o ro rH rH rH O o o o o rr o o <-\ r-\ rH rH rH o o oo
H o oo rf ^p <T\ 00 >X) IX) KD rH LO 00 O CJ~i <J\ o o "^ co oo r-\ KD CTl O r-i <x> <x> CNCQr^ LT) 00 KD CN
H
rH CN rH 00 CN =tf CN LT) <3* 00 [-- CN
H
00
CN
rH
CTl
o rH H O o rH rH o o 00
o
00<CLT)
5J«
#
rH CN 00 <rf KD oCO
rHÖ<c ^ CN oo <tf in *X> r-~ 00 CTi O
rH
rH
rH
CN
rH
00
rH rH
LT)
rH
KD
rH rH
co
rH rH
O
CN
rH
CN
CN
CN
- 103 -
1. Das Rohprodukt aus Ansatz 1 wurde in 5 ml Äther gelöst,
man gab 5 ml Hexan zu, unterschichtete mit 1 ml H„0 und
liess langsam eindunsten. Innerhalb von 2 Tagen bildete
sich oberhalb der Lösungsmitteloberfläche an der Kolben¬
wand eine amorphe Kruste; es konnte keine Kristallisation
erzielt werden.
5. Die Lösung des Rohproduktes von Ans. 5 in 5 ml Aceton
und 1 ml HO wurde im schwachen Stickstoffström während
ca. 2 Stunden eingedunstet. Im entstandenen Festkörper
war eine deutliche Abnahme von B, C, D und I, jedoch eine
Zunahme von E+F zu beobachten. Eine Probe der an allen
Nebenprodukten, vor allem aber an E+F angereicherten Mut¬
terlauge, wurde durch HPLC (System I) aufgetrennt, die
einzelnen Fraktionen gesammelt, mit Äther verdünnt, im
UV/VIS (qualitativ auf PE 402) untersucht und anschlies¬
send wieder mit HPLC kontrolliert:
B: BHT-Allomer?
A : 662 (0,67), 620 (0,07), 582 (0,03), 433 (1,00),maX
415 (0,64)
Chlorophyll-Typ Spektrum
einheitlich laut HPLC nach Aufnahme des UV/VIS-Spektrums.
E+F: hauptsächlich 2_S, enthielt auch metallfreies Material
A : 660 (0,77), 616 (0,12), 580 (0,06), 530 (0,04),maX
432 (1,00), 409 (0,68), 375 Seh (0,45)
Chlorophyll-Typ Spektrum
ergab bei HPLC-Kontrolle E+F und H im Verhältnis der Peak-
höhen von 78 :22.
G: LR
A : 666 (0,46), 608 (0,64), 533 (0,06), 505 (0,08),maX
408 (1,00)
Phäophytin-Typ Spektrum
Bei der HPLC-Kontrolle wurden Peaks bei 9,9 Min. (_1S) und
11,7 Min. (G = LR) im Höhenverhältnis von 19:81 erhalten.
H: _2R
A : 660 (0,77), 616 (0,12), 580 (0,06), 535 (0,02),maX
430 (1,00), 409 (0,63), 381 (0,39)
Chlorophyll-Typ Spektrum
Bei der HPLC-Kontrolle wurden E+F (2j3) und H (_2R) nachgewiesen.
- 104 -
Allomer
A : 660 (0,74), 612 (0,08), 578 (0,03), 530 (0,02), 430maX
(1,00), 411 (0,65), 388 (0,39)Chlorophyll-Typ Spektrum
Man löste das ganze Rohprodukt von Ans. 6 in 7 ml Dioxan
und tropfte in Analogie zu [136,137] unter Rühren langsam1 V2 ml H„0 zu. Der entstandene, sehr feine Niederschlagliess sich nur durch Zentrifugieren abtrennen. Sämtliche
Nebenprodukte waren in der Mutterlauge stark angereichert.
Im Festkörper war der Gehalt an E+F stark und an I gering¬
fügig angestiegen, die übrigen Nebenprodukte hatten s'.ark
abgenommen (HPLC).
Das in Aceton/H„0 10:1 gelöste Rohprodukt aus Ans. 7 wurde
über eine Destillationsbrücke mit einem zweiten, mit H_0
gefüllten Kolben verbunden (App. vgl. Abb. 13, S. 81)
am WV kurz evakuiert und so ein Teil des Acetons wieder
abgesaugt. Anschliessend liess man weiteres Aceton aus der
Kristallisationslösung isotherm ins Wasser abdestillieren.
Die Mutterlauge wurde am folgenden Tag vom schwimmenden
Festkörper abgetrennt. Laut HPLC war kein deutlicher Rei¬
nigungseffekt eingetreten, wahrscheinlich wegen zu ra¬
scher "Kristallisation".
Die Wiederholung des oben beschriebenen Versuches mit dem
Rohprodukt aus Ansatz 8 brachte ebenfalls keinen Reini¬
gungseffekt .
Zu dem in 8 ml THF (filtriert über Alox W 200) gelösten
Rohprodukt aus Ans. 9 wurde unter Rühren langsam 6 ml H_0
getropft. Dabei schied sich kein Festkörper, sondern
Tröpfchen ab, die sich beim Zentrifugieren als dunkel¬
grüne Phase über der nur noch schwach gefärbten Lösungsammelten.
Man fällte das Produkt aus Ans. 11 zweimal aus Dioxan/H_080:20. Dabei nahm der Anteil an E+F etwas zu (HPLC) (rel.
Peakhöhe 5,8), während B (1,2), C (ca. 0,5), D (0,5) und
I (1,2) deutlich abnahmen. Anschliessend liess man wie
- 105 -
für Ans. 7 beschrieben, aus 10 ml Aceton und 1 ml H„0
durch isotherme Destillation des organischen Lösungs¬
mittels in 4,5 ml HO kristallisieren. Innerhalb von 4
Wochen bildeten sich "Kristalle" von ^JR, die neben wenig
A (2,0; BHT) nur eine geringe Menge F (0,8; entspr. ca.
0,6 Mol-% 2S) enthielten.
Das zweimal aus 6 ml Dioxan und 2 ml H„0 gefällte Mate¬
rial (geringer Reinigungseffekt wegen zu weitgehender Fäl¬
lung!) aus Ans. 12 löste man in 9 ml Dioxan und 0,5 ml
H„0 und evakuierte dann die Apparatur (vgl. Ans. 7) wäh¬
rend 15 Minuten. Man versuchte so, das Dioxan isotherm in
3 ml H„0 abzudestillieren. Innerhalb von 4 Wochen bilde¬
ten sich jedoch keine Kristalle.
Um den Endpunkt der Einbaureaktion zu bestimmen, entnahm
man dem Gemisch mittels einer Pipette Proben nach 1, 2, 3,
6 und 10 Minuten. Dazu musste der Zweihalsaufsatz jeweils
kurz angehoben werden. Die trotz des Argonstroms (Ballon)
eindringende Luft führte aber zu weitgehender Oxidation
der Produkte.
Ansatz 14 wurde unter den in 5.2.3. (S. 109) beschriebenen
Bedingungen ausgeführt und das Rohprodukt zweimal aus 2 0
ml Dioxan und 5 ml H„0 gefällt. Das gereinigte Material
enthielt laut HPLC ausser ca. 1,3 Mol-% Allomer (I) ge¬
samthaft weniger als 0,5 Mol-% weiterer Verunreinigungen.
Das Verhältnis 2R zu 2S betrug 95:5. Sowohl H-NMR als
13auch C-NMR (in CDC1 /CD3OD 88:12) dieses Präparates
stimmten mit den Literaturdaten [13 0^ bzw. [132^ weitge¬
hend überein. Völlig unerklärlich waren jedoch die viel
zu tiefen Werte der Verbrennungsanalyse:
ber. für Chi a • 2 HO: C 71,06 H 8,24 N 6,03 %
gef.: C 65,90 H 7,88 N 5,09 %
bzw. nach Trocknen 0
70°/HV/66 Std.C 66'01 H 7'98 N 5'06 *
Obwohl die Lage der VIS-Maxima mit den Literaturwerten
übereinstimmten, lagen die Extinktionen ca. 20 % zu nie¬
drig. Berechnet für Chi a- 2 HO:
- 106 -
(Et 0) 659,5 (69'500), 427 ( 88'600)Lit. [135]: (Et20) 660,6 (85'100), 428,8 (111'700)
Die erste Vermutung, dass eine anorganische Verbindungdurch das Dioxan aus dem zu seiner Reinigung verwendeten
Alox gelöst wurde, konnte nicht bestätigt werden, denn aus
Dioxan/H„0 schied sich kein Festkörper ab. Die Verunreini¬
gung musste also beim Magnesiumeinbau eingeschleppt worden
sein. Ein Blindversuch, bei dem alle Reagenzien unter den
beschriebenen Bedingungen, aber ohne Zugabe von 1_ einge¬setzt wurden, ergab bei der gleichen Aufarbeitungsmeth i'de
keinen RückstandI
15. Das zuerst aus 17 ml Dioxan/5 ml H„0 und dann aus 14 ml
Dioxan/5 ml H„0 gefällte Material zeigte ebenfalls zu ge¬
ringe Extinktionen (berechnet für Chi a • 2 H_0: 663
(63'400), 431 (82'700); Lit. [135]: 662,0 (76'600), 430,1
(94'000) in Aceton), die Verunreinigung in Ans. 14 war
also nicht nur zufällig.'
16. Kristallisationsversuche des Rohproduktes unter den für
Ansatz 7 beschriebenen Bedingungen waren nicht erfolgreich.
18. Beim Lösen des Rohproduktes für die Fällung wurde im Kol¬
ben eine geringe Menge eines farblosen Rückstandes ent¬
deckt. Aufgeschlämmte Partikel dieser Verunreinigung wurden
bei der wie üblich vorgenommenen Filtration durch Watte
nicht zurückgehalten. Durch Zentrifugieren konnte die Ver-40)
unreinigung sedimentiert und das Chlorophyll a aus der
überstehenden Lösung gefällt werden. Nach der Wiederholungdes Vorganges wurde erstmals Chlorophyll a isoliert, des¬
sen Extinktionen und Analysendaten in der Nähe der erwar¬
teten Werte lagen: (Berechnet für Chi a • 2 H_o)
UV/VIS Aceton: 664 (69'200), 431 (88'200) (DW2)Benzol: 665 (70'100), 433 (92'700) (DW 2)
40) Unlöslich in organischen Lösungsmitteln und HO, löst sich in verdünn¬ter Salzsäure. Es dürfte sich um ein Magnesiumphosphat handeln [l38].
- 107 -
Analyse: ber.: C 71,06 H 8,24 N 6,03 %
gef.: C 70,52 H 8,18 N 5,63%
21. Ansatz 21 ist detailliert in 5.2.3. beschrieben.
22. Der erhöhte Gehalt an Allomer und vor allem an Epimer in
Ans. 22 ist auf die Bildung von Emulsionen bei der Ex¬
traktion mit Benzol und die dadurch bedingte Verlängerung
der Aufarbeitungszeit zurückzuführen.
5.2.2. Magnesiumreagens
In einem trockenen 50 ml-Zweihalskolben, versehen mit Magnet-
rührer, Rückflusskühler mit Argonballon und einem mit einem
einer Serumkappe verschlossenen Tropftrichter wurden 1,001 g
(4,18 mMol) Magnesiumspäne unter Argon vorgelegt und mit 3 ml
Äther* überschichtet. Während einer Stunde tropfte man eine
41)Lösung aus 3,2 ml ÄthylJodid und 14 ml Äther* unter mas¬
sigem Rühren zu. Man liess während 90 Minuten am Rückfluss
kochen, ersetzte dann im Argongegenstrom den Tropftrichter
durch einen Hahn mit aufgesetzter Serumkappe (vgl. Abb. 17)
und liess über Nacht stehen.
Je 1 ml der Lösung wurde mit 0,1 N HCl hydrolysiert und mit
0,1 N NaOH-Lösung gegen Phenolphthalein titriert. Die Konzen-
42)tration des Grignard-Reagenzes betrug 2,0 Mol/1 . So her¬
gestellte Lösungen unterlagen in der dichten Apparatur unter
Argon keiner Farbänderung und konnten auch nach einigen Tagen
verwendet werden, ohne dass sich eine Qualitätseinbusse fest-
4- -n i43)
stellen liess
41) Äthyljodid: Siegfried, purum, unter Argon frisch destilliert.
42) Höher konzentrierte Lösungen lassen sich mittels Spritzen nur noch
schwer handhaben.
43) Isenring ( [lOl] ,S. 166) fand einen ungünstigen Einfluss der mehrere
Tage alten Grignard-Lösung (nicht entgast) auf die Qualität des
Magnesiumreagenzes.
- 108 -
In einer getrockneten, aus einem 25 ml-Kolben mit Magnetrüh-
rer, Zweihalsaufsatz mit Hahn und Argonballon sowie Serumkap¬pe bestehenden Apparatur (Abb. 18) wurden 1,5023 g (6,82 mMol)
2,6-Di-tert-butyl-4-methyl-phenol (BHT) unter Argon in 4 ml
CH~C1 * gelöst und dann unter Rühren während ca. 2 Minuten
3,0 ml der 2 M Grignardlösung zugespritzt. Die heftig sieden¬
de Lösung wurde von Zeit zu Zeit im Wasserbad abgekühlt. Nach
beendeter Zugabe liess man die klare, farblose Lösung licht¬
geschützt stehen und verwendete sie nach 15 bis 20 Minuten.
Serum¬
kappe Argon¬ballon
Reaktions¬
kolben
Abb. 17Abb. 18
Das so hergestellte Reagens war instabil und verfärbte sich
44)innerhalb einiger Stunden zu einer tiefblauen Lösung , die
nach Luftzutritt rasch braun wurde. Für präparative Ansätze
wurden die Lösungen daher immer innerhalb 2 0 Minuten verwendet.
Eine im HV abgeschmolzene NMR-Probe, hergestellt aus 65 3,8 mg
(2,97 mMol) BHT, 0,8 ml CD2Cl2*, 3,7 ml CH Cl2* und 1,5 ml
44) Die Zersetzung wird wahrscheinlich durch Sauerstoff ausgelöst. Dieabgeschmolzene NMR-Probe verfärbte sich über Wochen auch am Lichtnur wenig.
- 109 -
einer 1,924 M Grignardlösung (2,89 mMol) zeigte im H-NMR
folgende Signale (RT).
6,85 s 2,5 H BHT: H-C3, 5
5,26 s CH2C123,37 q (J=7) 19,2 H Et20: CH3-2,16 s 2,6 H BHT: CH3-C41,42 s 18,0 H Et20: CH2-01,24 t (J=7) 28,7 H BHT: tert-butyl
,o ,o ,o • O
Tieftemperaturspektren bei 0 C, -44 C, -64 C und -85 C
ergaben weder eine Verschiebung der Signallagen, noch eine
Aufspaltung der Peaks. Es konnte nur eine Verbreiterung der
Absorptionen, bedingt durch die zunehmende Viskosität der
Lösung, gemessen werden.
5.2.3. Präparative Herstellung von Chlorophyll a
o
C02CH3C02Phytyl
O
C02CH3C02Phytyl
1R + IS
C55H74N4°5871,22
2R + 2S
C55H72N405Mg893,51
In einem 2 5 ml-Kolben mit Magnetrührer und Zweihalsaufsatz
("Y") mit 2 Hähnen wurde über Nacht 155,3 mg (0,178 mMol)
Phäophytin a (1_) am HV bei RT getrocknet. Man ersetzte dann
den einen Hahn im Argongegenstrom durch eine Serumkappe und
löste das Edukt anschliessend in 2,1 ml CH„C1 * (App. vgl.
Abb. 18). Im Wasserbad wurde auf 11 C abgekühlt. Unter in¬
tensivem Rühren spritzte man 3,9 ml Magnesiumreagens (3,3 mMol
Mg; 18,8-facher Überschuss) möglichst rasch zu, wobei sich die
- 110 -
Reaktionslösung sofort lindengrün färbte. Man liess während5 Minuten bei 11-12 C rühren und goss dann auf eine Mischungaus 200 ml Äther, 200 ml eisgekühltem H„0 und 500 ml Phosphat¬puffer (Extraktionsmischung durch Einleiten von N„ entgast!).Der Reaktionskolben wurde rasch mit wenig CH^Cl *
nachgespült,diese Lösung ebenfalls zur Mischung gegeben und intensiv ge¬schüttelt. Die Wasserphasen wurden sofort abgetrennt und ver¬
worfen, obwohl sie noch wenig grünes, ausgefallenes Material
enthielt. Die grünblaue Ätherphase wurde dreimal mit eisge¬kühltem Wasser und einmal mit gesättigter NaCl-Lösung gewa¬schen und dann mit Natriumsulfat getrocknet. Anschliessend
filtrierte man durch Watte und engte am RV ein. Man trocknete
am HV und sublimierte dann während 2 Stunden bei 6 0 C das
BHT ab. Nach weiteren 14 Stunden am HV wurde das gesamte Roh¬
produkt in die Dry-Box transferiert.
Eine nach dem Trocknen der Ätherphase abgetrennte und im Stick¬
stoffstrom getrocknete Probe des Rohproduktes zeigte folgendeEigenschaften:
UV/VIS: Äther, qualitativ auf PE 4 02:A : 662 (0,76), 616 (0,12), 567 (0,06), 429 (1,00),maX
410 (0,68), 373 (0,43), 276 (0,75; BHT)DC: Silgur, Hexan/Aceton 70:30
Rf 0,35: Hauptfleck, blaugrün; Chi a
0,45: sehr schwach, graubraun; Verunreinigung desEdukts
0,69: Im UV (254 nm) schwach sichtbar; BHT
HPLC: System II, 81 ml/h, LDC-Monitor:
tR(Min.) rel. Peakhöhe Mol-%
A 4,8BHT
B 8,2 0,6 0,3 BHT-AllomerC 8,9 0,7 0,5 Verunr.D 10,4 0,5 0,4 desE 12,0 1,8 1,6 EduktsG 12,6 0,3 0,3 1RF 13,1 2,1 1,5 .2S
13,6 0,4 0,3 ?H 17,4 100 94,3 2!RI
K
20,7
21,60,4
0,40,4
0,5 ] Allomere
- 111 -
Man löste das gesamte Rohprodukt in 11 ml Dioxan und zentri-
fugierte anschliessend. Die Lösung wurde vom weitgehend farb¬
losen Rückstand abpipettiert, dieser in 5 ml Dioxan suspen¬
diert und erneut zentrifugiert.
Man vereinigte die beiden Lösungen in einem 50 ml-Kolben. Un¬
ter intensivem magnetischem Rühren wurden während 30 Minuten
aus einer Spritze 4,0 ml H_0 zugetropft und anschliessend wäh¬
rend 30 Minuten weiter gerührt. Beim Zentrifugiren setzte
sich ein dunkelgrüner Niederschlag, die überstehende Lösung
blieb blaugrün. Die Mutterlauge wurde vom Niederschlag ge¬
trennt, dieser erneut in 11 ml Dioxan gelöst und das beschrie¬
bene Verfahren unter identischen Bedingungen wiederholt.
Der abgetrennte Niederschlag wurde mit wenig Dioxan in einen
45)Kolben transferiert und über Nacht gefriergetrocknet
12 5,6 mg (entspr. 73,1 %) Chi a N 1.
Die Mutterlaugen der beiden Fällungen wurden vereinigt und un¬
ter intensivem Rühren tropfte man während 30 Min. weitere
4 ml HO. Nach Zentrifugieren, Abpipettieren der überstehenden
Lösung und Gefriertrocknen über Nacht wurden weitere 2 5,8 mg
(entspr. 15 %) Chi a N 2 isoliert.
Der Reinigungseffekt dieser Fällung wurde anhand von HPLC ver¬
folgt. Die entsprechenden Resultate sind in Tabelle 11 zusammen¬
gestellt, für N 1 vgl. auch Abb. 27, S. 124.
45) Man schloss den Kolben mittels Glasbrücke an eine Kühlfalle an, fror
die Substanz in flüssigem Stickstoff ein, evakuierte auf < 2*10 Torr,
liess dann die Probe etwas auftauen (deutlicher Druckanstieg; Lösungs¬
mitteldampf I), schloss dann den Hahn zur Pumpe, kühlte die Kühlfalle
mit flüssigem Stickstoff und liess über Nacht stehen. Durch das Ge¬
frieren der nur noch aus Lösungsmitteldampf bestehenden Atmosphäre im
Innern der Apparatur Hessen sich in dichten Apparaturen (einwandfrei
gefettet; keine Schlauchverbindungen) Drücke von <<10_-i Torr erzielen.
- 112 -
Tabelle 11: HPLC-Resu Ltate von Chi a N 1 iand N 2,
System II, 108 bzw
. 100 ml/h, LDC-Monitor
fcR N 1 N 2
(ml) rel. Peakhöhe Mol-% rel. Peakhöhe Mol-%
6,0 ——
0,6A 6,8 -
-
0,9 BHTB 11,0 -
-
0,5 0,1 BHT-AllomerC 13,4 -
-
2,3 1,1 n Verunr.D 14,3 -
-
1,0 0,5 desE 16,5 0,5 0,3 5,4 3,1 _j EduktsG 17,2 -
-
1,0 0,6 1RF 18,2 10,3 7,2 68,2 31,9 iä19,3 -
< 0,4 -
22,3 --
0,3 0,2H 24,0 100 91,9 100 61,8 2RI 32,7K 42,0
0,2 0,3 0,4
0,3
0,3~
0,3 _j
Allomere
5.2.4. Analytische Daten von partialsynthetischem Chlorophyll a N 1
Smp. :
DC:
HPLC:
UV/VIS
Et20*
Et20*+ H20*
Dunkelgrünes, sehr feines Pulver
70-90° C
Silgur, Hexan/Aceton 70:30Rf: 0,27, hellgrün; 2_R
0,30, schwacher, hellgrüner Fleck; 2_S
vgl. Tabelle 11 und Abb. 27, S. 124
(Extinktionskoeffizienten ber. für MG = 964,09)
366,6 ug in 50 ml, c = 7,61-10_6 Mol/1 (Abb. 2, S. 36)
659 (86'800), 632/min (7'900), 613,5 (13'000),588,5/min (4'700), 573,5 (6'800), 545/min (2'600),527,5 (3'700), 495/Sch (2'100), 470/min (l'lOO),427,5 (110'800), 413/min (69'800), 409 (70'600),385,5/min (42'300), 380,5 (43'100), 336,5/min (22'000)
357,2 yg in 50 ml Et„0 (wassergesättigt),c = 7,41-10~6 Mol/1
662 (84'200), 634/min (8'800), 617 (13*500), 592/min(5'300), 578 (7'300), 549,5/min (2'600), 534 (3'400),506/Sch (1'600), 470/min (500), 430 (105'000), 416/min (66'100), 410 (67'900), 389,5/min (42M00), 383(43'300), 342/min (21'100), 327 (22'700)
- 113 -
390,1 yg in 50 ml, c = 8,09-10 Mol/1
Dioxan* 662 (83'500), 636,5/min (9'800), 622,5 (14'200),
615/Sch (13'300), 593/min (7'200), 587 (7'400),
547/min (3'100), 538 (3'300), 510/min (2'100), 500
(2'200), 471/rain (1'400), 433 (120'700), 417,5/min
(63'100), 410 (66'000), 393/min (39'500), 384
(41'100), 363/Sch (29'700), 345/min (22'000), 330
(24'300), 298/Sch (17'400)
432,7 yg in 50 ml, c = 8,98-10~6 Mol/1
Aceton* 662 (75'500), 635/min (9'700), 615 (13'600), 592/min
(6'000), 579,5 (6'400), 549/min (3'000), 535 (3'300),
505/Sch (1'700), 474/min (800), 430,5 (93*800), 417/
min (66'500), 411,5 (68'000), 388/min (43'800), 385
(44'100), 343/min (21'700)
418,5 yg in 50 ml, c = 8,68-10~6 Mol/1
Benzol* 677/Sch (43'500), 668 (52'300), 639/min (13'500),
626 (14'600), 592/min (7'500), 584 (7'700), 547/min
(2'600), 536 (3'000), 502/Sch (1'500), 483/min
(l'OOO), 434 (75'700), 416/Sch (56'300), 393/min
(40*200), 384 (41*400), 353/min (26*300), 346 (27'500)
IR: 2,5 %, 0,2 mm (Abb. 19)46)
CHC1 * 3000w, 2960s, 2930s, 2865m, 1730s, 1677s, 1640m,
1610s, 1555s, 1535s, 1490m, 1467m, 1453m, 1435w,
1380w, 1365w, 1345m, 1325w, 1305w, 1285m, 1185m,
1150Sch, 1125m, 1105w, 1070w, 1040m, 1020w, lOOOw,
985w, 920m, 890w, 875m
3 %, 0,2 mm
CC1 * 3090w, 2960s, 2930s, 2870m, 2860m, 1735s, 1695s,
1655s, 1610m, 1550m, 1530m, 1490m, 1465m, 1450m,
1430w, 1375w, 1365w, 1345m, 1328w, 1305w, 1287m,
1253w, 1240w, 1225w, 1190m, 1160m, 1130m, 1125m,
HOOw, 1070w, 1042m, 1000m, 985w, 920m, 888w, 877v/
KBr 3600-3200m, 2955s, 2930s, 2865m, 1735s, 1690s,
1650m, 1605m, 1548s, 1532m, 1485m, 1460m, 1450m,
1375m, 1345m, 1325m, 1300m, 1285m, 1255w, 1235m,
1182m, 1155m, 1130m, HOOw, 1070m, 1040m, 995m,
985m, 972m, 915m, 870m, 850w, 840w, 798m, 765w,
740m, 700w, 610w
46) Laut HPLC keine Zunahme des Gehalts an Allomeren während der Aufnahme
des Spektrums.
- 114 -
0,03 Mol/1 in Aceton-d * (Abb.6
20)
Anz. Protonen
ppm beob. theor.
9,68
9,66
s
0,7 H (1 H) HC-10
9,36
9,34
s
0,8 H (1 H) HC-5
8,52
8,47
s
0,9 H (1 H) HC-20
8,09 d- d (J=18 -11) 0,8 H (1 H) HC-316,19 d- d (J=18 ;2)
-
(1 H) Hz-326,13 s 2,5 H (1 H) HC-1325,98 d- d (J=11 •2)
_(1 H) HE-32
5,59CH2C12
4,8-5,2 b, triplettoid 1,3 H (1 H) HC-P24,0-4,6 —
(1 H) HC-18b 3,9 H (2
(1
H)
H)H2C-P1HC-17
3,78
3,73
s
4,6 H(3 H) H3CO-C-133
3,76 (q) , (J= 8) (2 H) HoC-813,55 s 2,2 H (3 H) H3C-I213,45 s 4,6 H Dioxan3,31
3,25
s
s5,3 H
(3
(3
H)
H)H3C-2IH3C~7
2,60 s 1,4 H H202,1-2,5 b 3,7 H (4 H) H2C-171,1722,01 quintuplett Aceton d51,5-2,0 b (2 H) H2C-P41,74 d (J=7)
12,2 H(3 H) H3C-I81
H3C-821,68 t (J=8) (3 H)1,51 s (3 H) H2C-P310,9-1,4 b 19,7 H (19 H) H2C_P
n
0,83d
+
(J
b
= 7)13,1 H
(6
(6
H)
H)H3C-P71,P111H3C-P151,P16
Das Spektrum stimmt mit Ausnahme der Lösungsmittel¬signale mit demjenigen in [150,151] überein. Die In¬tensität des Signals von Dioxan ist mit dem für die
Berechnungen verwendeten Gehalt von 0,75 Äquivalentvereinbar. Der Wassergehalt ist schwierig abzuschät¬zen; ca. die Hälfte des H20 stammt aus dem Deutero-aceton.
Nach der Aufnahme des Spektrums konnte keine messbareZunahme des Allomergehalts festgestellt werden (HPLC).
- 115 -
1H-NMR: 0,06 Mol/1 in CD-OD/CDC1 * 12:88
ppm
9,51
9,46
9,24
9,21
8,29
8,20
7,96
7,29
6,16
5,98
5,27
5,1
4,2-4,6
4,37
4,0-4,2
3,97
3,73
3,58
3,28
3,23
3,08
1,8-2,9
2,15
1,4-1,8
1,78
1,70
1,56
0,9-1,4
0,84
0,8
Anz. Protonen
beob. theor.
d-d (J=18;ll)
d-
d-
b
b
d
b
s
q
s
s
s
b
b
d
t
s
b
d
b
0,9 H
1,0 H
0,9 H
1,0 H
(1 H)
(1 H)
(1 H)
(1 H)
d (J=18 ;2)i i H
(1 H)
d (J=ll p2)-
* 1x n
(1 H)
1/1 H (1 H)
(J=8H)
~
3,3 H(1 H)
(2 H)
; 3,4 H(1 H)
(3 H)
(J=8) (2 H)
7,9 H (3 H)
6,0
1,1
H
H
(3 H)
(3 H)
(4 H)
(J=8)17,1 H
(2 H)
(3 H)
(J=8) (3 H)
(3 H)
19,1 H (19 H)
(J=6)11,6 H
(6 H)
(6 H)
HC-10
HC-5
HC-20
HC-31CHC13HzC-32
HEC-32
CH2C12HC-P2
HC-18
H2C-P2HC-17
H3CO-C-I3-H2C-81H3C-I21Dioxan
H3C-7}H3C~2CD3OH
17'H2C-171,Aceton
H2C-P4H3C-I8-1-H3C-82H3C-P3XH2C-PH3C-P71H3C-P151,P16
Pll1
Die Signale der Chlorophyllid-Protonen stimmen befrie¬
digend mit denjenigen von Methylchlorophyllid a über¬
ein [130,101].2
Das bei 6,1 ppm erwartete Signal des HC-13 fehlt.
Das Proton tauschte offenbar genügend rasch mit dem
CD3OD aus und erschien als CD30H-Signal bei 3,08 ppm,
dessen Integration recht genau 1 H ergab. Bei der Zu¬
gabe von CH3OH verstärkte sich das Signal und ver¬
schob sich nach tieferem Feld,gleichzeitig erschien
das Signal der Methylgruppe bei 3,28 ppm.
Acetonsignal: Die gleiche Probe wurde vor dieser Auf¬
nahme in Aceton dg gemessen und die Substanz mit Ace¬
ton wieder aus dem NMR-Rohr gespült. Trotz Trocknen
während 2 Tagen am HV bei RT konnten offensichtlich
nicht sämtliche Lösungsmittelreste entfernt werden.
I
3H-
oo
00
^D
o
*MöO
•COGJöO
-
isj
*NJ
to
0J
Ln
M•
oo
er
-ü
er
OO
>
MGJ
GJ
Wv]
Ol
U)
^ß
W>t^
MOJ
MNJ
OJM-JKJOJ^dOO^M^CTNMMMMMMMMi
ii
ii
ii
ii
ii
ii
ii
ii
iionoonnnnoooonnoonno
OJ
u>
10
00
tTi
•XI
CO
CO
mvi
in
CO
M^Ö
»Öl
-~J
£fO
-M
hj
K)fU
I4^
OU1NJMM
MM^tJlMOJ
NJ
WWO
OOO^HUlHvJvJ^JHmHHfcODslOHWX
MM
MOJ
MtO
M
II
II
II
H-
II
OJ
II
II
II
II
II
II
II
II
II
II
IInooonnnnnonooonooonooowooöooooon
ÖOH'OÖCOCOCOCOCOCOCOCOCOCOCOCO
t-30D
h,Oll-lW«)^HO)frl-,01CO*>I001L001sJ(»l-litiH
II
II
UJ
N)
1-9
OOJ
Inj
00
-JWO*sl--Jo«)Ofc*>UHDW^01v)00MUiUlW
MMMM
MMMMMMMMMMMMMMMMMMMM
HHMHHHIOfOWNIOMIOWWUlWWUWiMJiUlW
U3
*M
CT\
MCb
•
\1
CO
M3
00
-
grt
M
(ü
K>
NJ
o
Ul
>•
otr
^p
tr
oH-
>
£1sznw
co
CO
co
co
co
U)
U)
~J
M01WVDUlH'X)U10t»(Ti!Ti
^D
ö
NJ
GJ
CTi
-o
'O
i-3
^•oi-a^oooi-aüHgoo
•%)
-v)
"0
•<>
'O
•<>
O00+OOHi^h3Di-3i-3
Oo
HOOO00OUl0l01*OUIfcMOON)l£)MUl*>OUlvJ01
Ul
M
tBWHOJ~J
^J
CTi
CTl
K)
MO
mcoowuinuiuimoHwwvjffloo^HWHaiviüo
m
M
- 117 -
Aceton-dg:
Die Signallagen in Aceton stimmen mit den von Boxer
et al. [34] gefundenen Werten im allgemeinen inner¬
halb 0,2 ppm überein. Ausnahmen bilden die schwachen
Signale bei 171,3, 169,7 und 168,1 ppm, die von den
Literaturdaten um 0,9, -1,3 bzw. -1,4 ppm abweichen.
Diese Unterschiede sind wahrscheinlich in einem Kon¬
zentrationseffekt begründet; in der zitierten Arbeit
wurde eine Konzentration von 0,1 Mol/1 verwendet. Die
Lage dieser Signale ist infolge Aggregation stark lö¬
sungsmittelabhängig und wird daher auch von der Kon¬
zentration beeinflusst.
Die bei ca. 190 ppm und 162 ppm erwarteten Signale
von C-13 und C-13 fehlen im vorliegenden Spektrum
(zu geringe Konzentration!).
Ausser den bereits beschriebenen Signalen finden sich
im Spektrum folgende Peaks: 32,1, 31,3, 30,6, 29,812,
29,0, 28,3 und 27,5, sowie 206,1 ppm von Aceton-dg.
Die angegebenen chemischen Verschiebungen beziehen
sich auf das mittlere Acetonsignal = 29,812 ppm als
internen Standard.
CDC1 /CD OD:
Die Zuordnung der quaternären C-Atome wurden in Analo¬
gie zu den Resultaten von Boxer et al. [34] übernommen.
Das Spektrum in CDC13/CD30D stimmt mit demjenigen von
Goodman et al. [132] meist innerhalb von 0,1 ppm
überein; die Abweichungen betragen höchstens 0,3 ppm.
Das Signal für das C-13^ konnte nicht gefunden werden.
Dies wird auf den Austausch des Wasserstoffs gegen
Deuterium zurückgeführt. Dadurch wird einerseits die
Relaxationszeit drastisch heraufgesetzt und anderseits
bleibt das Signal auch im breitbandentkoppelten Spek¬
trum in ein Triplett aufgespalten. Das Rumpfsignal
verschwindet im Rauschen.
Das Signal bei 129,6 ppm ordnen Goodman et al. [132]einem quaternären, ungesättigten C-Atom des Ringsy¬
stems zu. Im Gegensatz dazu finden Boxer et al. [34]alle Signale der Pyrrol- und der beiden Pyrrolenin-
C-Atome mittels Indor-Technik oberhalb 134 ppm (in
Aceton dg). Es ist möglich, dass es sich beim frag¬
lichen Signal um die Absorption des C-3 -Atoms von
Chi a1 handelt, obwohl nicht ganz einsichtig ist, wie
eine geringe Konformationsänderung am isocyclischen
Ring eine so drastische Verschiebung der -"-^c-Resonanz
der Vinylgruppe bewirkt.
Ausser den bereits beschriebenen Absorptionen finden
sich im Spektrum folgende Signale:
78,6, 7 7,3 und 7 6,0 ppm von CDC1350,8, 50,0, 49,1, 48,2 und 47,4 ppm von CDoOD.
- 118 -
Nach Aufnahme der Spektren in Deuteroaceton undCDCI3/CD3OD betrug der Gehalt an Allomer laut HPLCca. 2 %, das Verhältnis von 2R:2S lag bei 79:21.
25 A 3 35 4
15 u 20 25
4000 V
500 400
Abb. 19: IR von Chlorophyll a (N 1); 2,5 % in CHCl3
Abb. 20: H-NMR von Chi a (N 1) in Aceton-d,
- 119 -
1 I. I I .~T~
sooo
2500
10,00
*i>**^.f)iMt<*<J*t
1
0
,wAiU^Ü4vM«J%4v^ Vowk twM^H^**)***1 'Vv'*«y^!,'W^s'
13Abb. 21: C-NMR-Spektrum von Chlorophyll a (N 1) in Aceton d,
5000
2900
!1000
^vJWw
13Abb. 22: C-NMR-Spektrum von Chlorophyll a (N 1) in CDC1 /
CD OD 88:12
Analyse: Chi a • 0,75 Dioxan • 0,25 H_0: C,0H.0 cN.O, _cMg
„ rs- . „~
^ 5o /ö,d 4 6,/5MG: 96 4,0 9
ber.: C 72,26 H 8,21 N 5,81 Mg 2,52 %
gef.: C 72,25 H 8,32 N 5,74 Mg 2,37 %7)
47) Frl. K. Lohner danke ich für die Magnesiumbestimmung mittels Atom¬
absorptionsspektroskopie .
- 120 -
5.2.5. Kristallisation
Das Rohprodukt eines nach der Vorschrift in 5.2.3. ausgeführ¬ten Ansatzes (Ans. 20) wurde in der Dry-Box in 10 ml CH„C1„
(frisch durch Alox W 200 filtriert) gelöst und zentrifugiert.Die überstehende Lösung wurde abpipettiert, der fast farblose
Rückstand in 5 ml CH„C1„ aufgeschlämmt und erneut zentrifu-
giert. Man vereinigte die beiden Lösungen, saugte das Lösungs¬mittel ab, löste in 17,5 ml Dioxan und fällte innerhalb 45
Min. durch Zugabe von 5 ml HO. Der Niederschlag wurde noch¬
mals aus 15 ml Dioxan und 5 ml H„0 gefällt und gefriergetrocknet.Ausbeute: 122,9 mg entspr. 75 % bez. eingesetztes 1..
Man löste den gesamten Niederschlag in 14 ml Aceton und fil¬
trierte durch Watte in einen zerkratzten Kolben, gab 2 ml H„0
zu und liess in der in Abb. 2 3 dargestellten Apparatur unter
leichtem Durchsaugen von Stickstoff (Umwälzrate ca. 1,6 1/h)
langsam eindunsten.
Nach 5 1/2 Wochen trennte man die Mutterlauge vom Festkörper ab
und trocknete diesen während 2 Tagen am HV bei RT.
Ausbeute: 7 7,5 mg entspr. 63 % bez. gefällte Substanz.
Abb. 2 3
- 121 -
Analytische Daten von kristallisiertem Chi a
Dunkelgrünes, körniges Pulver
Unter dem Polarisationsmikroskop konnten bei 500-facher
Vergrösserung einzelne Teilchen entdeckt werden, die
eindeutig als Kristalle erkannt wurden.
Grösste Abmessungen: ca. 1,5 x 6 ym.
HPLC:
UV/VIS
Dioxan*
Äther*
Aceton*
System II, 84,4 ml/h, PE-LC-55 Detektor, 280 nm
(Abb. 28)
13,0 Min. (0,5 Mol-%; ZS) , 15,2 (0,3; ?) , 16,5
(98,8; _2R) , 17,5 (0,2; ?) , 22,2 (0,1; Allomer) ,
25,0 (0,1; Allomer)
Die Retentionszeit ist identisch mit derjenigen von
authentischem, durch Extraktion aus Pflanzenmaterial
gewonnenem Chlorophyll a (Fluka, purum; Mischchroma-
togramm).
Die Extinktionskoeffizienten sind berechnet für
Chi a 2 HO; MG = 929,54
-6333,6 yg in 50 ml; c = 7,18-10 Mol/1
662 (87'800), 636/min (lO'OOO), 623,5 (14'900),
616/Sch (13'900), 593,5/min (7'200), 586 (7'700),
543/Sch (3'300), 473/min (l'lOO), 433 (125'500),
418/min (64'400), 411 (67'200), 393,5/min (39'700)
384,5 (41'500), 365/Sch (30'900), 346/min (22'300)
332 (25'500), 298,5/Sch (18'800), 283/Sch (16'700)
275/min (15'900), 248 (23'300)
342,5 ug in 50 ml; c = 7,37-10~6 Mol/1
659.0 (90'800), 633/min (8'400), 613,5 (13'600),
588/min (5'000), 574 (7'300), 547/min (3'100), 528
(4'100), 495/Sch (2'300), 468/min (1'400), 427,5
(115'600), 413/min (71'900), 409,5 (72*900), 387/
min (43'400), 380,5 (44'400), 340/min (23'700)
372.1 yg in 50 ml; c = 8,01-10~6 Mol/1
(gleiche Lösung wie für CD-Spektrum)
662 (79'300), 635,5/min (10'200), 616 (14'900),
590/min (6*900), 579,5 (8'100), 548/min (3'400),
533,5 (3'700), 500/Sch (2'400), 470,5/min (1'400),
430 (97'800), 415,5/min (69*400), 410,5 (70*600),
389/min (44'200), 383 (44*600), 342,5/min (23'100)
- 122 -
CD: Die Konzentrationen der Lösungen wurden berechnetfür Chi a • 2 HO
372.1 ug in 50 ml; c = 8,01-10_6 Mol/1 (Abb. 24,S. 123)
Aceton* 656 (-7,74),565 (-0,62),(+2,50), 400
(0,0)
Die UV/VIS-Spektren vor und nach der Aufnahme des CD-Spektrums waren deckungsgleich.In einer gleichzeitig im selben Lösungsmittel gelöstenProbe von Chlorophyll a vergrösserte sich der Gehaltan _2S während der Messung von 1,0 auf 1,4 Mol-% U'I'LC) .
381.2 yg in 50 ml; c = 8,20-10~6 Mol/1 (Abb. 25)Äther* 656 (-7,62), 632 (-0,37), 613 (-0,73), 600-450
(<±0,25), 425 (+9,27), 410,5 (+4,51), 399 (+6,95),379,5 (+2,93), 376 (+2,99), 362,5 (+0,67), 354(+1,22), 350 (+0,91), 322,5 (+7,80), 302 (+2,13),291 (+3,60), 283 (+2,99), 265 (+3,84), 243 (0,0),232 (-3,90)
Die UV/VIS-Spektren vor und nach der Aufnahme des CD-Spektrums zeigten geringe Unterschiede der Extinktions¬koeffizienten (Temperaturunterschiede?):e(660): vorher: 90'000, nachher: 88'760e(428): 115'580, 114'480
In einem vorgängig ausgeführten Versuch hatte der Ge¬halt an 2S_ einer im gleichen Äther gelösten Probe in¬nerhalb 2 Std. (entspricht der Aufnahmedauer des CD-Spektrums) von ca. 1,9 % auf ca. 3,1 % zugenommen(Tab. 12, S. 126).
t, i ^- 48)Pulverdiagramm:
Die Lagen der Reflexe im Pulverdiagramm stimmen mitdenjenigen der von Isenring [lOl] hergestelltenProbe, die jedoch nicht spezifizierte Verunreinigun¬gen enthielt, überein. Die Intensitäten der Reflexein dem von Kratky [.15 9] beschriebenen Pulverdiagrammsind aber, als Folge der bedeutend höheren Probemenge,deutlich stärker.
632 (-0,87), 615 (-1,37), 587 (0,0),530-455 (<±0,25), 428 (+5,93), 413(+5,06), 367 (0,00), 358 (-0,62), 353
48) Herrn Dr. R. Gubser danke ich für die Aufnahme des Pulverdiagramms.
- 123 -
i H
2 -
0 -] ^-tJ*^at?^*m»9«j
6 -
Abb. 24: CD-Spektrum von 2R
8,01-10~ Mol/1 in Aceton
700 nm
Abb. 25: CD-Spektrum von ZR
8,20-10~6 Mol/1 in Äther
- :24 -
m
10 20
Abb.
HPtjC von Phäophytin a
Systerr II, 84,4 ml/hPE-LC-55, 280 nm
ju
20 30 Min
Abb. 27:
HPLC von Chlorophyll a N 1
System II, 84,4 ml/h
PE-LC-55, 280 nm
Abb. 28:
HPLC von kristallisiertem
Chlorophyll a
System II, 84,4 ml/hPE-LC-55, 280 nm
30 Min
- 125 -
5.2.6. Epimerisierungsversuche
In der Dry-Box wurden einzelne Proben des kristallisierten 2_R
im angegebenen Lösungsmittel gelöst. Teile der Lösungen wurden
nach unterschiedlichen Reaktionszeiten abgetrennt, am WV ein¬
geengt und durch HPLC analysiert.
Die in Tabelle 12 zusammengefassten Daten geben den Anteil von
2S an der Gesamtmenge von Chlorophyll a (2R+2S) in Mol-% wie¬
der (vgl. auch Abb. 3, S. 40). Man untersuchte die Epimerisie-
rung in den folgenden Lösungsmitteln:
Dioxan (2x über Kalium destilliert); Dioxan (wie vorher, zu¬
sätzlich vor Verwendung über Alox W 200 filtriert); Dioxan/H„0
10:1; Aceton; Aceton/H 0 10:1; Äther (2x über LAH destilliert),
2 verschiedene Chargen; Methanol (über Magnesium destilliert).
Aus den vorliegenden Daten ergeben sich folgende Gleichgewichts¬
verhältnisse :
2R
Dioxan: 88 12
Aceton: 79 21
Äther: 79 21
Methanol: 83 17
2S
In Dioxan/H^O und Aceton/H„0 wurde das Gleichgewicht wahrschein¬
lich nicht erreicht.
12,5p-
in
Std.
672
22,9
13,3
12,0
11,9
Std.
340
20,7
Std.
250
22,4
4,1
Std.
224
20,7
Std.
198
20,9
2,6
9,1
12,3
12,4
Std.
144
21,4
Std.
96
5,8
12,1
12,3
Std.
72
12,2
Std.
58
16,6
20,3
1,2
10,6
Std.
48
7,2
Std.
34
16,0
10,2
16,2
0,9
5,2
Std.
24
2,5
1,7
11,7
10,4
Std.
9
7,2
9,9
1,0
Std.
817,6
4,5
5,3
0,7
1,3
1,1
9,4
8,2
Std.
4
3,1
2,9
1,0
1,0
0,9
7,3
6,7
Std.
2
17,4
2,5
0,7
0,8
0,7
5,2
8,8
Min.
60
17,7
1,8
1,2
1,2
0,7
4,7
3,3
Min.
30
17,5
1,9
0,9
0,7
0,6
2,8
1,8
Min.
15
0,5
0,7
1,0
1,3
Min.
5
OH
CH
Et20
Et20
H20
Aceton/
Aceton
H20
Dioxan/
(Alox)
Dioxan
Dioxan
t
(%)
2S/(2R+2S)
2S):
t(2R
aChlorophyll
von
Epimerisierung
Reversible
12:
Tabelle
- 127 -
5.3. Synthese von Cetyl-chlorophyllid a
5.3.1. Methyl-phäophorbid a (20)
o
CO9CH3C02Phytyl C02CH3
1R + IS
C55H74N4°5871,22
20_
C36H38N4°5606,73
In einem 250 ml-Kolben mit Magnetrührer, Rückflusskühler und
Dreiweghahn mit Argonballon wurden 3,009 g Phäophytin a (Roh¬
produkt aus der Chromatographie, leicht verunreinigt, vgl.
5.1.1.) in einer Mischung aus 200 ml Methanol und 6 ml H SO.
gelöst. Durch mehrmaliges Evakuieren am Wasserstrahlvakuum
bis zum Sieden und Begasen mit Argon wurde die Mischung par¬
tiell von Sauerstoff befreit. Man liess die dunkel blaugrüne
Lösung im Ölbad während einer Stunde am Rückfluss kochen und
kühlte den Kolben anschliessend im Eiswasser ab. Die schwefel¬
saure Methanollösung wurde nun zweimal mit 100 ml Hexan ausgezo¬
gen, die Hexanphasen nochmals mit 100 ml 3-proz. methanoli¬
scher Schwefelsäure extrahiert, die beiden Methanolphasen ver¬
einigt und auf 1,2 1 Eiswasser gegossen. Man extrahierte die
Wasserphase einmal mit 500 ml und zweimal mit 100 ml CH Cl,
wusch die organischen Phasen mit 700 ml H„O/100 ml Phosphat¬
puffer, zweimal mit H„0 und einmal mit gesättigter Kochsalz¬
lösung. Man trocknete mit Natriumsulfat, engte am RV ein und
trocknete am HV während 4 Stunden.
Ausbeute: 2,072 g
- 128 -
Die Hexanphasen wurden eingeengt und ergaben nach dem Trocknen
am HV während 2 Stunden bei RT 0,920 g leicht gelbliches,hochviskoses öl, das man nicht weiter untersuchte.
Für die Kristallisation löste man das Reaktionsprodukt in 10 ml
CH~C1,> bei RT und gab dann 20 ml Aceton zu. Am WV wurde nun
im warmen Wasserbad so lange Lösungsmittel abgezogen, bis
Kristalle sichtbar wurden. Man begaste mit Argon und löste
durch Erwärmen nochmals vollständig. Anschliessend liess man
auf RT abkühlen und vervollständigte die Kristallisation über
Nacht im Kühlschrank bei 4 C: 1.263 g violettblaue, glänzen¬de Kristalle (3 Std. HV/RT).
Die Mutterlauge wurde eingeengt und sorgfältig mit wenig Hexan
gewaschen, um die letzten Reste der Phytolderivate zu entfer¬
nen, und der Rückstand wie beschrieben aus 10 ml Aceton um¬
kristallisiert: 507 mg violettblaue Kristalle.
Ausbeute: 1,710 g =2,92 mMol entspr. 84,5 %
Mutterlaugen aus mehreren Ansätzen, sowie verunreinigtes Ma¬
terial, das man durch Umesterung von Phäophytin a aus Einbau¬
versuchen erhalten hatte, wurden durch Chromatographie an der
100-fachen Menge Kieselgel gereinigt. Man trug je ca. lgRohprodukt in ca. 20 ml Benzol/Aceton 90:10 auf und eluierte
mit Hexan/Aceton 80:20. Dabei kristallisierte ^0 in den weit¬
gehend reinen Fraktionen aus den übersättigten Elutionslösun-
gen in sehr dünnen, violettblauen, im Tageslicht tiefrot
fluoreszierenden Blättchen. Die DC-reinen Fraktionen wurden
vereinigt und das Produkt wie oben beschrieben aus Aceton um¬
kristallisiert.
Methylenchlorid/Aceton war für die Säulenchromatographie un¬
geeignet, obwohl sich damit im DC sehr gute Trennungen erga¬
ben. Bei länger dauernden Trennungen wurde, im Gegensatz zu
Phäophytin b-Derivaten [103] weitgehende Allomerisierung be¬
obachtet.
- 129 -
Analytische Daten von 20
Smp.: 230-260 C (Zers.)
DC: Kieselgel, Methylenchlorid/Aceton 92:8
Rf = 0,57; einheitlich
Kieselgel, Aceton
Rf = 0,86
UV/VIS: 248,2 yg in 50,45 ml, c = 8,11-10~ Mol/1
Dioxan* 667 (54*400), 631/min (4*900), 610 (8'500), 579/min
(2'000), 560,5 (3*100), 550/min (2*600), 535,5
(9'900), 524/min (4'900), 506 (12'300), 480/min
(4*400), 470 (4'600), 453/min (3'300), 412 (114'100)
401/Sch (95'700), 377/Sch (60'400), 332/min (20*700)
323 (21'600), 294/min (12'600), 276,5 (15'500),
255,5/min (11*600), 240,5 (17'000)
IR:
CHC1.
0,1 mm
3400w,
1735s,
1465w,
1348m,
1033m,
820w
3030Sch, 3010w, 2970m, 2950m, 2930w,
1700s, 1620m, 1583w, 1555m, 1540Sch,
1410w,
1122m,925Sch
1452m, 1437m,
1295m, 1165m,
985m, 970Sch,
2870w,
1500m,
1400w, 1380w, 1367m,
1112Sch, 1091w, 1058w,
910w, 897w, 853w, 841w,
MS 125
620
575
o
(1),
(10)
609 (1,4),574 (86;
608 (7,8)
M+-CH-.OH) ,
607 (32)
549 (21) ,
606 (76;
(57;
M+),
M+-C02CH2), 547
C02CH3,-CH3OH),44 (100)
(22), 488
461 (24),
548
(13), 487 (33; M+-CH2CH2-460 (16), 459 (25), 431 (10)
- 130 -
H-NMR: 0,10 Mol/1 in CDCl
Anz Protonen
ppm beob. theor.
9,20 s 0,9 H (1 H) HC-109,00 s 0,9 H (1 H) HC-58,46 s 0,8 H (1 H) HC-207,70 d-d (J=18 ;12) 0,9 H (1 H) HC-317,16
CHC136,21 s 0,9 H (1 H) HC-1326,06 d-d (J=18 ;1 5) 1
2,0 H(1 H) HZc-32
5,97 d-d (J=12 fl ,5)_
(1 H) HEC-324,41 m
] 1/9 H(1 H) HC-18
4,18 m (1 H) HC-173,85 s 3,0 H (3 H) H3CO-C-I?33,54
3,53
s
s '_ 5,8 H(3
(3
H)"
H).H3CO-C-I73
. H3C-I213,32 q (J=8)
5,2 H(2 H) HoC-81
^* 13,22 s (3 H) H3C-212,90 s 3,1 H (3 H) H3C~712,1-2,8 b 4,3 H (4 H) H2C-171,1722,09 s 0,3 H Aceton1,80 d (J=7) 2,9 H (3 H) H3C-I811,52 t (J= 8) 3,5 H (3 H) H3C-820,3-0,5 b 0,9 H (1 H) HN
-1,8 bs 0,9 H (1 H) HN
Das Spektrum enthält keine Anhaltspunkte für das Vor¬liegen des 13 - (S)-Epimeren (vgl. [166] ) .
0,13 Mol/1 in CDC13*
189,6 S C-131 105,2 S C-15173,3 S C-173,C-16 104,1 D C-10172,1 S C-19 97,2 D C-5169,6 S C-133 93,0 D C-20161,2 S C-13 64,7 D C-132155,3 S C-6 52,8 Q CH3O-C-I33150,7 S C-9 51,6 Q CH3O-C-I73149,6 S C-14 51,1 D C-17144,9 S C-8 50,1 D C-18141,9 S C-l 31,1 T C-171137,8 S C-ll 29,9 T C-172136,3 S C-3 23,1 Q C-181135,9 S C-4,C-7 19,1 T C-81131,6 S C-2 17,2 Q C-82128,8 S+D C-12/C-31 12,0 2Q C-21,C-121122,4 T C-32 10,9 Q C-71
Die vorliegenden Daten stimmen mit denjenigen in [131]und [134] innerhalb 0,5 bzw. 0,1 ppm überein.
- 131 -
5.3.2. Phäophorbid a (21)
co2ch3
o
co2ch3C02H
o
C02CH3
2Q_
C36H38N4°5606,73
21R + 21S
C_cH_.N.O,.
35 36 4 5
592,70
Ein Gemisch aus einer Lösung von 600 mg (0,99 mMol) 20 in
20 ml HCl/10 ml HO und 50 ml Äther49)
wurde 5 mal am WV
evakuiert und mit Argon wieder begast. Man kochte während
30 Minuten am Rückfluss (T = 32 C). Die Ätherlösung über
der dunkelgrünen wässrigen Phase blieb dabei völlig farblos.
Man kühlte anschliessend im Eisbad ab und goss auf 900 ml
Eiswasser/110 ml CH„C1„. Die organische Phase wurde zweimal
mit gesamthaft 1300 ml Eiswasser gewaschen und die Wasser¬
phasen zweimal mit je 60 ml CH„C1? extrahiert. Um die letzten,
hartnäckigen Emulsionen zu brechen, filtrierte man die ver¬
einigten organischen Phasen durch Glaswatte, dekantierte er¬
neut, trocknete mit Na~SO. und dampfte am RV ein. Das Rohpro¬
dukt enthielt laut DC (Aceton) je ca. 5-10 % Edukt und Pyro-
49) Der Äther war ursprünglich nur für die Temperaturkontrolle verwendet
worden, seine Anwesenheit hat jedoch einen entscheidenden Einfluss
auf den Reaktionsverlauf. Beim Umsatz von Methylphäophorbid a mit
konz. HC1/H20 2:1 während 30 Minuten bei 50-54° C konntai im Rohpro¬
dukt deutlich erhöhte Anteile an Pyrophäophorbid a (26) und Edukt (!)
festgestellt werden, so dass das gewünschte _21_ durch Kristallisation
nicht gereinigt werden konnte.
50) Umsetzung bei RT ergab ein ungünstigeres Resultat.
- 132 -
phäophorbid a (2J5) (Vergleich durch Mischchromatogramm mit
Hydrolyseprodukt von Methyl-pyrophäophorbid a; vgl. 5.3.6.,S. 145).
Man löste in 60 ml siedendem CH-Cl^/Aceton 1:1 und filtrier¬
te dann unter Stickstoff-Überdruck durch eine Nutsche D 3,
engte ein und kristallisierte fraktioniert aus CH Cl unter
Argon. Das so von ^_0 befreite Kristallisat wurde mehrmals aus
heissem Aceton umkristallisiert, um das noch vorhandene 2_5 zu
entfernen. Dabei reicherte sich 21S in den Kristallen gegenŸber 21R deutlich an.
Ausbeute: 4 56 mg = 0,77 mMol entspr. 78 %
Analytische Daten von 21 (3 mal aus Aceton kristallisiert)
Smp,
DC:
violettblaue Blättchen
Epimerengemisch von 21S und 21R 29:71 ( H-NMR)
ca. 250° C (Zers.)
Kieselgel, Aceton
zwei Flecken mit Rf = 0,75 (21S) und 0,71 (21R)(Pyrophäophorbid a: Rf = 0,67)
UV/VIS: 240,4 yg in 50 ml, c = 8,11-10 Mol/1
Dioxan* 669 (50'300), 632/min (3'900), 611 (7'800), 581/min(1'600), 562 (3'000), 552/min (2'500), 537 (9'400),525/min (4*400), 508 (11*500), 484/min (3'800), 472(4'400), 455/min (3'300), 412,5 (105*200), 401/Sch(88'400), 380/Sch (58*300), 331/min (19'600), 323(20'600), 296,5/min (12'100), 278 (14'800), 259/min(13'300)
IR:
KBr 3600-2800w, 3390w, 2960w, 2930w, 2870w, 1740s, 1700s,1670s, 1617s, 1583m, 1555m, 1540m, 1500m, 1490Sch,1455m, 1435m, 1400m, 1370m, 1347m, 1297m, 1222s,1200Sch, 1160m, 1125m, 1090w, 1060w, 1035m, 990m,970Sch, 913w, 898m, 845w, 815w, 770w, 750w, 740w,730w, 720w, 710w, 675w
- 133 -
"H-NMR: 0,11 Mol/1 in Pyridin-d,
ppm
Anz. Protonen
beob. theor.
9,64
9,60
s0,9 H (1 H) HC-10
9,43
9,39
s1/0 H (1 H) HC-5
8,77
8,75
s0,9 H (1 H) HC-20
8,69 Pyridin
8,00 d- d (J=18 ,11) 1,4 H (1 H) HC-31
7,53 Pyridin
7,16 Pyridin
6,83
6,601,4 H (1 H) HC-132
6,23
6,10
d-
d-
d (J=
d (J=
18
11
;2)
;2)2,4 H
(1
(1
H)
H)
HzC-32HEC-32
4,4-4,8 b 2,2 H (2 H) HC-18,17
4,00
3,90 s3,0 H (3 H) H3CO-C-I33
3,58
3,52
s
q (J=8)
~
5,2 H(3
(3
H)
H)
H3C-I21H2C-8l
3,25 s 3,0 H (3 H) H3C-2}3,02
2,4-3,0
s
b
—
6,6 H(3
(4
H)
H)
H3C-71H2C-171,17
1,97 Aceton
1,85 d (J=7) (3 H) H3C-I811,75 6,0 H 7
1,58 t (J=7) (3 H) H3C-820,4-0,8 b£ 1,1 H (1 H) HN
-1,2 bs 0,4 H (1 H) HN
Aus der Integration der Signale lässt sich ein Ver¬
hältnis von 21R zu 21S von ca. 67:33 berechnen.
T^Mfcy/ VrflW1
J4,+-*i*H*ttfilHtfiV*tftf ^*^S^^^^->^^A^Vy^V>^V^IWI ^M-»»** .^>»^^^%^*^^'nM^^^V>WMH<r^
jJüLwiJi-4i'''i^»^tM»>^ wnW 'S^Mf^^
Abb. 29: -*-H-NMR von Phäophorbid a in Pyridin-d,-
- 134 -
5.3.3. Veresterungsversuche von Phäophorbid a
Unter anderem wurden folgende Experimente durchgeführt:
1. Zu einer entgasten Lösung von 4,6 mg (7,9 yMol) 2JL und
25,5 mg Cetylalkohol 1_3 in 5 ml CH^Cl- (gesättigte Lösung)51)wurden unter Argon 2 0 yl DMF-dineopentylacetal ge¬
tropft und bei RT gerührt [168]. Weder nach 44 noch nach
114 Stunden wurde ein vollständiger Umsatz erreicht.
Im DC zeigte sich ein komplexes Gemisch verschiedener De¬
rivate.
2. 4,2 mg (7,1 yMol) ,21. wurden in 5 ml CH Cl * mit 10 yl52)
2 2
(75,3 yMol) DMF-dimethylacetal bei RT umgesetzt.
Selbst nach 8 Tagen wies man im DC noch bedeutende Men¬
gen Edukt neben ^_0 und weiteren Produkten nach.
3. Zu einer entgasten Lösung von 58 mg (97,9 yMol) 2\_ in53)40 yl (190,5 yMol) Äthyldiisopropylamin '
und 2 ml THF
wurde unter Argon bei -10 C 15 yl (190 yMol) Chloramei-54)
sensäuremethylester zugespritzt und unter Rühren auf¬
gewärmt [107,232], Nach zweistündigem Rühren bei RT gabman im Argonstrom 138,2 mg (570 yMol) Cetylalkohol zu,
rührte weiter während 6 Stunden bei RT und arbeitete dann
mit einer Mischung aus 20 ml Phosphatpuffer, 150 ml H~0
und 150 ml Äthylacetat auf. Nach Waschen mit H„0 wurde
die organische Phase mit Na„SO. getrocknet und eingeengt.Fällung aus 5 ml siedendem Äthylacetat mit 50 ml Hexan
ergab 4 5,2 mg Produkt. Aus der Mutterlauge erhielt man
weitere 6,1 mg violettblaues Pulver. Beide Fraktionen ent¬
hielten laut DC höchstens geringe Mengen _L3, daneben ge-
51) Dimethylformamid-dineopentylacetal: Fluka, prakt.
52) Dimethylformamid-dimethylacetal: Fluka, prakt., unter Argon frischdestilliert
53) Äthyldiisopropylamin: Fluka, puriss., über Kalium destilliert
54) Chlorameisensaure: Fluka, purum, unter Argon destilliert
sind.getrennt
unvollständignurHauptpeaksdenvon22Svonnale
Sig¬diedawerden,ermitteltnichtSpektrumgenden
vorlie¬demauskann22Szu22RvonVerhältnisDas
alkohol)H2C-(Cetyl-H3,3
H2C-82H3C-I81
H)
H)GJ
GJH6,3
H2C-171,172H)(4H5,0
H3C-71H)(3H2,8
H3C-2lH)(2
H)(2H8,3 H2C-81H3C-I21H)(3H3CO-C02-H)(3
H3CO-C-13/H)(3H5,2
HC-17,18H)(2H2,0
H2C-32H)(2H2,8
HC-132H)(1
CHC13
HC-31H)(1H0,8
HC-20H)(1H0,8
HC-5H)(1H1,0
HC-10H)(1H1,0
theor.beob.
Protonen.Anz
]bs
(J=7)t
(j=6)d
b
s
s
q
s
s
s
b
(J=18;ll)d-d
s
s
s
1,21
1,53
1,79
2,0-2,7
2,97
3,25
3,4
3,57
3,71
3,83
4,1-4,6
5,9-6,3
7,1
7,7
8,40
8,97
9,13
ppm
MHz)(60CDC1inMol/10,1"H-NMR:
894m908w,
983m,1035m,1088s,1123m,1160m,1295m,1345m,
1367m,1378w,1400w,1408w,1435m,1450m,1495m,
1550m,1580w,1620m,1635m,1695s,1740s,1825m,
2870w,2930m,2940m,3000w,3030w,3390w,3700w,3
CHCl
mm0,2%,3IR:
(21)0,390,63,0,76,beiVerunreinigungen
22),(Hauptfleck;0,60=Rf
1:1Hexan/AcetonKieselgel,DC:
22:vonDatenAnalytische
-Car-17umH-NMRundIRlautsicheshandelteProdukt
31
(22).aboxymethyl-phäophorbid
:lautsicheshandelteProdukt
BeimVerunreinigungen.weitereundEdukt%10ca.samthaft
-135-
- 136 -
22 hydrolisierte bei allen Chromatographieversuchen. Das
Hydrolyseprodukt konnte durch Umsetzung mit Diazomethan
wieder in Methylphäophorbid a (_2_0) übergeführt werden
(Identifikation durch Misch-DC).
Versuche, das gemischte Anhydrid 2_2 durch Umsetzung mit
einem Uberschuss an Cetylalkohol unter Zusatz von
3,3,6,9,9-Pentamethyl-2,10-diazabicyclo [4,4,0]-1-decen-2-oxid [170,171] oder von 4-Dimethylaminopyridin [169] in
THF bei 70 C zu verestern, brachten keine befriedigendenResultate. Während im ersten Experiment neben dem gew'Snschten Cetyl-phäophorbid a (später identifiziert durch Misch-
DC) auch Säure 2_1 und eine weitere Substanz, wahrschein¬
lich 20_, in grossen Anteilen nachgewiesen wurde, enthielt
das Produkt im zweiten Experiment noch zusätzlich weitere
Nebenprodukte.
Versuche zur Veresterung mit 1_3 und Trifluoracetanhydrid
[233] brachten ebenfalls keinen Erfolg.
Versuche zur Veresterung mit Cetylalkohol und Phosgen( [118] , vgl. auch [107]) in Pyridin erbrachten ein gün¬
stigeres Resultat (Hauptfleck im DC ca. 70 %, kein Edukt).
Durch Zusatz von 4-Dimethylaminopyridin zur Reaktionslö¬
sung konnte (laut DC) keine Verbesserung der Ausbeute er¬
reicht werden.
Präparative Ansätze wurden deshalb nach der unter 5.3.4.
beschriebenen Vorschrift durchgeführt.
- 137 -
5.3.4. Cetyl-phäophorbid a (23)
Substanz erstmals hergestellt von H. Fischer [118]
co2h
o
co2ch3C02C16H33
21R + 21S
C35H36N4°5592,70
23R + 23S
C51H68N4°5817,13
243,1 mg (0,41 mMol) Phäophorbid a, 495,4 mg (2,043 mMol)
Cetylalkohol (1_3) und 10 ml Pyridin wurden in einem 50 ml-
Kolben mit Magnetrührer, Zweihalsaufsatz mit Hahn und Serum¬
kappe vermischt. Die Mischung wurde durch Einfrieren entgast
und anschliessend mit Argon begast. Durch Erwärmen im Wasser¬
bad auf ca. 30 C wurden beide Edukte vollständig gelöst.
Man kühlte im Eisbad, wobei die Ausgangssubstanzen völlig ge¬
löst blieben, und tropfte unter intensivem Rühren mittels
einer Spritze während einer Stunde 2,4 ml (4,85 mMol) Phos¬
genlösung zu. Der entstandene graubraune Brei wurde während
2 Stunden bei RT nachgerührt, das Reaktionsgemisch anschlies¬
send mit Methylenchlorid verdünnt und in 750 ml Eiswasser ein¬
getragen. Man zog die Wasserphase mit 500 ml CH„C1 in 4
Portionen aus (die entstehenden Emulsionen lösten sich je¬
weils innerhalb 5 Min. weitgehend auf), wusch die organischen
Phasen mit ca. 1000 ml H^O in 2 Portionen, vereinigte und
filtrierte durch Glaswatte, um die letzten Emulsionen zu
brechen. Die organische Phase wurde abgetrennt, filtriert
und dann am RV vorsichtig (Tendenz zu Siedeverzügen.1) einge¬
engt. Am HV wurde das verbliebene Pyridin entfernt und das
- 138 -
Produktegemisch über Nacht bei RT getrocknet. Das Gemisch
zeigte im DC (Kieselgel, Hexan/Aceton 1:1) kein Edukt mehr,der Anteil an _2_3 betrug schätzungsweise 70 %.
HCl-Fraktionierung:
Das rohe Produktegemisch wurde in 300 ml Äther (entgast durch
Einleiten von Argon während ca. 10 Min.) aufgenommen und 5
mal mit 30 ml einer äthergesättigten 32-proz. eisgekühlten55)
Salzsäurelösung extrahiert. Die Salzsäurephasen wurden
auf 750 ml Eiswasser gegossen und 6 mal mit CH Cl ausgezogen.Die Methylenchloridphasen wurden vereinigt, einmal mit HO,das 30 ml Puffer pH 7 und 30 ml Phosphatpuffer enthielt, und
einmal mit reinem H^O gewaschen. Man presste die Methylen¬chloridphasen mit StickstoffÜberdruck durch eine Nutsche G 3,um die verbliebenen Emulsionen zu brechen, trennte die wäss-
rige Phase ab, trocknete die CHC1„-Phase mit Na SO., engteein und trocknete anschliessend am HV während 2 Stunden bei RT.
Es blieben 275,3 mg Rohprodukt I, das im DC nur noch wenig
Verunreinigungen zeigte, jedoch noch nicht ganz frei von
Pyridin war (Geruch!).
Die Ätherphasen enthielten neben _13_ immer noch wenig Cetyl-phäophorbid a. Sie wurde deshalb eingeengt und die HCl-Frak¬
tionierung wurde mit den halben Lösungsmittelmengen wiederholt.
Nach Trocknen am HV blieben 80 mg Rohprodukt II, das laut DC
jedoch bedeutend mehr Nebenprodukte als Rohprodukt I enthielt.
Die 2 75,3 mg Rohprodukt I wurden chromatographiert:90 g Kieselgel; Säule: 22 x 430 mm, aufgezogen in Hexan/Aceton92:8; Substanz in ca. 2 0 ml Benzol aufgetragen; Elutionsmittel:Hexan/Aceton 92:8, 90:10, 70:30; Tropfgeschwindigkeit ca.
120 ml/h. Die Säule wurde vorsichtshalber vor Licht geschützt.
55) Hergestellt aus 100 ml konz. HCl + 19 ml f^O; die äthergesättigteLösung enthielt ca. 55 Vol-% Et2Ü.
- 139 -
Mit grösstem Rf-Wert wurde zuerst wenig 1_3 eluiert, das mit
den weiteren farblosen Fraktionen verworfen wurde. Man elu-
ierte 163,8 mg (0,20 mMol) laut DC vollständig nebenprodukt¬
freies Cetyl-phäophorbid a (2_3) . Vor- und Nachfraktionen
enthielten ebenfalls noch gewünschtes 2^3. Sie wurden mit dem
Rohprodukt II vereinigt und erneut unter den beschriebenen
Bedingungen chromatographiert. Es konnten weitere 54,4 mg
DC-einheitliches 2_3 isoliert v/erden.
Ausbeute: 209,2 mg = 0,256 mMol entspr. 62,4 %
Kristallisation:
Zu einer Lösung von 16 3,8 mg Cetyl-phäophorbid a in 3 ml
heissem Aceton* spritzte man 12 ml heisses Methanol* zu und
Hess die Lösung während ca. 4 Stunden auf 4 C abkühlen. Die
Mutterlauge wurde abgetrennt und die Kristalle erneut umkri¬
stallisiert. Nach Trocknen am HV blieben 155,3 mg _2_3 als sehr
feine, dunkelblau glitzernde Kristalle.
Analytische Daten von 23
Smp.: 132-133° C
DC: Kieselgel, Methylenchlorid/Aceton 95:5
Rf = 0,62, einheitlich
Kieselgel, Hexan/Aceton 1:1
Rf = 0,84, einheitlich (Cetyl-pyro-phäophorbid a: 0,82)
Kieselgel, Hexan/Aceton 70:30
Rf = 0,33, einheitlich (Cetyl-pyro-phäophorbid a: 0,38)
HPLC: System II, 75 ml/h, PE-LC-55, 280 nm
9,9 Min. 0,1 % ?
11,8 Min. 10,3 % 2_3S12,8 Min. 0,5 % ?
13,8 Min. 89,4 % 23R
23S und Cetyl-pyro-phäophorbid a haben identische
Retentionszeiten.
23S und 23R wurden separat aufgefangen und zeigten
nahezu identische UV/VIS-Spektren.
- 140 -
System III, PE-LC-55, 415 nm
7,4 Min.
7,8 Min.
8,4 Min.
0,1 %
14,7 %
85,1 %
23S
23R
(Cetyl-pyro-phäophorbid a: t = 9,0 Min.)
UV/VIS: 326,1 yg in 50 ml, c = 7,98-10~6 Mol/1Dioxan* 669 (53'900), 632/min (4'500), 610 (8'400), 583/min
(2'000), 561 (3'100), 551/min (2*800), 536 (10*000),524/min (4*800), 507 (12*100), 483/min (4*100), 473(4*300), 454/min (3'100), 412 (112*900), 400/Sch(92*600), 380/Sch (62'100), 331/min (19*500), 323(20'400), 295/min (12'200), 274 (15'700)
IR: 5 %, 0,1 mm
CHC1 3400w, 3000w, 2960m, 2930s, 2858m, 1735s, 1700s,1620m, 1580m, 1555w, 1540Sch, 1500m, 1467w, 1452w,1435w, 1410w, 1400w, 1380Sch, 1370w, 1347w, 1295w,1162m, 1122m, lllOw, 1090w, 1058w, 1033m, 985m,970Sch, 910w, 895w, 854w, 840w, 820w
1H-NMR: 0,10 Mol/1 in CDC1 * (Abb. 30)
ppm
9,30 s
9,27
9,12 s
9,08
8,51 s
8,45
7,79 d-d (j=18;ll7,20
6,26 s
6,14
6,16 d-d (J=18;2)6,04 d-d (J=ll;2)5,22
4,1-4,6 b
3,87 s
3,81
3,8-4,0
3,60 s
3,43 q (J =8)3,39 s
2,99 s
2,0-2,6 b
1,82 d (J=7)1,58 t (J=8)1,1-1,2 b
0,85 t (J=6)0,41 b
-1,78 bs
Anz .
beob.
0,8 H
0,7 H
0,9 H
0,7 H
2,7 H
Protonen
theor.
4,9 H
8,5 H
3
4
39,2 H
1,0 H
0,8 H
(1 H)
(1 H)
(1 H)
(1 H)
HC-10
HC-5
HC-20
HC-31
CHC13
(1 H) HC-13:
(1 H)
(1 H)
2,0 H (2 H)
(3 H)
(2 H)
(3 H)
(2 H)
(3 H)
(3 H)
(4 H)
(3 H)
(3 H)
(28 H)
(3 H)
(1 H)
(1 H)
HZC-32HEC-32
CH2C12HC-17,18
H3CO-C-I33
H2C-Ce 1
H3C-I21H2C-8lH3C~2H3C-71H2C-171,172H3C-I81H3C-82H2C-Ce 2-15
H3C-CeHN
HN
16
- 141 -
C-NMR: 0,075 Mol/1 in CDC1 *
189,6 S C-131
173,0 s C-173,16172,2 s C-19
169,7 s C-133
161,2 s C-13
155,5 s C-6
150,9 s C-9
149,6 s C-14
145,0 s C-8
142,0 s Ol
137,9 s Oll
136,4 s C-3
136,1 s C-7,4
131,7 s C-2
129,0 S+D C-12,31122,6 T C-32
105,3 s C-15
104,3 D C-10
97,4 D C-5
93,1 D C-20
Die Zuordnung der Signale erfolgte in Analogie zu
denjenigen von Methyl-phäophorbid a [131,34], die
chemische Verschiebung der C-Atome in der Seiten¬
kette wurde nach [2 34] abgeschätzt.
Abb. 30: H-NMR von Cetyl-phäophorbid a in CDC1
Analyse: OnH,oN,0c, MG = 817,13bi oo 4 b
ber.: C 74,96 H 8,39 N 6,86 %
gef.: C 75,04 H 8,47 N 6,83 %
56) 23R:23S nach Aufnahme des C-NMR-Spektrums laut HPLC 85,4:14,4;
kein Allomer.
56'
78,3
77,0 CDC1
75,7
64,8 D+T C-132,Ce 1
52,8 Q CH3O-OI3351,2 D C-17
50,1 D C-18
31,9 T C-Ce 14
31,2 T C-171
29,7 T_ C-172
29,4
29,2
TC-Ce 2,4-1
28,5
25,8 T C-Ce 3
23,1 Q C-181
22,7 T C-Ce 15
19,3
17,3
T
Q
C-81C-82
14,1 Q C-Ce 16
12,1 2Q C-21,12111,0 Q C-71
- 142 -
5.3.5. Methyl-pyro-phäophorbid a (24)
(Vorschrift nach [133])
C02CH3
24_
C34H36N4°3548,69
1,0 g 2_0 (1,65 mMol) wurden in einem 250 ml-Kolben, versehen
57)mit Magnetrührer und Rückflusskühler, mit 100 ml Collidin
versetzt und unter intensivem Rühren 3 mal während ca. 2 Min.
am WV evakuiert und mit Argon begast. Anschliessend kochteCT Q \
man während 12 Minuten am Rückfluss. Die Lösung wurde ab¬
gekühlt und das Lösungsmittel am HV abgesaugt. Reste von
Collidin entfernte man durch mehrmalige Zugabe von Benzol und
Abziehen am RV. Der Rückstand wurde in CH^Cl aufgenommen,die Lösung durch Watte filtriert, am WV partiell eingeengtund dann erwärmt. Man gab heisses Aceton zu, liess während
16 Stunden auf 4 C abkühlen und isolierte 2A_ in sehr feinen
Nadeln.
Ausbeute: 0,738 mg =1,35 mMol entspr. 82 %
57) Sym. Collidin: Fluka, puriss. p.a.
58) Vorversuche hatten gezeigt, dass schon nach 10 Min. ein vollständigerUmsatz erreicht war (Reaktionszeit nach [235] : 90 Min.) .
20
C36H38N4°5606,73
- 143 -
Die Mutterlaugen aus verschiedenen Nachschubansätzen wurden
vereinigt und erneut aus Methylenchlorid/Aceton kristalli¬
siert; es wurde so eine durchschnittliche Ausbeute an kristal¬
linem DC-reinem _2_4 von 84 % erhalten.
Analytische Daten von 2 4
Smp.: 234-235° C
DC: Kieselgel, Methylenchlorid/Aceton 92:8
Rf = 0,60, einheitlich
(_2_0: Rf - 0,53)
UV/VIS: 235,8 yg in 50 ml, c = 8,60-10~ Mol/1
Dioxan* 668 (56*100), 631/min (4*400), 610 (8*100), 581/min
(1'500), 559 (2'900), 551/min (2'600), 537,5 (9'700),
525/min (4'500), 507,5 (12'300), 484/min (4'200),
475 (4'400), 455/min (3'100), 412 (120'500), 399/
Seh (95'200), 379/Sch (62'000), 329,5/min (18'200),
319 (21'100), 293/min (13'500), 279 (15*600), 252/
min (9*000), 239 (14*000)
IR: 4 %, 0 ,1 mm
CHC13 3400w, 3005m,
1620s, 1580w,
1400w, 1366m,
1090w, 1058w,818w
2965m, 2930w, 2870w, 1730m, 1685s,
1555m, 1487s, 1450w, 1435w, 1408w,
1346m, 1305w, 1160m, 1123m, 1109w,
1025m, 980w, 923w, 910w, 893w, 850w,
- 144 -
"H-NMR: 0,16 Mol/1 in CDCl.
Anz Protonen
ppm beob. theor.
9,07 s 0,9 H (1 H) HC-109,00 s 0,9 H (1 H) HC-58,50 s 0,9 H (1 H) HC-20
HC-317,72 d- d (J=18; 11) 0,9 H (1 H)7,16
CHCI36,08 d- d (J= 18; 2)
~
1,9 H(1 H) Hzc-32
5,97 d- d (J=11; 2) _j (1 H) HEC-35,14 H
5,00_
A,
(J
B-System=20) 1,9 H (2 H) H2C-132
4,0-4, 5 b 2,0 H (2 H) HC-17,183,55 s 2,9 H (3 H) H3C-I2-1-3,42 s (3 H) H3CO-C-I3,35 q (J=8) 8,0 H (2 H) H2C-18l3,24 s
_ (3 H) H3C-2I2,93 s 3,1 H (3 H) H3C"7\2,0-2, 8 b 4,5 H (4 H) H3C-I71,1,74 d (J=7) (3 H) H3C-I811,64 s 6,1 H •?
1,51 t (J=8) (3 H) H3C-8Z-1,98 b 0,5 H (1 H) HN
Die Signale stimmen mit den bekannten Werten weit¬gehend überein [l33,10l].
13C-NMR: 0,07 Mol/1 in CDCl
196,1 S C-131C-17 ,16
103,9 D c-10173,5 S 97,0 D C-5171,2 S C-19 92,9 D C-20
160,2 S C-13 78,3157,8? 77,0 CDCl155,1 S C-6 75,7150,6
148,9
S
s
C-9
C-14 56,1 Q+DCH-,0-017
C-17144,8 s C-8 50,0 D C-18141,5 s C-l 48,0 T C-132137,7 s C-ll 31,0 T C-171136,0 s C-3 29,8 T C-172135,9
135,7
s
s ] C-7,4 23,1
19,3
Q
T
C-181C-81
131,4 s C-2 17,4 Q C-82129,2
128,1
D
S
C-31C-12
12,0
11,9
Q"
Q _j
C-21,121122,4 T C-32 11,1 Q C-71105,9 S C-15
- 145 -
5.3.6. Pyro-phäophorbid a (25)
co2ch3 C02H
24_
C34H36N4°3548,69
25
C33H34N4°5534,66
Eine Mischung von 284,3 mg (0,52 mMol) 2_4, gelöst in 5 ml
konz. HCl und 2,5 ml H„0, und 25 ml Äther wurde am WV ent¬
gast und unter Argon während 45 Min. am Rückfluss gekocht
(T = 32 ). Man kühlte ab, verdünnte mit 450 ml Eiswasser und
50 ml Phosphatpuffer und extrahierte mit CH^Cl«. Nach Wa¬
schen der organischen Phase mit H„0 filtrierte man durch Gla
watte, trocknete die Methylenchloridlösung mit Na„SO. und
engte ein.
Man kristallisierte aus heissem CH„Cl~/Aceton unter Argon
und konnte 17 3 mg Pyro-phäophorbid a (2_5) in Form feiner,
violettblau glänzender Blättchen isolieren. Aus der Mutter¬
lauge kristallisierten nochmals 72,1 mg DC-reines 25.
Ausbeute: 245,1 mg = 45,8 mMol entspr. 85,5 %
- 146 -
Analytische Daten von 25
Smp. 250
DC; Kieselgel, Aceton
Rf = 0,86, einheitlich,(24: Rf = 0,92)
-6UV/VIS: 206,0 yg in 50 ml, c = 7,71-10 Mol/1
Dioxan* 669 (53'100), 632/min (4'900), 612 (7'500)min (1'200), 561 (2'900), 552/min (2'300),(9'100), 525,5/min (3'900), 508,5 (11'700),(3'500),400/Sch
, 582,5/
537,5
485/min475 (3'900), 457/min (2'700), 413 (112'900)(88'500), 380/Sch (58'500), 331/min (17''i00)
319
min
(20'200)(ll'OOO)
294/min (12'300), 274 (15'300), 256/
IR:
KBr
3650-2800w, 3400w, 2970m, 2930m, 2870m, 1727s,1690Sch, 1670s, 1615s, 158lw, 1552m, 1537m, 1500s,1465w, 1450w, 1410m, 1400m, 1378w, 1368w, 1347m,1305w, 1220s, 1195s, 1175m, 1165m, 1123m, 1095w,1058w, 1027m, 982m, 940w, 912m, 902w, 890w, 870w,840w, 815w, 788w, 770w, 760w, 750w, 735m, 715m, 705m,680m, 600w
"H-NMR: 0,16 Mol/1 in Pyridin-dc
ppm
9,53
9,41
8,73
8,67
7,99
7,49
7,13
6,21
6,03
5,45
5,26
4,3-
3,53
3,52
3,26
3,03
2,2-
1,84
1,58
0,44
-1,6
s
s
s
Anz.
beob.
1,0 H
1,0 H
1,0 H
Protonen
theor.
(1 H)
(1 H)
(1 H)
d-d (J=18;ll) 1,3 H (1 H)
4,7
s
q
s
s
3,0 b
d
t
bs
7 bs
d'd (J=18;2)d-d (J=ll;2)
A,B-System(J=20)b
(J=7)
(J=7)
(J=8)
2.0 H
2.1 H
2,1 H
4,8 H
3,1 H
3.1 H
4.2 H
3.0 H
3.1 H
0,9 H
0,5 H
(1 H)
(1 H)
(2 H)
HC-10
HC-5
HC-20
PyridinHC-31Pyridin
PyridinHzC-32HEC-32
HoC-132
(2 H) HC-17,18(3 H) H3C-I21
H2C-8l(2 H)
(3 H) H3C-2I(3 H) H3C-71
H2C-17;SH3C-I81
(4 H)
(3 H)
(3 H) H3C-82(1 H) HN
(1 H) HN
17'
- 147 -
5.3.7. Cetyl-pyro-phäophorbid a (26)
co2h C02C16H33
2_5
C34H36N4°3548,69
2£
C49H66N4°3759,09
Zu einer entgasten Lösung von 104,6 mg (0,20 mMol) 2_5 und
241,9 mg (1,00 mMol) Cetylalkohol in 5 ml Pyridin wurde wäh¬
rend 10 Min. 1,2 ml (2,42 mMol) Phosgenlösung bei 0 C unter
massigem Rühren zugespritzt. Man liess den dickflüssigen Brei
im Eisbad während 3 Stunden stehen, nahm dann in 80 ml CH CL
auf und schüttelte mit einer Lösung aus 50 ml Phosphatpuffer
und 350 ml Eiswasser. Die organische Phase wurde mit 800 ml
Eiswasser in 3 Portionen gewaschen, die Wasserphasen mit
CH Ck extrahiert, die Methylenchloridphasen vereinigt und
nach Filtration durch Glaswatte mit Natriumsulfat getrocknet,
eingeengt und das restliche Pyridin am HV entfernt.
Man nahm das Rohprodukt in 150 ml Äther auf und extrahierte
dreimal mit 25 ml einer äthergesättigten 30-proz. Salzsäure¬
lösung (100 ml konz. HCl + 19 ml HO + 130 ml Äther), ver¬
dünnte die HCl-Phasen mit Eiswasser und zog mehrmals mit CH„C1~
aus. Die organischen Phasen wurden neutral gewaschen, mit
Na„S0. getrocknet und eingedampft.
Man chromatographierte den Rückstand an 70 g Kieselgel (ca.
500-fache Menge) mit Hexan/Aceton 90:10, vereinigte die DC-
einheitlichen Fraktionen, die laut HPLC (System II) weniger
- 148 -
als 1 % Verunreinigungen enthielten und trocknete am HV bei
RT.
Ausbeute: 82,5 mg = 0,11 mMol entspr. 56 %
Das so gereinigte _2_6 wurde zweimal aus heissem Aceton*/Metha-nol* 20:80 unter Argon umkristallisiert und ergab violett¬
blaue Kristalle in praktisch quantitativer Ausbeute.
Analytische Daten von 26:
Smp. : 99-100° C
DC: Kieselgel, Methylenchlorid/Aceton 95:5Rf = 0,62, einheitlich
(Cetyl-phäophorbid a: Rf = 0,62)
Kieselgel, Hexan/Aceton 70:30Rf = 0,38, einheitlich
(Cetyl-phäophorbid a: Rf = 0,33)
HPLC: System II, 96 ml/h, PE-LC-55, 280 nm
t = 10,3 Min., keine Verunreinigungen > 0,1
UV/VIS:
Dioxan*
IR:
CHC1.
System III, PE-LC-55, 415 nm
t =9,0 Min., keine Verunreinigungen > 0,1R
-6304,2 yg in 50 ml, c = 8,01-10 Mol/1
668,5 (55'600), 630/min (4'000), 609,5 (8'000),581,5/min (1'700), 561,5 (2'900), 550/min (2'600),537,5 (9'700), 525/min (4'500), 507,5 (12'200),484/min (4'000), 476 (4'400), 456/min (2'900),412 (119'200), 400/Sch (93'600), 380/Sch (61'900),329/min (17'900), 319 (20'800), 293,5/min (13*000),283 (16'500), 255/min (15'000)
0,1 mm
3400w,
1687s,
1453w,
1162w,
3030w,
1620m,
1410w,
1122w,
3006w,
1582w,
1400w,
lllOw,
2964m,
1554w,
1379w,
1091w,
2930s,
1535w,
1368w,
1057w,925w, 911w, 883w, 867w, 850w, 818w
2858m,
1498m,1348m,
1026m,
1726m,
1468w,
1306w,
980m,
- 149 -
1H-NMR: 0,11 Mol/1 in CDCl * (Abb, 31)
Anz Protonen
ppm beob. theor.
9,20 s 0,8 H (1 H) HC-10
9,11 s 0,9 H (1 H) HC-5
8,46 s 0,9 H (1 H) HC-20
HC-37,82 d- d (J=18, 13) 0,9 H (1 H)
7,18 CHCl 3
6,14 d- d (J=18, 2) 11/9 H
(1 H) HzC-32
6,01 d- d (J=13, 2) J (1 H) HEC-32
5,18~
5,04 _
A,
(J
B-Sys
=2 0)
tem1,9 H (2 H) H2C-132
4,1-4, 6 m 2,1 H (2 H) HC-17,18
3,95 t (J=6) 2,0 H (2 H) H2C-Ce 1
3,50 s (3 H) H3C-I213,45 q (J=8) 7,9 H (2 H) H2C-8l3,30 s (3 H) H3C"2T3,02 s 3,0 H (3 H) H3C-712,1-2, 8 b 4,4 H (4 H) H2C-171,1721,78 d (J=8) 3,1 H (3 H) H3C-I81
H3C-821,57 t (J=8)31,0 H
(3 H)
1,15 bs (28 H) H2C-Ce 2-15
0,84 (t) 3,4 H (3 H) H3C-Ce 16
0,22 b 1,1 H (1 H) HN
-1,9 b 0,8 H (1 H) HN
=p
-A
JL^jWj^
4 (Ja.
jW
mAJu"v Ju
1 0
l I
Abb. 31: H-NMR von Cetyl-pyro-phäophorbid a in CDCI3
- 150 -
13C-NMR: 0,07 Mol/1 in CDC1 *
196,1 S C-131173,2 S C-173,16171,4 S C-19
160,3 S C-13
155,1 S C-6
150,7 S C-9
149,0 S C-14
144,9 S C-8
141,5 S C-l
137,8 S C-ll
136,1 S C-3
136,0
135,7
S
S ] C-7,4
131,4 S C-2
130,5?1
129,2 D C-31
128,2 S C-12
122,4 T C-32106,1 S C-15
104,0 D C-10
97,1 D C-5
92,9 D C-20
78,3
77,0 CDC1-,
75,7J
64,8 T C-Ce 1
51,7 D C-17
50,0 D C-18
48,1 T C-13231,9 T C-Ce 14
31,2 T C-17129,8 T C-17229,6 T
~
29,4
29,2
T
TC-Ce 2,4
28,5 T_
25,8 T C-Ce 3
23,2 Q C-18122,7 T C-Ce 15
19,4 T C-8117,4 Q C-8214,1 Q C-Ce 16
12,0 2Q C-21,12111,2 Q C-71
Die Zuordnung der Signale im Porphyrinskelett erfolg¬te in Analogie zu Z4, die Signallagen der Seitenket-ten-C-Atome wurden mittels Additivitätsregeln [2 34]abgeschätzt.
Analyse: C^H^N^ber. : C 77,53 H 8,76 N 7,38gef. : C 77,50 H 8,84 N 7,32
- 151 -
5.3.8. Cetyl-chlorophyllid a (27_)
o
C02CH3C02C16H33
O
C02CH3C02C16H33
2Ä
C51H68N4°5817,13
21_
C51H66N4°5M^839,42
In einer unter 5.2.3. beschriebenen Apparatur (Abb. 18) wur¬
den 103,1 mg (0,13 mMol) Cetyl-phäophorbid a59)
in 1,4 ml
CH?C1* in der Wärme unter Argon gelöst. Anschliessend kühlte
man auf 11 C ab und spritzte dann 2,6 ml eines 0,8 3 M Mag¬
nesiumreagenzes rasch zu, wobei auch hier die Farbände¬
rung nach gelbgrün (vgl. S. 109) beobachtet wurde. Man liess
5 1/4 Min. bei 11-12 C rühren und arbeitete dann mit einer
eisgekühlten Mischung aus 200 ml Äther, 200 ml H„0 und 40 ml
Phosphatpuffer auf. Die Ätherphase wurde mit 600 ml H„0 ge¬
waschen, gegen 50 ml gesättigte NaCl-Lösung geschüttelt, mit
Na SO. getrocknet und am RV eingeengt. Anschliessend subli-
mierte man das BHT am HV bei 60-70 C ab und brachte das Pro¬
dukt in die Dry-Box.
59) Kristallisiert, laut HPLC weniger als 0,3 % Nebenprodukte, über
Nacht am HV bei RT getrocknet.
60) Grignard-Reagens aus entgastem Äthyljodid (Siegfried, purum, dest.
unter Argon) hergestellt.
- 152 -
Eine Probe der Ätherlösung wurde separat im Stickstoffström
eingeengt. Ihr UV/VTS-Spektrum (Äther) stimmte mit den Spek¬tren von Chi a (Rohprodukt) überein. DC (Silgur, Hexan/Ace-ton 70:30) und HPLC (System II, vgl. Tabelle 13) zeigten nur
wenig Verunreinigungen.
Das Produkt wurde unter den in 5.2.3. beschriebenen Bedingun¬gen zweimal aus 7+4 ml Dioxan durch Zutropfen von 3 ml H„0
gefällt und die durch Zentrifugieren gesammelte Substanz45)
gefriergetrocknet
Man isolierte 75,8 mg = 0,085 mMol entspr. 67,3 % 27 N 1
(berechnet für C,,H J O Mg • 0,5 H„0 • 0,5 Dioxan)
Aus den vereinigten Mutterlaugen wurden nochmals 19,6 mg= 0,022 mMol entspr. 17,4 % 27 N 2 isoliert.
Analytische Daten von 27 N 1
Smp.: 110-111° C (Zers.)
DC: Silgur, Hexan/Aceton 70:30Rf = 0,26, schwache Flecken bei 0,15 und 0,30
HPLC: System II, 74 ml/h, PE-LC-55, 280 nm
Tabelle 13
t relative Peakhöhe Mol-%
(Min.) roh N 1 N 2 N 1
5,0 -
-
9,4 0,4 - 2,2 -
10,4 0,5 - 0,3 -
11,0 0,5 0,1 2,2 0,111,8 0,3 0,2 0,7 0,112,8 1,1 0,3 3,8 0,214,6 1,9 9,0 66,7 6,416,0 -
- 0,3 -
17,7 -- 0,7 -
19,0 100,0 100,0 100,0 92,225,2 -
- 0,8 -
28,4 1,0 0,8 0,8 1,1
BHT
27S
27R
Allomer
- 153 -
UV/VIS: (Extinktionskoeffizienten ber. für MG = 892,48;
Äther*
Dioxan*
Aceton*
318,7 yg in 50 ml, c = 7,14-106Mol/1
658,5 (84*900), 632/min (7'700), 613 (12'600),
587,5/min (4'600), 573 (6*700), 546/min (2'500),
529,5 (3'600), 502/Sch (1'800), 466/rain (l'OOO),
427 (108'000), 412/min (67'900), 408 (68*600),
385,5/min (40'900), 380 (41'300), 337,5/min
(20'200), 323 (22'800)
364 yg in 50 ml, c 16-106Mol/1 (Abb. 32;
662 (83*200), 636,5/min (9'700), 623,5 (14'100),
615/Sch (13'100), 593,5/min (6'900), 586 (7'400),
543/Sch (3*300), 500/Sch (2'000), 475/min (1*200),
433 (119'300), 418/min (62*200), 411 (65*000),
393,5/min (38'400), 384,5 (40'300), 366/Sch (30'500),
346/min (21'200), 331 (23'700), 295/Sch (17*900),
283/Sch (16'900), 274/min (16'100), 249 (22'400)
387,7 yg in 50 ml, c = 8,69-10 Mol/1
(identische Probe für CD-Spektrum)
662 (71'400), 635/min (8*900), 616 (13*100), 590,5/
min (5*800), 578,5 (7'100), 547/min (2*600), 534
(3*200), 500/Sch (2'000), 470/min (1'300), 430
(89*400), 415,5/min (63'200), 410,5 (64*300), 385/
Seh (41*800), 343,5/min (20*400)
XJCr-
Abb. 32: UV/VIS von Cetyl-chlorophyllid a in Dioxan
CD:
Aceton*
Die Konzentration der Lösung wurde mit MG = 892,41
berechnet.
387,7 yg in 50 ml, c = 8,69-10~6 Mol/1
656 (-7,48), 631 (-0,56), 617 (-0,89), 597 (0,0),
580 (+0,56), 573-455 (<±0,05), 430 (+5,97), 413
(+2,46), 401 (+4,13), 367 (0,0), 362 (-0,50), 356
(0,0)
- 154 -
IR: %, 0,2 mm61)
CHC1 *
KBr
'H-NMR:
3000w, 2960m, 2930s, 2855s,1610s, 1552s, 1530m, 1490m,1390w, 1377w, 1345m, 1325m,1147m, 1123m, HOOw, 1080w,985w, 918w, 890w, 875m
1730s, 1676s, 1640m,1466m, 1450m, 1432w,1305w, 1285s, 1185m,1069m, 1040m, lOOOw,
3650-3100w, 2960m, 2923s, 2855s, 1736s, 1690s, 1655m,1605m, 1550m, 1532m, 1487m, 1465m, 1448m,1375w, 1345m, 1325m, 1300m, 1285m, 1256m,1180m, 1155m, 1130m, HOOw, 1068m, 1038m,970w, 915m, 869m, 850w, 840w, 815w, 796m,721w, 702w, 610w
1432m,
1238m,
995m, 985m,765w, 741m,
0,02 Mol/1 in Aceton d * (gesättigte Lösung)
Anz. Protonenppm beob. theor.
9,67 s 0,9 H (1 H) HC-109,36 s 1,0 H (1 H) HC-58,52 s 0,9 H (1 H) HC-208,07 d-d (J=18 ;ll ) 1,4 H (1 H) HC-31
HZC-36,19 d-d (J=18 ;2) (1 H)6,12 s 3,2 H (1 H) HC-1325,97 d-d (J=ll ;2) (1 H) HEC-325,58
CH2C124,3-4, 7 b
2,8 H(1 H) HC-18
4,0-4, 3 b (1 H) HC-173,78 s (3 H) H3CO-C-1333,78 b 6,2 H (2 H) H2C-Ce 13,78 q? ( J=7) (2 H) H2C-813,53 s 2,3 H (3 H) H3C-I213,44 s 3,8 H Dioxan3,30
3,24
s
s
~
S.7 H(3
(3
H)
H)
H3C-21H3C-71
2,60 bs 2,3 H H202,1-2, 5 b 4,1 H (4 H) H2C-171,1722,01 quirituple tt Aceton d51,75 d (Jr=8)
~
7,0 H(3 H) H3C-I81
1,68 t (Jr=7) (3 H) H3C-821,0-1 4 b
'_ 30,5 H(28 H) H2C-Ce 2-15
0,86 (t) (3 H) H3C-Ce 16
Die Lage der Signale des Porphyrinskeletts stimmtinnerhalb ca. 0,01 ppm mit denjenigen von Chi a (inAceton) überein. Die Signale von 27S sind nur andeu¬tungsweise sichtbar.Die Integration der Peaks ist infolge der geringenKonzentration von 27 (geringere Löslichkeit als Chi a.')
61) Laut HPLC keine messbare Zunahme des Allomergehaltes während der Auf¬nahme des Spektrums.
- 155 -
relativ ungenau. Die breiten oder stark aufgespalte¬
nen Signale ergeben gegenüber den Singletts zu hoh.
Integrationswerte. Während sich die Menge an Dioxan
ungefähr abschätzen lässt, ist es schwierig, die Menge
an Kristallwasser zu bestimmen. Vermutlich stammt ca.
die Hälfte des beobachteten H2O aus dem Aceton dg.Die geschätzten Anteile an H2O und Dioxan (je 0,5 Mol)
lassen sich mit der Elementaranalyse vereinbaren.
Die Breite des Wassersignals wird als Hinweis dafür
interpretiert, dass das H2O teilweise am Magnesium
koordiniert ist und ein relativ langsamer Austausch
zwischen koordiniertem und unkoordiniertem H2O bzw.
deren Protonen stattfindet.
Nach Aufnahme des Spektrums hatte die Lösung laut
HPLC folgende Zusammensetzung: 27S: 11,6 %, 27R:
86,9 %, Allomere: 1,5 %.
1H-NMR: 0,08 Mol/1 in CDC1 */CD OD* 88:12 (Abb. 33)
ppm
9,50
9,46
9,24
9,20
8,30
8,22
7,95
7,28
6,14
5,98
5,25
Anz. Protonen
beob. theor.
d-d (J=18;ll)
d-d (J=18;2)"
d-d (J=ll;2)
3,5-4,5 b
3,96 s
3,94
3,60 s
3,50 s
3,34 s
3,28 s
3,07 bs
1,9-2,6 b
1,79 d (J=7)
1,70 t (J=7)
1,0-1,4 b
0,87 (t)
0,8 H (1 H) HC-10
0,8 H (1 H) HC-5
0,8 H (1 H) HC-20
0,9 H (1 H) HC-31
CHCI3
1,9 H(1
(1
H)
H)
HZC-32HEC-32
CH2C12(2 H) HC-17,18
(2 H) H2C-Ce 1
11,4 H(2
(3
H)
H)
H2C-81
H3CO-C-I32(3 H) H3C-I21
3,7 H
(3 H)
Dioxan
H3C-7I7,2 H (3 H) H3C-21
CD3OH4,4 H (4 H) H2C-171,172
34,5 H
(3
(3
H)
H)
H3C-I81H3C-82
(28 H) H2C-Ce 2-15
4,6 H (3 H) H3C-Ce 16
- 156 -
Die Signale des Porphyrinskeletts stimmen mit den¬jenigen von Chlorophyll a innerhalb ca. 0,05 ppmüberein.
Laut HPLC enthielt die Lösung nach Aufnahme desSpektrums 12,1 % 27£>, 83,5 % 27R, 2,5 % Allomere.
0,02 Mol/1 0,03 Mol/1in Aceton dg in CDC1 3CD
173,4 S 173,9 s C-173172 r6? s C-16
168 ,8 s C-133,19156,7 S 155 3 s C-14155,6 s 155 ,1 Ol
152,9 s 152 8 s C-6149,1 148 ,1 s C-4
147 6 s Oll
146,8 s 146 3 s C-9
145,0 144 ,1 s C-8
139 4 s C-3
135 8 s C-2
134 6 s
] 07
134 1 s 012
131,4 D 130 4 D C-31120,2 T 120 1 T C-32108,4 D 107 9 D O10
100,6 D 100 1 D C-5
93,7 D 92 6 D C-20
67,6 67, 1 T Dioxan66,1 D C-13264,8 T 65 0 T C-Ce 152,5 Q 53 1 Q H3C0-O13351,3 D 50, 5 C-1749,9 D 49 6 C-1832,6 T? 32 0 C-Ce 1431,1 30 ,8 C-17130,4 n 29 8 C-17230,1 29 2 C-Ce 2,4-13
28, 5
26,4 T 25 9 T C-Ce 323,9 Q 23
23,
6
0?
Q C-181
(27S)??23,3 T 22 8 C-Ce 1520,0 T 19 7 T C-8118,0 Q 17 6 Q C-8214,3 14, 1 Q C-Ce 16
12,5 2Q12
12
8
4
Q
Q ] C-21,12111,1 Q 11 1 Q C-71
- 157 -
Aceton d,6
Die Signale der Chlorophyllid-C-Atome weichen höch¬
stens 0,1 ppm von denjenigen von Chi a ab. Infolge
der geringen Konzentration sind nicht alle C-Atome
sichtbar.
Zusätzliche Signale von Aceton d5: 206,1, 32,1, 31,3,
30,6, 29,9, 29,1, 28,3 und 27,5 ppm.
Während der Messung trat Allomerisierung ein, offen¬
bar von eindringendem Sauerstoff verursacht (stärkere
Allomerisierung im Hals des Probenrohres).
Zusammensetzung der Probe nach der Messung: 19,7 %
27S, 69,7 % 2_7R, 10,6 % Allomere (HPLC) .
CDC1 /CD OD 88:12
Die Signale des Porphyrinskeletts stimmen mit denje¬
nigen in Chi a innerhalb 0,1 ppm überein. C-131, C-13,
C-15 und C-13^ konnten nicht beobachtet werden.
Im Spektrum findet man zusätzlich folgende Lösungsmit¬
telsignale: 78,6, 77,3 und 76,0 von CDCI3 und 50,8,
50,0, 49,1, 48,3 und 47,4 von CD3OD.
Während der Aufnahme des off-resonance-Spektrums muss-
te starke Allomerisierung in Kauf genommen werden.
Zusammensetzung der Probe nach der Messung: 27S: 14,7 %,
27R: 64,2 %, Allomere (mit grösserer Retentionszeit
als 27R): total 17,7 % (HPLC).
Abb. 33: H-NMR von 24_, 0,1 Mol/1 in CDC13/CD OD 88:12
- 158 -
Analyse: C H N^Mg -0,5 HO • 0,5 Dioxan MG = 892,48
ber. : C 71,32 H 8,02 N 6,28 Mg 2,72 %gef.: C 71,57 H 8,25 N 6,08 Mg 2,33 % 47>
Kristallisation:
Es wurde versucht, einen zum beschriebenen analogen Ansatz
aus Aceton/H„0 unter gleichen Bedingungen wie Chi a zu kri¬
stallisieren. Man liess die Lösung (92 mg Cetyl-chlorophyllida N 1 + N 2) während 30 Tagen eindunsten (App.: Abb. 23,
Stickstoffström ca. 1,6 1/h) und erhielt nach Abpipettier^nder Mutterlauge und Trocknen während 24 Stunden am HV ein
amorph aussehendes Pulver, das im Polarisationsmikroskop(500-fache Vergrösserung) als kristallin erkannt wurde. Die
grössten Abmessungen der Kristalle betrugen jedoch nur ca.
30 pm. Das Pulverdiagramm war demjenigen von Chlorophyll ähn¬
lich, aber etwas besser aufgelöst. Laut HPLC (System II, 280
nm) enthielt das Kristallisat neben ca. 1 % 27S ca. 20 % Allo-
mere, deren Entstehung auf die Verunreinigung der Dry-Box-
Atmosphäre zurückgeführt werden muss.
Ein weiterer Kristallisationsversuch konnte ohne bedeutende
Allomerisierung durchgeführt werden, die entstandenen Kristalle
(grösste Abmessungen ca. 20 ym) waren jedoch für eine Röntgen-
strukturanalyse leider unbrauchbar.
5.4
-159 -
Beobachtungen zur Komplexierung
5.4.1. UV/VIS-Spektren des Zwischenproduktes
Für die Messung der Spektren wurde eine 0,2 mm-UV-Zelle mit
Hahn und angeschmolzenem Reaktionsgefäss, verschlossen mit
einer Serumkappe, verwendet (Abb. 34). Nach mehrmaligem Eva¬
kuieren der Apparatur am HV und Begasen mit Argon wurde im
Argon-Gegenstrom die Serumkappe aufgesetzt. Mittels Spritze
wurde nun 0,3 ml einer ca. 2,5 mM Phäophytin-Stammlosung (durch
Einfrieren entgast) eingefüllt. Um eine gute Durchmischung zu
erreichen, spritzte man in scharfem Strahl 0,7 ml eines 0,71 M
Magnesiumreagenzes zu (Endkonzentra¬
tion an "Mg-BHT-J": 0,5 Mol/1).
Durch Neigen der Apparatur liess man
anschliessend das Reaktionsgemisch in
die UV-Zelle einfliessen. Die Spektren
wurden auf dem DW 2 nach verschiedenen
Reaktionszeiten bei RT aufgenommen.
Argon
Die Extrema und Extinktionskoeffizien¬
ten sind in Tabelle 14 zusammengefasst.
Die dort angegebenen Reaktionszeiten be¬
ziehen sich auf den Beginn der Aufnahme
(gesamte Aufnahmezeit: 60 Sek.).
Reaktions¬
gefäss
\
0, 2 nrai-
Zelle
In der gleichen Apparatur wurde unter
analogen Bedingungen auch Chlorophyll a
mit dem Magnesiumreagens umgesetzt. Da¬
durch wurden im wesentlichen die glei¬
chen Spektren erhalten; die Resultate
sind in Tabelle 15 zusammengestellt.
Abb. 3 4
- 160 -
i
Cn
Si
EhXm
•H
ß
cd
CH
P
>i
o:cd
o>
Cn
ß
N
V
CUw
sD
U
CU
-H
<DX!
CQ
0)
•P
-oou
a,Öcd
oCO
H
CO
cu
CUU
-P
CU&CO
I
CO
co
l
o
g
r<
H <J\r>
LO •. in «t
CN •.
r^ ^ r^ ^r r^ mCO CN CO r-~ r- r-~ CO cn co CO CO r^ CO co r- co rrrH - CO *. CO «. co ». o *». rH v o -
vo ro UD co O cn VO CN KD CO KD CN KD KD ^ KD *&r~ r>
748 •^ 733 CO
r- r~ r- r^
742 mr~-
CO KD co ^ CO CN CO cn co ^00 »k 00 - 00 •* m *. CN -
r^ cn r^ o r^ CN r^ KD r> -sfkd H «3 CN KD CN KD CN KD CN
r-- r~ o "^ in CN in CN KD l£>tj< * <• *» ^ *. •SP •. ^ •• f «• CO •n CO * co •k co ^KD LT) KD m KD m kd co KD KD KD «XI KD cn vo cn KD ^ U3 inVO CN kd CN kd CN kd CN \D CN KD CN KD CN KD CN KD CN KD CN
co r- CO r- CO 00 CO 00 CO CO CO CO CO m CO o CO CN co mo - O •i. o V o ». CN K CN •*, CN •k H k* O • CN «•
CN 00 CN CO CN 00 CN oo CN o CN o CN co CN CN CN O CN CN\o «3 KD KD KD H KD H KD H VX> H KD rH KD rH
CO LT) co LT) co co co i> CO rH CO r~- CO •^ CO 00 co CN CO rHID «• V£> •i. m s. m k» ^r •r. CO ^ CN *. M< »fc ^ ». m »r- ro l> CO i> co r-~ CN r^ ^t" r~ CO r~- KD r~- m !>• in r~ ix>LT) LT) m m m m m in m m
in m rf CO r-^ in CO o H KDoo * co «. m K. r^ »k CN «. rH ». CN >. CO «k ^r v o -•^r cn ^r CN ** CN <* CN ^ CN "* CN ^r m ^ m "=e ^ ^r -*m LT) m m in in m m m m
CO CO co *r CO o CO oo co cn co cn CO m CO in CO cn CO rHo •> o •. o K CN »k. o V. o - o »» o ** o *. o ^o n o CN o CN o o o H o o o co o «^ o CN O HIT) rH LT) rH m rH m rH m rH m H in rH m rH in H m h
CO o CO KD CO m CO CN co in CO CO CO o CO CO CO cn CO rHo «- o >• o *fc o V o *t o •. o »k o •. o ** o *r^ oo r^ VC r^ m r^ CN r^- •^r r^ CO r- r~ r^ (Ti r- CO r~ o«a* co •>* CO rr co -tf CO * CO "* CO ** CO ^r CO <vT co ^f co
CN CO m O co CO r^ cn rH ** r^KD - !>• *. 00 v. 00 •» r^ »>. co v r^ ». r^ «. r^ >- m •>co oo co KD CO "* co Cn co cn co CO co r~ CO rH CO cn co m^ r^ n< r^ •^ i> rr KD ^f KD •^ KD ^ r- ** CO ^ KD ^r kd
00 rH CN H KD 00 t -tf o CNrH - CN *. CO «. co •. CO •«. CO *. ^ •». co < co •k m *Cn KD cn KD CT» CO CTl o cn KD cn m cn CO cn rH CT\ KD cn ooco ^ CO •^r CO ^ co ^ CO ** CO m* CO m co m CO ^r CO <*
LT) rH ro 00 cn KD m cn CN inr» - r~- V r^ •«. r» *. r^ *» co •». 00 ^ r^- *. r~~ t. r~- ^
KD O KD o kd Cn KD m ^d CN KD CN KD CO KD m KD ^r kd mCO 00 CO 00 CO r^ CO r^ CO r^ CO r- CO oo CO oo CO r^ co r^
LO LO om^ <tf CO"3-
co KD cn CN m ^r •=^ m< co
"vT
H
KD H
O \
H rH• ou a
mH
inCN CN in mO o in inr^ r~ r- r^
cdEh <
CN co m KD
- 161 -
CDU
-P
cd
co
i
CO
H
>
I
Sl
Eh
CO
-P
-H
g
ou
orH
u
o
>
triÖ
0)•H
X
CDrH
04go«
m
rH
cd
CDXi(0
Eh
ro
I
g
r<
X)
• o
CO
TP cri r-~
(T\ ^ ro K r~ •»
KD 1X3 r- KD KD ro
CO CN CO rH CO rH co ro CO CN r- r- KD 1X3
TP »k o • o >. in >. o *»
IX) "SP 1X3 in KD in m m iX> KD CTi TP 00
r-- r- r-~ r-~ r-
741 m 742 KD 638 in
rH
10 00 CO r^ r^ CO 00 CO CTl CO CN CO m CO r-~ rH
ro •» m «. 00 ^ m >. in ^ tp ^ ro »• in s. in *b
r^ r- r~ tp r-~ CM r^ r^ r^ KD r- m r-~ 00 r^ m CN o
>X) CN KD CN KD ro KD CN KD CN KD CN KD CN IX) CN IX) CN
m ro co oo KD r-~ ro in m CO o
CN *. CN ** in •h CN •», CN v CN *n ro fct ro v o *»
KD 00 IX) r-~ *x> o 1X5 cn KD 00 iX> co IX) t~~ KD r^ cn H
KD <N KD CN KD ro IX> CN KD CN MD CN 1X3 CN 1X3 CN in rH
CO CTi CO rH CO ro CO m CO KD CO CN CO vo co m CO CO
rH *» r- *H m *» m •h CO •h r- >. >x> «. r- v in »fc
CM CN rH H rH tp H CN rH CN rH CN rH rH rH CN TP ro
KD H VO H KD rH IX> rH KD rH KD H 1X3 rH 1X3 rH m
H rH rH CN TP (J\ o ro CO CN
in *. rH *. CN "- r-~ *t o •fc o *b r- ". ro ». r-~ K
ro ro TP ro ro ro ro ro TP ro TP ro ro TP TP TP o CN
in in m m m m m m m
CO r^ CO Tp CO KD CO rH co 1X3 CO TP CO TP CO TP 00
r- *. 00 ^ <S\ *. 00 ^ co *t KD *h LT) *> 00 *t CN >.
<T\ CN cn ro CTi rH o> TP CT\ tp m TP CTi TP a\ TP CO rH
tp H TP rH TP H tp rH Tp rH TP rH TP rH TP H TP
co tp CO r~ CO r-~ co rH CO Tp co CO CO r^ CO CN CN
tp •* iX> k r-~- ^ r~ *. r~ •. >x> V r- • CN »h ro »*
KD vo IX) r-~ KD CN KD o KD 0> IX> CN KD r^ KD co ro m
TP ro TP ro TP ro tp ro Tp ro TP ro TP ro TP ro <p 00
tp o ro CN rH co cn 0^ CO o>
CM fc. ro >. CN *». ro >. ro K. ro *«. CN *» TP . r^ •.
00 H ro ro ro rH ro r-~ ro r- ro TP ro ro ro ro rH ro
Tp r- tp r-~ tp r- tp r^ tp r- TP r^ TP r- 5p r-~ ^ r^
o 00 r-~ 'S* ro m ro ro oo
CN ** CN •s. KD N. (N •». ro *. rH *t CN •* ro >. CN *.
a> »XI Ol tp CTi o CTi 00 <y\ 00 CTi 00 CTi m CTl o o\ TP
ro tp ro tp ro m ro TP ro tp ro TP ro TP ro m ro m
X3 ro o o CN oo r-~ ro o
tp ». m k KD v in ». in »- in «- in •k m >. TT *»
>x> TP U3 KD KD tp KD o KD O 1X3 oo KD co 1X3 0> CO 1X3
ro r- ro [-» ro r-» ro CO ro 00 ro r-~ ro r-~ ro r^ ro in
CO m CO KD a\
o *» o ** ro ^
m ro in 00 in 1X3
ro m ro in ro ro
in
o m o o o TP •h
ro rH in tp ro TP CT\
- -- - - - - ro ro
in
co
r-
tP m oo
rH
m
oo
CN
gH CDH Ö>i CD
Xi Ma, u
ou
orH
XiU
ou-p
CN
uCN
u
- 162 -
5.4.2. Epimerenverhältnisse von J. nach partieller Komplexierung
Je ca. 5 Mol Phäophytin a (Phäo a' : Phäo a = 28,8 : 71,2)wurden unter Argon in einem mit Magnetrührer, Zweihalsaufsatzmit Serumkappe und Hahn mit Argonballon versehenen Kolben in
1,05 ml CH~C1 * unter Rühren bei RT vollständig gelöst. An¬
schliessend wurden im Argongegenstrom 2,0 ml des 0,86 M Mag-nesiumreagens zugespritzt . Die so hergestellte Lösung war
0,56 M an Mg.
Die Reaktion wurde nach der angegebenen Zeit durch möglichstrasches Zuspritzen einer Mischung aus 5 ml Phosphatpuffer/H^O1:1 und 5 ml Äther (beide Komponenten durch Einleiten von
Stickstoff partiell von Sauerstoff befreit) abgebrochen. Man
nahm in 30 ml HO, 10 ml Phosphatpuffer und 30 ml Äther auf,
extrahierte, wusch die Ätherphase mit H„0, trocknete mit Na¬
triumsulfat, filtrierte und engte ein.
Man untersuchte die Reaktionsprodukte anschliessend mittels
HPLC (Tabellen 16 und 17)
G2) Bei einer Reaktionstemperatur von 10 C wurde auch das Magnesiumreagenszuvor auf 10° C abgekühlt.
- 163 -
Tabelle 16:
T = RT; System II, 76 ml/h, LDC-Monitor
Reaktionszeit; Angaben in Mol-%
63)
R
(Min.) 5 Sek. 10 Sek. 20 Sek.
5,4 BHT
7,2 0,8 2,8 1,4 1,0 0,8 1,3
8,0 0,1 - 0,2 - 0,3 0,4
8,6 0,1 0,8 0,7 0,9 1,1 1,8
9,1 - - 0,4 0,3 0,7 0,6
9,5 - 0,4 - 0,3 0,7 1,3
10,3 3,0 8,1 0,9 0,3 0,4 1,2
11,3 26,4 9,5 4,0 3,7 3,5 4,3 IS
12,2 0,5 0,8 1,0 0,8 0,7 0,8
12,8 54,2 56,8 67,3 68,0 48,5 47,2 IR
13,9 0,9 0,6 0,1 0,5 1,4 1,5 2S_
16,4 - 4,0 1,3 1,0 0,3 1,1
18,0 13,8 15,3 22,4 22,4 41,0 36,6 2R
19,2 - 0,7 0,1 0,6 0,4 0,8
24,8 ~ _ ~~ _ 0,4 1,0
Tabelle 17:
fcR
T = 10° C; System II, 80 ml/h, LDC-Detektor;
Reaktionszeit; Angaben in Mol-%
(Min.) 2 Sek. 5 Sek. 7 Sek.
4,9 BHT
6,6 2,9 1,1 0,4 - 0,5
7,2 0,4 - 0,2 - 0,2
7,8 0,2 - 0,2 - 0,2
8.2 0,7 1,0 0,5 0,5 0,6
9.3 6,0 1,5 1,5 3,8 0,9
10,1 14,8 15,3 8,4 9,1 8,8 IS
10,9 1,0 1,3 0,9 1,0 1,1
11,4 68,9 76,6 79,2 79,5 80,4 IR
12,9 2,1 0,4 0,8 1,2
13,8 0,4 - 0,3 -
15,1 0,5 0,6 0,5 0,2 0,6
16,1 1,6 1,9 4,4 4,7 6,8 2R
17,3 0,6 0,4 0,3
63) Die beiden Kolonnen für jede Reaktionszeit beziehen sich jeweils auf
einen einzigen Ansatz, die Proben wurden jedoch separat eingeengt und
durch HPLC analysiert.
- 164 -
REAKTIONSZENTREN
136.1. Synthese von [2- Cj-ö-Aminolävulinsäure
6.1.1. 3-Jodo-2-jodmethyl-propen-l (_32) [224,225]
HoCT
31_3_2
C4H7C1 C4H6J290,55 307,90
Die Synthese wurde nach der in unserem Laboratorium von M.G.
Bonetti [226] optimierten Vorschrift ausgeführt. In der ge¬
trockneten Apparatur, bestehend aus einem mit Gaseinleitrohr,Thermometer, mechanischem Rührer und Trockeneiskühler verse¬
henen 750 ml-Sulfierkolben wurden 220 g (2,08 Mol) Natrium-64)
carbonat vorgelegt. In leichtem Argongegenstrom wurden
181 g (2,00 Mol) Methallylchlorid (_3J.)'
zugegeben. Man lei¬
tete unter Rühren durch Schwefelsäure getrocknetes Chlorgasso rasch ein, dass die Reaktionstemperatur 46-51 C betrug,wobei die Apparatur im Wasserbad gekühlt wurde. Nach 2 1/2
Stunden Reaktionszeit war der gewünschte Brechungsindex der
Lösung n = 1,467 erreicht. Die Chlorzufuhr wurde beendet,
überschüssiges Chlor durch Einleiten von Argon und anschlies¬
sendem Evakuieren im Vakuum ausgetrieben, die Lösung filtriert,das Natriumcarbonat mehrmals gut mit Äther gewaschen, die Lö¬
sungen vereinigt und eingeengt.
64) Natriumcarbonat: MERCK, zur Analyse
o65) Methallylchlorid: Fluka, purum, frisch destilliert, Sdp. 73 C
- 165 -
Man destillierte rasch bei 50 Torr, sammelte die Fraktionen mit
Siedepunkt von 50 C bis 82 C und verwarf die übrigen.
Eine zweite Destillation erfolgte über eine 40 cm lange Vigreux-
Kolonne bei 50 Torr. Die einzelnen Fraktionen wurden gaschro-
matographisch untersucht (Carbowax, 16 0 C). Die Fraktionen mit
Siedepunkt zwischen 50 C und 72 C enthielten alle mehr als
30 % des gewünschten Isomeren und ergaben zusammen 83,4 g Pro¬
duktegemisch .
In einem 2-Liter-Dreihalskolben mit Intensivkühler und mechani¬
schem Rührer legte man 3 1 Aceton und 360 g (2,17 Mol) Kalium¬
jodid vor, gab 83,1 g des Chloridgemisches zu, spülte die Lö¬
sung mit Argon und versah die Apparatur mit einem Argonballon.
Man kochte die Reaktionsmischung unter heftigem Rühren während
12 Stunden am Rückfluss. Die braune Lösung wurde abfiltriert,
der Rückstand dreimal mit ca. 250 ml Aceton gewaschen, die Lö¬
sung vereinigt und auf ca. 500 ml eingeengt .Die Lösung
wurde mit 5 00 ml Hexan verdünnt und dreimal mit je 50 0 ml H„0
und viermal mit je 400 ml gesättigter Thiosulfatlösung ge¬
schüttelt, wobei rasche Entfärbung der dunkelbraunen Lösung
eintrat. Man zog die wassrigen Phasen je zweimal mit 750 ml
Hexan aus, vereinigte die organischen Phasen, trocknete mit
Natriumsulfat, engte auf 500 ml ein und liess über Nacht im
Tiefkühlschrank kristallisieren. Dabei entstanden 31 g leicht
rosarote Kristalle. Aus der Mutterlauge kristallisierten wei¬
tere 35,4 g Substanz in zwei Fraktionen mit Schmelzpunkt über
29° C.
Das so erhaltene Produkt wurde ohne weitere Reinigung für die
nächste Stufe eingesetzt.
Ausbeute: 66,4 g = 216 mMol entspr. 10,7 % bez. ^3_1
66) Das Dijodid 3_2_ ist Sauerstoff- und lichtempfindlich, die Arbeiten wur¬
den deshalb möglichst rasch ausgeführt. Da die Substanz haut- und
stark tränenreizend ist, arbeitete man immer in gut ziehender Kapelle
und mit Handschuhen.
- 166 -
6.1.2. 3-Phthalimido-2-jodmethyl-propen-l (33)
C4H6J2 C12H10N°2J307,90 327,12
66,3 g (215 mMol) 3-Jodo-2-jodmethyl-propen-1 {32) wurden zu-
sammen mit 39,8 g (215 mMol) Phthalimidkalium in 300 ml
Dimethylacetamid während 45 Minuten bei 70 C und 20 Min.
bei 100 C gerührt, wobei sich das Phthalimidkalium fast
vollständig löste. Man kühlte die braune Reaktionslösung an¬
schliessend ab und nahm sie in 400 ml Methylenchlorid auf.
Die Lösung wurde zweimal mit je ca. 250 ml Wasser und einmal
mit 300 ml halbgesättigter Kochsalzlösung, die 1 g Natrium¬
thiosulfat enthielt, gewaschen. Die wässrigen Phasen wurden
noch zweimal mit Methylenchlorid extrahiert, die gelben or¬
ganischen Phasen mit Na„SO. getrocknet, filtriert, vereinigtund im Vakuum eingeengt. Am HV befreite man den Rückstand weit¬
gehend vom Dimethylacetamid und teilweise vom Dijodid _3_2. Der
zurückbleibende Festkörper wurde in 400 ml Methylenchlorid ge¬
löst, die Lösung mit 300 ml Tetrachlorkohlenstoff versetzt
und am RV eingeengt. Das ausgefallene 3-Phthalimido-2-phthal-imidomethyl-propen-1 (^3_4) wurde abfiltriert, das Filtrat ein¬
geengt und nochmals am HV getrocknet. Anschliessend wurde der
Eindampfrückstand in 2 00 ml Methylenchlorid aufgenommen, noch¬
mals gegen 100 ml halbkonzentrierte Kochsalzlösung mit 1 g
Natriumthiosulfat geschüttelt, auf 30 ml eingeengt, mit 50 ml
Hexan versetzt und auf ca. 3 0 ml eingeengt, wobei sich haupt¬sächlich das gewünschte 33 abschied.
67) Phthalimidkalium; Fluka purum
68) Dimethylacetamid: Fluka, puriss., destilliert über Calciumhydrid
- 167 -
Aus der überstehenden Lösung erhielt man durch Einengen, Ab-
sublimieren von 3_2 an einen mit Trockeneis gekühlten Subli¬
mationsfinger im HV und Fällung aus Methylenchlorid/Hexan wei¬
teres Jodid 33.
Die 23,2 g Rohprodukt bestanden aus ca. 80 % Jodid 3_3 (NMR).
Erneute Kristallisation bewirkte keine weitere Reinigung. Des¬
halb chromatographierte man das Gemisch an 450 g (19-fache Men-
69)ge) Kieselgel .
Um das Edukt _32_ vollständig zu entfernen,
eluierte man zuerst mit Tetrachlorkohlenstoff und gewann dann
das Jodid _3_3 mit Methylenchlorid.
Die 17,68 g DC-reines Jodid _3_3 wurden aus Methylenchlorid/
Hexan umkristallisiert, wobei sich leicht gelbliche Kristalle
abschieden.
Ausbeute: 16,51 g = 5 0,5 mMol entspr. 23,5 %
Die Analysenprobe wurde zweimal aus Äther umkristallisiert, wo¬
bei man farblose Nadeln erhielt.
Analytische Daten von 33
Smp.
DC:
UV:
EtOH
IR:
CHC1.
70)
95-96 C
Kieselgel; MethylenchloridRf = 0,61, einheitlich
-62,712 mg in 50 ml, c = 165,8*10 Mol/1
298/Sch (2'150), 291,5 (2'340), 258/min (1'480), 239/
Seh (ll'OOO), 219,5 (50'700)
5 %, 0,1 mm
3470w, 3090w, 3020w, 2930w, 1775s, 1715s, 1470w,
1425s, 1390s, 1345m, 1323m, 1190w, 1170w, 1160s,
1120w, 1087m, 1070w, 987w, 952s, 925w, 910w, 660w
69) Chromatographie und Kristallisation wurden wegen der Lichtempfindlich-
keit des Produktes möglichst unter Lichtausschluss vorgenommen. Das
Jodid ^3_3_ ist schwach hautreizend.
70) Oberhalb 250 nm: 10 mm-Zelle, unterhalb 250 nm 1 mm-Zelle
- 168 -
H-NMR: 7,62-7 82 m 4 H aroma
CDCI35,31
5,13
s
t (J=D
1 H~
1 H_ H2C-14,47 d (J=D 2 H H2C-33,99 s 2 H H2C-J
MS: 80° C
Protonen
214 (1), 202 (2), 201 (16), 200 (100), 199 (1), 182(6), 161 (8), 160 (60), 149 (7), 133 (5), 130 (9),105 (8), 104 (17), 99 (8), 77 (17), 76 (23), 75 (7),74 (5), 53 (7), 51 (7), 50 (12), 41 (6), 39 (8),18 (15)
Metastabile Peaks: 166, 126, 110,5
Analyse: C12H10NO2Jber.: C 44,06 H 3,08 N 4,28 J 38,80gef.: C 44,10 H 3,23 N 4,23 J 39,07
Das als Hauptprodukt angefallene 3-Phthalimido-2-phthalimido-methyl-propen-1 (_3_4) kristallisierte man zweimal aus Methylen¬
chlorid/Hexan 1:1.
Die Analysenprobe wurde nochmals aus CHC1. umkristallisiert.
Analytische Daten von 34
Smp.
DC:
UV:
EtOH
70)
220-221 C
Kieselgel, MethylenchloridRf = 0,24, einheitlich
-61,608 mg in 50 ml, c = 92,9-10 Mol/1
299/Sch (3'470), 293 (3'640), 257/min (1'190),250,5 (19'700), 238,5/min (^MOO), 232/Sch (29'300),224/Sch (67'600), 219,5 (81M00)
IR:
CHC1.
0 ,1 mm
3480w,
1470m,
1120m,690w
3090w, 3030w,1425m, 1390s,1100m, 1090m,
2930w, 1775s, 1720s, 1615w,1345m, 1323m, 1190w, 1170w,1070w, 960m, 937w, 920w, 713m,
H-NMR:
CDC1.
7,8-7,855,80
4,29
m 8 H
t (J=0,8) 2 H
d (J=0,8) 4 H
aromat. Protonen
H2C-1H2C-3, H2C-C-2
- 169 -
MS: 105
+ >348 (1,5), 347 (11), 34^ (49; VT), 213 (11), 200 (18
199 U00) ,186 (37), 171 (14), 160 (33), 133 (16),
130 (15), 105 (22), 104 (35), 77 (24), 76 (22)
Metastabiler Peak: 311
136.1.3. [2- c]-2-Methoxycarbonyl-4-methyliden-5-phthalimido-
valeriansäure-methylester (35a)
co2ch3
co2ch3
3_3 25a
C12H10NO2J C17H17N°6327,12 332,23
1022,8 mg (9,75 mMol) [2- 3c]-Malonsäure (91,2 Atom-%; Stohler
Isotope Chemicals) wurden in einem 250 ml-Kolben in 5 ml Metha¬
nol warm gelöst. Man kühlte den Kolben mit Eis und versetzte
die Lösung portionenweise mit 75 ml frisch hergestellter Di-
azomethanlösung [2 36], so dass die Reaktionslösung leicht ge¬
färbt blieb. Die Lösung wurde 1 1/2 Stunden stehengelassen, dann
am RV eingeengt und anschliessend 30 Minuten am WV getrocknet.
Es blieben 1248 mg (9,31 mMol) Malonester (= 96 %), zu dem man
1606,1 mg (4,91 mMol) 3-Phthalimido-2-jodmethyl-propen-1 (33)
gab. Der Kolben wurde mit einem Magnetrührer, Zweihalsaufsatz,
Hahn und Serumkappe versehen, die Apparatur zweimal am WV ent¬
lüftet, mit Argon gefüllt und der Hahn mit Argonballon verse¬
hen. Anschliessend spritzte man 48 ml THF zu und löste die Eduk-
te in der Wärme (52-54 C). Zum Reaktionsgemisch wurden 25,5 ml
einer 0,2 M benzolischen Lösung von Natriumhexamethyldisila-
zanat [227] (5,10 mMol, 6 % Oberschuss bez. 3_3) zugespritzt.
Nach ca. 15 Minuten begann sich Natriumjodid abzuscheiden. Die
Reaktionslösung wurde während 2 Stunden bei 52-54 C gerührt,
- 170 -
anschliessend abgekühlt und in 450 ml Äther aufgenommen. Die
Ätherphase wurde einmal mit einer Mischung aus 300 ml gesättig¬ter Kochsalzlösung und 2,5 ml 6 N Salzsäurelösung und zweimal
mit je 300 ml gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Man extra¬
hierte die wässrigen Phasen zweimal mit 450 ml Äther, trennte
die organischen Phasen ab, trocknete mit Natriumsulfat und
engte ein.
Der leicht braune Rückstand wurde in einen 100 ml-Kolben trans¬
feriert und dieser mit einem Destillationsbogen und einem 50 ml
Zweihalskolben mit Hahn versehen. Der Auffangkolben wurde mit
flüssigem Stickstoff gekühlt und die Apparatur kurz am HV eva¬
kuiert; anschliessend destillierte man den überschüssigen Ma-
lonester während 3 1/2 Stunden bei 85 C ab. Es blieben 1653,8
mg dickflüssiger, honigähnlicher Rückstand. Das Destillat wur¬
de in Äther gelöst, über Natriumsulfat filtriert, eingeengtund 30 Minuten am WV getrocknet: 506,3 mg (3,81 mMol) [2-13C]-Malonsäure-dimethylester.
13Der rohe [2- c]-2-Methoxycarbonyl-4-methyliden-5-phthalimido-valeriansäure-methylester (35a) wurde nicht gereinigt und di¬
rekt weiter umgesetzt. Er enthielt ca. 3,5-5 Mol-% dialkyliertesProdukt 36a (vgl. 6.1.4.).
Analytische Daten von dem analog hergestellten, unmarkierten,chromatographisch gereinigten ^3_5
Fast farbloses, leicht gelbliches öl
DC: Kieselgel, MethylenchloridRf = 0,42, einheitlich
IR: 5 %, 0,1 mm
CHC1 3470w, 3090w, 3020m, 2960m, 2850w, 1770s, 1760-1705s,1655w, 1615w, 1470m, 1445s, 1425Sch, 1390s, 1340m,1290-1250m, 1170m, 1155m, 1115m, 1105m, 1090w, 1070w,1030m, 990w, 945m, 915w, 840w, 635w
- 171 -
H-NMR:
CDC1
MS
7,7-7,9 m 4 H aromat. Protonen
5,04
4,98
s
s
1 H
1 HH2C=
4,28 s 2 H H2C-53,81 t (J=8)
7 HHC-2
3,74 s H3CO-2,70 d (J=8) 2 H H2C-3
80° C
333 (0,2), 332 (1,0), 3^1 (3,9; M )
(50), 271 (12), 268 (42), 267 (100)
300 (20), 299
254 (11), 240
(13), 239 (45), 212 (34), 211 (21)", 200 (32), 160
(45), 149 (10), 133 (10), 130 (14), 120 (10), 105
;i4), 104 (22), 92 (12), 77 (lc 76 (16) ,65 (10) ,
Analyse
59 (12), 53 (11), 39 (11), 18 (46), 15 (11)
C-.-H, -NOr; MG = 331,331 / 1 / 6
ber. : C 61,63 H 5,17 N 4,23 %
gef. : C 62,25 H 5,19 N 3,84 %
6.1.4. Bis-(2-methyliden-3-phthalimido-propyl)-malonsäure-
dimethylester (36)
In Analogie zur Synthese von _3_5_ wurden 0,40 mMol Malonsäure-
dimethylester mit 0,828 mMol Jodid J3J3 umgesetzt. Man erhielt
nach Chromatographie (Kieselgel, Methylenchlorid/Athylacetat
90:10) und Kristallisation aus Methylenchlorid/Äther 1:3
Bis-(2-methyliden-3-phthalimido-propyl)-malonsäuredimethyl-
ester (_3J5) in 67,5 % Ausbeute.
Analytische Daten von 36
Smp.
DC
UV:70)
CH-CN
184-185o
Kieselgel, Methylenchlorid/Athylacetat 90:10
Rf = 0,51, einheitlich
2,468 mg in 50 ml, c = 93,0.10~6 Mol/1
298/Sch (3'400), 292,5 (3'640), 254/min (1'090), 240
(20'300), 238/min (18'100), 236/Sch (19*700), 231,5
(30'100), 230/min (28'700), 218,5 (87'700)
- 172 -
IR: 5 %, 0,1 mm
CHC1- 3470w, 3090w, 3020w, 2960w, 2840w, 1805w, 1775s,1750-1700s, 1650w, 1615w, 1595w, 1470m, 1435m,1425s, 1390s, 1333m, 1300m, 1010m, 955m, 910w, 840m
H-NMR:
CDC1„
MS
7,8-7,94,91
4,84
4,22
3,78
2,96
130° C
m
m
m
b
s
m
8 H aromat. Protonen
4 H H2OC-2, 21
4 H H2C-5, 5'
6 H H3CO-4 H H2C-3, 3'
532 (1), 531 (3),_
370 (12), 338 (10),291 (23), 279 (12),263 (10), 251 (22),201 (11), 200 (67),160 (100), 133 (11),77 (20) ,
76 (11)
530 (7; M+)319 (12),278 (44),250 (15) ,
176 (12),130 (18)
466 (12), 438
306 (12), 292
267 (19),238 (14),127 (10),105 (16),
(10) ,
19),266 (41) ,
236 (19) ,
161 (14),104 (24) ,
136.1.5. [_2- C]-2-Methoxycarbonyl-4-oxo-5-phthalimido-valerian-
säure-methylester (37a)
o
COoCH,
C02CH3
35a
C17H17N°6332,23
37a
C16H15N07334,21
Das Rohprodukt der Kondensation (1653,8 mg) wurde in 40 ml
71)Dioxan gelöst, 27,5 mg (0,11 mMol) Osmiumtetroxid in 20 ml
Dioxan zugegeben und die Lösung mit 2 0 ml H_0 versetzt. An¬
schliessend wurde während 10 Minuten gerührt. Zu der nun grau¬
grünen Lösung fügte man 2411 mg (11,3 mMol, 15 % Überschuss)
71) Osmiumtetroxid: MERCK, zur Analyse
- 173 -
72)Natrium-meta-perjodat zu, wobei sich festes NaJO_ abzu¬
scheiden begann. Man liess die Lösung während 20 Stunden bei
RT rühren und nahm dann in 300 ml Methylenchlorid auf. Die
Methylenchlorid-Lösung wurde dreimal mit gesättigter Kochsalz¬
lösung gewaschen, die wässrigen Phasen je zweimal mit Methy¬
lenchlorid extrahiert, die organischen Phasen abgetrennt, mit
Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und dann am HV vom Dioxan
befreit. Man löste das Produktegemisch in Methylenchlorid,
filtrierte und trocknete.
Das Rohprodukt (1715,1 mg) wurde zweimal aus Methylenchlorid/
Äther 1:2 umkristallisiert, die Mutterlaugen eingeengt und
mit Methylenchlorid/Äther 90:10 an Kieselgel chromatographiert.
Die DC-reinen Fraktionen wurden vereinigt und zweimal aus
Methylenchlorid/Äther 1:2 umkristallisiert. Man erhielt gesamt-
13haft 1092 mg [2- c]-Methoxycarbonyl-4-oxo-5-phthalimido-
valeriansäure-methylester in Form farbloser Nadeln.
Ausbeute: 1092 mg = 3,27 mMol
r 13 -i
Bilanz: [2- CJ-Malonsäure eingewogen: 9,25 mMol
13[2- C]-Malonsäure zurückgewonnen: 3,81 mMol
Verbraucht: 6,13 mMol
13Ausbeute an 37a bez. verbrauchter [2- c]-Malonsäure 55 %
Analytische Daten von 37a
Smp.: 152-153° C
DC: Kieselgel, Methylenchlorid/Äthylacetat 90:10
Rf = 0,59, einheitlich
IR: 5 %, 0,1 mm
CHC1 3480w, 3020m, 2960m, 2920w, 2840w, 1780s, 1760-1710s,
1615w, 1470m, 1437s, 1415s, 1390s, 1350m, 1275s,
1190m, 1160m, 1110m, 1090w, 1065w, 1025m, 990w, 960w,
905w
72) Natrium-meta-perjodat: MERCK, zur Analyse
- 174 -
2,0 C-4', 5'
1,8 C-3', 6'
1,0 CH3-0104,9 C-2,5
D (J=40)1,11
C-3
H-NMR: 7,6-7,9 m 4,OH aromat. Protonen
CDC14'62 fc 1
2 4 Hh13c"2
CDC13 4,57 s J 2'4H
H2C-53,74 s 6,0 H H3CO-3,1-3,3 s 2,5 H H2C-3, H13C-2
13C-NMR: Breitbandentkoppeltes Spektrum
CDC1 ppm Int.
134,0
123,4
52,9
46,4
39,2
37,6
MS: 110° C
335 (0,3), 334 (1,0;M+), 305 (0,4), 304 (2,0) 303(12,0), 302 (1,4), 234 (13), 174 (100), 173 (10),161 (15), 160 (82), 146 (99), 142 (27), 114 (82),104 (18), 77 (20), 76 (16), 59 (10), 56 (14),15 (11)
Metastabile Peaks: 122,5, 110, 91,5, 89
Daten der unmarkierten Verbindung _3_7
3,416 mg in 50 ml, c = 206,2-10~6 Mol/1
298/Sch (1'770), 292 (1'930), 258/min (730), 239/Sch(8'500) , 219 (43'100)
ppm Int.
199.2 S 0,4 C-4
168,5 S 0,6 C-l
167.3 S 0,2 C-l',
8'
134,1 D 1,6 C-4', 5'
132,0 S 0,3 C-2', 7'123,5 D 1,3 C-3', 6'
52,8 Q 1,0 CH3O-4 6,4 D+T 1,4 C-2, 5
38,5 T 0,7 C-3
MS: 75° C
334 (0,3), 213 (1,1; M+), 303 (2,2), 302 (12,2),242 (12), 173 (99), 161 (12), 160 (71), 145 (100),141 (23), 113 (77), 104 (17), 77 (23), 76 (19), 59(13), 55 (17), 15 (10)
Analyse: C^H^NO ; MG = 333,30
ber.: C 57,66 H 4,54 N 4,20 %
gef.: C 57,45 H 4,56 N 4,32 %
UV:70>
EtOH
13C-NMR
CDC1
- 175 -
136.1.6. [2- c]-6-Aminolävulinsäure (30a]
J? o C02CH3 O
WSf C02CH3 HCl C°2H
O
37a 30a
C1rH1cN0_ CcHQN0. • HCl1b 1b / b y 3
332,23 168,50
1119,3 mg (3,55 mMol) Keton jT7 wurden in einem 100 ml-Kolben
mit 30 ml konz. Salzsäure/Eisessig 1:1 versetzt und der Kol¬
ben mit einem Magnetrührer, Rückflusskühler und Argonballon
versehen. Unter Rühren wurde im Ölbad (135 C) erwärmt, wobei
rasche CO~-Entwicklung eintrat, die nach ca. 15 Minuten be¬
endet war. Man kochte die farblose Lösung während 16 Stunden
am Rückfluss und engte anschliessend am HV ein. Der trockene
Rückstand wurde zweimal in ca. 30 ml Wasser gelöst und wieder
getrocknet, um von der Salzsäure zu befreien. Das farblose
Pulver wurde in 100 ml Wasser gelöst und dreimal mit 90 ml
Essigester extrahiert, die organischen Phasen dreimal mit
50 ml Wasser ausgezogen, die wässrigen Phasen filtriert, ver¬
einigt und am RV mit Trockeneis-Kühleinsatz im HV eingeengt.
Weitere Reinigung (Entfernung von Phthalsäure-Resten) gelang
durch Ionenaustauscherchromatographie an 50 g Dowex 50W X8
200/400 mesh (saure Form). Man eluierte zuerst mit ca. 250 ml
HpO, dann mit kontinuierlich bis auf 3 N steigendem Salzsäure¬
gradienten (gesamthaft ca. 450 ml). Die Fraktionen 11-14, die
das gewünschte Produkt enthielten, wurden vereinigt, einge¬
engt und am HV getrocknet, noch zweimal in ca. 2 0 ml H„0 ge¬
löst und wieder getrocknet, um von der überschüssigen Salz¬
säure zu befreien.
Das Produkt wurde erneut in ca. 30 ml Wasser aufgenommen, einge--3
froren und während 18 Stunden am HV (< 10 Torr) gefrierge-
- 176 -
trocknet. Es blieben 555,8 mg [2- C]-ö-Aminolävulin-
säure als farbloser Festkörper.
Ausbeute: 555,8 mg = 3,30 mMol entspr. 98,5 %
Analytische Daten von 30a
DC: Die Substanzflecken wurden durch Besprühen mit metha¬nolischer Ninhydrinlösung und Erhitzen sichtbar ge¬macht. Das Produkt ist in allen Trennsystemen ein¬heitlich und hat den gleichen Rf-Wert wie authenti¬sches Material 73)#
Cellulose, n-Butanol/Wasser/Essigsäure 4:1:1Rf = 0,28, länglicher Fleck
Kieselgel, Phenol/Wasser 80:20Rf = 0,21
Kieselgel, Äthanol/Wasser/Pyridin/Essigsäure 50:25:15:10Rf = 0,70
IR: 3430w, 3160Sch, 2720m, 2660m, 2620m, 1720s, 1685Sch,1585m, 1415m, 1400w, 1350m, 1300s, 1238m, 1220s,1180w, 1150s, 1100m, 1085w, 1045m, 1000m, 980m,945m, 865m, 820m, 805w, 785m, 730m
13C-NMR: Breitbandentkoppeltes Spektrum
H„0 ppm Int.
205,3
48,1
36,0
34,4
28,3
Die aufgeführten Daten beziehen sich auf Dioxan =
67,4 ppm.
Analytische Daten der auf gleiche Art hergestellten, unmarkier¬ten 6-Aminolävulinsäure (30)
Smp.: 146-149° C (Zers.)
DC: identisch mit den oben beschriebenen
IR: Das IR-Spektrum in Nujol stimmt mit dem oben beschrie¬benen überein. Wenn die Substanz vor der Aufnahme mitfeuchtem Stickstoff behandelt wurde, ergab sich fol¬gendes Spektrum:
0,3 C-4
1,0 C-5
D (J=40) 1,0 C-3
100 C-2
- 177 -
Nujol 3400s, 2540w, 2510w, 1720s, 1580m, 1560m, 1490m,
1425m, 1410m, 1380s, 1355m, 1315w, 1250m, 1215s,
1190s, 1145s, 1105m, 1085w, 1060m, 1003m, 980m,
960s, 870m, 820m, 775w
Dieses Spektrum ist identisch mit demjenigen von
authentischem Material '-*' und stimmt, mit dem publi¬
zierten [223] überein.
1H-NMR: 8,4 0 bs 3 H H3N"1"3,98 bs 2 H H2C-51,8-5,6 b HOC-1
2*51 JAA'BB,~sYstem (J=6) 4 H H2C-2, 3
Das Spektrum ist identisch mit demjenigen einer
authentischen Probe '*'.
DMSO d,
13C-NMR: ppm Int.
H20 204,6 0,1 C-4
117,6 S 0,6 Ol
48,2 T 1,0 05
35,3 T 1,7 C-3
28,3 T 2,0 02
Die Daten beziehen sich auf Dioxan = 67,4 ppm.
13Diese Synthese von [2- c]-6-Aminolävulinsäure wurde mehrfach
wiederholt. Es resultierte dabei eine durchschnittliche Aus-
13beute von 53,4 % bez. eingesetzte [2- c]-Malonsäure.
73) 6-Aminolävulinsäure-hydrochlorid, Fluka, puriss. > 99 %, HO < 1 %
- 178 -
6.2. Untersuchungen an Reaktionszentren (RC)
Die Präparationen der Reaktionszentren wurden von M. Snozzi
zur Verfügung gestellt. Da die verschiedenen Präparationenalle auf die gleiche Art (RC durch LDAO-Behandlung von den
Membranen abgelöst) aus der carotinoidarmen Mutante G9 aus
Rhodospirillum rubrum hergestellt worden waren [190,179],konnte man wenigstens annähernd vergleichbare Eigenschaftenerwarten (vgl. [2 9], S. 146). Untersuchungen solcher Proben
durch Gel-Elektrophorese zeigten nach Behandlung mit SDS die
bekannten Proteinbanden [24] sowie eine schwache Verunreini¬
gung, bei der es sich wahrscheinlich um ein Antennen-Protein
handelte [190]. Die so hergestellte Probe enthielt noch 1,02Mol Ubichinon pro Mol RC und ca. 0,5 uMol Lipophosphat pro
mg Protein (vgl. [190] und [ll9~]). Die gereinigten RC fielen
74)in einer wässrigen Lösung an, die ca. 10 mMol/1 Tris-HCl
100 mMol/1 NaCl und 0,025 % LDAO75)
enthielt. Da das Verhal¬
ten von Puffer und Detergens bei der weiteren Reinigung (Ein¬
engen durch Ultrafiltration,Dialyse gegen 10 mMol/1 Tris-Puf-
fer und erneutes Aufkonzentrieren durch Ultrafiltration,alleOperationen bei 4 C) quantitativ nicht bekannt ist, können
über die Endkonzentrationen keine zuverlässigen Angaben ge¬
macht werden.
Ausbleichung und Stabilität der RC wurden anhand der VIS- und
NIR-Spektren untersucht. Bei der Auswertung konzentrierte man
sich auf die Extinktionsmaxima bei 802, 868 und 1245 nm.
802 nm: Die optische Dichte des Maximums bei 802 nm ändert
sich bei der Oxidation höchstens geringfügig, das
Maximum verschiebt sich aber auf 800 nm. Die Abnahme
74) Tris: Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
75) LDAO: Lauryldimethylaminoxid
- 179 -
der optischen Dichte wurde als Mass für die Zer¬
setzung der RC gewertet.
868 nm: Die Extinktion bei 868 nm (längstwelliges Maximum
der reduzierten RC) wurde als Mass für den Oxidations-
grad benützt. In reduzierten Proben beträgt das Ver¬
hältnis e (802)/e (868) = 2,2 (ausgemessen an Probe
3/8.; Übereinstimmung mit [23] und [27]). Durch in¬
tensive Beleuchtung (368 nm) wurde eine maximale
Ausbleichung der Bande bei 868 nm von 88 % erzielt
(gleich starke Ausbleichung in [22] und [178] ) ,was
einem Oxidationsgrad von 100 % entspricht.
1245 nm: Wenn das Maximum bei 868 nm infolge zu hoher Konzen¬
tration nicht ausgemessen werden konnte, diente die
Abnahme der Extinktion des Maximums bei 1245 nm als
Mass für den Rückgang des Oxidationsgrades.
Die Konzentration der Lösungen an reversibel ausbleichbarem
Protein-Pigment-Komplex P870 [27] wurden aus der optischen
Dichte bei 802 nm ermittelt. Annahme: £(802) =2,2 • e(868) =
308'000 (e(868) = 140'000 [2 9], Wert für R. sphaeroides [95]).
Die bei allen Oxidations- und Beleuchtungsexperimenten beob¬
achtbare, deutliche Abnahme der optischen Dichte im Bereich
von 770 nm ist wahrscheinlich auf eine irreversible Oxidation
von Bakteriochlorophyll a zurückzuführen, das aus bei der Prä¬
paration zerstörten RC oder aus den Antennen stammt (vgl.
[29] ,S. 37) .
Für die in der Folge beschriebenen Untersuchungen wurden drei
verschiedene RC-Lösungen verwendet.
- 180 -
6.2.1. C-NMR-Spektren von Reaktionszentren (unmarkiert)
Lösung 1:
Das Spektrum (breitbandentkoppelt, 171'000 Pulse, T = 5° C)der von E. Walter vorbereiteten Probe (140-10 Mol/1 P870)
zeigte im wesentlichen die erwarteten Signallagen. Die inten¬
sivsten Signale stammen von Tris-Puffer (60,4 ppm, interner
Standard) und LDAO. Der nicht erwartete Signalhaufen bei ca.
70 ppm rührte offenbar von Zuckern her, die keine Bestandtei¬
le der RC darstellen und nachträglich bei der Isolierung oder
Reinigung eingeschleppt wurden und nicht mehr abgetrennt wer¬
den konnten [19 3]. Ein scharfes Signal bei 107 ppm konnte nicht
interpretiert werden.
Lösung 2:
Die ursprünglich 300-10 M Lösung wurde durch Zugabe von ca.
30 % DO (für Deuteriumlock) auf 230-10~ Mol/1 verdünnt (1,8ml Lösung). Das Spektrum (Abb. 8, S. 63; 340'000 Pulse, breit¬
bandentkoppelt, T ca. 1 C) stimmte relativ gut mit demjeni¬gen von Lösung 1 überein. Stark unterschiedliche Konzentratio¬
nen an Tris-Puffer und LDAO erschwerten aber den exakten Ver¬
gleich.
Durch stufenweise Oxidation mit gesamthaft 8,8 mg K~Fe(CN)fi(27 pMol, 6 5-facher Uberschuss) wurde eine Extinktionsabnahmedes Maximums bei 868 nm auf 33 % erreicht, was einem Oxidations-
grad von 76 % entspricht. Um entstandenes Kaliumferrocyanidwieder zu oxidieren und damit die Oxidation der RC zu vervoll-
761ständigen, gab man 2 pl 30-proz. H„0„ zu und erreichte da¬
durch einen Oxidationsgrad von 84 %.
76) Perhydrol: 30 % HO, MERCK, zur Analyse
- 181 -
13Während der erneuten Aufnahme des C-NMR-Spektrums (328'000
Pulse, ca. 36 Std., T ca. 1 C) sank jedoch der Oxidations-
77)grad auf weniger als 10 % (Abnahme der Bande bei 1245 nm
auf ca. 7 % des höchsten erreichten Wertes). Das so erhaltene
NMR-Differenzspektrum der beiden Zustände ist deshalb bedeu¬
tungslos .
Durch elektrochemische Oxidation der Lösung (Potential +350 mV
qegen Kalomel: Fe (CN) .
-> Fe (CN) , ) konnte wieder ein Oxi-6 6
dationsgrad von 79 % erreicht werden (optische Dichte 30 % des
Wertes der reduzierten Probe), die Extinktion des Maximums bei
1245 nm betrug jedoch nur 74 % des vorher bei 84 % Oxidations-
grad erreichten Wertes. Daraus ergäbe sich ein Oxidationsgrad
von nur 62 %. Dieser Unterschied wird durch eine partielle Zer¬
setzung der Probe erklärt. Schon innerhalb 15 Min. nach Been¬
digung der elektrochemischen Oxidation wurde eine deutliche
Abnahme des Oxidationsgrades festgestellt (Extinktionszunahme
bei 867 nm und Abnahme bei 1245 nm).
Die während 4 Tagen bei ca. 0 C aufbewahrte Lösung reduzierte
sich in dieser Zeit weiter. Die optische Dichte der Maxima bei
599 nm und 534 nm hatten wieder den ursprünglichen Wert der
reduzierten Probe angenommen, in den Minima bei 646 und 560 nm
wurde jedoch eine sehr deutliche Zunahme der Absorption (ca.
75 %!) gemessen. Diese Daten, zusammen mit der selbst von Auge
deutlich sichtbaren Trübung Hessen auf eine partielle Zer¬
setzung der Probe schliessen.
77) Eine um den Faktor 50 verdünnte Probe, die jedoch geringfügig mehr
K^FefCNjg enthielt, zeigte einen viel geringeren Rückgang der Oxida¬
tion.
- 182 -
6.2.2. Vorversuche zur chemischen Oxidation
Lösung 3:
Sämtliche in der Folge beschriebenen Proben bestanden aus Tei¬
len der RC-Lösung 3 oder wurden durch Verdünnen mit H~0 aus ihr
hergestellt. Für das UV/VIS/NIR-Spektrum vgl. Abb. 35, S. 185.
Die folgenden Versuche 1 und 2 wurden direkt mit der frischen
Lösung durchgeführt. Der Rest der Lösung 3 wurde in Portionen
von je ca. 0,3 ml in flüssigem Stickstoff sehr rasch eingefro¬ren und bis zur Verwendung bei -25 C aufbewahrt (Lagerung ohne
Zersetzung, vgl. [29], S. 145). Nach dem Auftauen wurde keine
Veränderung gegenüber der ursprünglichen Lösung beobachtet.
1. Die auf 2,6*10 Mol/1 verdünnte Probe (2,7 ml) zeigte ein
Verhältnis E(802)/E (868) = 2,24 (+ Oxidationsgrad ca. 2 %) .
Das Verhältnis E(280)/E(802) betrug 1,54 (Wert für "reine"
RC: 1,25 [190]). Man oxidierte die Lösung stufenweise mit
gesamthaft 8 yl 0,2 N K_Fe(CN) -Lösung, wobei isosbestische
Punkte bei 930, 740 und 620 nm erhalten blieben. Die Aus¬
bleichung bei 868 nm auf 24 % des ursprünglichen Wertes
zeigte einen Oxidationsgrad von 88 % an, die breite Absorp¬tionsbande von P870 bei 1245 nm war klar erkennbar.
Durch Zugabe von 2 yl 0,2 N KJ/J„-Lösung sollte das ent-II 4-
standene Fe (CN)^ wieder oxidiert werden. Man erreichte6
so eine Erhöhung des Oxidationsgrades auf 93 %. Die ent¬
standene Lösung war jedoch nicht stabil. Man beobachtete
eine Extinktionsabnahme des Maximums bei 800 nm auf ca.
96 % innerhalb 3 Std. und auf 83 % innerhalb 44 Std. be¬
zogen auf den Wert unmittelbar nach der letzten Oxidation.
Die Absorptionszunähme der Bande bei 868 nm und -Abnahme
derjenigen bei 1245 nm waren nur geringfügig.Reduktion der Lösung mit einer Spatelspitze KBH. ergab im
wesentlichen wieder das Spektrum der ursprünglichen Lösung,die Auflösung der Banden war jedoch bedeutend geringer
(Trübung!). Die Intensitäten der Maxima konnten nur zu ca.
- 183 -
90 % wieder erreicht werden (bei 802 nm nur 80 %!).
0,3 ml der 88,6-10~6 M Probe (26,6-10~9 Mol) wurden durch
portionenweise Zugabe von insgesamt 2,03 mg K.Fe(CN),.3 D
(6,17 jjMol) bis zu einem Oxidationsgrad von 87 % umge¬
setzt, wobei die isosbestischen Punkte bei 930, 730, 623
und 580 nm erhalten blieben. Durch Weiteroxidation mit 1,1
pl 1 N KJ/J„-Lösung wurde eine Abnahme der Bande bei 868
nm auf 16 % erreicht (entspricht einem Oxidationsgrad von
96 %). Erstaunlicherweise wurde gleichzeitig eine Erniedri¬
gung der Extinktion bei 1245 nm beobachtet. Die optische
Dichte bei 800 nm der instabilen Lösung verringerte sich
innerhalb 44 Std. im Eisbad auf 43 % des ursprünglichen
Wertes der reduzierten Probe. Diese starke Zersetzung der
Probe war auch von einer deutlichen Verflachung des Spek¬
trums zwischen 650 und 450 nm begleitet.
Ein ca. 100-fach verdünnter Teil der Probe zersetzte sich
weniger schnell: E(800)/E(755) = 1,54 gegenüber 1,24 in
der konzentrierten Lösung nach 44 Std. im Eisbad.
2,6 ml einer 1,85'10 M Probe wurden mit insgesamt 10 yl
(Portionen von 0,3, 0,7, 2 und 7 yl) 0,2 N K Fe(CN) -Lö¬
sung stufenweise oxidiert. Isosbestische Punkte wurden bei
9 30, 650 und 592 nm beobachtet. Anschliessende Reduktion
mit KBH. ergab im wesentlichen das Ausgangsspektrum, wenn¬
gleich die meisten Extinktionen etwas kleiner waren (vgl.
Abb. 9, S. 66).
Eine 120-10 M Probe (0,3 ml) erreicnte mit 2,14 mg
K Fe(CN) einen Oxidationsgrad von 89 %. Innerhalb 44 Std.
im Eisbad trat eine Verminderung des Oxidationsgrades auf
(Extinktionsabnahme des Maximums bei 1245 nm auf 47 % des
unmittelbar nach der Oxidation gemessenen Wertes, sowie
Absorptionszunahme der Bande bei 868 nm). Eine Abnahme der
Bande bei 800 nm konnte qualitativ nachgewiesen werden, das
Maximum liess sich jedoch wegen der zu hohen Konzentration
nicht ausmessen. Man beobachtete einen sehr schwachen Nie¬
derschlag am Boden der UV-Zelle.
- 184 -
Mit 3 pl 0,1 N KJ/J -Lösung war keine weitergehende Oxida-
tion mehr zu erreichen. Innerhalb 72 Std. (Eisbad) trat
weitere Zersetzung ein. Durch anschliessende Zugabe von
KBH. konnte das ursprüngliche Spektrum auch qualitativnicht mehr reproduziert werden.
Ein Teil der Probe wurde unmittelbar nach der K^Fe(CN) -
3 6Oxidation mit H„0 ca. 50-fach verdünnt (Oxidationsgrad78 %). Die Zersetzung der Probe innerhalb 44 Std. (0° C)war bedeutend geringer als die der konzentrierten Lösung(Abnahme des Maximums bei 800 nm um 9,5 %). Anschliessen¬
de Reduktion mit KBH. führte zu einem der Ausgangslösungähnlicnen Spektrum (u.a. Maximum bei 802 nm um ca. 13 %
verringert).
3 ml einer 4,8*10 M Probe wurden portionenweise mit ge¬
samthaft 1,1 yl KJ/J -Lösung oxidiert, wobei isosbestische
Veränderungen im Spektrum beobachtet wurden. Die Reaktions¬
geschwindigkeit war niedrig; innerhalb 2 Std. nach der
letzten Zugabe von Oxidationsmittel stieg der Oxidations¬
grad von 82 auf 87 %. Gleichzeitig nahm die optische Dich¬
te bei 800 nm um ca. 6 % ab. Weitergehende Oxidation führ¬
te zu einer raschen Zersetzung der RC, die ausser im Spek¬trum auch an der deutlichen Trübung erkennbar war.
3 ml der 1,9-10 M Probe wurden stufenweise mit insgesamt2 yl (Portionen von 0,5, 0,5 und 1 yl) einer Lösung von
0,1 N KJ/J„ und 0,1 N K,Fe(CN). umgesetzt (9-, 18-, 36-£ob
facher überschuss an J„). Die isosbestischen Punkte bei
930, 730, 630 und 580 nm deuteten auf eine einheitliche
Reaktion hin. Innerhalb von 48 Std. im Eisbad nahm der Oxi¬
dationsgrad von 88 % auf 63 % ab. (Abb. 35). Anschliessende
Reduktion mit KBH führte weitgehend wieder zum Spektrumder ursprünglichen, reduzierten Probe.
- 185 -
10-
OD
i i i i i i i i i i r
400 600 800 1000 1200 nm
Abb. 35: 1,9 M RC-Lösung
unbehandelt
nach Oxidation mit 2 ul einer Lösung von
0,1 N K Fe(CN) + 0,1 N KJ/J
nach 48 Std. im Eisbad
-•—• nach Reduktion mit KBH.
6.2.3. Lichtinduzierte Ausbleichung
Lösung 3:
— f\
7. Das Spektrum der 2,8-10 M Probe unter Beleuchtung mit
368 nm-Licht (Emissionsmaximum der Quecksilberdampflampe)
stimmt im wesentlichen mit den publizierten [26,27] Spek¬
tren bestrahlter RC überein (bei der starken Erhöhung des
Absorptionsmaximums bei 800 nm dürfte es sich um ein Ar¬
tefakt handeln!). In der Dunkelheit reduzierte sich die
Probe langsam wieder (52 % Oxidationsgrad nach 10 Min.).
Innerhalb 4 Std. war wieder vollständige Reduktion erreicht,
wobei aber eine geringfügige Zersetzung stattgefunden hatte.
Die Probe war nach der Reduktion mit KBH. (anschliessend
an erneutes Belichten) weiterhin reversibel ausbleichbar.
— fi
8. Anhaltende Beleuchtung einer 2,85*10 M Probe mit Licht
der Wellenlänge 368 nm führte schon innerhalb 3 Stunden zu
einem Rückgang der Absorption des Maximums bei 800 nm um ca.
20 %.
- 186 -
Eine 2,65*10 M Probe wurde mit der sehr schwachen Emis¬
sionsbande der Quecksilberdampflampe bei 6 90 nm bestrahlt,wobei nur sehr langsame Ausbleichung der Absorptionsbandebei 868 nm eintrat (Oxidationsgrad: 63 % nach 15 Min.,86 % nach 30 Min., 93 % nach 210 Min., 97 % nach 22 Std.).
In dieser Zeit nahm die optische Dichte bei 800 nm um 10 %
ab (Bestrahlung bei RT). Nach 24 Std. im Dunkeln bei 0° C
war die Rückreaktion noch nicht vollständig, die optischeDichte bei 868 nm erreichte nur 56 % des ursprünglichenWertes. Durch Reduktion mit KBH. wurden 88 % der Absorptionbei 868 nm reproduziert, die optische Dichte bei 802 nm
erreichte jedoch nur noch 80 % des ursprünglichen Wertes.
— 6Eine während 4 Stunden bei 6 90 nm bestrahlte 2,4*10 M
Probe reduzierte sich auch während 64 Std. bei 0 C im
Dunkeln nicht vollständig. Gleichzeitig wurde jedoch eine
Verringerung des Maximums bei 800 nm um 6 % beobachtet.
Die anschliessende Bestrahlung der Probe mit dem gesamten
Wellenlängenbereich der Quecksilberdampflampe oberhalb
540 nm (K„Cr„0_-Filter) bei RT führte zur weitgehenden
Zersetzung der Probe (Extinktionsabnahme des Maximums bei
800 nm auf 57 % des ursprünglichen Wertes).
Eine 2,6*10 M Probe wurde mehrfach während 10-30 Sek.
mit Licht der Wellenlängen oberhalb 540 nm bei 10 C be¬
leuchtet und die zeitliche Abhängigkeit der Dunkelreaktion
aufgezeichnet (Zunahme der optischen Dichte bei 868 nm).
Die Reaktionsgeschwindigkeit A[RC ]/[RC] betrug nach
-4 i -4ca. 200 Sek. Dunkelreaktion -2,5-10 Sek.-1 bis -1,3*10
Sek.. Die Reaktionsgeschwindigkeit schien mit zunehmen¬
der Zahl der Experimente eher abzunehmen.
Bestrahlung während 14 Std. mit Licht oberhalb 540 nm bei
10 C führte zu einer Extinktionsabnahme des Maximums bei
800 nm auf ca. 80 %. Aus der erneuten kurzfristigen Be¬
leuchtung und der nachfolgenden Beobachtung der Dunkel¬
reaktion liess sicn eine Reaktionsgeschwindigkeit A[RC ] /
[RC] = -1,7*10 Sek. ermitteln. Offenbar verlang¬samte sich die Dunkelreaktion nicht mehr weiter.
- 187 -
Durch Reduktion mit KBH. wurden 82 % der optischen Dicht
bei 802 nm wieder reproduziert.
12. Beleuchtung einer 2,55*10 M Probe mit dem Wellenlängen¬
bereich oberhalb 6 30 nm während 15 Stunden führte zu einer
Extinktionsabnahme des Maximums bei 800 nm um 13 %.
— fi
13. Man beleuchtete eine 120•10 M Probe mehrmals in einer
1 mm-Zelle im Wellenlängenbereich oberhalb 6 30 nm während
je ca. 30 Sek. und beobachtete anschliessend die Dunkel¬
reaktion (Zunahme der optischen Dichte bei 868 nm, vgl.
Abb. 36). Der Anteil der RC im oxidierten Zustand in Ab¬
hängigkeit von der Zeit kann am besten durch eine e-Funk-
tion beschrieben werden (Abb. 36).
-kt[RC+] = e kt[RC+]
o
mit k = 10,7, 9,7, 9,8 und 7,7-10~4 Sek.1
oo-
-0 4
-0E
-12-
-16-
(RC+)'
IRC*1,
50
I
40 30 20
__L_
10 Mm
_J
OD
-13
-09
-07
-05
-03
Abb. 36: A OD(867) in Abhängigkeit der Zeit
B In([RC+]/ [RC+] ) in Abhängigkeit der Zeit
nach Ausschalten der Lichtquelle
- 188 -
Die Probe wurde in einem 10 mm-NMR-Rohr von oben unter
gleichen Bedingungen wie unter 12. (Lichtstrahl über einen
Spiegel umgelenkt) während 15 Std. bei 0 C belichtet. Die
anschliessend gemessene Rückreaktion war gegenüber den
-4oben aufgeführten Werten weiter verlangsamt: k = 5,6*10Sek.
. Die Extinktion des Maximums hatte in dieser Zeit
um ca. 10 % abgenommen. Nach erneuter Beleuchtung unter
denselben Bedingungen während 24 Stunden wurden nur noch
7 7 % der optischen Dichte des Maximums bei 800 nm bezüg¬lich des Ausgangswertes gemessen.
14. Beleuchtung mit 368 nm-Licht und Messung des Spektrums un¬
ter Verwendung eines Gelbfilters vor dem Detektor oder an¬
schliessende Aufnahme des Spektrums unter Einstrahlung bei
690 nm (ohne Filter) ergab im wesentlichen gleiche Spektren;die Probe war unter Beleuchtung mit 6 90 nm etwas wenigerstark oxidiert als vorher. Anschliessende Reduktion mit
KBH. ergab im wesentlichen das Spektrum der unbehandelten
Probe (Extinktionsabnahme bei 802 nm auf 97 %; c =
1,85-10~6 Mol/1; Abb. 10, S. 68).
- 189 -
ZUSAMMENFASSUNG
Chlorophyll a wurde durch präparativen Magnesiumeinbau mit 2,6-
Di-tert-butyl-4-methyl-phenoxy-magnesium-Jodid in das aus einem
Pflanzenextrakt gewonnene und gereinigte Phäophytin a darge¬
stellt. Die analytischen Daten des durch Fällung aus Dioxan/H„0
gereinigten Materials stimmen mit denjenigen von natürlichem
Chlorophyll a überein.
Ausgehend von Phäophytin a wurde Cetyl-phäophorbid a dargestellt
und unter den für Phäophytin a optimierten Bedingungen in Cetyl-
chlorophyllid a übergeführt.
Leider konnten weder vom partialsynthetischen Chlorophyll a
noch von Cetyl-chlorophyllid a Kristalle erhalten werden, die
für eine Röntgenstrukturanalyse geeignet gewesen wären.
Die VIS-Spektren der Reaktionslösung beim Magnesiumeinbau deuten
auf das Vorliegen eines im ß-Ketoester-System chelierten Magne-
sium-exo-Komplexes als Zwischenprodukt hin, das bei der Aufar¬
beitung durch stereoselektive Protonierung in das Chlorophyll a
2mit der natürlichen 13 -R-Konfiguration übergeht (laut HPLC
2nur ca. 1 % 13 -S-Epimer).
Für eine spezifische Markierung der porphinoiden Pigmente von
13
Rhodospirillum rubrum wurde eine neue Synthese von [2- C]-6-
Aminolävulinsäure ausgearbeitet.
13Im Hinblick auf eine geplante C-NMR-Differenzspektroskopie an
Reaktionszentren von Rhodospirillum rubrum G-9 im reduzierten
bzw. oxidierten Zustand wurden Untersuchungen sowohl zur chemi¬
schen Oxidation als auch zur lichtinduzierten Ausbleichung
durchgeführt. Sie brachten jedoch nicht den erhofften Erfolg,
denn die entstandenen Lösungen zeigten nicht die benötigte
Stabilität.
- 190 -
ABSTRACT
Chlorophyll a was prepared through introduction of magnesiumwith 2,6-di-tert-butyl-4-phenoxy magnesium iodide into puri-fied pheophytin a acquired from plant extracts. The analyti-cal data obtained from material purified by precipitationfrom aqueous dioxane are in agreement with those from natural
Chlorophyll a.
Cetyl-pheophorbid a was prepared from pheophytin a and was then
transformed into cetyl-chlorophyllid a utilizing the same con-
ditions as for pheophytin.
Unfortunately, crystals suitable for x-ray cristallographicanalysis could not be obtained from either partially syntheticChlorophyll a or cetyl-chlorophyllid a.
The visible spectra of the reaction Solution during magnesiumintroduction indicate the presence of a ß-ketoester chelated
magnesium-exo-complex as an intermediate. This intermediate was
2converted to Chlorophyll a with the natural 13 -R-configurationduring workup by stereoselective protonation. Only ca. 1 % of
2the 13 -S-epimer was detected by HPLC.
2- Cj-6-aminolevulinic acid was realizedfor a specific labeling of the porphinoid pigments of Rhodo-
spirillum rubrum.
13With regard to a planned C-NMR difference spectroscopic in-
vestigation of the reaction centers of Rhodospirillum rubrum+
G-9 in reduced and oxidized form, various experiments were
performed involving chemical oxidation as well as photoinducedbleaching. They did not lead, however, to a useful result
since the Solutions were of insufficient stability.
- 191 -
LITERATURVERZEICHNIS
[1] C.B. van Niel, Arch. Microbiol. 3, 1 (1931)
C.B. van Niel, Adv. Enzymol. 1, 263 (1941)
C.B. van Niel, Bact. Rev. 8^, 1 (1944)
[2] D.I. Arnon & R.K. Chain, Proc. Nat. Acad. Sei. USA JA'4961 (1975)
[3] M. Avron, 'The Electron Transport Chain in Chloroplasts',
in [9] ,S. 373
[4] H. Gimmler, 'Photophosphorylation in vivo', in [10],S. 448
[5] A.T. Jagendorf, 'Mechanism of Photophosphorylation',in [9] ,
S. 413
[6] H.T. Witt, 'Primary Acts of Energy Conservation in the
Functional Membrane of Photosynthesis', in [9], S. 493
[7] P.D. Boyer, B. Chance, L. Ernster, P. Mitchell, E.
Racker & E.C. Slater, Ann. Rev. Biochem. 4_6, 955 (1977)
[8] L.P. Vernon & G.R. Seely (eds.), 'The Chlorophylls',
Acad. Press, New York (1966)
[9] Govindjee (ed.), Bioenergetics of Photosynthesis', Acad.
Press, New York (1975)
[10] A. Trebst & M. Avron (eds.), 'Photosynthesis I' (Encycl.
Plant Physiol.; new ser. vol. 5), Springer, Berlin (1977)
[11] J. Barber (ed.), 'Primary Processes of Photosynthesis',
Elsevier, Amsterdam (1977)
[12] R.K. Clayton & W.R. Sistrom (eds.), 'The Photosynthetic
Bacteria', Plenum Press, New York (1978)
[13] J. Barber (ed.), 'The Intact Chloroplast', Elsevier,
Amsterdam (1976)
[14] A.L. Lehninger, 'Biochemistry', 2n ed., Worth Publishers
Inc., New York (1975), S. 587
[15] C.J. Avers, 'Cell Biology', D. van Nostrand Company,
New York (1976), S. 253
[16] D.E. Metzler, 'Biochemistry', Acad. Press, New York
(1977) ,S. 769
[17] W.P. Williams, 'The Two Photosystems and Their Inter-
actions', in [ll], S. 99
[18] J.H. Golbeck, S. Lien & A. San Pietro, 'Electron Trans¬
port in Chloroplasts', in [10], S. 94
[19] J.R. Bolton, 'Photosystem I Photoreactions', in [ll] ,
S. 187
[20] J.C. Goedheer, Biochim. Biophys. Acta 3_8, 389 (1960)
- 192 -
[21] D.W. Reed & R.K. Clayton, Biochem. Biophys. Res. Comm..30, 471 (1968)
[22] S.C. Straley, W.W. Parson, D.C. Mauzerall & R.K. Clay¬ton, Biochim. Biophys. Acta 305, 597 (1973)
[23] M. van der Rest & G. Gingras, J. Biol. Chem. 249, 6446(1974)
[24] M.Y. Okamura, L.A. Steiner & G. Feher, Biochemistry 13,1394 (1974)
[25] L.A. Steiner, M.Y. Okamura, A.D. Lopes, E. Moskowitz& G. Feher, Biochemistry .13, 1403 (1974)
[26] R.K. Clayton, Ann. Rev. Biophys. Bioing. _2, 131 (1973)
[27] W.W. Parson & R.J. Cogdell, Biochim. Biophys. Acta 416,105 (1975)
[28] P.A. Loach, Progress in Bioorganic Chemistry _4, 89 (1976)
[29] E. Walter, Diss. ETH Nr. 6106 (1978)
[30] E. Walter, A. Eschenmoser, J. Schreiber & E. Zass,Helv. Chim. Acta, im Druck
[31] IUPAC, J. Amer. Chem. Soc. J32, 5582 (1960)
[32] R. Bonnett, Ann. New York Acad. Sei. 206, 745 (197 3)
[33] H. Fischer & A. Stern, 'Die Chemie des Pyrrols', Vol. 2(i), Akademischer Verlag Leipzig (1940), S. 173
[34] S.G. Boxer, G.L.Closs & J.J. Katz, J. Amer. Chem. Soc.£6, 7058 (1974)
[35] H. Fischer & H. Wenderoth, Annalen 537, 170 (1939)
[36] H. Fischer & H. Wenderoth, Annalen 545, 140 (1940)
[37] G.E. Ficken, R.B. Johns & R.P. Linstead, J. Chem. Soc,1956, 2272
[38] I. Fleming, Nature 216, 151 (1967)
[39] H. Brockmann Jr., Angew. Chem. 8J), 233 (1968)
[40] R.C. Dougherty, H.H. Strain, W.A. Svec, R.A. Uphaus &J.J. Katz, J. Amer. Chem. Soc. 92., 2826 (1970)
[41] H. Budzikiewicz & K. Taraz, Tetrahedron 21_, 1447 (1971)
[42] A.S. Holt & H.V. Morley, Can. J. Chem. .37, 507 (1959)
[43] G. Sherman & S.-F. Wang, J. Org. Chem. _3_1, 1465 (1966)
[44] H.H. Strain & W.A. Svec, 'Extraction, Separation,Estimation, and Isolation of the Chlorophylls1 in [8],S. 21
[45] H.H. Strain, B.T. Cope & W.A. Svec, Methods Enzymol. 22_,452 (1971)
- 193 -
[46] A.H. Jackson, 'Structure, Properties, and Distribution
of Chlorophylls' in T. Goodwin (ed.), 'Chemistry and
Biochemistry of Plant Pigments', 2n<^ ed., Acad. Press,
New York (1976), Vol. 1, S. 1
[47] S.W. Jeffrey, Biochim. Biophys. Acta 279, 15 (1972)
[4 8] C. O'h Eocha, Oceanogr. Mar. Biol. Ann. Rev. 9_, 61
(1971) und darin zitierte Literatur
[49] S.W. Jeffrey, J. Phycol. 12, 349 (1976)
[50] M.B. Allen, 'Distribution of the Chlorophylls', in [8],S. 511
[51] J.C. Meeks, 'Chlorophylls1 in W.D.P. Stewart (ed.),
'Algal Physiology and Chemistry' (Botanical Mono-
graphs vol 10), Blackwell Scientific Publications,
Oxford (1974), S. 161
[52] R.A. Levin, Nature 261, 697 (1976)
[5 3] S.W. Thorne, E.H. Newcomb & C.B. Osmond, Proc. Nat.
Acad. Sei. USA 1_A_, 575 (1977)
[54] S. Schoch, U. Lempert & W. Rüdiger, Z. Pflanzenphysiol.
8_3, 427 (1977)
[55] S. Schoch & W. Schäfer, Z. Naturforsch. 3_3C/ 408 (1978)
[56] S. Schoch, U. Lempert, H. Wieschhoff & H. Scheer, J.
Chromatog. 1_57, 357 (1978)
[5 7] K. Sauer, 'Primary Events and the Trapping of Energy',in [9] ,
S. 115
[58] G.E. Hoch, 'P-700', in [10], S. 136
[59] R.B. Woodward & V. Skaric, J. Amer. Chem. Soc. 8_3, 4676
(1961)
[60] R.B. Woodward, Ind. chim. beige, 1962, 1293
[61] K. Harashima, T. Shiba, T. Totsuka, U. Simidu & N. Taga,
Agric. Biol. Chem. <42, 1627 (1978)
[62] K. Noack & E. Schneider, Naturwiss. _2_1, 835 (1933)
[63] E. Schneider, Z. Physiol. Chem. 226, 221 (1934)
[64] H. Fischer & R. Lambrecht, Z. Physiol. Chem. 249, I
(1937)
[65] J.H. Golden, R.P. Linstead & G.H. Whitham, J. Chem.
Soc., 1958, 1725
[66] H. Brockmann Jr., Angew. Chem. 8>0, 234 (1968)
[67] H. Scheer, W.A. Svec, B.T. Cope, M.H. Studier, R.G.
Scott & J.J. Katz, J. Amer. Chem. Soc. 9^, 3714 (1974)
[68] A.S. Holt, D.W. Hughes, H.J. Kende & J.W. Purdie, J.
Amer. Chem. Soc. 84, 2835 (1962)
- 194 -
[69] A.S. Holt, 'Nature, Properties and Distribution ofChlorophylls', in T.W. Goodwin (ed.), 'The Chemistryand Biochemistry of Plant Pigments', lst ed., Acad.Press, New York (1965), S. 3
[70] A.S. Holt, J.W. Purdie & J.W.F. Wasley, Can. J. Chem.44, 88 (1966)
[71] G.W. Kenner, F.R.S., J. Rimmer, K.M. Smith & J.F. Uns-worth, Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 273, 255 (1976)
[72] N. Risch & H. Brockmann Jr., Annalen, 1976, 578
[73] M.B. Caple, H.-C. Chow & C.E. Strouse, J. Biol. Chem.253, 6730 (1978)
[74] D.W. Hughes & A.S. Holt, Can. J. Chem. 4_0, 171 (1962)
[75] J.W. Purdie & A.S. Holt, Can. J. Chem. j43_/ 3347 (1965)
[76] H. Brockmann Jr., A. Gloe, N. Risch & W. Trowitzsch,Annalen, 1976, 566
[77] A. Gloe, N. Pfennig, H. Brockmann Jr. & W. Trowitzsch,Arch. Microbiol. _1Cv2 , 103 (1975)
[78] H. Brockmann Jr., Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 273, 277(1976)
[79] A. Gloe, Diss. Univ. Göttingen (1977)
[80] A. Jensen, 0. Aasmundrud & K.E. Eimhjellen, Biochim.Biophys. Acta 8j$, 466 (1964)
[81] A. Künzler & N. Pfennig, Arch. Microbiol. 9J_, 83 (1973)
[82] A. Gloe & N. Pfennig, Arch. Microbiol. 9j5, 93 (1974)
[83] H.-C. Chow, M.B. Caple & C.E. Strouse, J. Chromatog.151, 357 (1978)
[84] J.J. Katz, H.H. Strain, A.L. Harkness, M.H. Studier,W.A. Svec, T.R. Janson & B.T. Cope, J. Amer. Chem. Soc.9±, 7938 (1972)
[85] H. Brockmann Jr. & G. Knobloch, Arch. Microbiol. 85,123 (1972)
[86] H. Brockmann Jr., G. Knobloch, I. Schweer & W. Tro¬witzsch, Arch. Microbiol. 9_0, 161 (1973)
[87] N. Risch, T. Kemmer & H. Brockmann Jr., Annalen, 1978,585
[88] B.K. Pierson & R.W. Castenholz, Arch. Microbiol. 100,283 (1974)
[89] G.A. Dubinina & V.M. Gorlenko, Mikrobiologiya 4_4, 511(1975)
[90] G. Drews & P. Giesbrecht, Arch. Microbiol. _5_3, 255(1966)
[91] H. Brockmann Jr. & I. Kleber, Tetrahedron Letters, 1970,2195
- 195 -
[92] N. Pfennig, Ann. Rev. Microbiol. _31, 275 (1977)
[93] R.K. Clayton, Photochem. and Photobiol. 5_, 669 (1966)
[94] T. Beugeling, L. Slooten & P.G.M.M. Barelds-van de Beek,
Biochim. Biophys. Acta 283, 328 (1972)
[95] D.W. Reed & G.A. Peters, J. Biol. Chem. 247, 7148 (1972)
[96] G. Jolchine & F. Reiss-Husson, FEBS Letters 5_2, 33 (1975)
[97] J. Fajer, D.C. Brune, M.S. Davis, A. Forman & L.D.
Spaulding, Proc. Nat. Acad. Sei. USA ]2_, 4956 (1975)
[98] J. Fajer, M.S. Davis, D.C. Brune, A. Forman & J.P.
Thornber, J. Amer. Chem. Soc. 100, 1918 (1978)
[99] H. Falk, G. Hoornaert, H.P. Isenring & A. Eschenmoser,
Helv. Chim. Acta 5£, 2347 (1975)
[100] H.P. Isenring, E. Zass, K. Smith, H. Falk, J.-L. Luisier
& A. Eschenmoser, Helv. Chim. Acta 5_8_, 2357 (1975)
[101] H.P. Isenring, Diss. ETH Nr. 5369, Juris-Verlag (1974)
[102] J.-L. Luisier, These ETH No. 5423, Juris-Verlag (1975)
[103] E. Zass, Diss. ETH Nr. 5965, aku-Fotodruck (1977)
[104] B. Jaun, Diss. ETH Nr. 6259, Juris-Verlag (1979)
[105] F. Thönen, Diss. ETH, in Vorbereitung
[106] S.G. Boxer & G.L. Closs, J. Amer. Chem. Soc. 98_, 5406
(1976)
[107] M.R. Wasielewski, M.H. Studier & J.J. Katz, Proc. Nat.
Acad. Sei. USA 13, 4282 (1976)
[108] M.R. Wasielewski, W.A. Svec & B.T. Cope, J. Amer. Chem.
Soc. 1010, 1961 (1978)
[109] P.H. Hynninen, Acta Chem. Scand. B 11, 829 (1977)
[110] C. Kratky & J.D. Dunitz, Acta Cryst. B 11» 1586 (1975)
[111] C. Kratky & J.D. Dunitz, Acta Cryst. B 33;, 545 (1977)
[112] C. Kratky, H.P. Isenring & J.D. Dunitz, Acta Cryst. B 33,
547 (1977)
[113] R.B. Woodward, W.A. Ayer, J.M. Beaton, F. Bickelhaupt,
R. Bonnett, P. Buchschacher, G.L. Closs, H. Dutler, J.
Hannah, F.P. Hauck, S. Ito, A. Langemann, E. Le Goff,
W. Leimgruber, W. Lwowski, J. Sauer, Z. Valenta & H.
Volz, J. Amer. Chem. Soc. 8^2, 3800 (1960)
[114] R.B. Woodward, Angew. Chem. 12_, 651 (1960)
[115] R.B. Woodward, Pure Appl. Chem. 2, 383 (1961)
[116] H. Fischer & W. Lautsch, Annalen 528, 265 (1937)
[117] H. Fischer & A. Oestreicher, Annalen 546, 49 (1941)
[118] H. Fischer & W. Schmidt, Annalen 51!), 244 (1935)
- 196 -
[119] J.W.K. Burrell, L.M. Jackman & B.C.L. Weedon, Proc.Chem. Soc, 1959, 263
[120] J.W.K. Burrell, R.F. Garwood, L.M. Jackman, E. Oskay& B.C.L. Weedon, J. Chem. Soc. (C), 1966, 2144
[121] M. Strell, A. Kalojanoff & H. Koller, Angew. Chem. 72,169 (1960)
[122] M. Strell & A. Kalojanoff, Annalen 652, 218 (1962)
[123] H. Fischer & S. Goebel, Annalen _5_24, 269 (1936)
[124] J. Seibl, persönliche Mitteilung
[125] J. Schreiber, Chimia 25_, 405 (1971)
[126] N. Evans, D.E. Games, A.H. Jackson & S.A. Matlin, J.Chromatogr. 115, 325 (1975)
[127] K. Eskins, CR. Scholfield & H.J. Dutton, J. Chromatog.135, 217 (1977)
[128] W.T. Shoaf, J. Chromatog. 152_, 247 (1978)
[129] R. Willstätter & A. Stoll, 'Untersuchungen über Chloro¬phyll1, Springer Verlag, Berlin (1913), S. 275
[130] G.L. Closs, J.J. Katz, F.C. Pennington, M.R. Thomas &H.H. Strain, J. Amer. Chem. Soc. 8JJ, 3809 (1963)
[131] J.J. Katz & T.R. Janson, Ann. New York Acad. Sei. 206,579 (1973)
[132] R.A. Goodman, E. Oldfield & A. Allerhand, J. Amer. Chem.Soc. _95, 7553 (1973)
[133] J.J. Katz, R.C. Dougherty & L.J. Boucher, 'Infraredand Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Chloro¬phyll' in [8] , S. 185
[134] F.C. Pennington, H.H. Strain, W.A. Svec & J.J. Katz,J. Amer. Chem. Soc. 8j6, 1418 (1964)
[135] G.R. Seely & R.G. Jensen, Spectrochim. Acta 2_1, 1835(1965)
[136] K. Iriyama, N. Ogura & A. Takamiya, J. Biochem. (Japan)7jS, 901 (1974)
[137] K. Iriyama & M. Shiraki, Chemistry Letters, 1977, 787
[138J Gmelins Handbuch der anorganischen Chemie, 8. Aufl.,27, IB, S. 393 ff
[139] A.S. Holt & E.E. Jacobs, Am. J. Bot. 41, 710 (1954)
[140] S.S. Brody & M. Brody, 'Aggregated Chlorophyll in vivo1,in B. Kok & A.T. Jagendorf (eds.), 'PhotosyntheticMechanisms of Green Plants', National Academy ofSciences - National Research Council Publication 1145,Washington D.C. (1963)
- 197 -
[141] J.J. Katz, 'Chlorophyll', in G.L. Eichhorn (ed.),'In~
organic Biochemistry', Elsevier, Amsterdam (1973), Voi.
2, S. 1022
[142] G.R. Seely, 'Chlorophyll in Model Systems: clues to
the role of Chlorophyll in photosynthesis', in [ll],S. 1
[143] M.T. Cotton, P.A. Loach, J.J. Katz & K. Ballschmiter,
Photochem. and Photobiol. 21_, 735 (1978)
[144] H.H. Strain, M.R. Thomas, H.L. Crespi, M.I. Blake &
J.J. Katz, Ann. N.Y. Acad. Sei. 8^, 617 (1960)
[145] J.J. Katz, G.L. Closs, F.C. Pennington, M.R. Thomas
& H.H. Strain, J. Amer. Chem. Soc. 85_, 3801 (1963)
[146] A.F.H. Anderson & M. Calvin, Arch. Biochem. Biophys.
107, 251 (1964)
[14 7] K. Ballschmiter & J.J. Katz, J. Amer. Chem. Soc. 91,
2661 (1969)
[148] A.S. Holt & E.E. Jacobs, Plant Physiol. 3_0, 553 (1955)
[149] A. Stoll & E. Wiedemann, Helv. Chim. Acta 4_2, 679 (1959)
[150] J.K.M. Sanders, Chem. Soc. Rev. 6^, 467 (1977)
[151] J.K.M. Sanders, J.C. Waterton & I.S. Denniss, J. Chem.
Soc. Perkin I, 1978, 1150
[152] E. Rabinowitch, E.E. Jacobs, A.S. Holt & R. Kromhout,
Z. Physik _133_, 261 (1952)
[15 3] E.E. Jacobs, A.E. Vatter & A.S. Holt, Arch. Biochem.
Biophys. _5_3, 228 (1954)
[154] L.P. Zill, G. Colmano & H.J. Trurnit, Science 128, 478
(1958)
[155] E.E. Jacobs, A.S. Holt, R. Kromhout & E. Rabinowitch,
Arch. Biochem. Biophys. 7_2/ 495 (1957)
[156] A.F.H. Anderson & M. Calvin, Nature 194, 285 (1962)
[157] G. Sherman & E. Fujimori, Nature 219, 375 (1968)
[158] H.-C. Chow, R. Serlin & C.E. Strouse, J. Amer. Chem.
Soc. 92, 7230 (1975)
[159] C. Kratky, Diss. ETH Nr. 5760, aku-Fotodruck (1976)
[160] J.J. Katz, H.H. Strain, D.L. Leussing & R.C. Dougherty,
J. Amer. Chem. Soc. EK), 784 (1968)
[161] C. Houssier & K. Sauer, J. Amer. Chem. Soc. ^2, 779 (1970)
[162] I.R. Prokhorenko, V.M. Lobachev & V.M. Kutyurin, Z. Obs.
Khim. ^6_, 2147 (1976)
[163] J.J. Katz, G.D. Norman, W.A. Svec & H.H. Strain, J. Amer.
Chem. Soc. 90, 6841 (1968)
- 198 -
[164] H.O. House, 'Modern Synthetic Reactions', 2nd ed.,W.A. Benjamin Inc. London (1971), S. 495 und dort zi¬tierte Literatur
[165] J.J. Katz, Naturwiss. 6_0, 32 (1973)
[166] P.A. Ellsworth & C.B. Storm, J. Org. Chem. 4J3, 281 (1978)
[167] T. Mukaiyama, Angew. Chem. ^8, 111 (1976)
[168] H. Brechbühler, H. Büchi, E. Hatz, J. Schreiber & A.Eschenmoser, Helv. Chim. Acta 4_8, 1746 (1965)
[169] W. Steglich & G. Höfle, Angew. Chem. 81, 1001 (1969)
[170] M. Soukup, Diss. ETH Nr. 6318 (1978)
[171] F. Heinzer, M. Soukup & A. Eschenmoser, Helv. Chim.Acta j>l, 2851 (1978)
[172] H. Molisch, Ber. deutsch. Bot. Ges. _1£, 16 (1896)
[173] H. Scheer & J.J. Katz, J. Amer. Chem. Soc. 91_, 3273(1975)
[174] H. Scheer & J.J. Katz, J. Amer. Chem. Soc. 100, 561(1978)
[175] R.S. Alberte, J.P. Thornber, FEBS Letters _91, 126 (1978)
[176] R.K. Clayton & R.T. Wang, Methods Enzymol. 2_3, 696(1971)
[177] F. Reiss-Husson & G. Jolchine, Biochim. Biophys. Acta256, 440 (1972)
[178] H. Noel, M. van der Rest & G. Gingras, Biochim. Biophys.Acta 2J75, 219 (1972)
[179] M. Snozzi & R. Bachofen, Biochim. Biophys. Acta, imDruck
[180] G. Feher, M.Y. Okamura & J.D. McElroy, Biochim. Biophys.Acta 2_6_7, 222 (1972)
[181] G. Feher, Photochem. and Photobiol. 1_4, 373 (1971)
[182] L.L. Shipman, T.M. Cotton, J.R. Norris & J.J. Katz,Proc. Nat. Acad. Sei. USA 7_3/ 1791 (1976)
[183] F.K. Fong, V.J. Koester & J.S. Polles, J. Amer. Chem.Soc. £8, 6406 (1976)
[184] J.R. Norris, R.A. Uphaus, H.L. Crespi & J.J. Katz,Proc. Nat. Acad. Sei. USA 6j8, 625 (1971)
[185] J.R. Norris, H. Scheer, M.E. Druyan & J.J. Katz, Proc.Nat. Acad. Sei. USA Tl, 4897 (1974)
[186] M.Y. Okamura, R.A. Isaacson & G. Feher, Proc. Nat.Acad. Sei. USA T2, 3491 (1975)
[187] D.W. Reed, J. Biol. Chem. 244, 4936 (1969)
[188] D.W. Reed & B. Ke, J. Biol. Chem. 2_4_8, 3041 (1973)
- 199 -
[189] R.T. Wang & R.K. Clayton, Photochem. and Photobiol. 1_757 (1973)
[190] M. Snozzi, Ber. deutsch. Bot. Ges. _90, 485 (1977)
[191] A.R. Battersby & E. McDonald, 'Biosynthesis of Por-
phyrins, Chlorins and Corrins', in K.M. Smith (ed.),
'Porphyrins and Metalloporphyrins', Elsevier, Amster¬
dam (1975), S. 61
[192] K. Wüthrich, 'NMR in Biological Research: Peptides and
Proteins' North-Holland Publishing Company, Amsterdam
(1976)
[193] M. Snozzi, persönliche Mitteilung
[194] W.M. Clark, 'Oxidation-Reduction Potentials of Organic
Systems', Williams & Wilkins, Baltimore (1960), S. 131,
vgl. auch S. 319
[195] J.J. Katz, R.C. Dougherty, H.L. Crespi & H.H. Strain,
J. Amer. Chem. Soc. 8£, 2856 (1966)
[196] R.A. Uphaus, E. Flaumenhaft & J.J. Katz, Biochim.
Biophys. Acta 141, 625 (1967)
[197] E. Flaumenhaft, R.A. Uphaus & J.J. Katz, Biochim.
Biophys. Acta 215, 421 (1970)
[198] R. Wynn & A.H. Corwin, J. Org. Chem. 15_, 203 (1950)
[199] A. Neuberger & J.J. Scott, J. Chem. Soc. 1954, 1820
[200] Y.M. Rodionov & M.A. Gubareva, Zhur. Obshchei Khim. 2_3,1845 (1953) (Chem. Abstr. 49_, 1007i, 1955)
[201] D. Shemin, CS. Rüssel & T. Abramsky, J. Biol. Chem.
215, 613 (1955)
[202] L. Pichat, M. Hucleux & M. Herbert, Bull. Soc. chim.
France, 1956, 1750
[203] D. Shemin, Methods Enzymol. 4_, 643 (1957)
[204] J. Ratusky & F. Sorm, Chem. listy 5J., 1091 (1957)
(Chem. Abstr. 5JL, 13843e, 1957)
[205] L. Pichat & M. Herbert, Bull. Soc. chim. France, 1957,
673
[206] A.W. Schrecker & M.M. Trail, J. Amer. Chem. Soc. 8^,6077 (1958)
[207] A.A. Marei & R.A. Raphael, J. Chem. Soc.,1958, 2624
[208] D.P. Tschudy & A. Collins, J. Org. Chem. 2_4, 556 (1959)
[209] W.R. Hearn & M.E. Wildfeuer, Analyt. Biochem. 2, 140
(1961)
[210] F. Sparatore & W. Cumming, Biochem. Prep. _10_, 6 (1963)
[211] L. Pichat, J. Loheac & M. Herbert, Bull. Soc. chim.
France, 1966, 3268
- 200 -
[212] L. Pichat, J. Loheac, M. Herbert & G. Chatelain, Bull.Soc. chim. France, 1966, 3271
[213] L. Pichat, J. Loheac & M. Herbert, Bull. Soc. chim.France, 1966, 3564
[214] S. Lartillot, J. Desgres & C. Baron, Bull. Soc. chim.France, 1966, 483
[215] J. Loheac, Commis. Energ. At., Rapport No CEA - R3063 (1967)
[216] A.E.A. Mitta, A.M. Ferramola, H.A. Sancovich & M. Grin-stein, J. Labelled Compounds _3, 20 (1967)
[217] M. Herbert & L. Pichat, Bull. Inform. Sei. Tech. (Paris)No 118, 42 (1967) (Chem. Abstr. £8, 94983b, 1968)
[218] L. Pichat, J.P. Beaucourt & M. Herbert, Radioisotopy12, 519 (1971) (Chem. Abstr. 1S_, 113498f, 1972)
[219] J.P. Beaucourt, Thise, Paris Univ. Orsay (1972)
[220] A.R. Battersby, E. Hunt, E. McDonald & J. Moron, J.Chem. Soc. Perkin I, 1973, 2917
[221] S.I. Zav'yalov, N.I. Aronova, N.N. Makhova, Y.B.Vol'kenshtein, Izv. Akad. Nauk. SSSR, Ser. Khim., 1973,657 (Chem. Abstr. 1%_, 158859g, 1973)
[222] S.F. MacDonald, Can. J. Chem. 5_2, 3257 (1974)
[22 3] A.I. Scott, CA. Townsend, K. Okada, M. Kajiwara, R.J.Cushley & P.J. Whitman, J. Amer. Chem. Soc. J9_6, 8069(1974)
[224] B.C. Anderson, J. Org. Chem. 27_, 2720 (1962)
[225] P.S. Skell & R.G. Doerr, J. Amer. Chem. Soc. 8j^, 4688(1967)
[226] M.G. Bonetti, Diss. ETH Nr. 6360
[227] U. Wannagat & H. Niederprüm, Chem. Ber. 9A_, 1540 (1961)
[228] G. Sievers & P.H. Hynninen, J. Chromatog. 134, 359(1977)
[229] G.R. Seely, 'The Structure and Chemistry of FunctionalGroups in [8] , S. 67
[230] H. Wolf, H. Brockmann Jr., H. Biere & H.H. Inhoffen,Annalen 2M' 208 (1967)
[2 31] H. Biere, Diss. T.H. Braunschweig, 1966, S. 57
[2 32] T. Tokuyama, J. Daly & B. Witkop, J. Amer. Chem. Soc.91, 3931 (1961)
[233] R.C. Parish & L.M. Stock, Tet. Lett.,1964, 1285
[234] E. Pretsch, T. Clerc, J. Seibl & W. Simon, 'Struktur¬aufklärung organischer Verbindungen', Springer Verlag,Heidelberg (1976)
- 201 -
[235] G.W. Kenner, S.W. McCombie & K.M. Smith, J. Chem. Soc.
Perkin I, 1973, 2517
[2 36] Organikum, Deutscher Verlag der Wissenschaften, Berlin
1969, 9. Aufl. S. 598
LEBENSLAUF
Am 6. Juni 1951 wurde ich als Sohn des Max und der Elsa Etter-
Akeret in Frauenfeld geboren. Nach 6 Jahren Primarschule und
3 Jahren Sekundärschule in Weinfelden trat ich in die Kantons¬
schule Frauenfeld ein. Im Herbst 1970 legte ich dort die Matu¬
ritätsprüfung (Typ C) ab. Anschliessend begann ich das Studium
an der Abteilung für Chemie an der Eidgenössischen Technischen
Hochschule in Zürich, das ich im Herbst 1974 mit dem Diplom
als Chemiker abschloss.
Seither arbeitete ich am organisch-chemischen Laboratorium der
ETH unter der Leitung von Prof. Dr. A. Eschenmoser an der vor¬
liegenden Promotionsarbeit.
April 1979 Rolf Etter