Research Collection

Doctoral Thesis

Derivate der Chlorophyll-Reihe

Author(s): Etter, Rolf

Publication Date: 1980

Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-000189172

Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted

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ETH Library

Diss. ETH 6 J84

Derivate der Chlorophyll-Reihe

Abhandlung

zur Erlangung

des Titels eines Doktors der Naturwissenschaften

der

EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE

ZÜRICH

vorgelegt von

ROLF ETTER

dipl.Chem. ETH

geboren am 6. Juni 1951

von Birwinken (TG) und Langrickenbach (TG)

Angenommen auf Antrag von

Prof. Dr. A. Eschenmoser, Referent

Prof. Dr. K. Wüthrich, Korreferent

Für Anni

Meinem verehrten Lehrer,

Herrn Prof. Dr. A. Eschenmoser,

unter dessen Leitung ich die vorliegende Promotionsarbeit an

diesem ungewöhnlich vielseitigen Projekt ausführen durfte,

danke ich für die grosszügige Unterstützung und sein grosses

Verständnis.

Besonders danken möchte ich meinen Kollegen von der

"Grünen Gruppe"

Bernhard Jaun

Franz Thönen

Eri Walter

Engelbert Zass

Durch den regen Gedankenaustausch und die gute Zusammenarbeit

haben sie wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen.

Im übrigen gilt mein Dank all jenen, die mich bei der Ausfüh¬

rung dieser Arbeit unterstützt haben, besonders Fräulein Dr.

D. Felix und Herrn Dr. J. Schreiber für die vielen praktischen

Hinweise sowie Marco Bonetti für die Reproduktion der Abbil¬

dungen .

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Dem Stipendienfonds zur Unterstützung von Doktoranden auf dem

Gebiet der Chemie sowie dem Schweizerischen Nationalfonds

danke ich für die finanzielle Unterstützung.

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INHALTSVERZEICHNIS

ALLGEMEINER TEIL

1. Einführung 9

1.1. Nomenklatur 13

1.2. Strukturen und Verbreitung der verschiedenen

natürlichen Chlorophylle 15

2. Partialsynthese von Chlorophyll a-Derivaten aus

den Phäophorbiden 25

2.1. Einleitung und Problemstellung 25

2.2. Reinheitskriterien 28

2.3. Reinigung von Phäophytin a 29

2.4. Komplexierung von Phäophytin a mit "BHT-Mg-J"

zu Chlorophyll a 33

2.5. Cetyl-chlorophyllid a 42

2.6. Einige Beobachtungen zum Mechanismus des

Magnesiumeinbaus 4 7

3. Untersuchungen an Reaktionszentren 51

3.1. Einleitung 51

3.2. Problemstellung 53

133.3. Synthese von [2- C]-6-Aminolävulinsäure 56

3.4. Einbauversuche 6 0

3.5. Untersuchungen der Stabilität ausgebleichter

Reaktionszentren 64

3.6. Schlussfolgerungen 68

EXPERIMENTELLER TEIL

4. Einleitung 71

4.1. Allgemeines 71

4.2. Qualität der verwendeten Materialien 7 3

4.3. Messung und Darstellung der analytischen Daten 75

4.4. Dry-Box8 0

4.5. Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie 82

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5. Chlorophyll a-Derivate 86

5.1. Reinigung von Phäophytin a 86

5.2. Komplexierung von Phäophytin a zu Chlorophyll a 99

5. 3. Synthese von Cetyl-chlorophyllid a 127

5.4. Beobachtungen zur Komplexierung 159

6. Reaktionszentren 164

136.1. Synthese von [2- c] -6-Aminolävulinsäure 164

6.2. Untersuchungen an Reaktionszentren (RC) 178

LITERATURVERZEICHNIS191

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- 9 -

ALLGEMEINER TEIL

1. EINFÜHRUNG

Der Begriff "Photosynthese" umfasst die Gesamtheit der Vorgänge

in chlorophyllhaltigen Organismen, die Lichtenergie als trei¬

bende Kraft für die Synthese der für das Zellwachstum benötig¬

ten Biomoleküle benützt. Die Photosynthese bildet die Grund¬

lage der Energieversorgung der heutigen Biosphäre und stellt

zusammen mit der Atmung den sowohl in qualitativer als auch

quantitativer Hinsicht wichtigsten Energieumwandlungsprozess

dar. Nicht nur die ausserordentliche Bedeutung und die Einzig¬

artigkeit dieser Naturvorgänge, sondern auch die Hoffnung,

durch ein tieferes Verständnis der mit hoher Quantenausbeute

ablaufenden Primärprozesse die Natur in technischen Vorgängen

zu imitieren, führten in den letzten Jahren zu der sehr hohen

Aktivität und den relativ raschen Fortschritten in der Photo¬

syntheseforschung.

Die bei verschiedenen Bakterienklassen, Algen und höheren

Pflanzen verwirklichte photosynthetische Kohlendioxid-Assimi¬

lation wird vereinfacht in der von van Niel [l] aufgestellten

Gleichung dargestellt:

C02 + 2 H2A m- (CH20) + H20 + 2 A

In phototrophen Bakterien kann H„A ein breites Spektrum von

Substraten wie z.B. Schwefelwasserstoff (Chromatiaceae, Chloro-

biaceae) oder verschiedene organische Substanzen (Rhodospirilla-

ceae) bedeuten, während in Sauerstoffproduzierenden Organismen

wie Algen und grünen Pflanzen Wasser als Reduktionsmittel dient.

(CH„0) symbolisiert allgemein Kohlenstoff auf der Oxidations-

stufe der Kohlehydrate (vielfach Glukose).

- 10 -

Dieser Kohlenstoff dient dem Organismus einerseits direkt als

Zellbaustein und als Ausgangsmaterial für weitere essentielle

Biomoleküle (Lipide, Fette, Proteine, Nukleinsäuren, etc.),

anderseits deckt er den Grossteil des Energievorrats der Zelle.

Diese Energie wird bei der Atmung, summarisch als

(CH20) + 02 *- H20 + C02

beschrieben, wieder freigesetzt, und dient auch den hetero-

trophen Organismen als Energiequelle.

Für die intermediäre Energiekonservierung wird während der

Photosynthese ATP gebildet. Diese ATP-Synthese kann durch einen

cyclischen Elektronentransport angetrieben, oder aber an einen

"offenen" Elektronenfluss gekoppelt sein [2-4]. Eine aktuelle

Übersicht über die Theorien zum Mechanismus der ATP-Synthese

findet man in [5-7] .

Die folgende, sehr kurze Zusammenfassung über einzelne Aspekte

der Photosynthese soll nur einen groben Überblick vermitteln.

Detaillierte Besprechungen der einzelnen Gebiete findet man

in [8-12] .

Die Photosynthese, sowohl in Prokaryonten als auch in Eukaryon-

ten, ist stets an Membranen gebunden, in denen die photosyn¬

thetisch wirksamen Pigmente und die Hauptbestandteile der Elek-

tronentransportkette eingebettet sind. Diese Membranen bilden

abgeschlossene Systeme, sogenannte Thylakoide. In den Eukaryon-ten sind sie mit einer zusätzlichen Membran umgeben und bilden

Chloroplasten, während sie in den prokaryotischen Zellen im

Cytoplasma verteilt sind (Blaualgen) oder mit der Cytoplasma-

membran verbunden sind (Purpurbakterien). Detailliertere Be¬

schreibungen findet man z.B. in [13] oder in Lehrbüchern der

Biochemie [14-16] .

Der wichtigste Unterschied zwischen der Photosynthese der

Pflanzen und Blaualgen einerseits und entwicklungsgeschichtlich

- 11 -

älteren photosynthetischen Prozessen der Bakterien anderseits

besteht in der Möglichkeit der ersteren, Wasser zu oxidieren

und Sauerstoff freizusetzen, was erst das Entstehen der auf

Atmung beruhenden Lebensformen erlaubte. Diese Oxidation wird

dadurch ermöglicht, dass zwei verschiedene Photosysteme (als

PS I und PS II bezeichnet) miteinander gekoppelt sind, während

in den Bakterien wahrscheinlich nur ein dem PS I ähnliches

Photosystem vorhanden ist. Eine ausführliche Darstellung ver¬

mitteln neuere Ubersichtsartikel [17,18].

Die photosynthetischen Einheiten bestehen aus zwei strukturell

und funktionell verschiedenen Untereinheiten, einem Komplex

von Lichtsammler- (Antennen-) Pigmenten einerseits und einem

"aktiven" Protein-Pigment-Komplex anderseits. Die Pigmente der

Antennen, die mengenmässig den weitaus grössten Teil darstel¬

len, dienen dazu, Licht zu absorbieren und die Anregungsener¬

gie in geeigneter Form an die durch eine längerwellige Absorp¬

tionsbande (relativ zur Antenne) gekennzeichneten Reaktions¬

zentren weiterzuleiten. Über den Mechanismus der mit hoher

Quantenausbeute ablaufenden Energieübertragung ist man sich

noch nicht völlig im klaren [19] • In den Reaktionszentren fin¬

det dann der eigentliche Primärprozess der Photosynthese, die

Elektronenübertragung von Chlorophyll auf einen Akzeptor, statt.

Während es bis anhin nicht gelang, Reaktionszentren (RC) grüner

Pflanzen zu isolieren, lassen sich bakterielle RC in einzelnen

Fällen von den umgebenden Antennenpigmenten abtrennen. Nachdem

es Goedheer 1960 [20] gelungen war, die Antennenpigmente selek¬

tiv zu oxidieren, konnten Reed und Clayton 1968 [21] die RC

von Rhodopseudomonas sphaeroides durch Behandlung von Chroma-

tophoren mit Detergentien weitgehend von den übrigen Pigmenten

abtrennen. Die heute bekannten Methoden erlauben eine weitge¬

hende Reinigung bakterieller RC, wobei hauptsächlich die schwe¬

felfreien Purpurbakterien Rhodospirillum rubrum und Rhodopseu¬

domonas sphaeroides gut untersucht sind [22-28].

Auf die Struktur und die physikalischen Eigenschaften der Reak-

- 12 -

tionszentren sei hier nicht näher eingegangen, es sei auf Kapi¬tel 3 S. 51, auf einige neuere Ubersichtsartikel [26-28], so¬

wie auf eine in unserer Arbeitsgruppe durchgeführte Untersu¬

chung von E. Walter [2 9,30] verwiesen.

Die für die Photosynthese absolut notwendigen Pigmente sind

die Chlorophylle. Sie sind die wichtigsten Bestandteile so¬

wohl der Antennen als auch der Reaktionszentren. Eine beson¬

dere Stellung nimmt Chlorophyll a ein: Es ist dasjenige Pig¬ment, das in allen Sauerstoffproduzierenden Organismen vor¬

kommt, und es ist in den grünen Pflanzen auch quantitativ der

bedeutendste Farbstoff.

- 13 -

1.1. Nomenklatur

Chlorophylle sind Magnesiumkomplexe von Porphyrinen oder ihren

Di- und Tetrahydroderivaten. Das in dieser Arbeit verwendete

Numerierungssystem nach IUPAC [31,32] wird in Schema 1 der äl¬

teren, in der Literatur aber weit verbreiteten Numerierung

nach Fischer [33] (in der modifizierten Form von Boxer [34] )

anhand Phäophytin a (_1) gegenübergestellt.

IUPAC [31] Fischer [33] ,

erweitert nach Boxer [34]

Phäophytin a 1J*

R = Phytyl

P31 P71 P111 P151

Phytol 12_

Schema 1: Numerierung der C-Atome in Phäophytin a (.1)

- 14 -

Die folgenden Bezeichnungen werden im Sinne Fischer's ver¬

wendet:

3Chlorophyllid: freie Säure von Chlorophyll an C-17

Alkylchlorophyllid: Alkylester von Chlorophyllid

Phäophytin: metallfreier Ligand von Chlorophyll3

Phäophorbid: an C-17 nicht veresterter, metallfreier

Ligand

Alkylphäophorbid: Alkylester eines metallfreien Liganden

Chlorin: Dihydroporphyrin

Bakteriochlorin: an den Ringen B und D hydriertes Tetra-

hydroporphyrin2

Allomere: an C-13 O-substituierte Oxidationsprodukte2Das Präfix 'pyro' bezeichnet Derivate, deren C-13 Carboxy-

methylgruppe durch ein Proton ersetzt ist.

Die Chlorophylle sind mit andern, in der Elektronentransport-kette benötigten bzw. für den Sauerstofftransport notwendigen

Porphyrinen eng verwandt. Im Gegensatz zu Häm in den Cytochro-

men, das kovalent an Proteine gebunden ist, beruht die Bindungvon Chlorophyll an die Membranen im wesentlichen auf hydro¬

phoben Wechselwirkungen. Die Chlorophylle unterscheiden sich

von den andern, biologisch wirksamen Porphyrinen hauptsächlichin folgenden Eigenschaften:

Vorhandensein des isocyclischen Ringes (Ring E)

Magnesium als Zentralatom (im Gegensatz zu Eisen

in Häm)

Meistens Ester eines langkettigen Alkohols (Phytol,

Geranylgeraniol, Farnesol, u.a.)

- 15 -

1.2. Strukturen und Verbreitung der verschiedenen natür¬

lichen Chlorophylle

1.2.1. Chlorophylle in (^-produzierenden Organismen

Die verschiedenen Chlorophylle der Eukaryonten und der sauer-

stoffproduzierenden Prokaryonten unterscheiden sich nur gering¬

fügig. Chlorophyll c stellt in zweierlei Hinsicht eine Ausnah¬

me dar: Es handelt sich im Gegensatz zu den andern Chlorophyl-

len (Chlorine) um ein Porphyrin, dessen wichtigster physikali¬

scher Unterschied zu den Chlorinen die nur schwache Extinktion

im Rotbereich ist, zudem wird es stets als freie Säure und

nicht als Ester isoliert [40,41]. Die Strukturformeln der na¬

türlichen Chlorophylle sind in Schema 2 zusammengefasst, die

dort angegebenen Literaturstellen beziehen sich auf die Struk¬

turaufklärung .

Chlorophyll a (2) ist bei weitem das wichtigste Pigment der

Photosynthese, es kann in Extrakten aller Gefässpflanzen,

Moosen, Algen sowie in den Cyanobakterien (blaugrüne Algen;

Prokaryonten!) und Prochlorophyta, d.h. in allen sauerstoff¬

produzierenden Organismen gefunden werden [4 4]. Während Chloro¬

phyll a (2) in den Cyanobakterien als einziges Chlorophyll

vorkommt, ist es in Gefässpflanzen und Moosen, sowie in eini¬

gen Klassen von Algen von Chlorophyll b (_3_) begleitet. Das

Verhältnis von 2_ zu _3 variiert zwischen 2:1 und 3:1 [45,46] .

In den am meisten verbreiteten Klassen von Algen, vor allem

Kiesel- und Braunalgen, wird zusätzlich zu Chlorophyll a

Chlorophyll c, meist ein Gemisch aus den beiden Pigmenten

Chlorophyll c (4a.) und Chlorophyll c„ (_4b) gefunden. Einzig

in der Klasse der Kieselalgen (Dinophyceae) sowie in zwei Aus¬

nahmen bei andern Klassen kommt 4_b in Abwesenheit von _4_a vor.

Das Verhältnis von 4a zu 4b beträgt meistens ca. 1:1 [47].

Das Verhältnis von 2 zu 4 variiert von ca. 1,5 bis 6 (Ausnah¬

me: Xanthophyceae ca. 40-80). Chlorophyll d wird aus diversen

Spezies der Rotalgen (Rhodophyceae) neben Chlorophyll a iso¬

liert [48] .

- 16 -

C02R

Chlorophyll a 2

R = Phytyl

[35-39]

Chlorophyll c, 4_a

R = Äthyl

Chlorophyll c2 _4b

R = Vinyl

[40,41]

Chlorophyll b 3.

R = Phytyl

[35,36]

Chlorophyll d 5_

R = Phytyl

[42,43]

Schema 2: natürlich vorkommende Chlorophylle in Eukaryonten

- 17 -

Chlorophyll e, über dessen Vorkommen in Methanolextrakten

zweier Spezies der Xanthophyceae berichtet wurde [50], konnte

aus reinen Algenkulturen nie isoliert werden. Es handelte

sich möglicherweise um ein Zersetzungsprodukt von Chlorophyll

c [51].

Eine Übersicht über die Verbreitung der verschiedenen Chloro-

phylle vermittelt Tabelle 1.

Tabelle 1: Verbreitung der Chlorophylle in sauerstoffprodu¬zierenden Organismen 1)

Klasse: Chi a Chi b Chi c, c^ Chi d

Gefässpflanzen + + - - [50]

Bryobionta + + - - [50]

Rhodophyceae + - - + [48,51]

Cryptophyceae + - + + - [51,49]

Dinophyceae + - + - [51,49]

Rhaphidophyceae + - + - [51]

Chrysophyceae + - + + - [51,4 9]

Haptophyceae + - + + - [51,49]

Bacillariophyceae + - + + - [51,49]

Xanthophyceae + - + + - [51,4 9]

Phaeophyceae + + + - [51,49]

Prasinophyceae + + - - [51]

Euglenophyceae + + - - [51]

Chlorophyceae + + - - [51]

Cyanophyceae + - - - [51]

Prochlorophyta + + - - [52,53]

1) Einteilung der Algen nach [5l].

- 18 -

Die Alkoholkomponenten der Chlorophylle a, b und d sind Phy-2)

toi. Im Gegensatz dazu wird Chlorophyll c stets als freie

Säure isoliert [40,41].

Für einen geringen Teil von Chlorophyll a wird eine zentrale

Funktion als Bestandteil der Reaktionszentren sowohl in Photo-3)

System I als auch in Photosystem II nachgewiesen bzw. an¬

genommen. Die übrigen Chlorophylle sowie weitere Pigmente wie

Carotinoide, Xanthophylle und Phycobiline werden als akzesso¬

rische Pigmente bezeichnet und bilden zusammen mit der Haupt¬

menge des Chlorophylls a die Lichtenergie sammelnden Antennen.

Trotz der grossen Verbreitung dieser akzessorischen Pigmenteund deren zweifellos günstigen Effekt für eine optimale An¬

passung an die Umwelt dürften sie, was die Primärreaktion der

Energieumwandlung betrifft, entbehrlich sein [57].

2) Aus Haferkeimlingen konnten durch Dünnschichtchromatographie, Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) der entsprechenden Phäophytine a,sowie durch Gaschromatographie der entsprechenden Alkohole auch Geranyl-geranyl-, Di- und Tetrahydro-geranylgeranyl- und Phytylester nebenein¬ander nachgewiesen werden [54-56], was interessante Schlüsse auf dieBiosynthese zulässt.

3) Anteil von P700 ca. 0,25 % des gesamten Chlorophyll a-Gehalts [58].

- 19 -

1.2.2. Chlorophylle in Prokaryonten

Es sind nur wenige sauerstoffproduzierende Prokaryonten be¬

kannt: Die blaugrünen Algen enthalten Chlorophyll a als ein¬

ziges Chlorophyll, während in den Prochlorophyta Chlorophyll

b neben Chlorophyll a gefunden wird [52,53]. In den übrigen

phototrophen Bakterien kann teilweise sogar in einzelnen Kul¬

turen ein weites Spektrum von Bakteriochlorophyllen nachge¬

wiesen werden.

Die Bakteriochlorophylle a und b (6) und (7_) sind Bakterio-

chlorine und tragen eine Acetylgruppe an C-2. Ihr VIS-Spektrum

ist gegenüber denjenigen der Chlorine bathochrom verschoben.

4)Bei den Bakteriochlorophyllen c, d und e {8) , (_9_) und (10)

handelt es sich um Chlorine, die sich von den in grünen Pflan¬

zen vorkommenden Pigmenten hauptsächlich durch das Fehlen der

2

Carboxymethylgruppe an C-13 und die formal hydratisierte

Vinylgruppe an C-3 unterscheiden. Sie treten meist als Gemisch

mit homologen Seitenketten an C-8 und C-12 auf. Die Bakterio¬

chlorophylle c und e tragen überdies in der elektrophilen

[59,60] Mesoposition C-20 eine Methylgruppe.

Eine Übersicht über die Strukturen der Bakteriochlorophylle

vermitteln die Schemata 3 und 4.

Bakteriochlorophyll a (6) ist das wichtigste Pigment der Pur¬

purbakterien und wurde auch in Extrakten aller phototrophen

grünen Bakterien mindestens in kleinen Mengen (verglichen mit

dem Gesamt-Pigmentgehalt) nachgewiesen. Erst kürzlich konnte

6_ in kleiner Konzentration auch in einem Stamm eines aeroben,

heterotrophen Bakteriums entdeckt werden [61]. Bakteriochloro¬

phyll b (7_) wird nur in wenigen Spezies der Rhodospirillaceae

gefunden. Vor kurzem gelang in phäophytinisierten Extrakten

4) Die Bezeichnungen Bakteriochlorophyll c und Bakteriochlorophyll d

wurden von Jensen et al. [80] eingeführt und ersetzen die früher ge¬

bräuchlichen Namen Chlorobiura-Chlorophyll-660 und Chlorobium-Chloro-

phyll-650.

- 20 -

Bakteriochlorophyll a 6_ Bakteriochlorophyll b 1_R = Phytyl od. R = Phytyl

Geranylgeranyl

[62-66] [67]

Schema 3: Strukturen der Bakteriochlorophylle a und b

einiger dieser Organismen der Nachweis von Bakteriophäophytina (_11) /

der Autor schloss daraus auf das Vorkommen von S_ in

vivo [79] .

In den Chlorobineae, den grünen phototrophen Bakterien,kommendie Bakteriochlorophylle c, d und e als Hauptpigmente vor. Mit

wenigen Ausnahmen [79] wurden sie stets als Gemisch von Homo¬

logen extrahiert [69,73,75,80]. Bakteriochlorophyll e wurde

als Gemisch von mindestens drei Komponenten isoliert [77].

Tabelle 2 gibt Auskunft über die Verbreitung der Bakterio¬

chlorophylle in den phototrophen Bakterien.

Die Bakteriochlorophylle zeigen eine verwirrende Vielfalt von

Alkoholkomponenten. In phäophytinisierten Extrakten aller un¬

tersuchten Rhodospirillaceae [81], Chromatiaceae [82] und

Chlorobiaceae [82]isolierten Pfennig et al. ein mit Phytol(12) verestertes Bakteriophäophytin a (Bakteriophäophytin a

= 11_.) - In einzelnen Arten der Chromatiaceae konnten sie auch

- 21 -

C02R

Bakteriochlorophyll c

Rl

äthyl

äthyl

n-propyl

isobutyl

R2

methyl

äthyl

äthyl

äthyl

R: meist Farnesyl

[68-73]

Bakteriochlorophyll d

R-, R,

äthyl methyl

n-propyl methyl

isobutyl methyl

äthyl äthyl

n-propyl äthyl

isobutyl äthyl

R: meist Farnesyl

[69,71,72 ,74,75]

C02R

Bakteriochlorophyll e

R, R,

äthyl methyl

n-propyl methyl

isobutyl methyl

äthyl äthyl

n-propyl äthyl

isobutyl äthyl

R: Farnesyl , Phytyl od

[72,76-78]

Schema 4: Strukturen der Bakteriochlorophylle c,d,e

- 22 -

geringe Mengen des mit Geranylgeraniol veresterten Bakterio-

phäophytins a (Bakteriophäophytin a = 11 ) nachweisen,Gg Gg

während sie in den untersuchten Stämmen von Rhodospirillum6)rubrum hauptsächlich 11 neben nur wenig 11 fanden

. Die—Gg —PAutoren vermuteten deshalb, dass Bakteriochlorophyll a in

den RC (P870) von R. rubrum vorkommt [82]. Sorgfältige Unter¬

suchungen von E. Walter in unserem Arbeitskreis an gereinig¬ten RC von R. rubrum G 9 zeigten aber, dass diese Bakterio-

chlorophyll a neben Bakteriophäophytin a enthalten [2 9,3 0].Bakteriochlorophyll b wurde in Rhodopseudomonas viridis und

Thiocapsa pfennigii stets als Phytylester neben geringen Men¬

gen 6_ gefunden [79,82]. Bakteriochlorophyll c ist vorwie¬

gend mit Farnesol verestert. Durch Verwendung von HPLC gelangkürzlich zusätzlich der Nachweis folgender Alkoholkomponentenaus einem phäophytinisierten Extrakt von Chlorobium limicola

[83,73]: 2,6,10-trans-Geranylgeraniol, 10,14-Tetrahydro-Ge-ranylgeraniol, trans-Phytol (1_2) , sowie auch die nicht iso-

prenoiden Alkohole 4-Undecyl-2-furanmethanol und cis-9-Hexa-

decen-1-ol. In Chloroflexus aurantiacus wurde Stearylalkoholals hauptsächliche Alkoholkomponente identifiziert [79]. Wäh¬

rend in Bakteriochlorophyll d bis anhin nur Farnesol nachge¬wiesen wurde [68], ist Bakteriochlorophyll e meist mit Far¬

nesol verestert, es wurden aber auch mit Phytol und Cetyl-alkohol (_13) veresterte Verbindungen identifiziert [79] .

5) Die aufgezeichneten Verbindungen sind exakt identifiziert [71,73].Holt et al. [69] fanden aber ein Gemisch von 6 Komponenten und ver¬muteten aufgrund von Abbaustudien auch das Vorkommen einer Äthylgrup¬pe an C-20, was jedoch eher unwahrscheinlich scheint. Hauptsächlichanhand biosynthetischer Überlegungen vermutet Kenner [7l] in den nochunbekannten Strukturen 8-äthyl-12-isopropyl, 8-n-propyl-12-isopropylund 8-isobutyl-12-isopropyl oder eher 8-n-propyl-12-methyl und 8-iso-butyl-12-methyl Substituenten. Auch diese Vorschläge werden angezwei¬felt [73] , möglicherweise unterscheiden sich die zwei gesuchten Struk¬turen nur in der Alkoholkomponente von den übrigen 4 Verbindungen.

6) Katz et al. [84] und Brockmann et al. [85,86] hatten schon früher11 aus R. rubrum extrahiert.—<;g

- 23 -

Tabelle 2: Verbreitung der Chlorophylle in Prokaryonten

Bakteriochlorophylle

Chlorobineae:

Chlorobiaceae:

Chlorobium limicola

C. 1. thiosulfatophilum LI

C. 1. thiosulfatophilumNCIB 8346

Chlorobium vibrioforme

C. v. thiosulfatophilum

Pelodictyon luteolum

Chlorobium phaeovibroidesChlorobium phaeobacteroides

(Chloropseudomonas ethylicum)

Chloroflexaceae:

Chloroflexus aurantiacus

Chloronema giganteumChloronema spiroideum

Rhodospirillineae:

Chromatiaceae:

alle Arten

Rhodospirillaceae:

Rhodospirillum rubrum

Rhodospirillum tenue

Rhodospirillum photometricum

Rhodospirillum molischianum

Rhodopseudomonas gelatinosa

Rhodopseudomonas palustris

Rhodopseudomonas acidophilaRhodomicrobium vaniellii

Rhodopseudomonas viridis

Thiocapsa pfennigii

Rhodopseudomonas capsulata

Rhodopseudomonas spaeroides

Rhodopseudomonas globiformis

Rhodopseudomonas sp.

Rhodocyclus purpureus

Cyanophyceae

Prochlorophyta

++

+ - ++ - - 80 r77

+ — - ++ — _80,77_

+ - ++ - - "80"

+ - - ++ - "77"

+ - - ++ - "77"

+ - - ++ - ~11~

+ - - - ++ "77,78,+

+ - ++ -

++ "77,78][80]

+

+

+

- ++

++

++

-

8)

8)

~79

89

~89"

,88]

++

++

++ —

++ -

++ -

++ -

++ -

++ -

+ ++

+ ++

++ -

++ -

++ -

— ++

[80,82]

80

81"

80"

80"

80~.

'80"

81""81"7 9", 9 0 ,

[79,82]"80"

"80""81

"80'

++---- [81]

Chlorophyll a [9 2]

Chlorophylle a und b [52,5 3]

Es bedeutet: ++ Hauptpigment, + in geringen Mengen gefunden

nicht nachgewiesen

- 24 -

Nur die Bakteriochlorophylle a und b scheinen für die bak¬

terielle Photosynthese essentiell zu sein, die übrigen Bak¬

teriochlorophylle betrachtet man als akzessorische Pigmente,deren Vorkommen nicht als absolut notwendig für die Primär¬

reaktionen erachtet wird [57] . Es sei jedoch ausdrücklich auf

die Bedeutung von Bakteriophäophytin hingewiesen, das in den

RC von Rhodospirillum rubrum [2 3,29,30] als auch von Rhodo-

pseudomonas sphaeroides [22,93-96] vorkommt und wahrschein¬lich eine fundamentale Rolle als intermediären Elektronen¬

akzeptor spielt [97,98].

7) Einteilung nach Pfennig [92] .

8) 9 wurde nur in Zellsuspensionen anhand der Absorption nachgewiesen,es fehlen Angaben über den Gehalt an Bakteriochlorophyll a.

- 25 -

2. PARTIALSYNTHESE VON CHLOROPHYLL A-DERIVATEN AUS DEN

PHAOPHORBIDEN

2.1. Einleitung und Problemstellung

Für die Synthese des Cyclo-chlorophyllid-enols 1_6_, das als

Modellsystem für die Untersuchung von im ß-Ketoester-System

enolisierten Chlorophyllen diente [99-105], hatte in unserer

Arbeitsgruppe die Notwendigkeit bestanden, ein schonendes

Verfahren zur Einführung von Magnesium in die metallfreien

Liganden zu entwickeln. Die in der Literatur beschriebenen

Methoden für den Magnesiumeinbau in Porphyrin-und einfache

Chlorin-Liganden Hessen sich auf die empfindlicheren Chloro¬

phyllderivate nicht übertragen, da sie viel zu drastische

Bedingungen erfordern. Eine Übersicht über die früher verwen¬

deten Reagenzien findet sich in [103].

Der Durchbruch war H.P. Isenring [101] mit dem Auffinden des

Reagenzes 2,6-Di-tert-butyl-4-methyl-phenoxy-magnesium-Jodid

("BHT-Mg-J"; 1_4) gelungen, mit dem sich erstmals eine voll¬

ständige Komplexierung der freien Liganden der Chlorophyll a-

Reihe erreichen Hess und schwierige und verlustreiche Rei¬

nigungsoperationen vermieden werden konnten. So Hess sich

das Cyclo-phäophorbid-enol L5 mit 7 Mol-Äquivalent 1_4_ in

CHC1^/CH Cl^/Äther (45° C, 5 Min.) in das entsprechende Magne¬

sium-Derivat 1^6_ umwandeln, das in 76 % Ausbeute kristallin

isoliert wurde [100,101] (Schema 5). Methyl-phäophorbid a 20_

konnte entsprechend (CH Cl„/Äther, 12 C, 6 Min., 4-facher

Überschuss an "BHT-Mg-J") laut UV/VIS-Spektrum quantitativ in

Methylchlorophyllid a (1_7) umgesetzt und das Rohprodukt ohne

vorherige Reinigung in 73 % Ausbeute kristallisiert werden

[100,101] .

Die Bedeutung des Verfahrens wird durch seine Anwendung zur

Darstellung der Dimeren (RC-Chlorophyll-Modelle) von Pyro-

chlorophyllid a [106] und Chlorophyll a [107], sowie von

- 26 -

Schema 5

Bis(pyro-chlorophyllid)cyclophan [108] verdeutlicht.

E. Zass [103] gelang es, das Reagenzsystem zu modifizieren

und durch Zusatz von "BHT-Li" auch für die Komplexierung von

Chlorophyll b- und Bakteriochlorophyll a-Derivaten zu ver¬

wenden.

Die Partialsynthese von Chlorophyll a durch Magnesiumeinbauin Phäophytin a schien als weitere Anwendung und Test für die

Methode lohnend. Auch schien das Verfahren für die präpara-tive Herstellung von Chlorophyll a von Interesse, zumal Iso¬

lierung und Reinigung aus Pflanzenextrakten schwierig sind

[44,109]. Es bestand auch die Hoffnung, aus partialsyntheti-schem Chlorophyll a Kristalle für eine Röntgenstrukturanalysezüchten zu können, war es doch Isenring gelungen, durch Magne¬siumeinbau in die entsprechenden Phäophorbide hergestelltesMethyl- und Äthyl-chlorophyllid a für diesen Zweck zu kri¬

stallisieren [101,110-112].Zudem stellt die erfolgreiche Komplexierung von Phäophytin a

die letzte Stufe der Totalsynthese von Chlorophyll a dar.

- 27 -

•NH N=/

\\HN-

y/

C02CH3

C02CH3c02CH3

o

C02CH3C02Phytyl

*\\

\ .

MgV

O

C02CH3C02Phytyl

18

Woodward 1960 H. Fischer

Schema 6

Mit der Totalsynthese von Chlorin e -trimethylester (1_8) durch

Woodward et al. [113-115] war formal auch die Totalsynthese

von Chlorophyll a (2_) erreicht: Die letzten Stufen zur Dar¬

stellung von Phäophytin a (Schema 6) durch Bildung des iso-

cyclischen Fünfrings [116,117] und Veresterung des Phäophor-

bids a mit Phytol [118] sind aus den Arbeiten Fischer's be¬

kannt, die Synthese von optisch aktivem Phytol ist von Wee-

don et al. [119,120] beschrieben worden .Die Einführung

von Magnesium in Phäophytin a durch Behandlung mit Phytyloxy-

magnesium-bromid wurde von Fischer und Goebel beschrieben

[12 3]• Das entstandene Chlorophyll a war jedoch mit über¬

schüssigem Phytol verunreinigt und die analytischen Unter¬

suchungen mussten sich den damaligen Methoden gemäss auf ein

qualitatives VIS-Spektrum und auf einen positiven Phasentest,

sowie auf einen Vergleich des durch Dekomplexierung zurückge¬

wonnenen Phäophytins a mit dem Ausgangsmaterial anhand der

HCl-Zahl beschränken.

9) Über eine Totalsynthese von Methyl-phäophorbid a nach dem Konzept

Fischer's berichteten Strell et al. [l21,122j.

- 28 -

Die Partialsynthese von Chlorophyll a aus Phäophytin a durch

die schonende Komplexierung mit "BHT-Mg-J", verbunden mit

einer umfassenden Charakterisierung des Produkts war daher

wünschbar.

2.2. Reinheitskriterien

Infolge der hohen Labilität, speziell der metallhaltigen Ver¬

bindungen, ist die Reinheitsprüfung von Chlorophyll-Derivatonbesonders wichtig. Bei den üblicherweise verwendeten Krite-

1 13rien wie UV/VIS-, IR-, H-NMR- und C-NMR-Spektren sowie

Elementaranalyse liegt die Erfassungsgrenze für die meisten

Nebenprodukte viel zu hoch: Beispielsweise metallhaltigeAllomere können mittels UV/VIS-Spektroskopie nicht erfasst

werden, da sie mit Chlorophyll a fast deckungsgleiche Spektren1 13

ergeben; durch H-NMR und C-NMR lassen sich infolge der

hohen Komplexizität der Systeme Anteile unter 10 % kaum nach-10)

weisen

Durch analytische Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel(Startzone: Kieselgur, Trennzone: Kieselgel, vgl. S. 99)

liess sich zwar eine gute Trennung erreichen: So konnten zum

Beispiel Chlorophyll a (20 oder Cetylchlorophyllid a (2J7) bei¬

nahe ohne Zersetzung von Verunreinigungen abgetrennt werden.

Die für die Optimierung von Einbau und Reinigung notwendige

Quantifizierung war jedoch nicht möglich.

10) Die Massenspektroskopie liess sich selbst für die metallfreien Ver¬bindungen nicht anwenden, denn Versuche mit Phäophorbiden und Pyro-phäophorbiden ergaben keine reproduzierbaren Massenspektren; dieTemperaturabhängigkeit der Aufnahmen z.B. bei Cetyl-phäophorbid aliess auf eine Zersetzung schon vor dem Verdampfen schliessen [l24](Ausnahme: Methyl-phäophorbid a).

- 29 -

Als günstigste analytische Methode schien deshalb die Hoch¬

druck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC), die mit einem

UV/VIS-Detektor dank der hohen Extinktionskoeffizienten der

Substanzen sehr empfindlich ist (Nachweisgrenze je nach Re-

tentionszeit 0,1-0,5 %), rasch und mit kleinen Substanzmen¬

gen arbeitet und deren Trennleistung diejenige der Dünn¬

schichtchromatographie um ein mehrfaches übertrifft.

Aufgrund der Erfahrungen mit HPLC an corrinoiden Liganden

[12 5] hatten J. Schreiber und E. Walter [2 9,3 0] Trennsysteme

mit Kieselgel als stationärer Phase für Alkyl-bakterio-

phäophorbide entwickelt, die sich mit Erfolg auch auf die

Chlorophyll b-Derivate übertragen Hessen [10 3] . Systeme ähn¬

licher Fliessmittelzusammensetzung konnten dann auch auf

Alkyl-phäophorbide a und unter den entsprechenden Vorsichts-

massnahmen auch auf Alkylchlorophyllide a angewendet werden.

Die Leistungsfähigkeit zur Trennung von Derivaten der Chloro¬

phyll a-Reihe wird in Abb. 14, S. 85 gezeigt. Die Nützlichkeit

der HPLC im Bereich der Chlorophyll-Derivate wird auch durch

ihre Anwendung in anderen neueren Arbeiten [56,73,83,126-128]

unterstrichen.

2.3. Reinigung von Phäophytin a

Orientierende Vorversuche von Isenring zur Darstellung von

Chlorophyll a (_2) durch Einführung von Magnesium in Phäophy¬

tin a (1_) hatten laut UV/VIS-Spektroskopie erwartungsgemäss

zur vollständigen Komplexierung geführt. Das isolierte Pro¬

dukt enthielt jedoch 10-20 % einer unbekannten, farblosen

Verunreinigung, die Isenring als eine aus dem eingesetzten

Phäophytin a stammende, phytolähnliche Substanz vermutete

(vgl. [101] ,S. 192). Für die in dieser Arbeit geplante Dar¬

stellung von analysenreinem 2_ war deshalb zuerst die Reini¬

gung des Edukts 1 notwendig:

- 30 -

o

co2CH3C02Phytyl

O

C02CH3C02Phytyl

1RIS

Schema 7

Phäophytin a (1) wurde durch Chromatographie an Kieselgel(vgl. [101]) aus einem Phäophytin a/b-Gemisch (Spinatextrakt)der Fa. Sandoz AG

11)in ca. 50 Ausbeute laut DC fast rein

erhalten. Laut HPLC (Detektorwellenlänge: 280 nm) bestand das

2eluierte Material aus einem Gemisch der beiden an C-13 epi-meren Phäophytine a (Schema 7), wobei das "natürliche" Epi-mere mit der thermodynamisch günstigeren trans-Konfiguration

2der beiden Seitenketten an C-13 und C-17 überwog (LR:1S_ =

81:19). Die qualitativen UV/VIS-Spektren der beiden separat

aufgefangenen Substanzen sind praktisch deckungsgleich, LR

wandelt sich im verwendeten HPLC-Lösungsmittel wieder in ein

Gemisch von LR und 1S_ um. Zudem konnten duch HPLC auch far¬

bige Nebenprodukte (ca. 4 %) neben farblosen Verunreinigun¬

gen nachgewiesen werden.

Reinigungsversuche durch die "klassische" Methode der Salz-

säurefraktionierung [129] brachten nur teilweisen Erfolg. Man

extrahierte eine Ätherlösung von Phäophytin a mehrmals mit

11) Herrn Prof. H.H. Inhoffen danke ich für das grosszügige Geschenk.

- 31 -

wässriger Salzsäure, deren Konzentration von 24 bis 32 % ge¬

steigert wurde. Die Porphyrinderivate lassen sich so auf¬

grund ihrer unterschiedlichen Basizität und Verteilungskoef¬

fizienten trennen [129] .Die Anreicherung von 1_ in den Frak¬

tionen höherer Salzsäurekonzentration war jedoch von einer

partiellen Hydrolyse des Phytylesters begleitet (Startfleck

im DC), so dass eine anschliessende Chromatographie notwendig

geworden wäre.

Im Gegensatz zu Phäophytin b [10 3] liess sich Phäophytin a

durch erneute Säulenchromatographie nicht befriedigend rei¬

nigen.

Durch mehrmaliges Umfallen aus heissem Aceton/Methanol gelang

es, die farblosen Verunreinigungen weitgehend abzutrennen, wo¬

bei die porphinoiden Verunreinigungen laut HPLC-Analyse nur

unvollständig entfernt wurden. Durch Entgasen der verwende¬

ten Lösungsmittel und Arbeiten unter Inertgas konnte die vor¬

her beobachtete Allomerisierung eingeschränkt werden, zudem

reicherten sich die Allomeren in der Mutterlauge an. Der Rei-

nigungseffekt zeigte sich am deutlichsten in den UV/VIS-Spek-

tren: Die spezifischen Extinktionen der Mutterlauge betrugen

nur ca. 55 % derjenigen des durch dreimaliges Umfallen er¬

haltenen Niederschlages. Bei dieser Reinigungsoperation rei¬

cherte sich das unnatürliche Epimere im Niederschlag an: Das

beobachtete Verhältnis _1R:3-S = 73,5:26,5 entspricht also nicht

] 2)der Gleichgewichtszusammensetzung

"

.In Aceton und Äther

stellte sich das Verhältnis innerhalb ca. 24 bzw. 48 Std. auf

84:16 bzw. 80:20 ein. Da sich beim Magnesiumeinbau überwie-

2

gend das "natürliche" 13 -Epimere von 2_ bildet (vgl. S. 34),

konnte auf die schwierige und aufwendige, mittels HPLC prin¬

zipiell mögliche Epimerentrennung verzichtet werden.

12) Man vergleiche dazu das Verhalten von Phäophytin b und Bakteriophäo-

phytin a, wo beim Umfallen die "natürlichen" Epimeren angereichert

werden ( [l03] S. 68 und [29] S. 31).

- 32 -

So gereinigtes 1 ergab eine befriedigende Verbrennungsana¬lyse. Die chemischen Verschiebungen im H-NMR-Spektrum (Abb.16 S. 98) stimmen innerhalb 0,05 ppm mit den Literaturdaten

[130] überein. Die Signale der C-Atome des Phäophorbid-Ge-13

rüsts im C-NMR-Spektrum weichen von denjenigen in Methyl-phäophorbid a (vgl. auch [131,34]) um höchstens 0,1 ppm ab.

Eine Ausnahme stellt das Signal bei 172,8 ppm (bzw. 173,3 ppm3in 2_0) dar, das den Atomen C-16 und C-17 zugeordnet wird

[34]. Die chemischen Verschiebungen der Alkoholkomponentesind in guter Übereinstimmung mit denjenigen von Phytylace-tat [132], Im IR-Spektrum (CHCl ; Abb. 15 S. 97) zeigen Sxch

-1nur im Bereich von 3030 bis 2 930 cm (C-H-Streckschwingun-gen) Unterschiede zu Methyl-phäophorbid a. Die Bandenlagenstimmen auch mit den für Phäophytin a beschriebenen überein

[133] .

Die Extinktionskoeffizienten in Äther: e (667,5) = 52'700,e (408,5) = 106'500 (Abb. 1, S. 36) liegen tiefer als die in

der Literatur [134] angegebenen Werte: e (667) = 61'000,e(409) = 129'000, was mit einer durch HPLC nicht erfassbaren

Verunreinigung von ca. 16 % erklärt werden könnte. Ein Ver¬

gleich der Extinktionskoeffizienten in Dioxan (genauer als

in Äther wegen der geringeren Verdunstung) mit andern, kri¬

stallinen Phäophorbid a-Derivaten fällt folgendermassen aus:

_,... , , . Methyl- Cetyl-Phaophytm a...

,,.-, ,..u i~ ^phäophorbid a

phäophorbid a

e(669): 52'200 54'400 53'900

e(412): HO'100 114'100 112'900

Diese Daten deuten auf einen Gehalt an nicht-porphinoiden Ver¬

unreinigungen von ca. 4 % hin, da man bei Chlorophyll-Deri¬vaten keinen Einfluss der Alkoholkomponente auf die Extink¬

tionkoeffizienten findet (vgl. auch [135]).

- 33 -

2.4. Komplexierung von Phäophytin a mit "BHT-Mg-J" zu

Chlorophyll a

Die ersten Vorversuche unter den Bedingungen von Isenring

[101] (4,6-facher Überschuss an "BHT-Mg-J" in CH Cl2/Äther,

Magnesiumkonzentration: 0,14 Mol/1, 10 bis 12 C, ca. 7 Min.)

ergaben trotz der Verwendung von entgastem Methylenchlorid

stets Nebenprodukte (je ca. 2-5 %) mit t = 8,2 Min. und

20,7 Min. (HPLC: System II, 81 ml/Std., t„ von 2R = 17,4

Min.), bei denen es sich wahrscheinlich um metallhaltige

Allomere handelte. Die demjenigen von 2_ sehr ähnlichen UV/

VIS-Spektren der durch HPLC aufgetrennten Proben und das ver¬

stärkte Auftreten dieser Verunreinigungen nach Eindringen

von Luft in das Reaktionsgefäss (Ans. 13, S. 105) stützen die¬

se Annahme. Bei der ersten Verunreinigung (t = 8,2 Min.)R

dürfte es sich in Analogie zu dem von Isenring ( [101] ,S.

174) bei der Komplexierung von Methyl-phäophorbid a beobach-

2teten Nebenprodukt um 13 -(Di-tert-butyl-4-methyl-phenoxy)-

Chlorophyll a = "BHT-Allomer" handeln, das sich laut HPLC

unter den Epimerisierungsbedingungen für Chlorophyll a nicht

veränderte. Durch rigoroses Entgasen des für das Grignard-

Reagens verwendeten Äthers gelang es, die Anteile dieser Ne¬

benprodukte auf je ca. 0,5-2 % zu senken. Die Verwendung

eines höher konzentrierten Einbaureagenzes (Magnesiumkonzen¬

tration in der Einbaulösung 0,56 statt 0,14 Mol/1) und damit

eines grösseren Überschusses bewirkte bei gleichzeitiger Ver¬

kürzung der Reaktionszeit auf 5 Min. vollständigere Komple¬

xierung (ca. 99,5 % statt ca. 96 %; HPLC).

Für präparative Ansätze wurden die in Schema 8 aufgezeigten

Reaktionsbedingungen angewendet. Nach Aufarbeitung mit Äther/

Phosphatpuffer bei 0 C wurde eine Komplexierung von über

99 % beobachtet, wobei der Anteil an Verunreinigungen laut

HPLC weniger als 5 % betrug. Für ein einwandfreies Gelingen

der Reaktion ist der Ausschluss von Sauerstoff trotz der An¬

wesenheit von BHT (Antioxidans') von entscheidender Bedeutung.

- 34 -

O

C02CH3CC^Phytyl

19 Mol Äquivalent

"BHT-Mg-J" (14)

Et O/CH Cl 72:28

5 Min./H-12° C

c(l) = 0,030 Mol/1

o

co2CH3C02Phytyl

1R + IS2R

Schema 8

Die Sauerstoffempfindlichkeit wurde in Ansatz 13 deutlich,als bei der periodischen Probenentnahme eindringende Luft

innerhalb 10 Min. zur Oxidation der Hälfte des Chlorophyllsführte!

Bei allen Komplexierungsversuchen trat eine überaus signi¬fikante Verschiebung der Epimerenverhältnisse ein: Ausgehendvon einem Verhältnis 1R:_1S_ = 73,5:26,5 wurde ein Verhältnis

2JR:2jS = 98,4:1,6 gefunden, während die Gleichgewichtslagebei ca. 88:12 bis 79:21 liegt (vgl. S. 42). Die stark bevor¬

zugte Entstehung des natürlichen Epimeren kann durch die

Bildung eines exo-Magnesium-Komplexes des 3~Ketoestersystemsim isocyclischen Ring und bevorzugte, kinetisch kontrollier¬te Protonierung zu 2R erklärt werden (vgl. 2.6, S. 47).

Die Reinigung des durch Absublimieren im Hochvakuum vom BHT

befreiten Rohprodukts (weniger als 5 % Verunreinigungen laut

HPLC) wurden unter striktem Sauerstoffausschluss in der Dry-Box (Stickstoffatmosphäre, Sauerstoffgehalt < 5 ppm) ausge¬

führt. Nach anfänglich erfolglosen Kristallisationsversuchenzur Reinigung des Rohprodukts gelang es, in Anlehnung an die

- 35 -

Versuche von Iriyama et al. [136,137] ,die Hauptmenge der

Verunreinigungen durch Fällen aus Dioxan/H„0 abzutrennen und

13)laut HPLC eine Reinheit von über 98 % (ZR + 2j3) zu er¬

reichen. Die trotz der mit den Literaturdaten [130-132] über-

1 13einstimmenden H-NMR- und C-NMR-Spektren völlig falschen

Werte der Verbrennungsanalyse und die zu niedrigen Extink¬

tionskoeffizienten konnten vorerst nicht erklärt werden. Aus

dem Wasser oder Dioxan stammende Verunreinigungen oder schwer

entfernbare, mit den verwendeten Mitteln nicht nachweisbare

Nebenprodukte wurden aufgrund von Blindproben (Durchführung

der Reaktion und der Aufarbeitung unter Verwendung aller

Reagenzien, aber ohne Zugabe von Phäophytin a) ausgeschlossen.

Bei weiteren Ansätzen zeigte sich dann, dass das Rohprodukt

einen farblosen, in organischen Lösungsmitteln und Wasser un¬

löslichen, sehr fein verteilten Festkörper enthielt, der

beim Aufarbeiten nur zusammen mit Chlorophyll a in die Äther¬

phase gelangte. Es dürfte sich dabei um ein Magnesiumphos¬

phat handeln (vgl. [138]). Infolge der überwiegend sehr fei¬

nen Verteilung liess sich die Verunreinigung nicht durch die

üblicherweise angewendete Filtration durch Watte entfernen,

sondern konnte nur durch Zentrifugieren der Dioxanlösung vor

der Fällung mit H~0 abgetrennt werden.

Das so in 73 % Ausbeute isolierte, als sehr feines Pulver

aus Dioxan/H 0 ausgefallene Chlorophyll a (Reinheit laut HPLC

ca. 99 %, ZR:_2S ca. 92:7) enthielt nach Trocknen am HV bei

RT ca. 0,75 Mol Dioxan und 0,25 Mol H„0. Dieser Lösungsmittel-

1

gehalt ist sowohl mit dem H-NMR-Spektrum als auch mit der

Elementaranalyse vereinbar.

Der Vergleich der UV/VIS-Spektren von 1_ und 2_ in Äther (Abb.

1 und 2) zeigt die erwartete bathochrome Verschiebung und die

stärkere Strukturierung der Soret-Bande, sowie die hypso-

13) Die in Dioxan rasche Epimerisierung führte zu einem Verhältnis 2R:2S

ca. 95:5 im Niederschlag.

- 36 -

chrome Verschiebung der Rotbande von _2 relativ zum metall¬

freien Edukt 1.

—i—

700

200400

Abb. 1 (oben) UV/VIS-Spektrum von Phäophytin a (1)

c = 8,69-10~6 Mol/1 in Äther

Abb. 2 (unten): UV/VIS-Spektrum von partialsynthetischem

Chlorophyll a (2)

c = 7,61-10~6 Mol/1 in Äther

Die für den Lösungsmittelgehalt korrigierten Extinktionskoef¬

fizienten in verschiedenen Lösungsmitteln stimmen gut mit den

Literaturdaten [134 ,135] überein und liegen ca. 4 % unter

den von Isenring für Methyl-chlorophyllid a gefundenen Werten

[lOlJ. Bei den Vergleichen ist zu beachten, dass Seely und

Mitarbeiter [135] nicht die absoluten Extinktionskoeffizien¬ten bestimmten, sondern als Basis die Werte von kristallinem

Äthyl-chlorophyllid a in Aceton [13 9] verwendeten. Die Spek¬tren in apolaren Lösungsmitteln sind vom Wassergehalt abhän-

- 37 -

gig und werden durch Aggregation sehr stark beeinflusst

[140-14 3]. Die breiten Absorptionsbanden und die niedrigen

Extinktionskoeffizienten in (trockenem) Benzol sind auf die¬

sen Effekt zurückzuführen.

Beim Vergleich der IR-Spektren von 1_ und 2_ (Abb. 15, S. 97

und Abb. 19, S. 118) fallen das Verschwinden der N-H-Banden

bei 34 00 cm sowie die Veränderungen im Bereich der C=0-

Streckschwingungen von 1750-1600 cm auf, wo sich die ur¬

sprünglich 3 Banden in ein System von 4 Peaks aufspalten.

Ausführliche Diskussionen der IR-Spektren und ihrer Lösungs¬

mittel- (Aggregations-) Abhängigkeit findet man in [133,141,

145-147]. Die Spektren in CHC1 (Abb. 19, S. 118), CCl und

KBr sind in guter Übereinstimmung mit den bekannten Daten

[148] , [145-147] und [149] .

Das H-NMR-Spektrum in Aceton-d, (Abb. 20, S. 118) stimmt mit

Ausnahme der Lösungsmittelsignale mit dem in [150,151]

überein, das Spektrum in Deuterochloroform/Deuteromethanol

88:12 ist mit demjenigen in [130] vereinbar, die chemi¬

schen Verschiebungen der Protonen im Chlorophyllid-Skelett

weichen auch nicht mehr als 0,06 ppm von denjenigen in Me-

thyl-chlorophyllid a ab [101].

Die C-NMR-Spektren in Aceton-d, und in CDC1_/CD.0D (Abb. 21

1 A \

und 22, S. 119) entsprechen den Literaturdaten [34] bzw.

14)[132] ,

wobei die Abweichungen 0,2 ppm selten übersteigen.

Die Kristallisation der Chlorophylle stellt ein schwieriges

Problem dar. Aus zahlreichen Untersuchungen [152-157] geht

die Notwendigkeit der Anwesenheit von Wasser [149-158] hervor,

Kristallisation aus Aceton/H„0 [149] schien am günstigsten,

nachdem schon Isenring [101] auf diese Art (allerdings verun¬

reinigte) Kristalle erhalten hatte, die ein ausgezeichnetes

14) Die untersuchten Chlorophyll-Proben waren nach den Methoden von

Strain et al. [l44,44] , Irijama et al. [l25] oder Jacobs et al. [l37]durch Extraktion von Spinatblättern oder Blaualgen gewonnen und durch

Chromatographie an Puderzucker von Carotinoiden und nötigenfalls von

Chlorophyll b abgetrennt und gereinigt worden.

- 38 -

Pulverdiagramm [159] ergaben. Nach erfolglosen Kristallisa¬

tionsversuchen auch aus Hexan/Äther/Wasser, Dioxan/Wasserund THF/Wasser gelang nach wiederholten Bemühungen die Kri¬

stallisation aus Aceton/H„0 7:1 durch sehr langsames (5 Wo¬

chen) Eindunsten in der Dry-Box. Das in Klümpchen kristalli¬

sierte Material ergab ein Pulverdiagramm mit deutlich ge-15)

trennten Linien und wurde unter dem Polarisationsmikro¬

skop bei 500-facher Vergrösserung eindeutig als kristallin

erkannt. Die grössten Kristalle zeigten Ausdehnungen von ca.

1,5x6jj und waren somit für eine Röntgenstrukturanalyse lei¬

der ungeeignet.

2Die Anreicherung des natürlichen Epimeren mit (13 -R)-Kon¬

figuration bei der Kristallisation wurde durch HPLC nachge¬wiesen. Das Kristallisat bestand aus 98,8 % _2R, 0,5 % 2S^ und

ca. 0,7 % Nebenprodukten (umgefälltes Ausgangsmaterial: 91,4 %

2R, 7,4 % 2_S und 1,2 % Verunreinigungen; Gleichgewicht 2R: 2S

= 79:81). Der Lösungsmittelgehalt der Kristalle ist nicht be¬

kannt. Die Tendenz des koordinativ ungesättigten Magnesiums,

polare Lösungsmittel zu koordinieren [141,143,145,160] und

die Beobachtungen bei der Röntgenstrukturanalyse von Äthyl-und Methyl-chlorophyllid a [158,110-112] lassen vermuten,dass 2 Mol HO koordiniert sind (evtl. auch Aceton). Die

unter dieser Annahme (MG = 929,54) berechneten Extinktions¬

koeffizienten liegen in allen untersuchten Lösungsmitteln

(Äther, Dioxan, Aceton) ca. 4,5 % höher als diejenigen des

umgefällten Materials.

Die in verschiedenen Arbeitsgruppen [161,162] gemessenen CD-

Spektren in Äther zeigten bedeutende Abweichungen voneinan¬

der, die mit unterschiedlicher Qualität der verwendeten Chlo-

15) Die Lagen der Reflexe sind identisch mit den in der von Kratky [l59]beschriebenen Pulveraufnähme (Chlorophyll a von H.P. Isenring herge¬stellt und kristallisiert; nicht gereinigt, spektroskopischer Gehaltca. 88 % [lOl]) .

- 39 -

rophyll-Proben begründet wurden [162]. Prokhorenko et al.

[162] fanden in einer Chlorophyll-Probe, die nach der von

Houssier et al. [161] verwendeten Vorschrift hergestellt wor¬

den war, Epimere und Allomere als Verunreinigungen. Leider

wurde die Reinigungsmethode für das verwendete Chlorophyll

a in [162] nicht beschrieben, sondern auf eine Dissertation

verwiesen.

Die Messung der CD-Spektren wurde wegen dieser Unterschiede

mit besonderer Sorgfalt durchgeführt. Die Chlorophyll-Proben

epimerisierten in den verwendeten Lösungsmitteln relativ lang¬

sam, so dass der Gehalt an Epimer (^2_S) während der Aufnahme

des CD-Spektrums in Äther (Abb. 25, S. 12 3) ca. 2-3 % und in

Aceton (Abb. 24, S. 123) ca. 1-1,4 % betragen haben dürfte

(vgl. S. 40 und exp. Teil S. 125). In den gleichen Lösungsmit¬

teln gelöste und in der Dry-Box aufbewahrte Proben von 2_R wa¬

ren während mindestens 14 Tagen stabil; d.h. ausser Epimeri-

sierung (vgl. S. 125) konnten durch HPLC keine Veränderungen

festgestellt werden.

Das in Äther aufgenommene CD-Spektrum (Abb. 25, S. 123) zeigte

sehr deutliche Unterschiede zu den publizierten Daten (Tabelle

3). Diese Unterschiede können nicht mit Differenzen im Epime¬

rengehalt der einzelnen Lösungen erklärt werden: Aufgrund des

in [162] beschriebenen Spektrums von 2_S erwartet man nämlich

bei hohem Epimerengehalt ein grosses Verhältnis Ae (432)/Ae (399)

gepaart mit einem grossen Verhältnis | Ae (432) | / | Ae (656) | .

Tabelle 3: CD-Spektren von Chlorophyll a in Äther

Diese Arbeit [l6l] [162] _2_S [162]

nm Ae nm Ae nm Ae nm Ae

656 -7,6 661 -13,8 656 -12,7 656 -18,3

432 +9,3 428 + 11,0 432 + 12,5 432 +28,5

399 +7,0 400 +6,9 392 + 7,6 392 -10,4

16) E.G. Sud'ina, Dissertation, Odessa (1959)

- 40 -

Da die Zusammensetzung des Kristallisats nicht der Gleichge¬wichtszusammensetzung entsprach, bot sich Gelegenheit, die

Epimerisierungsgeschwindigkeit in verschiedenen Lösungsmit¬teln zu untersuchen. Durch Einengen von Proben der verschie¬

denen Lösungen von ^2R und ihre anschliessende Untersuchungdurch HPLC wurden die Epimerenverhältnisse in Abhängigkeitder Zeit bestimmt. Die Resultate sind in Abb. 3 graphischdargestellt.

_! , ( ,

100 200 Std.

Abb. 3: Epimerisierung von 2_R in verschiedenen Lösungsmittelnbei RT. Aufgezeichnet ist der Anteil von ^S am Gesamt-

Chlorophyll-Gehalt (in %)

1 Äther 3 Aceton/H20 5 Dioxan/H 0

2 Aceton 4 Dioxan 6 MeOH

Die Gleichgewichtslagen und besonders die Epimerisierungsge-schwindigkeiten sind sehr stark von den Lösungsmitteln abhän¬

gig.

Die Epimerisierung erfolgt über eine Enolat- oder in nicht¬

basischen Lösungsmitteln wahrscheinlicher über eine Enol-

Zwischenstufe 1£ [145,147,163] (Schema 9).

- 41 -

C02Phytyl C02Phytylu n

C02Phytyl

2R ü 2S

Schema 9

In den aprotischen Lösungsmitteln nimmt die Epimerisierungs-

geschwindigkeit mit zunehmender Polarität (zunehmender Di¬

elektrizitätskonstante: Dioxan, Äther, Aceton) ab. Durch Zu¬

satz von H„0 wird die Epimerisierung stark verlangsamt.

Diese Tendenz stimmt mit der Beobachtung überein, dass in Fäl¬

len, wo die Ausbildung einer intramolekularen Wasserstoff¬

brücke möglich ist, die Enolisierung in apolaren Lösungs¬

mitteln gefördert wird [164]. Es bestehen aber (scheinbar)

1 r -i

gegensätzliche Beobachtungen ( H-NMR) von Katz et al. |_16 3J ,

wonach Chlorophyll a in THF um ein Mehrfaches schneller epi-

merisiert als in Benzol. In trockenen, apolaren (Magnesium

nicht koordinierenden) Lösungsmitteln ist jedoch die Möglich-2

keit der Bildung von Aggregaten durch Koordination der 13 -

Carbonyl-Gruppe mit dem Magnesiumatom anderer Chlorophyll-

Moleküle zu beachten [147,141,165].' Die ausserordentlich

rasche Epimerisierung in Methanol kann jedoch nicht erklärt

werden.

Die Gleichgewichtszusammensetzungen in verschiedenen Lösungs¬

mitteln sind in Tabelle 4 zusammengestellt.

- 42 -

Tabelle 4: Epimerengleichgewichte von Chlorophyll a

2R : _2S

Dioxan 88 : 12

Äther 79 : 21

Aceton 79 : 21

Methanol 83 : 17

2.5. Cetyl-chlorophyllid a

Da es nicht gelungen war, Einkristalle von Chlorophyll a in

der für eine Röntgenstrukturanalyse benötigten Grösse zu er¬

halten, wurde versucht, ein Chlorophyll-Derivat mit möglichstähnlichen Eigenschaften wie 2_ kristallin herzustellen. Cetyl-

chlorophyllid a (2_7) schien dafür am günstigsten: Wegen der

gleichen Kettenlänge von Phytol (J^2) und Cetylalkohol (13)dürften sich vergleichbare Kristalle ergeben und dank dem

Fehlen der Doppelbindung und der Methylgruppen erwartete man

eine bessere Kristallisierbarkeit. Zudem wurde Cetylalkoholauch als natürliche Alkoholkomponente in Bakteriochlorophylle (1_0) gefunden [7 9] . Die Synthese von 2_7 wurde auf dem in

Schema 10 aufgezeichneten Weg durchgeführt.

Methyl-phäophorbid a (2J)) ist aus Phäophytin a (1) durch Um-

esterung in methanolischer Schwefelsäure leicht und in guterAusbeute zugänglich und lässt sich im Gegensatz zu 1. durch

Kristallisation gut reinigen. Das so hergestellte 2^) besteht

nur aus einem Epimeren ( H-NMR), obwohl die Gleichgewichts¬lage 20R:20S bei ca. 86:14 [166] liegt.Da Phäophorbid a (21.) nicht völlig problemlos kristallisier¬te und der Reinigungseffekt nicht ganz überzeugte, wurde auf

die direkte Hydrolyse des ebenfalls nicht leicht zu reinigen¬den 1_ (vgl. S. 30) verzichtet und der Weg über 20_ gewählt.Die Bildung von Pyro-phäophorbid a, die wahrscheinlich über

- 43 -

1R + IS

MeOH/H2S04

C02CH3

O

C02CH3

24-proz. HCl/

Et 0

± 1

Rückfluss,

30 Min.

C02H

O

C02CH3

+ 24

20R 21R + 21S

C16H33OHPhosgen/Pyridin

0-20°C/2 Std.

O

C02CH3C02^16H33

2 7R + 2 7S

19 Mol-Äquivalent

"BHT-Mg-J" (14:)-m

Et20/CH2C12 72:28

5 Min./ll-12°C

O

C02Cri3C02C16H33

2 3R -r 2 3S

Schema 10

3die konkarrierende Hydrolyse der 13 -Esterfunktion, qetolgt

von einer spontanen Decarboxy1ierung der entstandenen '-Keto-

sciure erfolgt, iiess sich bei der Verseifunq von 2_0 (24-proz,

HCl/Äther; Rücki'iuss, 30 Min.) nicht völlig vermeiden. Neben

einem Gemisch von 21R und 21S ais Hauptprodukte wurden stets

- 44 -

ca. 10 % Pyro-phäophorbid a (2J5) und ca. 5 % Edukt 20_ gefun¬den (DC) .

Da bei der Darstellung des bisher unbekannten Cetyl-chloro-phyllid a eine eindeutige Identifikation und Reinheitskon¬trolle nötig war, wurden zu Vergleichszwecken auch die metall¬

freien Derivate der Pyro-Reihe ausgehend von Methyl-pyro-phäophorbid a (24) hergestellt (Schema 11).

C02CH3

/ O

C02CH3

Collidin

Rückfluss,

10 Min.

C02CH3

20R24

24-proz. HCl/Et 0

Rückfluss/30 Min.

C16H33OH

Phosgen/Pyridin

0-20°C/2 Std.

C02Ci6H33 C02H

2625

Schema 11

- 45 -

Da für die Veresterung von ^1 wegen der hohen Oxidations-

empfindlichkeit der Chlorine viele der modernen, auf einem

Redox-Mechanismus beruhenden Veresterungsmethoden (vgl. z.B.

[167]) nicht in Betracht kommen, versuchte man zuerst die

Kondensation über die Aktivierung des Alkohols zu erreichen.

Weder die Umsetzung von ^L mit Cetylalkohol in Gegenwart von

Dimethylformamid-dineopentylacetal, noch die Veresterung von

21 mit Dimethylformamid-dimethylacetal [168] gelangen in be¬

friedigender Ausbeute. Bei den in Analogie zu der von Wasie-

lewski et al. [107] beschriebenen Darstellung des Phäophor-

bid a-äthylenglykol-monoesters ausgeführten Versuchen zu

Veresterung mittels Chlorameisensäure-methylester in Gegen¬

wart von Äthyldiisopropylamin bildete sich zwar das entspre¬

chende gemischte Anhydrid _22_, das sich auch aus dem Reaktions¬

gemisch isolieren liess, die anschliessende Umsetzung zu 2_3

war jedoch zu langsam. Sie liess sich auch durch Umsetzung von

22 mit 1_3 unter Zusatz von 4-Dimethylaminopyridin [169] oder

3,3,6,9,9-Pentamethyl-2,10-diaza-bicyclo[4,4,0] -l-decen-2-

oxid [170,171] nicht erreichen. Da auch die Versuche zur

Veresterung von ^L mit 13 in Trifluoracetanhydrid nicht zum

Ziel führten, griff man auf die Methode von Fischer [118],

der Cetylpnäophorbid als erster hergestellt hatte, zurück und

setzte 2\_ mit 1_3 in Pyridin mit Phosgen zu 2_3 um. Nach HC1-

17)Fraktionierung und Säulenchromatographie an Kieselgel

18)wurde der Ester in 62 % Ausbeute als Gemisch der beiden

Epimeren 23R und 23S (ca. 88:12) isoliert. Cetyl-phäophorbid

a konnte aus heissem Aceton/Methanol als Epimerengemisch kri-

1 13stallisiert werden. Die UV/VIS-, IR-, H-NMR- und C-NMR-

Spektren sind denjenigen von Methyl-phäophorbid a (2_0) und

Cetyl-pyro-phäophorbid (2_6_) sehr ähnlich.

17) Durch die Abtrennung der Hauptmenge an überschüssigem 1_3_ wurde die

nachfolgende Chromatographie erleichtert.

18) Reinheit laut HPLC über 99 %; insbesondere konnte die Abwesenheit

des entsprechenden Pyro-Derivates nachgewiesen werden.

- 46 -

Man führte das Magnesium unter den für Phäophytin a optimier¬ten Bedingungen, allerdings in kleineren Ansätzen, ein und

beobachtete dabei die analoge Anreicherung des "natürlichen"

Epimeren von Cetyl-chlorophyllid a (2_7) , aber einen etwas

höheren Anteil an Allomer (ca. 1 %). Umfallen aus Dioxan/H„0 unter den Bedingungen wie für 2^ ergab einen vergleichba¬ren Reinigungseffekt, wobei auch hier Epimerisierung (von

27R;27S = 98:2 im Rohprodukt zu 93:7 im Niederschlag) eintrat.

Die sehr hohe Ähnlichkeit der UV/VIS-, IR-, H-NMR- und 13C-NMR-Spektren mit denjenigen von Chlorophyll a beweist die

Strukturzuordnung. Die Extinktionskoeffizienten liegen jedochetwas tiefer als diejenigen von 2^. Die Signallagen der Pro¬

tonen des Chlorophyllid-Skeletts weichen nicht mehr als 0,0513ppm von denjenigen in _2 ab, die Abweichungen im C-NMR-

Spektrum liegen innerhalb 0,1 ppm.

Durch Kristallisation aus Aceton/H„0 unter den für 2^ ange¬

wandten Bedingungen wurde ein amorph scheinendes Pulver er¬

halten, dessen Kristallinität sich unter dem Polarisations¬

mikroskop aber zweifelsfrei zeigte (grösste Kristalle ca. 30p).Das Pulverdiagramm ist besser aufgelöst als dasjenige von

Chlorophyll a und weist auf eine vergleichbare Kristallstruk¬

tur hin. Durch HPLC wurde jedoch ein sehr hoher Allomerenge-halt nachgewiesen, dessen Entstehung auf Verunreinigung(Sauerstoff) der Dry-Box-Atmosphäre zurückgeführt werden muss.

Ein weiterer Kristallisationsversuch mit frisch hergestelltem

Cetyl-chlorophyllid a gelang ohne starke Allomerisierung, die

entstandenen Kristalle mit grössten Abmessungen von ca. 20ywaren jedoch für eine Röntgenstrukturanalyse ungeeignet.

- 47 -

2.6. Einige Beobachtungen zum Mechanismus des Magnesium¬

einbaus

Nach der Einführung von Magnesium in das Epimerengemisch von

Phäophytin a wurde in allen Versuchen jeweils nur ein sehr ge¬

ringer Anteil des unnatürlichen Epimeren (S-Konfiguration an

2C-13 ) gefunden. Die gleiche Tendenz war auch beim Magnesium¬

einbau in Phäophytin b festgestellt worden [1031 .Die beim

Einbau beobachtete Farbänderung der Lösung von graubraun nach

gelbgrün deutete auf das Entstehen eines im ß-Ketoestersystem

des isocyclischen Rings enolisierten Zwischenproduktes hin.

Mit einem vergleichbaren Enolat wird auch die charakteristi¬

sche Farbe des Molisch1sehen Phasentests [172] erklärt.

Das VIS-Spektrum der Reaktionslösung (Phäophytin a: 0,75 mM,

BHT-Mg-J: 0,5 M in CH Cl2/Äther, 0,2 mm-Zelle) zeigt mit der

Aufspaltung der Soret-Bande das charakteristische Merkmal

eines enolisierten Chlorophyll-Derivates ( [101] , vgl. auch

[105]). Eine hohe Ähnlichkeit besteht zu den peripheren

Magnesiumkomplexen, die Scheer und Katz [173,174] durch Um¬

setzung von Methyl-phäophorbid a mit Mg(C10.)„ in trockenem

Pyridin erhalten hatten. Eine sehr gute Übereinstimmung ergibt

sich auch mit den Spektren eines peripheren Magnesiumkomplexes

28 (Schema 12), in CH2C12, den B. Jaun [104] durch Umsatz

einer Lösung von Magnesium-methoxid und Hydroxy-trimethyl-2 3

benzochinon 1:1 mit 13 ,17 -Cyclo-chlorophyllid-enol a (17)

dargestellt hatte.

Der im Reaktionsgemisch vorliegende Komplex wird daher wahr¬

scheinlich am besten durch die Formel 2_9 beschrieben (Schema 12) :

Die Spektren der Reaktionslösung nach verschiedenen Reaktions¬

zeiten sind in Abb. 4, S. 49 wiedergegeben.

- 48 -

C02Phytyl O-Mg

2829

Schema 12

Sowohl die Lage als auch das Verhältnis der optischen Dichten

der Soret-Maxima sind mit denen in 2_8 praktisch identisch.

Geringe Unterschiede ergeben sich bei den Schultern zwischen

450 nm und 520 nm, sowie bei der Rotbande, deren Maximum in

28 bei 682 nm liegt, gegenüber 662 nm im Spektrum der Reak¬

tionslösung.

Die Möglichkeit zur Ausbildung eines Enolats scheint die Ein¬

führung von Magnesium zu erleichtern, wurden doch bei allen

in unserer Arbeitsgruppe untersuchten Derivaten der Chloro¬

phyll a-, Chlorophyll b- und Bakteriochlorophyll a-Reihe für

Verbindungen mit intaktem ß-Ketoestersystem höhere Einbauge¬schwindigkeiten mit "BHT-Mg-J" als für die entsprechenden

Pyro-Derivate gefunden [101,103]. Diese Beobachtungen stehen

im Gegensatz zu den Befunden von Scheer et al. [174] , die

bei Versuchen zum Magnesiumeinbau im System Mg(CIO.)„/Pyridineine Komplexierung des ß-Ketoestersystems der metallfreien

Verbindungen erreichten [173,174], wodurch aber der Metall¬

einbau verhindert wurde. Die Einführung von Magnesium gelangmit Mg(CIO.)„/Pyridin nur in die Pyro-Derivate [106,174].

- 49 -

Abb. 4

800 nm

u-

- 0D,

12- /\

-V \

i \

10-

J V/' '1

08-

7

\^f

06- \J\

04-

02-

\

\\

7 V

oo-

I ' l 1' 1 1

Abb. 5

300 400 500 600 700 800 nm

Abb. 4: Komplexierung von _1

Beginn der Aufnahme (10 nm/Sek.)

I Min. 45 Sek.

19 Min. nach Mischen (RT)

Abb. 5: Komplexierung von 2^

Beginn der Aufnahme (10 nm/Sek.)

5 0 Sek.

. 2 Min. 40 Sek.

15 Min. nach Mischen (RT)

- 50 -

Die Darstellung peripherer Magnesiumkomplexe bereits metall¬

haltiger Verbindungen gelang Scheer und Katz [16 3] nicht.

Im Gegensatz dazu liess sich der Magnesium-exo-Komplex aus¬

gehend von Chlorophyll a mit "BHT-Mg-J" 14_ ohne Schwierigkei¬ten erzeugen. Die entsprechenden VIS-Spektren sind mit den

durch Umsetzung von Phäophytin a unter gleichen Bedingungenerhaltenen Aufnahmen fast identisch. Abb. 5 zeigt die nach

unterschiedlicher Reaktionsdauer gemessenen Spektren.

Die Bildung des peripheren Komplexes könnte somit vor oder

nach der Einführung des zentralen Magnesiumatoms erfolgen.In Analogie zur angenommenen stereoselektiven Protonierungvon 29_ zu _2R nach dem Magnesiumeinbau würde man auch eine

solche des entsprechenden peripheren Magnesiumkomplexes von

Phäophytin a zu LR erwarten. Die Untersuchungen des Epime-renverhältnisses im nicht komplexierten 1. nach einer Reak¬

tionsdauer von ca. 2 bis 2 0 Sek. ergaben ausgehend von einem

Verhältnis LR:1£> unter dem Gleichgewichtsverhältnis ein Ver¬

hältnis 1R:1_S über der Gleichgewichtszusammensetzung (Tabellen

16, 17, S. 163). In einzelnen Fällen (nach 2 und 5 Sek. bei

10 C) war die Abnahme von JLS stärker als die Zunahme von 2R;es wurde also die postulierte Vergrösserung des Gehalts an LR

oezüglich der Gesamtmenge an Porphyrinderivaten beobachtet.

Diese Resultate (höchstens 71 % -> 79 %) sind aber nicht sehr

signifikant. Die Geschwindigkeit der Komplexierung des Zentrums

und des ß-Ketoestersystems scheinen nicht stark unterschiedlich

zu sein und erlauben somit nicht, eine stereoselektive Proto¬

nierung des Phäophytin a-exo-Komplexes zu beobachten.

- 51 -

3. UNTERSUCHUNGEN AN REAKTIONSZENTREN

3.1. Einleitung

Über die Eigenschaften und Funktion bakterieller Reaktions¬

zentren (RC) existieren verschiedene umfassende Ubersichts-

artikel [26-28] ,es soll hier deshalb eine sehr kurze Zusam¬

menfassung genügen:

Die auf grüne Pflanzen und photosynthetische Bakterien einfal¬

lende Lichtenergie wird durch ein System von Lichtsammler-

(Antennen-) Pigmenten aufgefangen und auf die Reaktionszen¬

tren (P700 des Photosystems I in grünen Pflanzen, P870 bzw.

P96 0 in phototrophen Bakterien, die Bakteriochlorophyll a bzw.

b enthalten) übertragen, die durch ein längerwelliges Absorp¬

tionsmaximum relativ zur Antenne gekennzeichnet sind. Die RC

sind von den Antennen sowohl funktionell als auch strukturell

verschieden und lassen sich prinzipiell von ihnen abtrennen.

Während aber die Anreicherung von Reaktionszentren der Gefäss-

pflanzen sehr schwierig ist, und bis anhin höchstens Ver¬

hältnisse von P700 zu Chlorophyll a ca. 1:20 erreicht wurden

[175], gelingt es in einigen Fällen, bakterielle Reaktions¬

zentren von den Antennenpigmenten vollständig abzutrennen

[21,24,176-179]. Für die Untersuchung der Primärprozesse sind

die RC aus Bakterien auch deshalb sehr gut geeignet, weil de¬

ren Photosyntheseapparat bedeutend einfacher ist als derje¬

nige der höher entwickelten grünen Pflanzen [28] und sich

durch die Züchtung von geeigneten Mutanten einzelne Eigen¬

schaften besser untersuchen lassen.

Die Reaktionszentren der hauptsächlich untersuchten Organis¬

men Rhodospirillum rubrum und Rhodopseudomonas sphaeroides

scheinen sich nicht sehr stark zu unterscheiden. Die durch Be¬

handlung mit dem Detergens Lauryldimethylaminoxid (LDAO) von

den Membranen abgelösten Partikel bestehen aus drei Unterein-

- 52 -

heiten mit Molekulargewichten von 21'000, 24'000 und 28'000,die in einer Natriumdodecylsulfat-Lösung dissoziieren [24].Durch sorgfältige Behandlung mit LDAO und Natriumdodecylsul-fat lässt sich das grössere, pigmentfreie Protein unter Er¬

haltung der Photoaktivität im Komplex der beiden andern Pro¬

teine abtrennen [24]. Die Aminosäurezusammensetzung der RC in

den beiden Organismen sind sehr ähnlich [25] . Pigmentanaly¬sen sowohl in R. sphaeroides [22,95,96] als auch in R. rubrum

[23] ergaben ein Verhältnis von Bakteriochlorophyll a {6)/

Bakteriophäophytin a (_11) 2:1, wobei die RC 4 Moleküle 6_und 2 Moleküle 2J- enthalten [22,23,95]. Daneben enthalten

die RC im allgemeinen 1 Mol Ubichinon und 1 Mol Nicht-Häm-

Eisen [24,180,181] .

Die folgende Reaktionssequenz der photosynthetischen Energie¬

umwandlung scheint wahrscheinlich: Die von den Antennen auf

die RC übertragene Lichtenergie führt zu einer Ladungstren¬

nung und damit zur Ausbildung eines Radikalkations und eines

Radikalanions. Wahrscheinlich dient ein Assoziat von 2 Bak¬

teriochlorophyll a (oder b)-Molekülen [182,183] als Elektro-

nendonor: ESR- und ENDOR-Spektren des entstandenen Radikal-

Kations deuten auf eine Delokalisation über beide Pigmentmo¬leküle hin [184,185]. Als intermediärer Akzeptor wird Bakte¬

riophäophytin aufgrund von Messungen der VIS-Spektren im Pico-

sekundenbereich vorgeschlagen [97,98]. Als Primärakzeptordient wahrscheinlich ein Ubichinon-Eisen-Komplex [186].

In isolierten RC (R. rubrum, R. sphaeroides) ist die Absorp¬tionsbande im Bereich von 870 nm durch Belichtung reversibel

ausbleichbar [176,181,187] (Oxidation des photoaktiven P870).

Die hauptsächlichsten Veränderungen im VIS/NIR-Spektrum sind:

Entstehen einer schwachen Absorptionsbande bei 1245 nm, Aus¬

bleichen der Bande bei 870 nm, Verschiebung des Maximums von

802 nm auf 800 nm, Erhöhung der Absorption im Bereich von

770 nm und Abnahme des Extinktionsmaximums bei 600 nm (vgl.auch Abb. 10, S. 68). Die beschriebenen Veränderungen lassen

- 53 -

sich auch durch chemische Oxidation mit K Fe(CN), [178,188]

(vgl. auch Abb. 9, S. 66) oder mit HO [189] erreichen.

Dank der Erfolge bei der Isolierung und Reinigung der Reak¬

tionszentren aus der carotinoidarmen Mutante R. rubrum G 9

in der Arbeitsgruppe von Prof. Bachofen am Institut für Pflan¬

zenbiologie der Universität Zürich konnten uns RC für eigene

Untersuchungen zur Verfügung gestellt werden. Die Vorschrif¬

ten zur Herstellung der RC-Präparationen sowie ihre Zusammen¬

setzung sind in [190,179] beschrieben; die wichtigsten Daten

sind auch auf S.178 zusammengestellt. Die von E. Walter durch¬

geführte Pigmentanalyse solcher Proben ergab ein Verhältnis

von Bakteriochlorophyll a /Bakteriophäophytin a von ca.

2:1 [29,30].

3.2. Problemstellung

Die Funktion der einzelnen Bestandteile der Reaktionszentren

ist noch nicht völlig geklärt und zum Teil umstritten, ins¬

besondere fehlen detaillierte Strukturinformationen. Wir ha-

13ben die Frage untersucht, ob durch C-NMR-DifferenzSpektro¬

skopie Informationen über die aktive Form der Pigmente gewon¬

nen werden könnten.

Für die Untersuchung der Konstitution und allfälliger symme¬

trischer Anordnungen der Chlorophylle und Phäophytine im ak-

13tiven Protein-Pigment-Komplex ist die Anreicherung an C

notwendig, einerseits um überhaupt eine genügend hohe Kon-

13zentration äquivalenter C-Kerne und damit ein akzeptables

Signal/Rauschen-Verhältnis zu erhalten (maximal erreichte RC-

-4Konzentration 4-10 Mol/1) und anderseits um die Signale der

interessierenden Porphyrine im Verhältnis zu den Protein¬

signalen zu verstärken. Wir interessierten uns besonders für

die Frage nach der Bedeutung des 3-Ketoestersystems im iso-

cyclischen Ring, besitzen doch alle bis anhin in Reaktions-

- 54 -

Zentren gefundenen Chlorophylle und Phäophytine diese intakte

3-Ketoester-Struktur. Die Frage, ob diese funktionelle Gruppeim P870 allenfalls in ihrer Enolform vorliegt, sollte, paral¬lel zu den in unserem Arbeitskreis durchgeführten Untersuchun-

19)gen der in ihrer Enolform stabilen Cyclochlorophyllidesowohl der Chlorophyll a- als auch der Bakteriochlorophyll a-

r -i2Reihe [_99-106j , durch Beobachtung der Hybridisierung (sp

3 2oder sp ) des 13 -Kohlenstoffatoms der Pigmente in den RC

angegangen werden. Zu diesem Zweck wird eine möglichst hohe,13 2spezifische Anreicherung von C in Stellung 13 der Porphy¬

rine benötigt.

Da sich die Pigmente, obwohl nicht kovalent an die Proteine

gebunden, nicht reversibel aus diesen herauslösen lassen, ist13die angestrebte Anreicherung an C nur durch Einschleusen

eines entsprechend markierten Chlorophyll-Vorgängers auf bio¬

logischem Wege in wachsende Bakterienzellen und anschliessen¬

de Isolierung der gebildeten RC denkbar.

13Die Wahrscheinlichkeit, durch Messung des C-NMR-Spektrumsder unbelichteten, in ihrer neutralen Form vorliegenden RC

direkt interpretierbare Signale zu erhalten, ist allerdings13auch bei einer sehr hohen spezifischen C-Anreicherung der

Pigmente wegen der zu erwartenden hohen Proteinabsorptioneneher gering (vgl. Abb. 7 und 8, S. 63). Durch die Differenz¬

spektroskopie (neutraler Eduktzustand minus ausgebleichter,oxidierter Produktzustand) bietet sich für die Untersuchungvon P870 eine einzigartige Chance, die in der Art der photo¬synthetischen Primärreaktion selbst, nämlich in der mit der

lichtinduzierten Elektronenabgabe verbundenen Multiplizitäts-

änderung verbunden ist.

19) Die Ergebnisse lassen die Beteiligung einer monomeren Enolform von

Chlorophyll am Primärprozess der Photosynthese unwahrscheinlich er¬

scheinen [|l04j .

- 55 -

Die durch die Ausbildung des paramagnetischen Zentrums zu er-

wartende Verbreiterung der Signale der mit dem ungepaarten

13Elektronenspin gekoppelten C-Kerne dürfte im Idealfall prak¬

tisch zum Verschwinden der Absorptionen führen. Die Signale

der am Primärprozess beteiligten Moleküle würden eliminiert,

während man nur einen geringen Einfluss auf die Proteine und

weitere Komponenten (Detergens, Puffer) der Lösung erwartet.

Im Differenzspektrum der beiden Zustände würden die Signale

der sich nicht verändernden Bestandteile der Lösung verschwin¬

den, während die Absorptionen der an der Lichtreaktion direkt

teilnehmenden Pigmente, die vom diamagnetischen Eduktzustand

in den paramagnetischen Produktzustand übergehen und somit die

zentrale photosynthetische Einheit P870 bilden, erhalten blie¬

ben.

13Das so erhaltene C-NMR-Differenzspektrum würde also genau

die an der Primärreaktion beteiligten Chlorophylle und Phäo-

phytine in ihrem diamagnetischen Eduktzustand aufzeigen.

Es sei jedoch auf einige denkbare Schwierigkeiten hingewiesen,

welche die Interpretation eines solchen NMR-Experimentes er¬

schweren würden. Möglicherweise wird sich die Ausbildung eines

Radikalkations im Protein auch auf die Signale der umgebenden

Aminosäuren auswirken. Ebenso kann nicht ausgeschlossen werden,

dass die Signale der Chlorophylle und Phäophytine mindestens

teilweise erhalten bleiben, sich aber durch den Einfluss des

Kationradikals verschieben. Beide Möglichkeiten würden das an¬

gestrebte Differenzspektrum erheblich komplizieren. Ausserdem

darf aber auch nicht ausser Acht gelassen werden, dass die

durch das hohe Molekulargewicht bedingte lange Korrelations¬

zeit eine Verbreiterung der C-Signale schon, im diamagneti¬

schen Edukt bewirkt.

13Für die Abschätzung der Durchführbarkeit dieser geplanten C-

NMR-Differenzspektroskopie mussten vorab folgende Fragen be¬

antwortet werden:

- 56 -

Kann die benötigte, hohe, spezifische Markierung der

Chlorophylle und Phäophytine überhaupt erreicht werden?

Sind die RC im neutralen Zustand über die Dauer der Auf-13

nähme eines C-NMR-Spektrums stabil?

Reicht die Stabilität der RC im belichteten oder im die¬

sen simulierenden chemisch oxidierten Zustand für die13

vermutete Dauer der C-NMR-Messung aus?

133.3. Synthese von [2- C]-6-Aminolävulinsäure

Die Biosynthese der Chlorophylle dürfte auf dem in Schema 13

dargestellten Weg erfolgen. Eine ausführliche Zusammenfassungder Resultate der Biosyntheseforschung an Porphyrinen befin¬

det sich in [191] (vgl. auch [71]).Die gewünschte Markierung liesse sich theoretisch durch Ver-

13füttern von [9- C]-PBG erreichen. Orientierende Einbauver¬

suche mit [ C]-PBG verliefen jedoch erfolglos. Da die2

Markierung von C-13 prinzipiell auch durch den Einbau des

13biosynthetisch früheren Vorläufers [2- c] -ALA möglich ist

r 14-iund diesbezügliche Vorversuche mit |_4- C]-ALA hohe Einbau-

13raten ergaben, wurden Fütterungsexperimente mit [2- C]-6-Aminolävulinsäure ins Auge gefasst.

Von den über 20 beschriebenen Synthesen für 6-Aminolävulin¬

säure (_3_0) [198-223] eignet sich nur diejenige von Pichat et

al. [203] für eine Markierung in 2-Stellung. A.I. Scott et al13[223] synthetisierten so [2- C] -6-Aminolävulinsäure (30a)13in ca. 53 % Ausbeute bez. [2- c]-Bromessigsäure. Wir streb¬

ten die Synthese von 30a auf einem neuen, in Schema 14 auf-

20) Sämtliche Einbauversuche wurden von Dr. H. Zürrer, Institut für

Pflanzenbiologie der Universität Zürich, durchgeführt.

- 57 -

o

H3NCO.

CQ2HC02H

-C02.

CO„H ,/^u2CO~H

C02H \__NH HN-/

C02H F NH HN-

-C02H

-Aminolävulinsäure

ALA

PorphobilinogenPBG

co2H 0O2H

Uroporphyrinogen III

co2h co2h co2ch3

Protoporphyrin IXMagnesium-

Protoporphyrin IX

co2h

o

co2ch3

C02Phytyl C02RC02CH3

Protochlorophyllid a Chlorophyll a Bakteriochlorophyll a

Schema 13: Chlorophyll-Biosynthese

- 58 -

HoC

31

Cl1. Cl2/Na2C03

2. KJ/Aceton, Rf

11 % 32

Phthalimidkalium/o

DMA / 75-100 C, 2 Std

O

N

O

H2NHCl

33

35a

24 %

13

O

C02H

|2- c] -Malonsäuredimethylester/

Natriumhexamethyldisalazanat/

THF/Benzol / 53° C, 2 Std.

OsO /NaJO

Dioxan/Wasser, 20 Std.

13[ cjMalonsäure -> 37a: 55

HCl/HOAc 1:1

Rf, 16 Std.

99 %

30a

Schema 14

- 59 -

gezeichneten Weg an. Die Synthese wurde an nicht-markiertem

Edukt optimiert und dann auf die Herstellung von 30a ange¬

wendet :

Das Dijodid _3J-, das nach der von M.G. Bonetti [226] in unse¬

rem Labor optimierten Vorschrift nach [224,225] aus Methallyl-

chlorid hergestellt worden war, konnte durch Kondensation mit

Phthalimidkalium in _3_2 übergeführt werden. Die bescheidene

Ausbeute von 2 3,5 % erklärt sich einerseits durch die hohe

Reaktionsgeschwindigkeit von _3_3 mit Phthalimidkalium zu 3-

Phthalimido-2-phthalimidomethyl-propen-l (_3_4_) und mit der ge¬

ringen Stabilität des Jodids anderseits (-> Zersetzung) ,was

durch die etwas höheren Ausbeuten bei kleineren Ansätzen

(kürzere Aufarbeitungs- und Reinigungszeit) unterstrichen

wird. Der Tendenz zur zweifachen Alkylierung von Malonestern

konnte durch Verwendung eines zweifachen Überschusses an

r 13 n

|_2- Cj-Malonsäuredimethylester und destillativer Rückgewin¬

nung des unverbrauchten Edukts begegnet werden. Die Anwendung

von Natrium-hexamethyldisilazanat [227] als Base erlaubte

eine sehr glatte Umsetzung zu 35a, so dass im H-NMR-Spektrum13

des Rohprodukts ausser ca. 3-5 Mol-% [2- c]-Bis-(2-methyli-

den-3-phthalimido-propyl)-malonsäuredimethylester (36a) keine

Nebenprodukte festgestellt werden konnten. Die anschliessende

Oxidation mit OsO./NaJO. wurde direkt mit dem Rohprodukt13

durchgeführt und ergab [2- c]-2-Methoxycarbonyl-4-oxo-5-

phthalimido-valeriansäure-methylester (37a), der direkt durch

Kristallisation gereinigt werden konnte. Die Ausbeute bezüg¬

lich verbrauchter Malonsäure betrug 55 %.

Die anschliessende Hydrolyse erfolgte unter den in [223] be¬

schriebenen Bedingungen durch Kochen am Rückfluss in Salz¬

säure/Eisessig 1:1 während 16 Stunden und ergab nach Abtren-

13

nen der entstandenen Phthalsäure laut DC einheitliche [2- c]-13

ö-Aminolävulinsäure (30a), in deren C-NMR-Spektrum keine

Verunreinigungen nachgewiesen werden konnten.

- 60 -

20)3.4. Einbauversuche

Bei Versuchen zur Verfütterung von [4- C]-ALA an wachsende

Zellkulturen von Rhodospirillum rubrum gelang es, die Pigmenteradioaktiv zu markieren. Da aber die spezifischen molaren

Einbauraten bei hoher Konzentration des Vorläufers im Nähr¬

medium das theoretische Maximum von 8 überstieg und auch in

andern Zellbestandteilen Radioaktivität gemessen wurde, muss-

te angenommen werden, dass die [4- C]-ALA teilweise abge¬baut und dann unspezifisch vom Organismus aufgenommen worden

war.

13Die Verfütterung von [2- C]-ALA unter vergleichbaren Bedin¬

gungen verlief trotzdem erfolgversprechend (Wachstumsbedin¬

gungen siehe [2 9], S. 242). Die Pigmente der gesamten Zellen

(RC und Antennen) wurden von E. Walter extrahiert und phäo-13phytinisiert [2 9], S. 244). B. Jaun ermittelte einen C-

2Gehalt in Stellung 13 von 43,8 ± 1,5 % durch Integration

13 1des C-Satelliten im H-NMR-Spektrum.

13Aus der Integration der C-Signale (Pulsabstand 20 Sek.;

1 2vollständige Relaxation) wurde für die Positionen 2,3,12 12 17

, 8,

12,

17 und 18 ein gleich hoher Markierungsgradbestimmt. Die übrigen Stellen im Makrocyclus zeigten einen13C-Gehalt von ca. 1,2 %, was ungefähr dem natürlichen Vor-

13kommen entspricht. Der Anteil an C im Geranylgeranylrestlag mit 2,5 % ca. doppelt so hoch, was einen teilweisen Ab-

13bau von [2- C]-ALA und Einbau auf einer einfacheren Stufe

13beweist (Abb. 6). Eine detaillierte Beschreibung des C-

NMR-Spektrums der extrahierten Pigmente findet sich in [2 9] ,

S. 244.

Für die Entscheidung, ob das geplante NMR-Experiment zu

brauchbaren Resultaten führen dürfte, ist es wichtig, das

Intensitätsverhältnis der Signale der Chlorophylle zu denje¬nigen der Proteine abzuschätzen. Mit diesem Ziel wurde das

zu erwartende Spektrum des Proteins berechnet und mit dem zu

- 61 -

...,,... | ,,,,,,,, |. . | | | , , , , .

|.

,, , , | , ! | ,

5000

,1 r -1 *- >

1000 C 181, .

TC2'

1 C32 H100 I cJ

25

I/

C 32C-172

S

CDCI3—'

HywdfA^>li**AJvjJuL180 160 140 120 p-

80 60 40 20 0

Abb,13C-NMR-Spektrum von markiertem Bakteriophäophytin a,

13spezifischer C-Gehalt 44 %, in CDC1

erwartenden Spektrum der Chlorophylle verglichen. Das vermu¬

tete Spektrum des Proteins wurde in Abb. 7 wie folgt aufge¬

zeichnet :

1. Aus der von Steiner et al. [25] ermittelten Aminosäuren¬

zusammensetzung wurde unter Annahme eines Molekularge¬

wichts der RC-Proteine von 73'000 die Zahl der einzelnen

Aminosäuren pro RC berechnet (z.B. 42 Valin-Einheiten pro

RC). Die Höhe des Signals, hervorgerufen durch eine Ami-

13nosäure mit natürlichem C-Gehalt wurde für alle H-sub-

stituierten C-Atome als identisch betrachtet und in Abb.

7 willkürlich mit 0,14 mm festgesetzt. Für quaternäre C-

Atome wurde 1/3 dieser Signalintensität angenommen, d.h.

die entsprechende Höhe in Abb. 7 beträgt 0,04 7 mm.

2. Die chemischen Verschiebungen der Signale des Proteins

wurden von Wüthrich ( [192], S. 17 5) übernommen. Sie waren

anhand von Tetra- und Pentapeptiden in D~0 gemessen worden.

3. Für die zu erwartende Linienbreite wurde ein Wert von 25

Hz, entspricht 1 ppm bei 25 MHz, angenommen (die erwar-

- 62 -

teten Signalintensitäten wurden über alle Aminosäuren

innerhalb 1 ppm aufsummiert).

Das erwartete Spektrum, hervorgerufen durch ein Bakteriophäo-

phytin pro RC wurde in Abb. 7 (oben) unter der Annahme glei¬cher Einbauraten in die Pigmente der Antennen und der RC auf¬

gezeichnet (der experimentell ermittelte Markierungsgrad be¬

zieht sich auf die Pigmente der gesamten Zelle, d.h. über¬

wiegend auf diejenigen des Lichtsammlersystems). Für die Ab¬

schätzung der Signalintensitäten wurde somit ein spezifi-13

scher C-Gehalt der markierten Zentren von 4 4 % angenommen.

Die chemischen Verschiebungen entsprechen denjenigen von

Bakteriophäophytin a in CDC1_. Es ist zu beachten, dass die

RC-Proteine 6 Pigmente (4 Chlorophylle und 2 Phäophytine)

enthalten, die bei symmetrischer Anordnung durch Überlagerungder Signale zu höheren Intensitäten führen könnten.

Das experimentell ermittelte Spektrum unmarkierter RC (Abb.

8) stimmt mit dem berechneten (Abb. 7) relativ gut überein,wobei jedoch zu beachten ist, dass bei der Abschätzung des

Spektrums die Signale von Puffer und Detergens (Tris und

LDAO), deren Konzentrationen in den verschiedenen RC-Präpa-rationen stark variieren, nicht berücksichtigt wurden. Der

zusätzlich beobachtete Signalhaufen bei ca. 70 ppm dürfte

von Kohlehydraten stammen. Diese Interpretation wurde durch

den Nachweis von Zuckern in den RC-Präparationen gestützt

[19 3] .

- 63 -

III III.I

200 150 100 50

200 150 100 50

Abb. 7 (oben): Strichspektrum von Bakteriophäophytin a

13(44 % C, 1 Molekül pro RC)

berechnetes Spektrum der Proteinsignale

der RC

13Abb. 8 (unten): gemessenes C-NMR-Spektrum unmarkierter RC

- 64 -

3.5. Untersuchungen der Stabilität ausgebleichter

ReaktionsZentren

Die sehr hohe Einbaurate von [2- c]-ALA war die wichtigste13Voraussetzung für weitere Versuche in Hinblick auf ein C-

NMR-Differenzspektrum. Nachdem es E. Walter gelungen war,

Puffer- und Detergenskonzentrationen zu finden, bei denen

sich die RC (im unbehandelten Zustand) während 2 Tagen bei

ca. 1 C (Aufnahmetemperatur) in der wässrigen Lösung kaum

veränderten, mussten Bedingungen gefunden werden, unter de¬

nen sich die RC auch in oxidiertem Zustand über längere Zeit

nicht zersetzen.

Die RC lassen sich sowohl durch Licht als auch chemisch oxi-

dieren. Die an sich günstiger scheinende lichtinduzierte Aus¬

bleichung wirft jedoch apparativ bedeutende Probleme auf:

Die sehr hohe optische Dichte einer NMR-Probe (OD(802) ca.

501) verhindert eine gleichmässige Durchleuchtung der gesam¬

ten Lösung. Durch seitliche Einstrahlung würde zwar eine mög¬lichst grosse Oberfläche belichtet, eine solche Bestrahlungwürde aber bedeutende Änderungen im Probenraum des NMR-Ge-

rätes bedingen. Eine Bestrahlung von oben müsste, um einen

vernünftigen Anteil an oxidierten RC zu ergeben, mit einer

stetigen Durchmischung gekoppelt sein. (Ein Quarz- oder Glas¬

stab, der zugleich als Lichtleiter dient, dürfte durch Be¬

rühren der langsam rotierenden Probe wahrscheinlich genügen.)

Es wurden deshalb vorerst Versuche zur chemischen Oxidation

der RC durchgeführt. Ziel der ersten Vorversuche war, mög¬lichst vollständige Oxidation bei gleichzeitig hoher Stabili¬

tät der Lösung zu erreichen. Die Auswahl der Oxidationsmittelwar sehr beschränkt, mussten sie doch den folgenden Forderun¬

gen so weit wie möglich genügen:

13- Keine eigenen C-Absorptionen

- Sowohl im oxidierten als auch im reduzierten Zustand dia-

- 65 -

magnetisch oder höchstens schwach paramagnetisch, um Störun¬

gen der NMR-Signale zu vermeiden

- Redox-Potentiale in der Nähe derjenigen der RC (möglichst

grosse Pufferwirkung und möglichst geringe Oxidation der

Proteine!)

- definiertes, von der Lösung möglichst unabhängiges Redox¬

potential (Fremdionen, Ionenstärke, Detergens, Puffer).

Die bekannte [178,188] Oxidation der RC mit K Fe(CN) hat den

Nachteil, dass das Redoxpotential des Oxidationsmittels (430

mV [184]) unter demjenigen der RC (450-490 mV [27]) liegt

und es deshalb in sehr grossem Überschuss eingesetzt werden

muss. In einem ersten Versuch wurde eine konzentrierte RC-

Lösung (Lösung 2) bis zu einem Oxidationsgrad von 76 % mit

II 4-K.Fe(CN), umgesetzt und dann das entstandene Fe (CN)r mit

3 6 6

H 0 wieder oxidiert. Man erreichte so einen Oxidationsgrad13

von 84 %. Innerhalb von 38 Stunden (Aufnahme des C-NMR-

Spektrums) reduzierte sich die Probe jedoch wieder vollstän¬

dig! Anschliessende elektrochemische Oxidation der Lösung

führte nur zu einem kurzfristigen Erfolg, denn nach Beendi¬

gung der Oxidation trat erneut rasche Reduktion ein. Inner¬

halb von 4 Tagen bei 0 C entstanden weitere Veränderungen,

die als irreversible Zersetzung der RC interpretiert wurden.

— 6

Die stufenweise chemische Oxidation einer 1,85"10 M RC-

Lösung führte zu den bekannten Änderungen im VIS/NIR-Spektrum,

selbst mit einem 200-fachen Überschuss an K^Fe(CN)r liess3 6

sich jedoch keine vollständige Oxidation erreichen (Abb. 9).

Durch Oxidation unterschiedlich konzentrierter Proben mit

K Fe(CN), und Nachoxidation mit KJ/J~-Lösung (das Ferricya-

nid/Ferrocyanid-Gemisch sollte als Potentialpuffer wirken)

wurde zwar ein Oxidationsgrad von 93 % bzw. 96 % bei vergleich¬

barem molarem Überschuss an Oxidationsmittel erreicht, wobei

die konzentriertere, etwas stärker oxidierte Lösung jedoch

instabiler war und deutlich stärkere Extinktionsabnahme des

Maximums bei 800 nm innerhalb 44 Std. zeigte (Proben 3/1.,

- 66 -

Abb. 9: 1,85*10 M RC-Lösung

unbehandelt

nach Oxidation mit 0,3, 1, 3 bzw. 10 yl0,2 N KFe(CN) -Lösung3 b

nach anschliessender Reduktion mit KBH„

3/2.) . Eine durch Verdünnen der konzentrierten, oxidierten Lö¬

sung mit HO entstandene Probe (3/2J zersetzte sich wenigerrasch als die Stammlösung.Die Stabilität einer konzentrierten, nur mit K.Fe(CN)_ oxi-

3 6dierten Probe war bedeutend geringer als aus Vorversuchenvon E. Walter (sogar bei höherem Oxidationsgrad) mit verdünn¬ten Proben zu erwarten war. Möglicherweise hatte die stark er¬

höhte Ionenstärke einen negativen Einfluss auf die Haltbarkeitder Probe. Durch Verdünnen der oxidierten Probe mit H„0 konn¬te die Zersetzung deutlich vermindert werden.

Direkte Oxidation mit KJ/J_ ergab erwartungsgemäss (möglicheReaktion von Jod mit den Proteinen) keine stabile Lösung.Günstigere Resultate bezüglich Stabilität der Proben wurdedurch die Oxidation mit einer 1:1 Mischung aus 0,2 N KJ/J„-und 0,2 N K_,Fe (CN) r-Lösung erreicht.3 6

Da das Ziel, eine "saubere" chemische Oxidation zu einem in-

13nerhalb der anzunehmenden Messzeit für das C-NMR-Spektrumstabilen Produkt nicht erreicht wurde, untersuchte man dieStabilität der RC unter andauernder Beleuchtung. Die Messung13des C-NMR-Spektrums unter Einstrahlung würde apparativ einen

- 67 -

grossen Mehraufwand bedeuten, hätte aber den Vorteil eines

stärker realitätsbezogenen Experiments.

Die ersten diesbezüglichen Versuche wurden unter Beleuchtung

mit 368 nm-Licht (Emissionsmaximum der Quecksilberdampflampe)

durchgeführt. Die hohe Intensität des eingestrahlten Lichts

bewirkte einerseits eine vollständige Ausbleichung der Ab¬

sorptionsbande bei 867 nm, anderseits jedoch eine sehr ra¬

sche Zersetzung der RC. Diese Instabilität ist für die Auf-

13nähme des C-NMR-Spektrums (zu vermutende Dauer ca. 48 Std.)

prohibitiv.

Man versuchte deshalb, die Ausbleichung durch weniger inten¬

sive und längerwellige Strahlung zu erreichen. Versuche mit

der sehr schwachen Emissionsbande der Quecksilberdampflampe

bei 690 nm brachten eine fast vollständige, aber sehr langsam

eintretende Ausbleichung der Bande bei 868 nm. Die so verfüg¬

bare Lichtintensität dürfte jedoch zur Ausbleichung einer kon-

zentrierteren Lösung bei weitem nicht ausreichen. Die VIS/NIR-

Spektren einer RC-Lösung unter Einstrahlung mit 368 nm-Licht

bei Verwendung von Gelbfiltern und unter Einstrahlung mit 690

nm-Licht ohne Filter sind in Abb. 10 wiedergegeben.

Um eine höhere Lichtintensität zu erreichen, wurde die Mög¬

lichkeit untersucht, die Proben durch Einstrahlung des gesam¬

ten Wellenlängenbereichs oberhalb 540 nm bzw. 630 nm auszu¬

bleichen. Die verdünnten Lösungen waren unter diesen Bedin¬

gungen nicht stabil genug, für konzentriertere Lösungen er¬

wartete man aber bei gleicher Lichtintensität eine bedeutend

geringere Zersetzung. Bestrahlung einer konzentrierten Probe

in einem NMR-Rohr (10 mm Durchmesser) ergab jedoch leider ent¬

gegen der Erwartung eine vergleichbar rasche Zersetzung. Die

Stabilität der behandelten Probe dürfte für ein NMR-Experi-

ment nicht ausreichen.

- 68 -

10-

00

o.o- ;~—=-=-='-"""'

1 ' 1 ' 1 ' 1 ' I ' 1 ' 1 ' 1 ' 1500 600 700 800 900 1000 H00 1200 1300 nm

Abb. 10: 1,85'ICT M RC-Lösung

— — unbehandelt

unter Bestrahlung mit Licht von 368 nm

Wellenlänge (Gelbfilter in Referenz- und

Messstrahl)

-. • unter Bestrahlung mit 690 nm-Licht (ohne

Filter)

nach Reduktion mit KBH.

3.6. Schlussfolgerungen

Die Frage nach der Durchführbarkeit der geplanten C-NMR-

Differenzspektroskopie konnte anhand der beschriebenen Ver¬

suche nicht abschliessend beantwortet werden. Auf die Ausfüh¬

rung musste hauptsächlich deshalb verzichtet werden, weil kei¬

ne genügende Stabilität der RC im oxidierten Zustand erreicht

werden konnte. Die grosse Bedeutung einer direkten Beobach-13

tung von P870 durch C-NMR-Differenzspektroskopie würde je¬doch weitere, verstärkte Anstrengungen in dieser Richtungrechtfertigen. Für solche Arbeiten sollten die folgendenErfahrungen und Vorschläge berücksichtigt werden:

1. Die Qualität der einzelnen RC-Präparationen und damit die

Stabilität gegenüber Oxidationsmitteln war stark unter¬

schiedlich (Lösungen 1, 2, 3). RC-Präparationen einheit¬

licherer Qualität wären für weitere Untersuchungen von

- 69 -

grossem Vorteil.

Einfrieren und Auftauen hatten keinen negativen Einfluss

auf die Qualität der RC.

Konzentriertere Proben zersetzten sich bei gleichem Ver¬

hältnis von RC zu Oxidationsmittel rascher als verdünnte.

Ursache der Instabilität der durch einen grossen molaren

Uberschuss an K Fe(CN) oxidierten Lösung könnte minde¬

stens teilweise in der stark erhöhten Ionenstärke liegen.

Versuche, weniger Ferricyanid einzusetzen und das ent¬

standene Ferrocyanid durch ein stärkeres Oxidationsmittel

(H 0„, Jod) wieder zu oxidieren waren wenig erfolgreich.

Das beste Resultat wurde bei gleichzeitiger Addition von

Ferricyanid und Jod erreicht.

13Für die C-NMR-Differenzspektroskopie wäre eine lichtin¬

duzierte Oxidation vorzuziehen, die beiden Messungen wä¬

ren dann unter sonst identischen Bedingungen möglich.

Die Stabilität aller lichtinduziert gebleichten RC-

Proben war ungenügend.

Die Geschwindigkeit der Rückreaktion nach lichtinduzier¬

ter Ausbleichung schien mit zunehmender Dauer der Experi¬

mente abzunehmen. Offenbar verarmten die Lösungen an Re¬

duktionsmittel, was bedeutet, dass diese Oxidation -

Reduktion keinen sauberen Kreisprozess bildete, sondern

dass ein Teil der Elektronen irreversibel "verloren ging"

Um eine möglichst homogene Beleuchtung der Probe zu er¬

reichen, sollte bei einer Wellenlänge mit möglichst ge¬

ringer Extinktion der Lösung eingestrahlt werden. Die

beste Möglichkeit wäre die Beleuchtung mit Licht von ca.

870 nm Wellenlänge (hohe Absorption des Edukts, geringe

Absorption des Produkts). Dadurch könnten auch mögliche

Photoreaktionen der oxidierten RC auf ein Minimum be¬

schränkt werden.

- 70 -

13Vielleicht würde sich auch die Untersuchung der C-NMR-

Spektren nur der reduzierten RC lohnen. Die störenden

Signale der Proteine könnten prinzipiell durch Verfüttern12

eines an C angereicherten Nährmediums unterdrückt wer¬

den. Bedeutend einfacher wäre jedoch die Anzucht der Bak-21)

terien in D„0. Die so gebildeten, deuterierten Amino¬

säuren würden infolge der stark erhöhten Relaxationszeit13der D-substituierten C-Kerne gegenüber den H-substitu-

ierten Atomen und der dadurch erreichten Sättigung zu be¬

deutend geringeren Intensitäten der Signale führen. Die

r 13 iunverdaut eingebauten, H-substituierten [2- Cj-ALA-Mo-leküle würden Signale der Pigmente mit unverminderter In¬

tensität erzeugen.

21) Katz et al. züchteten Kulturen von R. rubrum in DO und erreichteneine H-Markierung verschiedener Gruppen durch Verfütterung von Bern-steinsäure-H-4 L195J . Man vergleiche dazu auch die Anzucht von mehr¬fach markierten Algen [l96,197_| •

- 71 -

EXPERIMENTELLER TEIL

4. EINLEITUNG

4.1. Allgemeines

Die Glasgeräte wurden für Versuche mit Porphyrinderivaten ge¬

nerell mit Chromschwefelsäure gereinigt, anschliessend mehr¬

mals mit Ionentauscherwasser, mit einem Aceton/Methanol-Ge-

misch und mit destilliertem Aceton gespült und bei 120 C im

Trockenschrank getrocknet.

Die Herstellung von Magnesium-Reagens und der Einbau des Magne¬

siums wurde in gedämpftem Licht durchgeführt. Man arbeitete

stets mit Lösungsmittelgemischen auf, deren organische und

wassrige Phasen während mindestens 15 Minuten durch Einleiten

eines kräftigen StickstoffStromes entgast worden waren. Nach

Entfernen des Lösungsmittels am Rotationsverdampfer bei 10-

20 C wurde jeweils mit Argon begast.

"Entgasen durch Absaugen" bedeutet, dass unter intensivem magne¬

tischen Rühren entweder am Wasserstrahlvakuum oder am Hoch-

-3Vakuum (hier bis auf einen Enddruck < 2*10 Torr, gemessen

zwischen Pumpe und Kühlfalle) die Luft und ein Teil des Lö¬

sungsmittels abgesaugt wurde.

Unter "Entgasen durch Einfrieren" wird das Einfrieren des Lö¬

sungsmittels in einem höchstens zu einem Drittel gefüllten-3

Rundkolben mit flüssigem Stickstoff, evakuieren auf < 2*10

Torr und raschem Auftauen der abgeschlossenen Probe in heis-

sem Wasser verstanden. Dieses Verfahren wurde 3 bis 5 mal

- 72 -

wiederholt, bis beim erneuten Evakuieren der Probe kein Druck¬

anstieg mehr zu beobachten war. Für grosse Lösungsmittelmengen(> 100 ml) war es möglich, das Verfahren auf 2 bis 3 maligesEinfrieren abzukürzen, indem man am Anfang einen Teil (= 10 %)des Lösungsmittels in die Kühlfalle absaugte.

Die Oxidationsversuche der Reaktionszentren wurden in grösst-möglicher Dunkelheit ausgeführt, um eine unkontrollierte

lichtinduzierte Ausbleichung zu unterdrücken. Dazu stand ein

Dunkelraum mit stufenlos auf das absolut benötigte Minimum

einstellbarer Beleuchtung zur Verfügung.

Abkürzungen Chi a Chlorophyll a

Chi a' 132(S)-Chlorophyll a

Phäo a Phäophytin a

2Phäo a1 13 (S)-Phäophytin a

DC DünnschichtchromatogrammHPLC Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie

-3HV Hochvakuum (< 2-10 Torr)

WV Wasserstrahlpumpen-Vakuum

RV Rotationsverdampfer

MG Molekulargewicht

Smp. Schmelzpunkt

RT Raumtemperatur

konz. konzentriert

M, mM molar, millimolar

- 73 -

4.2. Qualität der verwendeten Materialien

DünnschichtChromatographie

Cellulose DC-Alufolien, Schichtdicke 0,1 mm (Merck),

Laufstrecke ca. 8 cm

Kieselgel DC-Fertigplatten Kieselgel 60 F254, Schicht¬

dicke 0,25 mm (Merck), Laufstrecke ca. 8 cm

Silgur DC-Fertigplatten Silgur-25 UV 254, Schicht¬

dicke 0,25 mm (Macherey - Nagel & Co); Kom¬

binationsschicht Kieselgur/Kieselgel, Lauf¬

strecke auf Kieselgel ca. 8 cm

Säulenchromatographie

Kieselgel Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,2 mm (Merck)

Alox W 200 Aluminiumoxid basisch W 200 Akt. Super I

(Woelm). Verwendet zum Trocknen und Reini¬

gen von Lösungsmitteln

Hochdruck-Flüssigchromatographie

Partisil 5 (Whatman / Reeve-Angel)

Lösungsmittel und Reagenzien

Lösungsmittel * Die mit * bezeichneten Lösungsmittel wurden

entweder durch Einfrieren oder durch Ab¬

saugen am HV entgast

Aceton Merck, zur Analyse

Äther destilliert, vor Gebrauch über Alox W 200

filtriert (nur für Aufarbeitung)

Fluka, puriss. p.a., absolut, vor Gebrauch

zweimal über LAH destilliert

Äthylacetat destilliert

Benzol Merck, zur Analyse, über Calciumhydriddestilliert

BHT "Butylhydroxytoluol" = 2,6-Di-tert-butyl-4-

methyl-phenol; Fluka, purum, vor Gebrauch

im HV bei 60-70° C sublimiert

Calciumhydrid Fluka, purum, pulverisiert

Cetylalkohol Fluka, puriss.

Chloroform Merck, zur Analyse, stabilisiert mit Äthanol

vor Gebrauch durch Alox W 200 filtriert

- 74 -

Dirnethoxyäthan

Dirnethy1formamid

Dioxan

Essigsäure

HMPA

Hexan

Kaliumborhydrid

Kaiiumferricyanid

LAH

Methanol

Magnesium

Methylenchlorid

Natriumhydrid

Natriumsulfat

Pentan

Phosphatpuffer

Phosgen

Pyridin

Salzsäure

Schwefelsäure

Tetrachlorkohlen¬

stoff

Tetrahydrofuran

Deuterochloroform

Fluka, purum, über Natriumhydrid destilliert

Fluka, puriss. p.a., über Calciumhydrid de¬stilliert

Fluka, puriss. p.a., zweimal über Kaliumdestilliert. Für die Verwendung in derDry-Box wurde unmittelbar vor Gebrauch durchAlox W 200 filtriert

,-2

Merck, zur Analyse, 100 %

Hexamethylphosphorsäuretriamid:Fluka, purum, destilliert bei 10"^ Torr

destilliert

Fluka, purum p.a.

Kaliumhexacyanoferrat III, Fluka, puriss.

Lithiumaluminiumhydrid: Fluka, puriss. p.a.

Fluka, puriss. p.a., über Magnesium de¬stilliert

Fluka, purum, für Grignard

destilliert, vor Gebrauch durch Alox W 200filtriert

Fluka, prakt. Dispersion 55-60 % in Öl

Merck, zur Analyse, wasserfrei

über Natriumhydrid destilliert

gesättigte wässrige Lösung von NaH„P0.

Fluka, purum, 20 % in Toluol

Fluka, puriss. p.a., dest. über KOH

Merck, zur Analyse, mind. 37 %

Merck, zur Analyse, 95-97 %

destilliert (zur Chromatographie)Merck, zur Analyse

Fluka, puriss. p.a., zwei- bis dreimalüber Kalium destilliert

Merck Sharp & Dohme, Canada, Isotopen¬reinheit 99,8 %, vor Gebrauch durch AloxW 200 filtriert

Hexadeuteroaceton Fluka, puriss., 99,5 Atom-% D

Tetradeutero-

methanol

Tetramethylsilan

Merck, Methanol d4, Deuterierungsgradmind. 99,5 %, Uvasol

Ciba-Geigy, mind. 99,8 %, GC

- 75 -

4.3. Messung und Darstellung der analytischen Daten

Prof. J.F.M. Oth hat mir in grosszügiger Weise das ÜV/VIS/NIR-

Gerät Cary-17 sowie die für die Untersuchung der RC benötig¬

ten Zusatzapparaturen zur Verfügung gestellt. Ich möchte ihm

an dieser Stelle dafür herzlich danken.

Für die Aufnahme der MS-Spektren danke ich Herrn Prof. J.

Seibl und Frau L. Golgowski, für die IR- und UV/VlS-Spektren

(Cary-14) den Herren R. Dohner und H. Hediger.

Besonderen Dank schulde ich Frl. B. Brandenberg und Herrn

1 13K. Hiltbrunner für die Aufnahme der H- und C-NMR-Spektren.

Ihre Hilfsbereitschaft waren mir bei der Ausführung meiner

Arbeit von grossem Nutzen.

Herrn Dr. A. Thoma danke ich für die Aufnahme der CD-Spektren.

Schmelzpunkte

-2

Porphyrinderivate in abgeschmolzenen Röhrchen (ca. 10 Torr),

übrige Substanzen in offenen Kapillaren in einer Apparatur

nach Dr. Tottoli bestimmt, nicht korrigiert.

Elementaranalysen

Mikroanalytisches Laboratorium der ETH Zürich. Herrn D.

Manser danke ich für die Ausführung.

H-NMR-Spektren

Aufgenommen auf einem VARIAN Spektrometer HA-100 oder XL-100

(100 MHz). Gelegentlich erwähnte Routinespektren wurden auf

einem HITACHI PERKIN-ELMER R 24 A (60 MHz) gemessen.

- 76 -

Die chemischen Verschiebungen 6 in ppm beziehen sich auf

Tetramethylsilan als internen Standard. Der Signaltyp wird

bezeichnet mit: s = Singlett, d = Dublett, t = Triplett, q =

Quartett, bs = verbreitertes Singlett, b = breites Signal von

komplexer Struktur, Kopplungskonstanten J sind in Hertz ange¬

geben. Die Integrale bestimmte man durch elektronische Inte¬

gration und normierte durch Aufsummieren der Signalflächenund Division durch die insgesamt erwartete Protonenzahl.

Die in den tabellarisch wiedergegebenen Spektren durch ein¬

gerückte 6-Werte bezeichneten Signale wurden den entsprechen¬den epimeren Verbindungen zugeordnet.

C-FT-NMR-Spektren

Aufgenommen auf einem VARIAN-Spektrometer XL-100. Die ange¬

gebenen chemischen Verschiebungen (6-Werte) aus den breit-

bandentkoppelten Spektren beziehen sich, falls nicht anders

spezifiziert, auf Tetramethylsilan als internen Standard. Die

Multiplizitäten der Signale aus den off-resonance-entkoppel-ten Spektren sind bezeichnet mit: S = Singlett, D = Dublett,T = Triplett, Q = Quartett. Unsichere Zuordnungen sind mit

einem Fragezeichen versehen.

Die Messung sämtlicher Porphyrinderivate erfolgte in einer

10 mm-Mikrozelle (Inhalt: 1 ml), die in der Dry-Box abge¬füllt wurde. Trotz möglichst dichtem Verschliessen der Probe

war es nicht immer möglich, Luftzutritt und damit Allomeri-

sierung der metallhaltigen Verbindungen vollständig zu ver¬

hindern.

Massenspektren

Aufnahmen auf einem Massenspektrograph Hitachi RMU 6M.

Direkte Probenzuführung bei der jeweils angegebenen Einlass¬

temperatur, lonisierungsenergie 70 eV.

-II-

IR-Spektren

Aus PERKIN ELMER Gitterspektrographen PE 125, PE 257 oder

PE 283 gemessen. Konzentrationsangaben in Gewichtsprozent

(mg/100 yl), die Schichtdicken sind jeweils angegeben. Ban¬

denlagen in cm .Die abgeschätzten Bandenintensitäten wur¬

den mit s = stark, m = mittel, w = schwach, Seh = Schulter

bezeichnet.

CD-Spektren

Aufgezeichnet auf einem Dichrographen JOBIN-YVON MARK III.

Bereich 750 bis 230 nm, Bandbreite 2 nm, Aufnahmegeschwin¬

digkeit 6 nm pro Min., Schichtdicke 1 cm. Angaben von Ae in

l'Mol •cm

Vor und nach der Aufnahme der CD-Spektren wurde jeweils das

UV/VIS-Spektrum der Probe gemessen.

UV/VIS-Spektren

Für die Messungen standen die unten aufgeführten Spektrophoto-

meter zur Verfügung. Aufnahmen auf Cary 14 oder Cary 17, so¬

fern bei den Spektren gegenteilige Angaben fehlen.

PERKIN-ELMER PE 402:

Für qualitative Routineaufnahmen.

Aminco-Spektrophotometer DW 2:

Für die Aufzeichnung der Spektren der Zwischenprodukte beim

Magnesiumeinbau im Wellenlängenbereich von 300 bis 800 nm.

Bandbreite 3 nm.

Cary 14:

Für analytische Spektren.

- 78 -

Cary 17:

Die Untersuchung der Reaktionszentren (RC) wurde auf einem

Cary-Spektrophotometer Modell 17 durchgeführt. Für die Unter¬

suchung der chemischen Oxidation der RC verwendete man je nach

Konzentration Zellen mit Schichtdicken von 10, 1 oder 0,2 mm.

Die Untersuchung der lichtinduzierten Ausbleichung (Cary 17)

erfolgte in 10 mm-Fluoreszenzzellen. Die verwendete Seiten¬

beleuchtungseinrichtung war von Prof. J.F.M. Oth gebaut wor¬

den (Abb. 11): Die Lichtquelle bestand aus einer 200 W

Quecksilber-Höchstdrucklampe (Osram HBO 200 W) und einem

Gitter-Monochromator (Bausch & Lomb, 200-700 nm, 1200 Kerben

pro mm). Zur Bestrahlung verwendete man die Emissionsbanden

bei 368 und 690 nm. Zudem wurden Versuche unternommen, bei

denen man mit dem gesamten Wellenlängenbereich der Lichtquel¬le oberhalb 540 nm oder 610 nm einstrahlte. Als Filter dien¬

te eine gesättigte wässrige Kaliumbichromatlösung (Schicht-

-3dicke 1 cm, Transmission T = 0,5 bei 560 nm, T < 10 unter¬

halb 540 nm) bzw. zusätzlich ein rotes Farbglasfilter mit

einer Absorptionskante bei 6 30 nm (Spindler & Hoyer, RG 6 30,T = 0,5 bei 630 nm, T < 10~3 unterhalb 610 nm).

Die in einem Quarzkryostaten fixierte Fluoreszenzküvette konn¬

te mit kaltem Stickstoff (eisgekühlter Wärmeaustauscher) ge¬kühlt werden. Da sich die Referenzküvette nicht kühlen liess,glichen sich die Absorptionen von H„0 nicht vollständig aus.

Dieser Effekt wurde in den abgebildeten Spektren durch Sub¬

traktion der experimentellen Basislinie korrigiert.Das (für Tieftemperaturmessungen benötigte) Spiel der UV-Zelle

erlaubte eine geringe Drehung der Küvette, so dass durch Re¬

flexion und Streuung eine Verschiebung der Basislinie möglichwar. Um diesen Effekt auszugleichen, wurde diese Verschiebungelektronisch so kompensiert, dass der isosbestische Punkt

bei 930 nm erhalten blieb.

Um Streulichtfehler möglichst klein zu halten, verwendete man

bis ca. 325 nm den IR-Detektor (Bleisulfidzelle, die geringe

- /y -

L1

Abb. 11: Schema der Seitenbeleuchtungsapparatur

LI: Lichtquelle des Messgerätes

L2: Lichtquelle der Seitenbeleuchtung(Osram HBO 200 W)

Ml: Monochromator des Messgerätes

M2: Monochromator bzw. Filterkombination der

Seitenbeleuchtung

K: Quarzkryostat mit Probenküvette

-3F: Gelbes Farbglasfilter (T < 10 unterhalb

480 nm), verwendet beim Belichten mit 368 nm

D: Detektor

-3

Empfindlichkeit des Detektors gestattet eine hohe Intensität

des Messstrahls). Zur Vermeidung der Streulichteffekte beim

Beleuchten mit 368 nm wurde ein gelbes Farbglasfilter (T < 10

unterhalb 480 nm) in Mess- und Referenzstrahl eingesetzt; beim

Ein- bzw. Ausschalten der aktinischen Lichtquelle ergab sich so

keine Änderung der Basislinie mehr.

Beim Beleuchten bei 690 nm trat auch ohne Filter infolge der

geringen Intensität des eingestrahlten Lichtes keine Verschie¬

bung der Basislinie auf.

Beim Bestrahlen mit dem gesamten Wellenlängenbereich oberhalb

540 nm bzw. 610 nm konnte infolge der grossen Intensität des

- 80 -

Streulichts verglichen mit derjenigen des Messstrahls das

Spektrum nicht gleichzeitig aufgezeichnet werden. In diesen

Fällen wurde die Messung unmittelbar (ca. 3 Sek.) nach Be¬

leuchtung mit grosser Bandbreite unter Einstrahlung bei 690

nm durchgeführt.

4.4. Dry-Box

Für die Arbeiten unter Inertgas stand eine Dry-Box der

Vacuum Atmospheres Company, Los Angeles zur Verfügung (Dry-Lab DL 001-S-P/Dry-Train HE 493); Stickstoffatmosphäre, ge¬schätzter Sauerstoffgehalt < 5 ppm.

Sämtliche in der Dry-Box verwendeten Lösungsmittel wurden

unmittelbar nach der Destillation durch Einfrieren entgast.Dafür verwendete man einen Kolben mit Kernschliff und Tropf¬spitze und einen Hahnen mit Hülsenschliff (Abb. 12), um so

das Eindringen von Schliffett in die Lösungsmittel zu ver¬

hindern. Aceton und Wasser wurden im HV bei RT destilliert

und in einem mit flüssigem Stickstoff gekühlten Kolben aufge¬fangen (Abb. 13) und anschliessend durch Einfrieren entgast.

Sämtliche für analytische Zwecke verwendeten Lösungen von

metallhaltigen Porphyrinderivaten (ausser für HPLC) wurden in

der Dry-Box hergestellt und abgefüllt. Das für die Trocknungvon Lösungsmitteln verwendete Alox brachte man unmittelbar

vor Gebrauch in die Dry-Box, um den Kontakt mit den Lösungs¬mitteldämpfen in der Stickstoffatmosphäre möglichst kurz zu

halten. Das Alox adsorbierte jedoch immer Lösungsmitteldämpfe(vor allem CH„Clp), die dann mit den zu trocknenden Lösungs¬mitteln von der Säule gewaschen wurden. Daher gelang es nie,

NMR-Lösungen in CDC1., in der Box so herzustellen, dass in den

Spektren kein Methylenchloridsignal sichtbar wurde.

- 81 -

HV

Abb. 12 Abb. 13

Zentrifugieren:

Alle Proben wurden ausserhalb der Dry-Box auf einer Labor¬

zentrifuge (ca. 2500 U/Min.) während mindestens 15 Min. zen-

trifugiert. Dazu wurden die Zentrifugengläser mit einer Se¬

rumkappe dicht verschlossen. Nach dem Zentrifugieren wurden

-3sie in einem evakuierten Glasrohr (< 2-10 Torr) wieder in

die Dry-Box zurückgebracht.

- 82 -

4.5. Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie

Die verwendete Apparatur wurde von Dr. J. Schreiber entworfen

und gebaut. Für seine Hilfe und seine praktischen Ratschlägemöchte ich ihm nochmals herzlich danken.

Die Apparatur sei kurz durch die folgenden Angaben charakte¬

risiert; eine ausführliche Darstellung findet man in [2 9].

Säulendimensionen:

Adsorbens:

mobile Phasen:

System I

System II

System III

Druck:

Flussrate:

Detektoren:

7 x 24 0 nm

Partisil 5: gepackt nach der 'slurry-

packing' Methode

22)Pentan/CH2C12100:20:2,25:0,1

/DME/HMPA

22)/DME/HMPA/H 0Pentan/CH2C1?

100:20:2:0,1:0,025

Pentan/CH Cl /CH CN

100:40:20

35-45 atm; gemessen zwischen Pumpe und Säule

70-100 ml/h; die Flussrate ist bei den be¬

schriebenen Chromatogrammen jeweils angegeben

Laboratory Data Control, UV-Monitor,23)

Detektorwellenlänge 280 nm

(LDC-Detektor)

PERKIN-ELMER LC-55 Spektrophotometer

Detektorwellenlänge variabel, meistens ver¬

wendete Wellenlänge 280 nm (PE-LC-55)

22) Für die Trennung von magnesiumhaltigen Derivaten ist es unumgänglich,stets frisch über Alox filtriertes Methylenchlorid einzusetzen. Schonnach einmaliger Verwendung von unbehandeltem Methylenchlorid mussteeine deutliche Qualitätsverminderung der Säule festgestellt werden.Im Chromatogramm wurde eine Verunreinigung festgestellt, deren Peak-form auf die Entstehung während der Chromatographie hinwies.

- 83 -

^)

0 J

V t„-tR o

to

to

Auswertung der Chromatogramme

theoretische Bodenzahl N

Kapazitätsverhältnis k' =

t = Retentionszeit der KomponenteR

t = Totzeit; gemessen als Retentionszeit von Pentan

a = Standardabweichung der Gausskurve

halbe Signalbreite in 60 % Peakhöhe

Die Retentionszeiten hängen im wesentlichen von der Flussge¬

schwindigkeit und der Zusammensetzung der mobilen Phase, so¬

wie in geringerem Mass von der Temperatur ab. Auch bei kon¬

stanter Zusammensetzung der Lösungsmittel (gleiche Charge)

und unverändertem Hubraum der Pumpe gelang es normalerweise

nicht, eine Konstanz der Retentionszeiten über einige Stunden

24)zu erhalten (Abweichungen bis ca. 5 %) .

Man chromatogra-

phierte deshalb am Anfang und Ende einer Trennserie Phäophy-

tin a (Epimerengemisch) als Referenz.

Durch Aufzeichnung der optischen Dichte in Abhängigkeit der

Zeit (und damit des Elutionsvolumens) wurde die quantitative

Zusammensetzung der Proben unter folgenden Annahmen ermittelt:

23) Infolge der benützten Zellenkonstruktion reagiert der Detektor auch

auf Unterschiede in den Brechungsindices. Es werden deshalb teilweise

auch Substanzen, die im verwendeten Wellenlängenbereich nicht absor¬

bieren, sowie Druckunterschiede angezeigt.

24) Mögliche Ursachen: Temperaturunterschiede oder wahrscheinlicher sehr

langsame Einstellung des Gleichgewichtes des Wasser- oder HMPA-Ge-

haltes zwischen stationärer und mobiler Phase.

- 84 -

1. Die Flächenintegrale wurden durch das Produkt von Peak-

höhe und Halbwertsbreite approximiert. Wenn die Halbwerts¬

breite der Epimeren infolge der geringen Konzentration

nicht ausgemessen werden konnte, setzte man einen aus meh¬

reren Messungen gemittelten Wert für das Verhältnis der

Halbwertsbreiten ein:

(Chi a)/(Chl a1) =1,3

(Phäo a)/(Phäo a') = 1,1

(Chi a)/(Phäo a) =1,4

2. Die molaren Extinktionskoeffizienten der metallhaltigenDerivate (Chi a, Chi a' und Allomere) unterscheiden sich

höchstens geringfügig und wurden für die Berechnung als^ 4.- u u 25)identisch angesehen

Entsprechendes gilt für die metallfreien Derivate

3. Das Verhältnis der Extinktionen von Phäophytin a und Chlo¬

rophyll a wurde durch die Auftrennung eines Gemisches be-

27)kannter Zusammensetzung ermittelt. Ein Teil einer Lö¬

sung aus 790,6 ug Phäophytin a (0,907 yMol) und 942,2 yg

Chlorophyll a (0,977 yMol) (beides Epimerengemische; die

Flächen der Epimerensignale wurden zu denjenigen der

Hauptpeaks addiert) ergaben Signale mit den Flächenver¬

hältnissen

0,715 : 1 (PE-LC-55; 280 nm; vgl. Abb. 14)

0,676 : 1 (LDC-Monitor; 280 nm)

25) Die gute Übereinstimmung der qualitativen UV/VIS-Spektren zwischenChi a und Chi a' (vgl. auch [l63j und Q?28j und zwischen Chi a undden Allomeren (vgl. z.B. [229J, S. 91) lassen grosse Unterschiede derExtinktionskoeffizienten unwahrscheinlich erscheinen.

26) Qualitativ gute Übereinstimmung der UV/VIS-Spektren zwischen Phäo aund Phäo a' (vgl. Fussnote 36)) sowie zwischen Methylphäophorbid a

(20) und 132-Methoxy-methyl-phäophorbid a (vgl. S. 130 bzw. [230]).27) Infolge der grossen Bandbreite des Messstrahls kann nicht einfach

der molare Extinktionskoeffizient bei 280 nm eingesetzt werden.

- 85 -

Daraus errechnet man ein Verhältnis der "Aquivalentflachen"

von Phäophytin a zu Chlorophyll a von:

1 : 1,11 für den PE-LC-55

1 : 1,37 für den LDC-Monitor

Die Trennleistung sei anhand der Auftrennung des Standardge¬

misches aufgezeigt (Abb. 14)

System II; 72,8 ml/h; PE-LC-55

N'R

k'

A Phäo a' 9025 9,5' 0,75

B Phäo a 9112 10,5' 0,94

C Chi a" 9757 12,1' 1,23

D Chi a 10845 15,1' 1,75

B D

0 10 20 30 Min.

Abb. 14: Chromatogramm einer Mischung aus Phäophytin a',

Phäophytin a, Chlorophyll a' und Chlorophyll a

(Molverhältnis der metallfreien zu den metallhal¬

tigen Derivate 1:1,08), System II

- 86 -

5.1.

CHLOROPHYLL A-DERIVATE

Reinigung von Phäophytin a

Pflanzenextrakt

1R + IS

C55H74N4°5871,22

5.1.1. Chromatographie des Pflanzenextraktes [101,231]

2 8)Als Ausgangsmaterial stand ein roher Spinatextrakt zur

Verfügung, der neben Phäophytin a und Phäophytin b noch ge¬ringe Mengen Carotinoide, farblose Verunreinigungen und allo-merisierte Derivate enthielt.

50 g Extrakt wurden an 2,5 kg Kieselgel (aufgezogen in CCl.)getrennt: Säule: 10 cm x 80 xm, Extrakt in ca. 200 ml CH-Cl«

28) Herrn Prof. Dr. H.H. Inhoffen danken wir für die Überlassung einergrösseren Menge dieses Extraktes. (Ursprung: Sandoz AG Basel,Dr. A. Stoll).

- 87 -

aufgetragen; eluiert mit CC1./Aceton 95:5; Tropfgeschwindig-

keit ca. 200 ml/h.

Die Chromatographie wurde vorsichtshalber im Dunkelraum aus¬

geführt. Die einzelnen Fraktionen untersuchte man mittels

UV/VIS-Spektroskopie und DC auf Kieselgel. Die schwach ge¬

färbten Carotinoide wurden praktisch mit der Front eluiert.

Von den nachfolgenden Porphyrinderivaten zeigte Phäophytin a

(_1) den grossten Rf-Wert. Es wurde praktisch quantitativ,

mit wenig Mischfraktionen, von den übrigen Derivaten abge¬

trennt. Nach Elution des Phäophytins a konnten auf der Säule

keine getrennten Zonen mehr gesehen werden; man erhielt auch

keine einheitlichen Fraktionen mehr. Als zweites Hauptprodukt

fiel Phäophytin b an, das aber in allen Fraktionen noch von

weiteren farbigen Substanzen begleitet war.

Die laut DC nur schwach verunreinigten Fraktionen von Phäo¬

phytin a (_1) wurden vereinigt, am RV eingeengt und während

2 4 Stunden am HV bei RT getrocknet. 2 0,1 g (40 %) Phäophytin

a blieb als violettblaue, klebrige, schmierige Masse. Misch¬

fraktionen, die hauptsächlich 1. enthielten (4,3 g), wurden

später für die Umesterung zu Methylphäophorbid a (2_0) ver¬

wendet.

Die Phäophytin b-Fraktionen wurden ebenfalls vereinigt und am

HV getrocknet. Es blieben 9,1 g = 18,2 % einer an Phäophytin

b (1_6_) angereicherten braunen, klebrigen Masse.

Phäophytin a-Fraktionen:

DC: Kieselgel, Methylenchlorid/Acetonitril 95:5

Rf = 0,62, sehr schwache Verunreinigungen zwischen

0,7 und 0,5 erkennbar 29)

29) Die sehr schwachen Substanzflecken sind nur wegen ihrer tiefroten

Fluoreszenz unter der UV-Lampe (366 nm) deutlich erkennbar

- 88 -

Kieselgel, Methylenchlorid/Aceton 95:5Rf = 0,63, sehr schwache Verunreinigungen haupt¬sächlich bei Rf = 0,55 29)

Kieselgel, Hexan/Aceton 70:30Rf = 0,41, geringe Verunreinigung bei Rf = 0,35 29)

UV/VIS: Methylenchlorid, qualitativ auf PE 402

Amax: 667 (0,43), 610 (0,08), 537 (0,09)507 (0,10), 414 (1,00)

HPLC:- System I, 80 ml/h, LDC-Monitor

t^ in Min., (relative Peakhöhe ou')

4,1 (0,5), 4,4 (0,6), 4,7 (0,7), 5,1 (0,3), 5,7 (0,2),8,1 (0,8), 9,4 (0,4), 9,9 (25,8; IS), 11,0 (2,3),11,6 (100,0; 1R), 14,1 (0,4)

Aus den angegebenen Werten errechnet man ein Ver¬hältnis von Phäo a' zu Phäo a von 19:81.

Phäophytin b-Fraktionen:

DC: Kieselgel, Methylenchlorid/Acetonitril 95:5Rf = 0,57, Hauptverunreinigungen bei 0,45 und 0,39

Kieselgel, Methylenchlorid/Aceton 95:5Rf = 0,57, Hauptverunreinigungen bei 0,5 und 0,46

Kieselgel, Hexan/Aceton 70:30Rf = 0,39, Hauptverunreinigung bei 0,3

UV/VIS: Methylenchlorid, qualitativ auf PE 402

Ämax: 655 (0,20), 600 (0,05), 554 (0,05),525 (0,07), 439 (1,00), 417 (0,40)

5.1.2. Vorversuche zur Reinigung der Phäophytin a-Fraktionen

HCL-Fraktionierung [12 9] :

106,9 mg Phäophytin a wurden in 150 ml Äther (entgast durch

Einleiten von Argon während 10 Min.) gelöst. Anschliessend

30) Da die Strukturen und damit auch die Absorptionskoeffizienten der

Verunreinigungen nicht bekannt sind, können die Mol-Verhältnissenicht ermittelt werden. Man beschränkte sich deshalb auf die An¬gabe der relativen Höhe der Peaks.

- 89 -

extrahierte man nacheinander je zweimal mit 30 ml 20, 22,

24, 26, 28, 30 und 31,8 proz. wässriger Salzsäure (ätherge¬

sättigt bei 0° C). Die entsprechenden salzsauren Phasen wur-

31)den vereinigt und auf je 240 ml eisgekühlte Pufferlösung

gegossen, diese mit je 150 ml Äther ausgezogen, die organi-31)

sehen Phasen nochmals mit 100 ml Pufferlösung gewaschen,

mit Na„SO getrocknet und eingeengt.

Keine der 7 Fraktionen war DC-rein (Kieselgel, Hexan/Aceton

80:20). Die Verunreinigungen hatten sich zwar in den ersten

Fraktionen angereichert, in den Fraktionen mit höherer Salz¬

säurekonzentration trat jedoch im Dünnschichtchromatogramm

ein "Startfleck" (wahrscheinlich durch Hydrolyse des Esters

entstandenes Phäophorbid a) auf. Die Ausbeuten und die Er¬

gebnisse der HPLC-Analysen sind in Tabelle 5 zusammengefasst.

Die Fraktionen mit 2 0 und 22 Prozent HCl sowie die Äther¬

fraktionen waren fast farblos und wurden nicht untersucht.

Tabelle 5: Ergebnisse der HCl-Fraktionierung (HPLC, System I

LDC-Monitor; relative Höhe)

t 24 % 26 % 28 % 30 % 31,8 % HCl-Konz.K.

(Min.) 2,5 mg 6,8 mg 21,8 mg 35,0 mg 28,6 mg Menge

5,3 13,7 0,2 - 0,9 -

7,4 3,2 0,2 - - -

8,2 1,7 2,2 1,1 0,6 0,3

9,0 0,2 0,1 - - -

9,5 - 0,3 - - 0,3

10,0 40,4 49,7 35,2 28,9 21,6

11,0 3,6 3,9 2,3 2,0 1,3

11,7 100 100 100 100 100

13,5 1,2 - - - -

14,2 0,7 0,7 - 0,4 0,6

31) Phosphatpuffer, 1:1 mit HO verdünnt.

- 90 -

Säulenchromatographie:

Vorversuche zu einer nochmaligen Säulenchromatographie an der

230-fachen Menge Kieselgel mit Hexan/Aceton 80:20 oder an der32)250-fachen Menge Lichrosorb 10 mit Pentan/Aceton 85:15

unter Zusatz von BHT als Antioxidans ergab nur einzelne Frak¬

tionen mit weitgehend reinem Material in geringer Ausbeute.

Da es aussichtslos schien, die Hauptverunreinigung (HPLC:t = 11,0 Min., vgl. Tab. 5) abzutrennen, wurden keine weite¬re

ren Versuche in dieser Richtung unternommen.

Umfallen:

Die diversen Versuche zur Reinigung von Phäophytin a wurden

nach der folgenden allgemeinen Vorschrift ausgeführt: Je ca.

33)100 mg Phäophytin a wurden in Lösungsmittel 1 in einem

50 ml-Birnkolben mit Zweihalsaufsatz, Hahn mit Argonballonund Glasstopfen bzw. Serumkappe (vgl. Abb. 18, S. 108) in der

Wärme gelöst. Unter stetigem Erwärmen spritzte man das Lö-33)

sungsmittel 2 langsam zu und liess dann die Lösung auf RT

abkühlen. Anschliessend filtrierte man unter Stickstoff durch

eine Nutsche D 3, trocknete den Rückstand am HV bei RT und

untersuchte Festkörper und Mutterlauge mittels HPLC. Die Be¬

dingungen sind in Tabelle 6 zusammengefasst und die Resul¬

tate der HPLC-Analysen in Tabelle 7 zusammengestellt.

32) Merck, Lichrosorb Si 60, mittlere Korngrösse 10 \m (Kieselgel).

33) Durch Einleiten von Argon während ca. 15 Min. von Sauerstoff weit¬gehend befreit.

- 91 -

Tabelle 6: Bedingungen zum Umfallen des Epimerengemisches

von Phäophytin a

Nr,

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Menge Lm 1 Lm 2 Ausb. Bern.

110.2 mg

109.3 mg

99,0 mg

104.4 mg

109.3 mg

97,2 mg

102,2 mg

104.4 mg

9 2,3 mg

12 0,1 mg

4 0,6 mg

6 2,3 mg

5 ml CH Cl

5 ml

7 ml

3 ml

3 ml

3 ml

3 ml

3 ml

3 ml

3 ml

3 ml

3 ml

CH2C12

CH2C12Aceton

Aceton

CHC1

EtOAc

Et20

C2H4C12

CH2C12Aceton

CH„C1„

25 ml MeOH

25 ml

20 ml

30 ml

10 ml

30 ml

30 ml

20 ml

30 ml

30 ml

30 ml

30 ml

Hexan

MeOH

MeOH

H20MeOH

MeOH

MeOH

MeOH

CH CN

CH CN

EtOH

62 mg

74,7 mg

quant.

57,0 mg

61,6 mg

65,2 mg

4 7,3 mg

26,4 mg

19,0 mg

17,2 mg

N 1

N 2 a)

b)

b)

c)

d)

e,d)

f,g)

Bemerkungen;

a) Nach dem Abfiltrieren ausgefallenes Produkt.

b) Es bildete sich auch nach einigen Stunden bei 4 C kein

Niederschlag.

c) Die Pigmente wurden fast quantitativ gefällt, die über¬

stehende Lösung war nur noch schwach gefärbt.

d) Die Fällung der Farbstoffe wurde erst durch partielles

Einengen der Lösung am WV erreicht.

e) Die Mutterlauge aus Versuch 7 wurde als Ausgangsmaterial

eingesetzt.

Niederschlag aus Versuch 8 diente als Ausgangsmaterial.f)

g) T = 4° C statt RT.

2

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3

-Z6-

- 93 -

5.1.3. Präparative Fällung von Phäophytin a

1,876 g Phäophytin a wurden in einem 250 ml-Kolben mit Zwei-

34)halsaufsatz und Hahn mit Argonballon in 30 ml Aceton in

34)der Wärme gelöst. Man gab 100 ml heisses Methanol im Argon-

Gegenstrom zu und liess anschliessend langsam auf 4 C abküh¬

len. Der dabei gebildete, voluminöse, graubraune Niederschlag

wurde unter Stickstoff abfiltriert. Die beschriebene Fällung

wurde zweimal wiederholt. Man trocknete den amorphen Nieder¬

schlag während 2 Tagen am HV bei RT und erhielt eine etwas

spröde violettblaue Masse (Fraktion I).

Die Mutterlaugen der drei Fällungen wurden vereinigt, am RV

eingeengt und am WV kurz getrocknet. Anschliessend fällte man

wie beschrieben noch einmal aus 10 ml Aceton und 30 ml Methanol

um (Fraktion II).

Die Mutterlauge dieser letzten Fällung ergab beim Einengen

ein graubraunes, hochviskoses Gemisch.

Der Reinigungseffekt wurde anhand HPLC und VIS-Spektroskopie

ermittelt:

Laut HPLC zeigte sich vor allem eine sehr starke Zunahme des

Allomergehaltes, sowie eine Anreicherung der Verunreinigungen

mit niedrigeren t -Werten als Phäo a1 in Fraktion II und vor

allem in der Mutterlauge.

In den VIS-Spektren manifestierte sich der in Fraktion II und

in der Mutterlauge stark erhöhte Gehalt an farblosen (wahr¬

scheinlich phytolähnlichen) Verunreinigungen in einer starken

Abnahme der relativen Extinktionen.

Fraktion I: 1,142 g (60,9 %)

UV/VIS: 393,5 yg in 50 ml Äther*, c = 7,87 mg/1

E(668) = 0,474 (60,3 1/g) ,definiert als 100 %

E(409,5) = 0,960 (122,0 1/g), definiert als 100 %

34) entgast durch mehrmaliges Absaugen am WV.

- 94 -

Fraktion II: 0,392 g (20,9 %)

UV/VIS: 296,8 yg in 50 ml Äther*, c = 5,94 mg/1E(668) = 0,323 (54,4 1/g), entspr. 90,3 %E(409,5) = 0,654 (110,2 1/g), entspr. 90,3 %

Mutterlaugen: 0,225 g (12,0 %)

UV/VIS: 464,0 yg in 50 ml Äther*, c = 9,28 mg/1E(668) = 0,305 (32,9 1/g), entspr. 54,6 %E(409,5) = 0,626 (67,5 1/g), entspr. 55,3 %

Die angegebenen Prozentzahlen beziehen sich auf den Gesamt¬

gehalt an Phäophytin a-Derivaten (inkl. Allomer; Annahme:

e(Allomer) = e (Phäo a)).

HPLC; System I, 80 ml/h, LDC-Detektor: Tabelle 8

Tabelle 8

t (Min.) Frakt. I

relative Peakhöhe

Frakt. II Mutterl.

4,4 0,5 - 1,6

4,6 0,5 0,7 2,3

5,0 -- 4,4

5,5 -- 1,4

6,1 -- 0,9

6,8 -- 0,7

8,8 1,0 0,1 0,5

10,1 0,7 1,1 0,7

10,7 39,6 41,1 46,5 Phäo a,36)11,6 1,9 2,5 2,8

35)

12,3 100 100 100 Phäo a36)

12,8 -- 3,7

15,2 1,2 5,0 11,6 Allomere

32,3 -- 0,9

Für Frakt. I ergibt sich ein Molverhältnis von

Phäo a zu Phäo a1 von 7 3,5 zu 2 6,5

- 95 -

5.1.4. Analytische Daten von Phäophytin a (Fraktion I,

Epimerengemisch/ 1R _£_ LS - 73,5 : 26,5)

Smp. 123-125o

DC29)

bei 0,30

Silgur: Hexan/Aceton 70:30

Rf = 0,40; schwache Verunreinigung

Kieselgel: Methylenchlorid/Aceton 95:5

Rf = 0,35; schwache Verunreinigung 29) kej_ o,27

Kieselgel: Hexan/Aceton 70:30

Rf = 0,35; schwache Verunreinigung29)

bei 0,27

HPLC: Tabelle 8, vgl. auch Abb. 26, S. 124

UV/VIS: 324 ug in 50 ml, c = 7,44-10~ Mol/1

Dioxan* 669 (52'200), 631,5/min (4'400), 611 (8'100),

581/min (1'700), 559 (3'400), 551/min (2'800),

537 (9'900), 524/min (4'700), 506 (11'800), 483/min

(4'200), 471,5 (4*300), 455/min (3'300), 412

(HO'100), 400/Sch (92'100), 380/Sch (60*900),

330/min (19*600), 323,5 (20'600), 295/min (12'400),

274 (15*900), 260/min (15*200)

35)

36)

Bei dieser Verunreinigung handelte es sich nicht, wie ursprünglich

vermutet, um Pyrophäophytin a: 10 mg 1_ (gefällt) wurden in 3 ml

Collidin während 15 Min. am Rückfluss gekocht. (Bedingungen für die

Decarboxylierung von Methylphäophorbid a (20) optimiert.) Nach Auf¬

arbeiten isolierte man ein Produkt mit folgenden Eigenschaften:

DC:

IR:

Kieselgel; Hexan/Aceton 80:20

Hauptfleck Rf = 0,31, schwache Verunreinigungen bei 0,26 und

0,19 (vgl. 1_: Rf = 0,26)

(PE 257, CHCl3): Gleiche Bandenlagen wie _1_. Das IR-Spektrum

unterscheidet sich von demjenigen von 1_ hauptsächlich durch die

stark verminderte Intensität der Bande bei 1723 nm (ca. 60 %)

HPLC: System I, LDC-Monitor (vgl. auch Tabelle 8) t in Min. (rel.

Peakhöhe): 8,8 (0,5), 10,7 (100,0), 11,6 (1,3?, 15,2 (0,5).

Pyrophäophytin a wird mit der gleichen Retentionszeit eluiert

wie 1S_ (Mischchromatogramm) .

Die VIS-Spektren der beiden durch HPLC getrennten Epimeren Phäo a

und Phäo a' sind praktisch deckungsgleich:

Xmax

664 (0,49), 608 (0,07), 534 (0,08), 506 (0,10), 410 (1,00)

- 96 -

378,5 yg in 50 ml, c = 8,69-10~6 Mol/1 (Abb. 1, S. 36)

Äther* 667,5 (52'700), 629,5/min (4'100), 609,5 (7'800),580,5/min (1'600), 559,5 (2'900), 547,5/min (2'200),533 (lO'lOO), 521,5/min (4'500), 504,5 (11'700),481/min (3'800), 470 (4'100), 452/min (3'100), 408,5(106'500), 398/Sch (92'600), 377,5/Sch (61'600), 328/min (18'000), 320 (19'200), 290,5/min (9'600), 273(10'600), 264,5/min (lO'OOO)

IR: 5 %, 0,1 mm (Abb. 15)

CHC1., 3390w, 3030w, 3005w, 2960s, 2930s, 2870m, 1735s,1700s, 1620m, 1583w, 1555m, 1540Sch, 1500m, 1465w,1452m, 1437m, 1410w, 1400w, 1380w, 1367m, 1348m,1295m, 1165m, 1122m, lllOw, 1091w, 1058w, 1033m,985m, 970Sch, 925Sch, 910w, 897w, 853w, 841w, 820w

"H-NMR: 0,09 Mol/1

ppm

in CDC1 * (Abb. 16)

Anz. Protonen

beob. theor.

9,32

9,28

s

0,7 H (1 H) HC-10

9,14

9,10

s

0,8 H (1 H) HC-5

8,50

8,44

s

0,7 H (1 H) HC-20

7,81 d- d (J= 18 ;12) 0,8 H (1 H) HC-317,20

CHC136,25

6,14

s

2,7 H(1 H) HC-132

6,14 d- d (J=18 ;D (1 H) HzC-326,05 d- d (J=12 ;D

_ (1 H) HEC-325,0-5,3 b 1,3 H (1 Hl HC-P24,3-4,6 b (1 H) HC-184,56 d (J = 8) 3,1 H (2 H) H2C-P14,1-4,3 b (1 H) HC-173,87

3,82

s

2,9 H (3 H) H3CO-C-I333,61

3,57

s

7,5 H(3 H) H3C-I21

3,46 q (J = 7) (2 H) H2C-8l3,29 s (3 H) H3C-2I3,02 s 2,9 H (3 H) H3C~7\1,7-2,8 b

9,3 H

(4

(2

H)

H)H2C-171,172H2C-P4

1,81 d (J = 7) (3 H) H3C-I811,58 t (J =7) (3 H) H3C-821,57 s 25,4 H (3 H) U3C-P3i0,9-1,5 b (19 H) H2C~P

,0,83

0,7-0,9

d

b

(J=6)~

11,9 H(6

(6

H)

H)H3C-P71,PlliH3C-P151,P16

0,44 b 1,7 H (1 H) HN-1,5

-1,7

b

b

~

1,3 H(1 H) HN

- 97 -

Die Signallagen stimmen mit den Literaturdaten [13 0"1

innerhalb 0,05 ppm überein. Nach Aufnahme des Spek¬

trums bestand die Lösung laut HPLC aus einem Epimeren-

gemisch .1R:.1S = 76,5:23,5. Die Integrale der Epimeren-

signale sind mit diesem Wert vereinbar.

C-NMR: 0,11 Mol/1 in CDC1-

189,5

172,8

172,0

169,5

161,1

155,3

150,7

149,5

144,8

142,7

141,8

137,8

136,2

135,9

131,6

128,8

122,4

117,7

105,1

104,1

97,2

92,9

78,2

76,9

75, 6

65,7

S C-13

S C-16, 173S C-19

S C-133S C-13

S C-6

S C-9

S C-14

S C-8

S C-P3

S C-l

S C-ll

S C-3

S C-4,C-7

S C-2

D+S C-31,C-12T C-32D C-P2

S C-15

D C-10

D C-5

D C-20

CDC1-

C-132 (2S)

64.6 D C-13

61.4 T C-Pl

52.7 Q CH30-C-13351.1 D C-17

50,0 D C-18

39,7 T C-P4

39.2 T C-P14

37,2 3?T C-P8,P10,P12

36.5 T C-P6

32.7 D C-Pll

32.5 D C-P7

31.2 T C-171

29.8 T C-172

27.8 D? C-P15

24.9 T C-P5

24.7 T? C-P13

24.3 T C-P9

23.0 Q C-P15,P16

22.6 Q C-181

19,6 2Q C-P71,P11119.1 T C-81

17.2 Q C-82

16,2 Q C-P31

11,9 2Q C-21,12110.8 Q C-71

Die Zuordnung der Signale erfolgte in Analogie zu den

publizierten Spektren von Methyl-phäophorbid a [131,34] und Phytylacetat [132].

4000 Vcm 500 400

Abb. 15: IR von Phäophytin a in CHCl.

- 98 -

Abb. 16: H-NMR von Phäophytin a in CDCl.

Analyse: CrrH_ .N.O.-55 74 4 5

ber. :

gef. :

C 75,82C 75,95

H 8,56 N 6,43 %

H 8,64 N 6,35 %

5.1.5. Epimerisierung von Phäophytin a

Zur Bestimmung der Epimerisierungsgeschwindigkeit und der

Gleichgewichtslage wurden in der Dry-Box je ca. 1 mg _1 gelöst.Man engte die entnommenen Proben am WV rasch ein und untersuch¬

te sie anschliessend mittels HPLC. Im folgenden sind hinter

den Reaktionszeiten (bei RT) die entsprechenden Anteile von

IS an der Gesamtmenge (1R+1S) aufgeführt:

HPLC: System II, PE-1C-55 Detektor.

Epimerisierung in Aceton:5 Min. (25,6), 65 Min. (22,6), 225 Min. (18,5),8 1/2 h (16,7), 23 V2 h (16,3), 33 V2 h (16,2), 48(16,0), 57 V2 h (17,1), 198 h (16,2)Gleichgewicht: 1R:1S = 84:16

Epimerisierung in Äther15 Min. (26,7), 30 Min. (25,8) ,

60 Min. (26,1) ,120 Min. (25,4), 4 h (24,5), 8 VA h (23,6), 24 h(23,4), 48 h (21,7), 145 h (19,6), 224 h (19,7)360 h (21,4)

Gleichgewicht: 1R:1S = 80:20

- 99 -

5.2. Komplexierung von Phäophytin a zu Chlorophyll a

5.2.1. Versuche zur Komplexierung und Reinigung

Die Komplexierungsversuche von Phäophytin a (1R+1S) wurden nach

der folgenden allgemeinen Vorschrift ausgeführt; die Reaktions¬

bedingungen sind in Tabelle 9 zusammengestellt.

Ca. 50 mg _1 wurden in einem 25 ml-Kolben, versehen mit einem

Zweihalsaufsatz, Hahn mit Argonballon und Serumkappe (vgl.

Abb. 18, S. 108) in CH Cl gelöst und dann auf ca. 10-11° C

abgekühlt. Unter intensivem magnetischem Rühren wurde eine

0,2 bis 1,0 M Lösung "BHT-Magnesiumjodid"3 )

in Äther/CH Cl

zugespritzt und während der angegebenen Zeit gerührt. An¬

schliessend goss man die Lösung rasch auf ein eisgekühltes

Gemisch aus einem organischen Lösungsmittel (meist Äther) und

Phosphatpuffer (mit H_0 verdünnt), schüttelte, wusch die or¬

ganische Phase zweimal mit eisgekühltem H„0 und einmal mit

gesättigter Natriumchloridlösung, trocknete mit Na_S0., trenn¬

te einen Teil der Lösung für die UV/VIS-, DC- und HPLC-Unter-

suchungen ab und engte ein. Für Reinigungsversuche sublimier-

te man das BHT ab, bevor die Ansätze in die Dry-Box gebracht

wurden. Die Ansätze 14 bis 22 wurden nach der in 5.2.3. (S.

109) beschriebenen Vorschrift ausgeführt (Tab. 9).

Die UV/VIS-Spektren in Äther (Lage und Verhältnis der Extink¬

tionen) der Rohprodukte entsprachen den Literaturdaten [135] .

Durch Dünnschichtchromatographie (Silgur, Hexan/Aceton 70:30)

wurden normalerweise nur noch sehr geringe Mengen Edukt und

wenig Allomer neben ZR nachgewiesen. Bei raschem Arbeiten be¬

obachtete man höchstens einen schwachen Startfleck; während

der Trennung zersetzte sich die Probe nur sehr geringfügig.

37) BHT-Magnesiumjodid: Durch Umsetzung einer 1 bis 2,7 M ätherischen

Lösung von ÄthylmagnesiumJodid mit 1,1 Mol-Äquivalent Di-tert-butyl-

4-methyl-phenol in CH2C12 bei RT hergestellt und innerhalb 10 bis 45

Min. verwendet.

- 100 -

Die Resultate der HPLC-Untersuchungen sind in Tabelle 10 zu-

sammengefasst. Die darin oben genannten Retentionszeiten be¬

ziehen sich auf System I (LDC-Monitor; Ans. Nr. 1). Da die

Trennung nicht völlig befriedigte (E und F wurden nicht unter¬

schieden) , wechselte man im Laufe der Arbeit (ab Versuch 17)zu System II. Die unten aufgeführten Retentionszeiten bezie¬

hen sich auf System II (LDC-Monitor, 81 ml/h) und wurden für

Ansatz Nr. 21 gemessen.

Peak A stammt von BHT. Seine Höhe ist hauptsächlich von den

Trocknungsbedingungen abhängig und wurde deshalb nicht ausge¬messen. Bei Verbindung B handelt es sich um ein metallhalti¬

ges Chlorin, das in Lösung (unter Epimerisierungsbedingungen3 8)für ^S_ und _2R) nicht epimerisiert

. Es könnte sich, in Ana¬

logie zu dem von Isenring bei der Komplexierung von Methyl-39) 2phäophorbid a (2_0) gefundenen Nebenprodukt

, um 13 - (Di-

tert-butyl-4-methyl-phenoxy)-Chlorophyll a (BHT-Allomer) han¬

deln. Die Peaks C, D und E sind Verunreinigungen des Edukts

(t_, = 8,8, 10,1 bzw. 11,6 Min. in Tabelle 8), die beim Einbau

scheinbar weder komplexiert noch sonstwie verändert werden.

Peak G konnte aufgrund von Retentionszeit und Mischchromato-

gramm (Ans. Nr. 18) als LR identifiziert werden. Bei den Sub¬

stanzen F und H handelt es sich um Chi a' (^S_) bzw. Chi a (2R) .

Substanz I ist wahrscheinlich ein weiteres Allomer (neben B);38es zeigt ebenfalls das Spektrum eines metallhaltigen Chlorins

Bemerkungen zu einzelnen Ansätzen:

Sämtliche Reinigungsversuche wurden in der Dry-Box durchge¬führt. Man filtrierte das gelöste Rohprodukt jeweils mindestenseinmal durch Watte.

38) Vgl. Reinigungsversuch von Ansatz Nr. 5, S. 103.

39) Vgl. [lOl] ,S. 174.

- 101 -

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- 102 -

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CN

CN

- 103 -

1. Das Rohprodukt aus Ansatz 1 wurde in 5 ml Äther gelöst,

man gab 5 ml Hexan zu, unterschichtete mit 1 ml H„0 und

liess langsam eindunsten. Innerhalb von 2 Tagen bildete

sich oberhalb der Lösungsmitteloberfläche an der Kolben¬

wand eine amorphe Kruste; es konnte keine Kristallisation

erzielt werden.

5. Die Lösung des Rohproduktes von Ans. 5 in 5 ml Aceton

und 1 ml HO wurde im schwachen Stickstoffström während

ca. 2 Stunden eingedunstet. Im entstandenen Festkörper

war eine deutliche Abnahme von B, C, D und I, jedoch eine

Zunahme von E+F zu beobachten. Eine Probe der an allen

Nebenprodukten, vor allem aber an E+F angereicherten Mut¬

terlauge, wurde durch HPLC (System I) aufgetrennt, die

einzelnen Fraktionen gesammelt, mit Äther verdünnt, im

UV/VIS (qualitativ auf PE 402) untersucht und anschlies¬

send wieder mit HPLC kontrolliert:

B: BHT-Allomer?

A : 662 (0,67), 620 (0,07), 582 (0,03), 433 (1,00),maX

415 (0,64)

Chlorophyll-Typ Spektrum

einheitlich laut HPLC nach Aufnahme des UV/VIS-Spektrums.

E+F: hauptsächlich 2_S, enthielt auch metallfreies Material

A : 660 (0,77), 616 (0,12), 580 (0,06), 530 (0,04),maX

432 (1,00), 409 (0,68), 375 Seh (0,45)

Chlorophyll-Typ Spektrum

ergab bei HPLC-Kontrolle E+F und H im Verhältnis der Peak-

höhen von 78 :22.

G: LR

A : 666 (0,46), 608 (0,64), 533 (0,06), 505 (0,08),maX

408 (1,00)

Phäophytin-Typ Spektrum

Bei der HPLC-Kontrolle wurden Peaks bei 9,9 Min. (_1S) und

11,7 Min. (G = LR) im Höhenverhältnis von 19:81 erhalten.

H: _2R

A : 660 (0,77), 616 (0,12), 580 (0,06), 535 (0,02),maX

430 (1,00), 409 (0,63), 381 (0,39)

Chlorophyll-Typ Spektrum

Bei der HPLC-Kontrolle wurden E+F (2j3) und H (_2R) nachgewiesen.

- 104 -

Allomer

A : 660 (0,74), 612 (0,08), 578 (0,03), 530 (0,02), 430maX

(1,00), 411 (0,65), 388 (0,39)Chlorophyll-Typ Spektrum

Man löste das ganze Rohprodukt von Ans. 6 in 7 ml Dioxan

und tropfte in Analogie zu [136,137] unter Rühren langsam1 V2 ml H„0 zu. Der entstandene, sehr feine Niederschlagliess sich nur durch Zentrifugieren abtrennen. Sämtliche

Nebenprodukte waren in der Mutterlauge stark angereichert.

Im Festkörper war der Gehalt an E+F stark und an I gering¬

fügig angestiegen, die übrigen Nebenprodukte hatten s'.ark

abgenommen (HPLC).

Das in Aceton/H„0 10:1 gelöste Rohprodukt aus Ans. 7 wurde

über eine Destillationsbrücke mit einem zweiten, mit H_0

gefüllten Kolben verbunden (App. vgl. Abb. 13, S. 81)

am WV kurz evakuiert und so ein Teil des Acetons wieder

abgesaugt. Anschliessend liess man weiteres Aceton aus der

Kristallisationslösung isotherm ins Wasser abdestillieren.

Die Mutterlauge wurde am folgenden Tag vom schwimmenden

Festkörper abgetrennt. Laut HPLC war kein deutlicher Rei¬

nigungseffekt eingetreten, wahrscheinlich wegen zu ra¬

scher "Kristallisation".

Die Wiederholung des oben beschriebenen Versuches mit dem

Rohprodukt aus Ansatz 8 brachte ebenfalls keinen Reini¬

gungseffekt .

Zu dem in 8 ml THF (filtriert über Alox W 200) gelösten

Rohprodukt aus Ans. 9 wurde unter Rühren langsam 6 ml H_0

getropft. Dabei schied sich kein Festkörper, sondern

Tröpfchen ab, die sich beim Zentrifugieren als dunkel¬

grüne Phase über der nur noch schwach gefärbten Lösungsammelten.

Man fällte das Produkt aus Ans. 11 zweimal aus Dioxan/H_080:20. Dabei nahm der Anteil an E+F etwas zu (HPLC) (rel.

Peakhöhe 5,8), während B (1,2), C (ca. 0,5), D (0,5) und

I (1,2) deutlich abnahmen. Anschliessend liess man wie

- 105 -

für Ans. 7 beschrieben, aus 10 ml Aceton und 1 ml H„0

durch isotherme Destillation des organischen Lösungs¬

mittels in 4,5 ml HO kristallisieren. Innerhalb von 4

Wochen bildeten sich "Kristalle" von ^JR, die neben wenig

A (2,0; BHT) nur eine geringe Menge F (0,8; entspr. ca.

0,6 Mol-% 2S) enthielten.

Das zweimal aus 6 ml Dioxan und 2 ml H„0 gefällte Mate¬

rial (geringer Reinigungseffekt wegen zu weitgehender Fäl¬

lung!) aus Ans. 12 löste man in 9 ml Dioxan und 0,5 ml

H„0 und evakuierte dann die Apparatur (vgl. Ans. 7) wäh¬

rend 15 Minuten. Man versuchte so, das Dioxan isotherm in

3 ml H„0 abzudestillieren. Innerhalb von 4 Wochen bilde¬

ten sich jedoch keine Kristalle.

Um den Endpunkt der Einbaureaktion zu bestimmen, entnahm

man dem Gemisch mittels einer Pipette Proben nach 1, 2, 3,

6 und 10 Minuten. Dazu musste der Zweihalsaufsatz jeweils

kurz angehoben werden. Die trotz des Argonstroms (Ballon)

eindringende Luft führte aber zu weitgehender Oxidation

der Produkte.

Ansatz 14 wurde unter den in 5.2.3. (S. 109) beschriebenen

Bedingungen ausgeführt und das Rohprodukt zweimal aus 2 0

ml Dioxan und 5 ml H„0 gefällt. Das gereinigte Material

enthielt laut HPLC ausser ca. 1,3 Mol-% Allomer (I) ge¬

samthaft weniger als 0,5 Mol-% weiterer Verunreinigungen.

Das Verhältnis 2R zu 2S betrug 95:5. Sowohl H-NMR als

13auch C-NMR (in CDC1 /CD3OD 88:12) dieses Präparates

stimmten mit den Literaturdaten [13 0^ bzw. [132^ weitge¬

hend überein. Völlig unerklärlich waren jedoch die viel

zu tiefen Werte der Verbrennungsanalyse:

ber. für Chi a • 2 HO: C 71,06 H 8,24 N 6,03 %

gef.: C 65,90 H 7,88 N 5,09 %

bzw. nach Trocknen 0

70°/HV/66 Std.C 66'01 H 7'98 N 5'06 *

Obwohl die Lage der VIS-Maxima mit den Literaturwerten

übereinstimmten, lagen die Extinktionen ca. 20 % zu nie¬

drig. Berechnet für Chi a- 2 HO:

- 106 -

(Et 0) 659,5 (69'500), 427 ( 88'600)Lit. [135]: (Et20) 660,6 (85'100), 428,8 (111'700)

Die erste Vermutung, dass eine anorganische Verbindungdurch das Dioxan aus dem zu seiner Reinigung verwendeten

Alox gelöst wurde, konnte nicht bestätigt werden, denn aus

Dioxan/H„0 schied sich kein Festkörper ab. Die Verunreini¬

gung musste also beim Magnesiumeinbau eingeschleppt worden

sein. Ein Blindversuch, bei dem alle Reagenzien unter den

beschriebenen Bedingungen, aber ohne Zugabe von 1_ einge¬setzt wurden, ergab bei der gleichen Aufarbeitungsmeth i'de

keinen RückstandI

15. Das zuerst aus 17 ml Dioxan/5 ml H„0 und dann aus 14 ml

Dioxan/5 ml H„0 gefällte Material zeigte ebenfalls zu ge¬

ringe Extinktionen (berechnet für Chi a • 2 H_0: 663

(63'400), 431 (82'700); Lit. [135]: 662,0 (76'600), 430,1

(94'000) in Aceton), die Verunreinigung in Ans. 14 war

also nicht nur zufällig.'

16. Kristallisationsversuche des Rohproduktes unter den für

Ansatz 7 beschriebenen Bedingungen waren nicht erfolgreich.

18. Beim Lösen des Rohproduktes für die Fällung wurde im Kol¬

ben eine geringe Menge eines farblosen Rückstandes ent¬

deckt. Aufgeschlämmte Partikel dieser Verunreinigung wurden

bei der wie üblich vorgenommenen Filtration durch Watte

nicht zurückgehalten. Durch Zentrifugieren konnte die Ver-40)

unreinigung sedimentiert und das Chlorophyll a aus der

überstehenden Lösung gefällt werden. Nach der Wiederholungdes Vorganges wurde erstmals Chlorophyll a isoliert, des¬

sen Extinktionen und Analysendaten in der Nähe der erwar¬

teten Werte lagen: (Berechnet für Chi a • 2 H_o)

UV/VIS Aceton: 664 (69'200), 431 (88'200) (DW2)Benzol: 665 (70'100), 433 (92'700) (DW 2)

40) Unlöslich in organischen Lösungsmitteln und HO, löst sich in verdünn¬ter Salzsäure. Es dürfte sich um ein Magnesiumphosphat handeln [l38].

- 107 -

Analyse: ber.: C 71,06 H 8,24 N 6,03 %

gef.: C 70,52 H 8,18 N 5,63%

21. Ansatz 21 ist detailliert in 5.2.3. beschrieben.

22. Der erhöhte Gehalt an Allomer und vor allem an Epimer in

Ans. 22 ist auf die Bildung von Emulsionen bei der Ex¬

traktion mit Benzol und die dadurch bedingte Verlängerung

der Aufarbeitungszeit zurückzuführen.

5.2.2. Magnesiumreagens

In einem trockenen 50 ml-Zweihalskolben, versehen mit Magnet-

rührer, Rückflusskühler mit Argonballon und einem mit einem

einer Serumkappe verschlossenen Tropftrichter wurden 1,001 g

(4,18 mMol) Magnesiumspäne unter Argon vorgelegt und mit 3 ml

Äther* überschichtet. Während einer Stunde tropfte man eine

41)Lösung aus 3,2 ml ÄthylJodid und 14 ml Äther* unter mas¬

sigem Rühren zu. Man liess während 90 Minuten am Rückfluss

kochen, ersetzte dann im Argongegenstrom den Tropftrichter

durch einen Hahn mit aufgesetzter Serumkappe (vgl. Abb. 17)

und liess über Nacht stehen.

Je 1 ml der Lösung wurde mit 0,1 N HCl hydrolysiert und mit

0,1 N NaOH-Lösung gegen Phenolphthalein titriert. Die Konzen-

42)tration des Grignard-Reagenzes betrug 2,0 Mol/1 . So her¬

gestellte Lösungen unterlagen in der dichten Apparatur unter

Argon keiner Farbänderung und konnten auch nach einigen Tagen

verwendet werden, ohne dass sich eine Qualitätseinbusse fest-

4- -n i43)

stellen liess

41) Äthyljodid: Siegfried, purum, unter Argon frisch destilliert.

42) Höher konzentrierte Lösungen lassen sich mittels Spritzen nur noch

schwer handhaben.

43) Isenring ( [lOl] ,S. 166) fand einen ungünstigen Einfluss der mehrere

Tage alten Grignard-Lösung (nicht entgast) auf die Qualität des

Magnesiumreagenzes.

- 108 -

In einer getrockneten, aus einem 25 ml-Kolben mit Magnetrüh-

rer, Zweihalsaufsatz mit Hahn und Argonballon sowie Serumkap¬pe bestehenden Apparatur (Abb. 18) wurden 1,5023 g (6,82 mMol)

2,6-Di-tert-butyl-4-methyl-phenol (BHT) unter Argon in 4 ml

CH~C1 * gelöst und dann unter Rühren während ca. 2 Minuten

3,0 ml der 2 M Grignardlösung zugespritzt. Die heftig sieden¬

de Lösung wurde von Zeit zu Zeit im Wasserbad abgekühlt. Nach

beendeter Zugabe liess man die klare, farblose Lösung licht¬

geschützt stehen und verwendete sie nach 15 bis 20 Minuten.

Serum¬

kappe Argon¬ballon

Reaktions¬

kolben

Abb. 17Abb. 18

Das so hergestellte Reagens war instabil und verfärbte sich

44)innerhalb einiger Stunden zu einer tiefblauen Lösung , die

nach Luftzutritt rasch braun wurde. Für präparative Ansätze

wurden die Lösungen daher immer innerhalb 2 0 Minuten verwendet.

Eine im HV abgeschmolzene NMR-Probe, hergestellt aus 65 3,8 mg

(2,97 mMol) BHT, 0,8 ml CD2Cl2*, 3,7 ml CH Cl2* und 1,5 ml

44) Die Zersetzung wird wahrscheinlich durch Sauerstoff ausgelöst. Dieabgeschmolzene NMR-Probe verfärbte sich über Wochen auch am Lichtnur wenig.

- 109 -

einer 1,924 M Grignardlösung (2,89 mMol) zeigte im H-NMR

folgende Signale (RT).

6,85 s 2,5 H BHT: H-C3, 5

5,26 s CH2C123,37 q (J=7) 19,2 H Et20: CH3-2,16 s 2,6 H BHT: CH3-C41,42 s 18,0 H Et20: CH2-01,24 t (J=7) 28,7 H BHT: tert-butyl

,o ,o ,o • O

Tieftemperaturspektren bei 0 C, -44 C, -64 C und -85 C

ergaben weder eine Verschiebung der Signallagen, noch eine

Aufspaltung der Peaks. Es konnte nur eine Verbreiterung der

Absorptionen, bedingt durch die zunehmende Viskosität der

Lösung, gemessen werden.

5.2.3. Präparative Herstellung von Chlorophyll a

o

C02CH3C02Phytyl

O

C02CH3C02Phytyl

1R + IS

C55H74N4°5871,22

2R + 2S

C55H72N405Mg893,51

In einem 2 5 ml-Kolben mit Magnetrührer und Zweihalsaufsatz

("Y") mit 2 Hähnen wurde über Nacht 155,3 mg (0,178 mMol)

Phäophytin a (1_) am HV bei RT getrocknet. Man ersetzte dann

den einen Hahn im Argongegenstrom durch eine Serumkappe und

löste das Edukt anschliessend in 2,1 ml CH„C1 * (App. vgl.

Abb. 18). Im Wasserbad wurde auf 11 C abgekühlt. Unter in¬

tensivem Rühren spritzte man 3,9 ml Magnesiumreagens (3,3 mMol

Mg; 18,8-facher Überschuss) möglichst rasch zu, wobei sich die

- 110 -

Reaktionslösung sofort lindengrün färbte. Man liess während5 Minuten bei 11-12 C rühren und goss dann auf eine Mischungaus 200 ml Äther, 200 ml eisgekühltem H„0 und 500 ml Phosphat¬puffer (Extraktionsmischung durch Einleiten von N„ entgast!).Der Reaktionskolben wurde rasch mit wenig CH^Cl *

nachgespült,diese Lösung ebenfalls zur Mischung gegeben und intensiv ge¬schüttelt. Die Wasserphasen wurden sofort abgetrennt und ver¬

worfen, obwohl sie noch wenig grünes, ausgefallenes Material

enthielt. Die grünblaue Ätherphase wurde dreimal mit eisge¬kühltem Wasser und einmal mit gesättigter NaCl-Lösung gewa¬schen und dann mit Natriumsulfat getrocknet. Anschliessend

filtrierte man durch Watte und engte am RV ein. Man trocknete

am HV und sublimierte dann während 2 Stunden bei 6 0 C das

BHT ab. Nach weiteren 14 Stunden am HV wurde das gesamte Roh¬

produkt in die Dry-Box transferiert.

Eine nach dem Trocknen der Ätherphase abgetrennte und im Stick¬

stoffstrom getrocknete Probe des Rohproduktes zeigte folgendeEigenschaften:

UV/VIS: Äther, qualitativ auf PE 4 02:A : 662 (0,76), 616 (0,12), 567 (0,06), 429 (1,00),maX

410 (0,68), 373 (0,43), 276 (0,75; BHT)DC: Silgur, Hexan/Aceton 70:30

Rf 0,35: Hauptfleck, blaugrün; Chi a

0,45: sehr schwach, graubraun; Verunreinigung desEdukts

0,69: Im UV (254 nm) schwach sichtbar; BHT

HPLC: System II, 81 ml/h, LDC-Monitor:

tR(Min.) rel. Peakhöhe Mol-%

A 4,8BHT

B 8,2 0,6 0,3 BHT-AllomerC 8,9 0,7 0,5 Verunr.D 10,4 0,5 0,4 desE 12,0 1,8 1,6 EduktsG 12,6 0,3 0,3 1RF 13,1 2,1 1,5 .2S

13,6 0,4 0,3 ?H 17,4 100 94,3 2!RI

K

20,7

21,60,4

0,40,4

0,5 ] Allomere

- 111 -

Man löste das gesamte Rohprodukt in 11 ml Dioxan und zentri-

fugierte anschliessend. Die Lösung wurde vom weitgehend farb¬

losen Rückstand abpipettiert, dieser in 5 ml Dioxan suspen¬

diert und erneut zentrifugiert.

Man vereinigte die beiden Lösungen in einem 50 ml-Kolben. Un¬

ter intensivem magnetischem Rühren wurden während 30 Minuten

aus einer Spritze 4,0 ml H_0 zugetropft und anschliessend wäh¬

rend 30 Minuten weiter gerührt. Beim Zentrifugiren setzte

sich ein dunkelgrüner Niederschlag, die überstehende Lösung

blieb blaugrün. Die Mutterlauge wurde vom Niederschlag ge¬

trennt, dieser erneut in 11 ml Dioxan gelöst und das beschrie¬

bene Verfahren unter identischen Bedingungen wiederholt.

Der abgetrennte Niederschlag wurde mit wenig Dioxan in einen

45)Kolben transferiert und über Nacht gefriergetrocknet

12 5,6 mg (entspr. 73,1 %) Chi a N 1.

Die Mutterlaugen der beiden Fällungen wurden vereinigt und un¬

ter intensivem Rühren tropfte man während 30 Min. weitere

4 ml HO. Nach Zentrifugieren, Abpipettieren der überstehenden

Lösung und Gefriertrocknen über Nacht wurden weitere 2 5,8 mg

(entspr. 15 %) Chi a N 2 isoliert.

Der Reinigungseffekt dieser Fällung wurde anhand von HPLC ver¬

folgt. Die entsprechenden Resultate sind in Tabelle 11 zusammen¬

gestellt, für N 1 vgl. auch Abb. 27, S. 124.

45) Man schloss den Kolben mittels Glasbrücke an eine Kühlfalle an, fror

die Substanz in flüssigem Stickstoff ein, evakuierte auf < 2*10 Torr,

liess dann die Probe etwas auftauen (deutlicher Druckanstieg; Lösungs¬

mitteldampf I), schloss dann den Hahn zur Pumpe, kühlte die Kühlfalle

mit flüssigem Stickstoff und liess über Nacht stehen. Durch das Ge¬

frieren der nur noch aus Lösungsmitteldampf bestehenden Atmosphäre im

Innern der Apparatur Hessen sich in dichten Apparaturen (einwandfrei

gefettet; keine Schlauchverbindungen) Drücke von <<10_-i Torr erzielen.

- 112 -

Tabelle 11: HPLC-Resu Ltate von Chi a N 1 iand N 2,

System II, 108 bzw

. 100 ml/h, LDC-Monitor

fcR N 1 N 2

(ml) rel. Peakhöhe Mol-% rel. Peakhöhe Mol-%

6,0 ——

0,6A 6,8 -

-

0,9 BHTB 11,0 -

-

0,5 0,1 BHT-AllomerC 13,4 -

-

2,3 1,1 n Verunr.D 14,3 -

-

1,0 0,5 desE 16,5 0,5 0,3 5,4 3,1 _j EduktsG 17,2 -

-

1,0 0,6 1RF 18,2 10,3 7,2 68,2 31,9 iä19,3 -

< 0,4 -

22,3 --

0,3 0,2H 24,0 100 91,9 100 61,8 2RI 32,7K 42,0

0,2 0,3 0,4

0,3

0,3~

0,3 _j

Allomere

5.2.4. Analytische Daten von partialsynthetischem Chlorophyll a N 1

Smp. :

DC:

HPLC:

UV/VIS

Et20*

Et20*+ H20*

Dunkelgrünes, sehr feines Pulver

70-90° C

Silgur, Hexan/Aceton 70:30Rf: 0,27, hellgrün; 2_R

0,30, schwacher, hellgrüner Fleck; 2_S

vgl. Tabelle 11 und Abb. 27, S. 124

(Extinktionskoeffizienten ber. für MG = 964,09)

366,6 ug in 50 ml, c = 7,61-10_6 Mol/1 (Abb. 2, S. 36)

659 (86'800), 632/min (7'900), 613,5 (13'000),588,5/min (4'700), 573,5 (6'800), 545/min (2'600),527,5 (3'700), 495/Sch (2'100), 470/min (l'lOO),427,5 (110'800), 413/min (69'800), 409 (70'600),385,5/min (42'300), 380,5 (43'100), 336,5/min (22'000)

357,2 yg in 50 ml Et„0 (wassergesättigt),c = 7,41-10~6 Mol/1

662 (84'200), 634/min (8'800), 617 (13*500), 592/min(5'300), 578 (7'300), 549,5/min (2'600), 534 (3'400),506/Sch (1'600), 470/min (500), 430 (105'000), 416/min (66'100), 410 (67'900), 389,5/min (42M00), 383(43'300), 342/min (21'100), 327 (22'700)

- 113 -

390,1 yg in 50 ml, c = 8,09-10 Mol/1

Dioxan* 662 (83'500), 636,5/min (9'800), 622,5 (14'200),

615/Sch (13'300), 593/min (7'200), 587 (7'400),

547/min (3'100), 538 (3'300), 510/min (2'100), 500

(2'200), 471/rain (1'400), 433 (120'700), 417,5/min

(63'100), 410 (66'000), 393/min (39'500), 384

(41'100), 363/Sch (29'700), 345/min (22'000), 330

(24'300), 298/Sch (17'400)

432,7 yg in 50 ml, c = 8,98-10~6 Mol/1

Aceton* 662 (75'500), 635/min (9'700), 615 (13'600), 592/min

(6'000), 579,5 (6'400), 549/min (3'000), 535 (3'300),

505/Sch (1'700), 474/min (800), 430,5 (93*800), 417/

min (66'500), 411,5 (68'000), 388/min (43'800), 385

(44'100), 343/min (21'700)

418,5 yg in 50 ml, c = 8,68-10~6 Mol/1

Benzol* 677/Sch (43'500), 668 (52'300), 639/min (13'500),

626 (14'600), 592/min (7'500), 584 (7'700), 547/min

(2'600), 536 (3'000), 502/Sch (1'500), 483/min

(l'OOO), 434 (75'700), 416/Sch (56'300), 393/min

(40*200), 384 (41*400), 353/min (26*300), 346 (27'500)

IR: 2,5 %, 0,2 mm (Abb. 19)46)

CHC1 * 3000w, 2960s, 2930s, 2865m, 1730s, 1677s, 1640m,

1610s, 1555s, 1535s, 1490m, 1467m, 1453m, 1435w,

1380w, 1365w, 1345m, 1325w, 1305w, 1285m, 1185m,

1150Sch, 1125m, 1105w, 1070w, 1040m, 1020w, lOOOw,

985w, 920m, 890w, 875m

3 %, 0,2 mm

CC1 * 3090w, 2960s, 2930s, 2870m, 2860m, 1735s, 1695s,

1655s, 1610m, 1550m, 1530m, 1490m, 1465m, 1450m,

1430w, 1375w, 1365w, 1345m, 1328w, 1305w, 1287m,

1253w, 1240w, 1225w, 1190m, 1160m, 1130m, 1125m,

HOOw, 1070w, 1042m, 1000m, 985w, 920m, 888w, 877v/

KBr 3600-3200m, 2955s, 2930s, 2865m, 1735s, 1690s,

1650m, 1605m, 1548s, 1532m, 1485m, 1460m, 1450m,

1375m, 1345m, 1325m, 1300m, 1285m, 1255w, 1235m,

1182m, 1155m, 1130m, HOOw, 1070m, 1040m, 995m,

985m, 972m, 915m, 870m, 850w, 840w, 798m, 765w,

740m, 700w, 610w

46) Laut HPLC keine Zunahme des Gehalts an Allomeren während der Aufnahme

des Spektrums.

- 114 -

0,03 Mol/1 in Aceton-d * (Abb.6

20)

Anz. Protonen

ppm beob. theor.

9,68

9,66

s

0,7 H (1 H) HC-10

9,36

9,34

s

0,8 H (1 H) HC-5

8,52

8,47

s

0,9 H (1 H) HC-20

8,09 d- d (J=18 -11) 0,8 H (1 H) HC-316,19 d- d (J=18 ;2)

-

(1 H) Hz-326,13 s 2,5 H (1 H) HC-1325,98 d- d (J=11 •2)

_(1 H) HE-32

5,59CH2C12

4,8-5,2 b, triplettoid 1,3 H (1 H) HC-P24,0-4,6 —

(1 H) HC-18b 3,9 H (2

(1

H)

H)H2C-P1HC-17

3,78

3,73

s

4,6 H(3 H) H3CO-C-133

3,76 (q) , (J= 8) (2 H) HoC-813,55 s 2,2 H (3 H) H3C-I213,45 s 4,6 H Dioxan3,31

3,25

s

s5,3 H

(3

(3

H)

H)H3C-2IH3C~7

2,60 s 1,4 H H202,1-2,5 b 3,7 H (4 H) H2C-171,1722,01 quintuplett Aceton d51,5-2,0 b (2 H) H2C-P41,74 d (J=7)

12,2 H(3 H) H3C-I81

H3C-821,68 t (J=8) (3 H)1,51 s (3 H) H2C-P310,9-1,4 b 19,7 H (19 H) H2C_P

n

0,83d

+

(J

b

= 7)13,1 H

(6

(6

H)

H)H3C-P71,P111H3C-P151,P16

Das Spektrum stimmt mit Ausnahme der Lösungsmittel¬signale mit demjenigen in [150,151] überein. Die In¬tensität des Signals von Dioxan ist mit dem für die

Berechnungen verwendeten Gehalt von 0,75 Äquivalentvereinbar. Der Wassergehalt ist schwierig abzuschät¬zen; ca. die Hälfte des H20 stammt aus dem Deutero-aceton.

Nach der Aufnahme des Spektrums konnte keine messbareZunahme des Allomergehalts festgestellt werden (HPLC).

- 115 -

1H-NMR: 0,06 Mol/1 in CD-OD/CDC1 * 12:88

ppm

9,51

9,46

9,24

9,21

8,29

8,20

7,96

7,29

6,16

5,98

5,27

5,1

4,2-4,6

4,37

4,0-4,2

3,97

3,73

3,58

3,28

3,23

3,08

1,8-2,9

2,15

1,4-1,8

1,78

1,70

1,56

0,9-1,4

0,84

0,8

Anz. Protonen

beob. theor.

d-d (J=18;ll)

d-

d-

b

b

d

b

s

q

s

s

s

b

b

d

t

s

b

d

b

0,9 H

1,0 H

0,9 H

1,0 H

(1 H)

(1 H)

(1 H)

(1 H)

d (J=18 ;2)i i H

(1 H)

d (J=ll p2)-

* 1x n

(1 H)

1/1 H (1 H)

(J=8H)

~

3,3 H(1 H)

(2 H)

; 3,4 H(1 H)

(3 H)

(J=8) (2 H)

7,9 H (3 H)

6,0

1,1

H

H

(3 H)

(3 H)

(4 H)

(J=8)17,1 H

(2 H)

(3 H)

(J=8) (3 H)

(3 H)

19,1 H (19 H)

(J=6)11,6 H

(6 H)

(6 H)

HC-10

HC-5

HC-20

HC-31CHC13HzC-32

HEC-32

CH2C12HC-P2

HC-18

H2C-P2HC-17

H3CO-C-I3-H2C-81H3C-I21Dioxan

H3C-7}H3C~2CD3OH

17'H2C-171,Aceton

H2C-P4H3C-I8-1-H3C-82H3C-P3XH2C-PH3C-P71H3C-P151,P16

Pll1

Die Signale der Chlorophyllid-Protonen stimmen befrie¬

digend mit denjenigen von Methylchlorophyllid a über¬

ein [130,101].2

Das bei 6,1 ppm erwartete Signal des HC-13 fehlt.

Das Proton tauschte offenbar genügend rasch mit dem

CD3OD aus und erschien als CD30H-Signal bei 3,08 ppm,

dessen Integration recht genau 1 H ergab. Bei der Zu¬

gabe von CH3OH verstärkte sich das Signal und ver¬

schob sich nach tieferem Feld,gleichzeitig erschien

das Signal der Methylgruppe bei 3,28 ppm.

Acetonsignal: Die gleiche Probe wurde vor dieser Auf¬

nahme in Aceton dg gemessen und die Substanz mit Ace¬

ton wieder aus dem NMR-Rohr gespült. Trotz Trocknen

während 2 Tagen am HV bei RT konnten offensichtlich

nicht sämtliche Lösungsmittelreste entfernt werden.

I

3H-

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M

- 117 -

Aceton-dg:

Die Signallagen in Aceton stimmen mit den von Boxer

et al. [34] gefundenen Werten im allgemeinen inner¬

halb 0,2 ppm überein. Ausnahmen bilden die schwachen

Signale bei 171,3, 169,7 und 168,1 ppm, die von den

Literaturdaten um 0,9, -1,3 bzw. -1,4 ppm abweichen.

Diese Unterschiede sind wahrscheinlich in einem Kon¬

zentrationseffekt begründet; in der zitierten Arbeit

wurde eine Konzentration von 0,1 Mol/1 verwendet. Die

Lage dieser Signale ist infolge Aggregation stark lö¬

sungsmittelabhängig und wird daher auch von der Kon¬

zentration beeinflusst.

Die bei ca. 190 ppm und 162 ppm erwarteten Signale

von C-13 und C-13 fehlen im vorliegenden Spektrum

(zu geringe Konzentration!).

Ausser den bereits beschriebenen Signalen finden sich

im Spektrum folgende Peaks: 32,1, 31,3, 30,6, 29,812,

29,0, 28,3 und 27,5, sowie 206,1 ppm von Aceton-dg.

Die angegebenen chemischen Verschiebungen beziehen

sich auf das mittlere Acetonsignal = 29,812 ppm als

internen Standard.

CDC1 /CD OD:

Die Zuordnung der quaternären C-Atome wurden in Analo¬

gie zu den Resultaten von Boxer et al. [34] übernommen.

Das Spektrum in CDC13/CD30D stimmt mit demjenigen von

Goodman et al. [132] meist innerhalb von 0,1 ppm

überein; die Abweichungen betragen höchstens 0,3 ppm.

Das Signal für das C-13^ konnte nicht gefunden werden.

Dies wird auf den Austausch des Wasserstoffs gegen

Deuterium zurückgeführt. Dadurch wird einerseits die

Relaxationszeit drastisch heraufgesetzt und anderseits

bleibt das Signal auch im breitbandentkoppelten Spek¬

trum in ein Triplett aufgespalten. Das Rumpfsignal

verschwindet im Rauschen.

Das Signal bei 129,6 ppm ordnen Goodman et al. [132]einem quaternären, ungesättigten C-Atom des Ringsy¬

stems zu. Im Gegensatz dazu finden Boxer et al. [34]alle Signale der Pyrrol- und der beiden Pyrrolenin-

C-Atome mittels Indor-Technik oberhalb 134 ppm (in

Aceton dg). Es ist möglich, dass es sich beim frag¬

lichen Signal um die Absorption des C-3 -Atoms von

Chi a1 handelt, obwohl nicht ganz einsichtig ist, wie

eine geringe Konformationsänderung am isocyclischen

Ring eine so drastische Verschiebung der -"-^c-Resonanz

der Vinylgruppe bewirkt.

Ausser den bereits beschriebenen Absorptionen finden

sich im Spektrum folgende Signale:

78,6, 7 7,3 und 7 6,0 ppm von CDC1350,8, 50,0, 49,1, 48,2 und 47,4 ppm von CDoOD.

- 118 -

Nach Aufnahme der Spektren in Deuteroaceton undCDCI3/CD3OD betrug der Gehalt an Allomer laut HPLCca. 2 %, das Verhältnis von 2R:2S lag bei 79:21.

25 A 3 35 4

15 u 20 25

4000 V

500 400

Abb. 19: IR von Chlorophyll a (N 1); 2,5 % in CHCl3

Abb. 20: H-NMR von Chi a (N 1) in Aceton-d,

- 119 -

1 I. I I .~T~

sooo

2500

10,00

*i>**^.f)iMt<*<J*t

1

0

,wAiU^Ü4vM«J%4v^ Vowk twM^H^**)***1 'Vv'*«y^!,'W^s'

13Abb. 21: C-NMR-Spektrum von Chlorophyll a (N 1) in Aceton d,

5000

2900

!1000

^vJWw

13Abb. 22: C-NMR-Spektrum von Chlorophyll a (N 1) in CDC1 /

CD OD 88:12

Analyse: Chi a • 0,75 Dioxan • 0,25 H_0: C,0H.0 cN.O, _cMg

„ rs- . „~

^ 5o /ö,d 4 6,/5MG: 96 4,0 9

ber.: C 72,26 H 8,21 N 5,81 Mg 2,52 %

gef.: C 72,25 H 8,32 N 5,74 Mg 2,37 %7)

47) Frl. K. Lohner danke ich für die Magnesiumbestimmung mittels Atom¬

absorptionsspektroskopie .

- 120 -

5.2.5. Kristallisation

Das Rohprodukt eines nach der Vorschrift in 5.2.3. ausgeführ¬ten Ansatzes (Ans. 20) wurde in der Dry-Box in 10 ml CH„C1„

(frisch durch Alox W 200 filtriert) gelöst und zentrifugiert.Die überstehende Lösung wurde abpipettiert, der fast farblose

Rückstand in 5 ml CH„C1„ aufgeschlämmt und erneut zentrifu-

giert. Man vereinigte die beiden Lösungen, saugte das Lösungs¬mittel ab, löste in 17,5 ml Dioxan und fällte innerhalb 45

Min. durch Zugabe von 5 ml HO. Der Niederschlag wurde noch¬

mals aus 15 ml Dioxan und 5 ml H„0 gefällt und gefriergetrocknet.Ausbeute: 122,9 mg entspr. 75 % bez. eingesetztes 1..

Man löste den gesamten Niederschlag in 14 ml Aceton und fil¬

trierte durch Watte in einen zerkratzten Kolben, gab 2 ml H„0

zu und liess in der in Abb. 2 3 dargestellten Apparatur unter

leichtem Durchsaugen von Stickstoff (Umwälzrate ca. 1,6 1/h)

langsam eindunsten.

Nach 5 1/2 Wochen trennte man die Mutterlauge vom Festkörper ab

und trocknete diesen während 2 Tagen am HV bei RT.

Ausbeute: 7 7,5 mg entspr. 63 % bez. gefällte Substanz.

Abb. 2 3

- 121 -

Analytische Daten von kristallisiertem Chi a

Dunkelgrünes, körniges Pulver

Unter dem Polarisationsmikroskop konnten bei 500-facher

Vergrösserung einzelne Teilchen entdeckt werden, die

eindeutig als Kristalle erkannt wurden.

Grösste Abmessungen: ca. 1,5 x 6 ym.

HPLC:

UV/VIS

Dioxan*

Äther*

Aceton*

System II, 84,4 ml/h, PE-LC-55 Detektor, 280 nm

(Abb. 28)

13,0 Min. (0,5 Mol-%; ZS) , 15,2 (0,3; ?) , 16,5

(98,8; _2R) , 17,5 (0,2; ?) , 22,2 (0,1; Allomer) ,

25,0 (0,1; Allomer)

Die Retentionszeit ist identisch mit derjenigen von

authentischem, durch Extraktion aus Pflanzenmaterial

gewonnenem Chlorophyll a (Fluka, purum; Mischchroma-

togramm).

Die Extinktionskoeffizienten sind berechnet für

Chi a 2 HO; MG = 929,54

-6333,6 yg in 50 ml; c = 7,18-10 Mol/1

662 (87'800), 636/min (lO'OOO), 623,5 (14'900),

616/Sch (13'900), 593,5/min (7'200), 586 (7'700),

543/Sch (3'300), 473/min (l'lOO), 433 (125'500),

418/min (64'400), 411 (67'200), 393,5/min (39'700)

384,5 (41'500), 365/Sch (30'900), 346/min (22'300)

332 (25'500), 298,5/Sch (18'800), 283/Sch (16'700)

275/min (15'900), 248 (23'300)

342,5 ug in 50 ml; c = 7,37-10~6 Mol/1

659.0 (90'800), 633/min (8'400), 613,5 (13'600),

588/min (5'000), 574 (7'300), 547/min (3'100), 528

(4'100), 495/Sch (2'300), 468/min (1'400), 427,5

(115'600), 413/min (71'900), 409,5 (72*900), 387/

min (43'400), 380,5 (44'400), 340/min (23'700)

372.1 yg in 50 ml; c = 8,01-10~6 Mol/1

(gleiche Lösung wie für CD-Spektrum)

662 (79'300), 635,5/min (10'200), 616 (14'900),

590/min (6*900), 579,5 (8'100), 548/min (3'400),

533,5 (3'700), 500/Sch (2'400), 470,5/min (1'400),

430 (97'800), 415,5/min (69*400), 410,5 (70*600),

389/min (44'200), 383 (44*600), 342,5/min (23'100)

- 122 -

CD: Die Konzentrationen der Lösungen wurden berechnetfür Chi a • 2 HO

372.1 ug in 50 ml; c = 8,01-10_6 Mol/1 (Abb. 24,S. 123)

Aceton* 656 (-7,74),565 (-0,62),(+2,50), 400

(0,0)

Die UV/VIS-Spektren vor und nach der Aufnahme des CD-Spektrums waren deckungsgleich.In einer gleichzeitig im selben Lösungsmittel gelöstenProbe von Chlorophyll a vergrösserte sich der Gehaltan _2S während der Messung von 1,0 auf 1,4 Mol-% U'I'LC) .

381.2 yg in 50 ml; c = 8,20-10~6 Mol/1 (Abb. 25)Äther* 656 (-7,62), 632 (-0,37), 613 (-0,73), 600-450

(<±0,25), 425 (+9,27), 410,5 (+4,51), 399 (+6,95),379,5 (+2,93), 376 (+2,99), 362,5 (+0,67), 354(+1,22), 350 (+0,91), 322,5 (+7,80), 302 (+2,13),291 (+3,60), 283 (+2,99), 265 (+3,84), 243 (0,0),232 (-3,90)

Die UV/VIS-Spektren vor und nach der Aufnahme des CD-Spektrums zeigten geringe Unterschiede der Extinktions¬koeffizienten (Temperaturunterschiede?):e(660): vorher: 90'000, nachher: 88'760e(428): 115'580, 114'480

In einem vorgängig ausgeführten Versuch hatte der Ge¬halt an 2S_ einer im gleichen Äther gelösten Probe in¬nerhalb 2 Std. (entspricht der Aufnahmedauer des CD-Spektrums) von ca. 1,9 % auf ca. 3,1 % zugenommen(Tab. 12, S. 126).

t, i ^- 48)Pulverdiagramm:

Die Lagen der Reflexe im Pulverdiagramm stimmen mitdenjenigen der von Isenring [lOl] hergestelltenProbe, die jedoch nicht spezifizierte Verunreinigun¬gen enthielt, überein. Die Intensitäten der Reflexein dem von Kratky [.15 9] beschriebenen Pulverdiagrammsind aber, als Folge der bedeutend höheren Probemenge,deutlich stärker.

632 (-0,87), 615 (-1,37), 587 (0,0),530-455 (<±0,25), 428 (+5,93), 413(+5,06), 367 (0,00), 358 (-0,62), 353

48) Herrn Dr. R. Gubser danke ich für die Aufnahme des Pulverdiagramms.

- 123 -

i H

2 -

0 -] ^-tJ*^at?^*m»9«j

6 -

Abb. 24: CD-Spektrum von 2R

8,01-10~ Mol/1 in Aceton

700 nm

Abb. 25: CD-Spektrum von ZR

8,20-10~6 Mol/1 in Äther

- :24 -

m

10 20

Abb.

HPtjC von Phäophytin a

Systerr II, 84,4 ml/hPE-LC-55, 280 nm

ju

20 30 Min

Abb. 27:

HPLC von Chlorophyll a N 1

System II, 84,4 ml/h

PE-LC-55, 280 nm

Abb. 28:

HPLC von kristallisiertem

Chlorophyll a

System II, 84,4 ml/hPE-LC-55, 280 nm

30 Min

- 125 -

5.2.6. Epimerisierungsversuche

In der Dry-Box wurden einzelne Proben des kristallisierten 2_R

im angegebenen Lösungsmittel gelöst. Teile der Lösungen wurden

nach unterschiedlichen Reaktionszeiten abgetrennt, am WV ein¬

geengt und durch HPLC analysiert.

Die in Tabelle 12 zusammengefassten Daten geben den Anteil von

2S an der Gesamtmenge von Chlorophyll a (2R+2S) in Mol-% wie¬

der (vgl. auch Abb. 3, S. 40). Man untersuchte die Epimerisie-

rung in den folgenden Lösungsmitteln:

Dioxan (2x über Kalium destilliert); Dioxan (wie vorher, zu¬

sätzlich vor Verwendung über Alox W 200 filtriert); Dioxan/H„0

10:1; Aceton; Aceton/H 0 10:1; Äther (2x über LAH destilliert),

2 verschiedene Chargen; Methanol (über Magnesium destilliert).

Aus den vorliegenden Daten ergeben sich folgende Gleichgewichts¬

verhältnisse :

2R

Dioxan: 88 12

Aceton: 79 21

Äther: 79 21

Methanol: 83 17

2S

In Dioxan/H^O und Aceton/H„0 wurde das Gleichgewicht wahrschein¬

lich nicht erreicht.

12,5p-

in

Std.

672

22,9

13,3

12,0

11,9

Std.

340

20,7

Std.

250

22,4

4,1

Std.

224

20,7

Std.

198

20,9

2,6

9,1

12,3

12,4

Std.

144

21,4

Std.

96

5,8

12,1

12,3

Std.

72

12,2

Std.

58

16,6

20,3

1,2

10,6

Std.

48

7,2

Std.

34

16,0

10,2

16,2

0,9

5,2

Std.

24

2,5

1,7

11,7

10,4

Std.

9

7,2

9,9

1,0

Std.

817,6

4,5

5,3

0,7

1,3

1,1

9,4

8,2

Std.

4

3,1

2,9

1,0

1,0

0,9

7,3

6,7

Std.

2

17,4

2,5

0,7

0,8

0,7

5,2

8,8

Min.

60

17,7

1,8

1,2

1,2

0,7

4,7

3,3

Min.

30

17,5

1,9

0,9

0,7

0,6

2,8

1,8

Min.

15

0,5

0,7

1,0

1,3

Min.

5

OH

CH

Et20

Et20

H20

Aceton/

Aceton

H20

Dioxan/

(Alox)

Dioxan

Dioxan

t

(%)

2S/(2R+2S)

2S):

t(2R

aChlorophyll

von

Epimerisierung

Reversible

12:

Tabelle

- 127 -

5.3. Synthese von Cetyl-chlorophyllid a

5.3.1. Methyl-phäophorbid a (20)

o

CO9CH3C02Phytyl C02CH3

1R + IS

C55H74N4°5871,22

20_

C36H38N4°5606,73

In einem 250 ml-Kolben mit Magnetrührer, Rückflusskühler und

Dreiweghahn mit Argonballon wurden 3,009 g Phäophytin a (Roh¬

produkt aus der Chromatographie, leicht verunreinigt, vgl.

5.1.1.) in einer Mischung aus 200 ml Methanol und 6 ml H SO.

gelöst. Durch mehrmaliges Evakuieren am Wasserstrahlvakuum

bis zum Sieden und Begasen mit Argon wurde die Mischung par¬

tiell von Sauerstoff befreit. Man liess die dunkel blaugrüne

Lösung im Ölbad während einer Stunde am Rückfluss kochen und

kühlte den Kolben anschliessend im Eiswasser ab. Die schwefel¬

saure Methanollösung wurde nun zweimal mit 100 ml Hexan ausgezo¬

gen, die Hexanphasen nochmals mit 100 ml 3-proz. methanoli¬

scher Schwefelsäure extrahiert, die beiden Methanolphasen ver¬

einigt und auf 1,2 1 Eiswasser gegossen. Man extrahierte die

Wasserphase einmal mit 500 ml und zweimal mit 100 ml CH Cl,

wusch die organischen Phasen mit 700 ml H„O/100 ml Phosphat¬

puffer, zweimal mit H„0 und einmal mit gesättigter Kochsalz¬

lösung. Man trocknete mit Natriumsulfat, engte am RV ein und

trocknete am HV während 4 Stunden.

Ausbeute: 2,072 g

- 128 -

Die Hexanphasen wurden eingeengt und ergaben nach dem Trocknen

am HV während 2 Stunden bei RT 0,920 g leicht gelbliches,hochviskoses öl, das man nicht weiter untersuchte.

Für die Kristallisation löste man das Reaktionsprodukt in 10 ml

CH~C1,> bei RT und gab dann 20 ml Aceton zu. Am WV wurde nun

im warmen Wasserbad so lange Lösungsmittel abgezogen, bis

Kristalle sichtbar wurden. Man begaste mit Argon und löste

durch Erwärmen nochmals vollständig. Anschliessend liess man

auf RT abkühlen und vervollständigte die Kristallisation über

Nacht im Kühlschrank bei 4 C: 1.263 g violettblaue, glänzen¬de Kristalle (3 Std. HV/RT).

Die Mutterlauge wurde eingeengt und sorgfältig mit wenig Hexan

gewaschen, um die letzten Reste der Phytolderivate zu entfer¬

nen, und der Rückstand wie beschrieben aus 10 ml Aceton um¬

kristallisiert: 507 mg violettblaue Kristalle.

Ausbeute: 1,710 g =2,92 mMol entspr. 84,5 %

Mutterlaugen aus mehreren Ansätzen, sowie verunreinigtes Ma¬

terial, das man durch Umesterung von Phäophytin a aus Einbau¬

versuchen erhalten hatte, wurden durch Chromatographie an der

100-fachen Menge Kieselgel gereinigt. Man trug je ca. lgRohprodukt in ca. 20 ml Benzol/Aceton 90:10 auf und eluierte

mit Hexan/Aceton 80:20. Dabei kristallisierte ^0 in den weit¬

gehend reinen Fraktionen aus den übersättigten Elutionslösun-

gen in sehr dünnen, violettblauen, im Tageslicht tiefrot

fluoreszierenden Blättchen. Die DC-reinen Fraktionen wurden

vereinigt und das Produkt wie oben beschrieben aus Aceton um¬

kristallisiert.

Methylenchlorid/Aceton war für die Säulenchromatographie un¬

geeignet, obwohl sich damit im DC sehr gute Trennungen erga¬

ben. Bei länger dauernden Trennungen wurde, im Gegensatz zu

Phäophytin b-Derivaten [103] weitgehende Allomerisierung be¬

obachtet.

- 129 -

Analytische Daten von 20

Smp.: 230-260 C (Zers.)

DC: Kieselgel, Methylenchlorid/Aceton 92:8

Rf = 0,57; einheitlich

Kieselgel, Aceton

Rf = 0,86

UV/VIS: 248,2 yg in 50,45 ml, c = 8,11-10~ Mol/1

Dioxan* 667 (54*400), 631/min (4*900), 610 (8'500), 579/min

(2'000), 560,5 (3*100), 550/min (2*600), 535,5

(9'900), 524/min (4'900), 506 (12'300), 480/min

(4*400), 470 (4'600), 453/min (3'300), 412 (114'100)

401/Sch (95'700), 377/Sch (60'400), 332/min (20*700)

323 (21'600), 294/min (12'600), 276,5 (15'500),

255,5/min (11*600), 240,5 (17'000)

IR:

CHC1.

0,1 mm

3400w,

1735s,

1465w,

1348m,

1033m,

820w

3030Sch, 3010w, 2970m, 2950m, 2930w,

1700s, 1620m, 1583w, 1555m, 1540Sch,

1410w,

1122m,925Sch

1452m, 1437m,

1295m, 1165m,

985m, 970Sch,

2870w,

1500m,

1400w, 1380w, 1367m,

1112Sch, 1091w, 1058w,

910w, 897w, 853w, 841w,

MS 125

620

575

o

(1),

(10)

609 (1,4),574 (86;

608 (7,8)

M+-CH-.OH) ,

607 (32)

549 (21) ,

606 (76;

(57;

M+),

M+-C02CH2), 547

C02CH3,-CH3OH),44 (100)

(22), 488

461 (24),

548

(13), 487 (33; M+-CH2CH2-460 (16), 459 (25), 431 (10)

- 130 -

H-NMR: 0,10 Mol/1 in CDCl

Anz Protonen

ppm beob. theor.

9,20 s 0,9 H (1 H) HC-109,00 s 0,9 H (1 H) HC-58,46 s 0,8 H (1 H) HC-207,70 d-d (J=18 ;12) 0,9 H (1 H) HC-317,16

CHC136,21 s 0,9 H (1 H) HC-1326,06 d-d (J=18 ;1 5) 1

2,0 H(1 H) HZc-32

5,97 d-d (J=12 fl ,5)_

(1 H) HEC-324,41 m

] 1/9 H(1 H) HC-18

4,18 m (1 H) HC-173,85 s 3,0 H (3 H) H3CO-C-I?33,54

3,53

s

s '_ 5,8 H(3

(3

H)"

H).H3CO-C-I73

. H3C-I213,32 q (J=8)

5,2 H(2 H) HoC-81

^* 13,22 s (3 H) H3C-212,90 s 3,1 H (3 H) H3C~712,1-2,8 b 4,3 H (4 H) H2C-171,1722,09 s 0,3 H Aceton1,80 d (J=7) 2,9 H (3 H) H3C-I811,52 t (J= 8) 3,5 H (3 H) H3C-820,3-0,5 b 0,9 H (1 H) HN

-1,8 bs 0,9 H (1 H) HN

Das Spektrum enthält keine Anhaltspunkte für das Vor¬liegen des 13 - (S)-Epimeren (vgl. [166] ) .

0,13 Mol/1 in CDC13*

189,6 S C-131 105,2 S C-15173,3 S C-173,C-16 104,1 D C-10172,1 S C-19 97,2 D C-5169,6 S C-133 93,0 D C-20161,2 S C-13 64,7 D C-132155,3 S C-6 52,8 Q CH3O-C-I33150,7 S C-9 51,6 Q CH3O-C-I73149,6 S C-14 51,1 D C-17144,9 S C-8 50,1 D C-18141,9 S C-l 31,1 T C-171137,8 S C-ll 29,9 T C-172136,3 S C-3 23,1 Q C-181135,9 S C-4,C-7 19,1 T C-81131,6 S C-2 17,2 Q C-82128,8 S+D C-12/C-31 12,0 2Q C-21,C-121122,4 T C-32 10,9 Q C-71

Die vorliegenden Daten stimmen mit denjenigen in [131]und [134] innerhalb 0,5 bzw. 0,1 ppm überein.

- 131 -

5.3.2. Phäophorbid a (21)

co2ch3

o

co2ch3C02H

o

C02CH3

2Q_

C36H38N4°5606,73

21R + 21S

C_cH_.N.O,.

35 36 4 5

592,70

Ein Gemisch aus einer Lösung von 600 mg (0,99 mMol) 20 in

20 ml HCl/10 ml HO und 50 ml Äther49)

wurde 5 mal am WV

evakuiert und mit Argon wieder begast. Man kochte während

30 Minuten am Rückfluss (T = 32 C). Die Ätherlösung über

der dunkelgrünen wässrigen Phase blieb dabei völlig farblos.

Man kühlte anschliessend im Eisbad ab und goss auf 900 ml

Eiswasser/110 ml CH„C1„. Die organische Phase wurde zweimal

mit gesamthaft 1300 ml Eiswasser gewaschen und die Wasser¬

phasen zweimal mit je 60 ml CH„C1? extrahiert. Um die letzten,

hartnäckigen Emulsionen zu brechen, filtrierte man die ver¬

einigten organischen Phasen durch Glaswatte, dekantierte er¬

neut, trocknete mit Na~SO. und dampfte am RV ein. Das Rohpro¬

dukt enthielt laut DC (Aceton) je ca. 5-10 % Edukt und Pyro-

49) Der Äther war ursprünglich nur für die Temperaturkontrolle verwendet

worden, seine Anwesenheit hat jedoch einen entscheidenden Einfluss

auf den Reaktionsverlauf. Beim Umsatz von Methylphäophorbid a mit

konz. HC1/H20 2:1 während 30 Minuten bei 50-54° C konntai im Rohpro¬

dukt deutlich erhöhte Anteile an Pyrophäophorbid a (26) und Edukt (!)

festgestellt werden, so dass das gewünschte _21_ durch Kristallisation

nicht gereinigt werden konnte.

50) Umsetzung bei RT ergab ein ungünstigeres Resultat.

- 132 -

phäophorbid a (2J5) (Vergleich durch Mischchromatogramm mit

Hydrolyseprodukt von Methyl-pyrophäophorbid a; vgl. 5.3.6.,S. 145).

Man löste in 60 ml siedendem CH-Cl^/Aceton 1:1 und filtrier¬

te dann unter Stickstoff-Überdruck durch eine Nutsche D 3,

engte ein und kristallisierte fraktioniert aus CH Cl unter

Argon. Das so von ^_0 befreite Kristallisat wurde mehrmals aus

heissem Aceton umkristallisiert, um das noch vorhandene 2_5 zu

entfernen. Dabei reicherte sich 21S in den Kristallen gegenŸber 21R deutlich an.

Ausbeute: 4 56 mg = 0,77 mMol entspr. 78 %

Analytische Daten von 21 (3 mal aus Aceton kristallisiert)

Smp,

DC:

violettblaue Blättchen

Epimerengemisch von 21S und 21R 29:71 ( H-NMR)

ca. 250° C (Zers.)

Kieselgel, Aceton

zwei Flecken mit Rf = 0,75 (21S) und 0,71 (21R)(Pyrophäophorbid a: Rf = 0,67)

UV/VIS: 240,4 yg in 50 ml, c = 8,11-10 Mol/1

Dioxan* 669 (50'300), 632/min (3'900), 611 (7'800), 581/min(1'600), 562 (3'000), 552/min (2'500), 537 (9'400),525/min (4*400), 508 (11*500), 484/min (3'800), 472(4'400), 455/min (3'300), 412,5 (105*200), 401/Sch(88'400), 380/Sch (58*300), 331/min (19'600), 323(20'600), 296,5/min (12'100), 278 (14'800), 259/min(13'300)

IR:

KBr 3600-2800w, 3390w, 2960w, 2930w, 2870w, 1740s, 1700s,1670s, 1617s, 1583m, 1555m, 1540m, 1500m, 1490Sch,1455m, 1435m, 1400m, 1370m, 1347m, 1297m, 1222s,1200Sch, 1160m, 1125m, 1090w, 1060w, 1035m, 990m,970Sch, 913w, 898m, 845w, 815w, 770w, 750w, 740w,730w, 720w, 710w, 675w

- 133 -

"H-NMR: 0,11 Mol/1 in Pyridin-d,

ppm

Anz. Protonen

beob. theor.

9,64

9,60

s0,9 H (1 H) HC-10

9,43

9,39

s1/0 H (1 H) HC-5

8,77

8,75

s0,9 H (1 H) HC-20

8,69 Pyridin

8,00 d- d (J=18 ,11) 1,4 H (1 H) HC-31

7,53 Pyridin

7,16 Pyridin

6,83

6,601,4 H (1 H) HC-132

6,23

6,10

d-

d-

d (J=

d (J=

18

11

;2)

;2)2,4 H

(1

(1

H)

H)

HzC-32HEC-32

4,4-4,8 b 2,2 H (2 H) HC-18,17

4,00

3,90 s3,0 H (3 H) H3CO-C-I33

3,58

3,52

s

q (J=8)

~

5,2 H(3

(3

H)

H)

H3C-I21H2C-8l

3,25 s 3,0 H (3 H) H3C-2}3,02

2,4-3,0

s

b

—

6,6 H(3

(4

H)

H)

H3C-71H2C-171,17

1,97 Aceton

1,85 d (J=7) (3 H) H3C-I811,75 6,0 H 7

1,58 t (J=7) (3 H) H3C-820,4-0,8 b£ 1,1 H (1 H) HN

-1,2 bs 0,4 H (1 H) HN

Aus der Integration der Signale lässt sich ein Ver¬

hältnis von 21R zu 21S von ca. 67:33 berechnen.

T^Mfcy/ VrflW1

J4,+-*i*H*ttfilHtfiV*tftf ^*^S^^^^->^^A^Vy^V>^V^IWI ^M-»»** .^>»^^^%^*^^'nM^^^V>WMH<r^

jJüLwiJi-4i'''i^»^tM»>^ wnW 'S^Mf^^

Abb. 29: -*-H-NMR von Phäophorbid a in Pyridin-d,-

- 134 -

5.3.3. Veresterungsversuche von Phäophorbid a

Unter anderem wurden folgende Experimente durchgeführt:

1. Zu einer entgasten Lösung von 4,6 mg (7,9 yMol) 2JL und

25,5 mg Cetylalkohol 1_3 in 5 ml CH^Cl- (gesättigte Lösung)51)wurden unter Argon 2 0 yl DMF-dineopentylacetal ge¬

tropft und bei RT gerührt [168]. Weder nach 44 noch nach

114 Stunden wurde ein vollständiger Umsatz erreicht.

Im DC zeigte sich ein komplexes Gemisch verschiedener De¬

rivate.

2. 4,2 mg (7,1 yMol) ,21. wurden in 5 ml CH Cl * mit 10 yl52)

2 2

(75,3 yMol) DMF-dimethylacetal bei RT umgesetzt.

Selbst nach 8 Tagen wies man im DC noch bedeutende Men¬

gen Edukt neben ^_0 und weiteren Produkten nach.

3. Zu einer entgasten Lösung von 58 mg (97,9 yMol) 2\_ in53)40 yl (190,5 yMol) Äthyldiisopropylamin '

und 2 ml THF

wurde unter Argon bei -10 C 15 yl (190 yMol) Chloramei-54)

sensäuremethylester zugespritzt und unter Rühren auf¬

gewärmt [107,232], Nach zweistündigem Rühren bei RT gabman im Argonstrom 138,2 mg (570 yMol) Cetylalkohol zu,

rührte weiter während 6 Stunden bei RT und arbeitete dann

mit einer Mischung aus 20 ml Phosphatpuffer, 150 ml H~0

und 150 ml Äthylacetat auf. Nach Waschen mit H„0 wurde

die organische Phase mit Na„SO. getrocknet und eingeengt.Fällung aus 5 ml siedendem Äthylacetat mit 50 ml Hexan

ergab 4 5,2 mg Produkt. Aus der Mutterlauge erhielt man

weitere 6,1 mg violettblaues Pulver. Beide Fraktionen ent¬

hielten laut DC höchstens geringe Mengen _L3, daneben ge-

51) Dimethylformamid-dineopentylacetal: Fluka, prakt.

52) Dimethylformamid-dimethylacetal: Fluka, prakt., unter Argon frischdestilliert

53) Äthyldiisopropylamin: Fluka, puriss., über Kalium destilliert

54) Chlorameisensaure: Fluka, purum, unter Argon destilliert

sind.getrennt

unvollständignurHauptpeaksdenvon22Svonnale

Sig¬diedawerden,ermitteltnichtSpektrumgenden

vorlie¬demauskann22Szu22RvonVerhältnisDas

alkohol)H2C-(Cetyl-H3,3

H2C-82H3C-I81

H)

H)GJ

GJH6,3

H2C-171,172H)(4H5,0

H3C-71H)(3H2,8

H3C-2lH)(2

H)(2H8,3 H2C-81H3C-I21H)(3H3CO-C02-H)(3

H3CO-C-13/H)(3H5,2

HC-17,18H)(2H2,0

H2C-32H)(2H2,8

HC-132H)(1

CHC13

HC-31H)(1H0,8

HC-20H)(1H0,8

HC-5H)(1H1,0

HC-10H)(1H1,0

theor.beob.

Protonen.Anz

]bs

(J=7)t

(j=6)d

b

s

s

q

s

s

s

b

(J=18;ll)d-d

s

s

s

1,21

1,53

1,79

2,0-2,7

2,97

3,25

3,4

3,57

3,71

3,83

4,1-4,6

5,9-6,3

7,1

7,7

8,40

8,97

9,13

ppm

MHz)(60CDC1inMol/10,1"H-NMR:

894m908w,

983m,1035m,1088s,1123m,1160m,1295m,1345m,

1367m,1378w,1400w,1408w,1435m,1450m,1495m,

1550m,1580w,1620m,1635m,1695s,1740s,1825m,

2870w,2930m,2940m,3000w,3030w,3390w,3700w,3

CHCl

mm0,2%,3IR:

(21)0,390,63,0,76,beiVerunreinigungen

22),(Hauptfleck;0,60=Rf

1:1Hexan/AcetonKieselgel,DC:

22:vonDatenAnalytische

-Car-17umH-NMRundIRlautsicheshandelteProdukt

31

(22).aboxymethyl-phäophorbid

:lautsicheshandelteProdukt

BeimVerunreinigungen.weitereundEdukt%10ca.samthaft

-135-

- 136 -

22 hydrolisierte bei allen Chromatographieversuchen. Das

Hydrolyseprodukt konnte durch Umsetzung mit Diazomethan

wieder in Methylphäophorbid a (_2_0) übergeführt werden

(Identifikation durch Misch-DC).

Versuche, das gemischte Anhydrid 2_2 durch Umsetzung mit

einem Uberschuss an Cetylalkohol unter Zusatz von

3,3,6,9,9-Pentamethyl-2,10-diazabicyclo [4,4,0]-1-decen-2-oxid [170,171] oder von 4-Dimethylaminopyridin [169] in

THF bei 70 C zu verestern, brachten keine befriedigendenResultate. Während im ersten Experiment neben dem gew'Snschten Cetyl-phäophorbid a (später identifiziert durch Misch-

DC) auch Säure 2_1 und eine weitere Substanz, wahrschein¬

lich 20_, in grossen Anteilen nachgewiesen wurde, enthielt

das Produkt im zweiten Experiment noch zusätzlich weitere

Nebenprodukte.

Versuche zur Veresterung mit 1_3 und Trifluoracetanhydrid

[233] brachten ebenfalls keinen Erfolg.

Versuche zur Veresterung mit Cetylalkohol und Phosgen( [118] , vgl. auch [107]) in Pyridin erbrachten ein gün¬

stigeres Resultat (Hauptfleck im DC ca. 70 %, kein Edukt).

Durch Zusatz von 4-Dimethylaminopyridin zur Reaktionslö¬

sung konnte (laut DC) keine Verbesserung der Ausbeute er¬

reicht werden.

Präparative Ansätze wurden deshalb nach der unter 5.3.4.

beschriebenen Vorschrift durchgeführt.

- 137 -

5.3.4. Cetyl-phäophorbid a (23)

Substanz erstmals hergestellt von H. Fischer [118]

co2h

o

co2ch3C02C16H33

21R + 21S

C35H36N4°5592,70

23R + 23S

C51H68N4°5817,13

243,1 mg (0,41 mMol) Phäophorbid a, 495,4 mg (2,043 mMol)

Cetylalkohol (1_3) und 10 ml Pyridin wurden in einem 50 ml-

Kolben mit Magnetrührer, Zweihalsaufsatz mit Hahn und Serum¬

kappe vermischt. Die Mischung wurde durch Einfrieren entgast

und anschliessend mit Argon begast. Durch Erwärmen im Wasser¬

bad auf ca. 30 C wurden beide Edukte vollständig gelöst.

Man kühlte im Eisbad, wobei die Ausgangssubstanzen völlig ge¬

löst blieben, und tropfte unter intensivem Rühren mittels

einer Spritze während einer Stunde 2,4 ml (4,85 mMol) Phos¬

genlösung zu. Der entstandene graubraune Brei wurde während

2 Stunden bei RT nachgerührt, das Reaktionsgemisch anschlies¬

send mit Methylenchlorid verdünnt und in 750 ml Eiswasser ein¬

getragen. Man zog die Wasserphase mit 500 ml CH„C1 in 4

Portionen aus (die entstehenden Emulsionen lösten sich je¬

weils innerhalb 5 Min. weitgehend auf), wusch die organischen

Phasen mit ca. 1000 ml H^O in 2 Portionen, vereinigte und

filtrierte durch Glaswatte, um die letzten Emulsionen zu

brechen. Die organische Phase wurde abgetrennt, filtriert

und dann am RV vorsichtig (Tendenz zu Siedeverzügen.1) einge¬

engt. Am HV wurde das verbliebene Pyridin entfernt und das

- 138 -

Produktegemisch über Nacht bei RT getrocknet. Das Gemisch

zeigte im DC (Kieselgel, Hexan/Aceton 1:1) kein Edukt mehr,der Anteil an _2_3 betrug schätzungsweise 70 %.

HCl-Fraktionierung:

Das rohe Produktegemisch wurde in 300 ml Äther (entgast durch

Einleiten von Argon während ca. 10 Min.) aufgenommen und 5

mal mit 30 ml einer äthergesättigten 32-proz. eisgekühlten55)

Salzsäurelösung extrahiert. Die Salzsäurephasen wurden

auf 750 ml Eiswasser gegossen und 6 mal mit CH Cl ausgezogen.Die Methylenchloridphasen wurden vereinigt, einmal mit HO,das 30 ml Puffer pH 7 und 30 ml Phosphatpuffer enthielt, und

einmal mit reinem H^O gewaschen. Man presste die Methylen¬chloridphasen mit StickstoffÜberdruck durch eine Nutsche G 3,um die verbliebenen Emulsionen zu brechen, trennte die wäss-

rige Phase ab, trocknete die CHC1„-Phase mit Na SO., engteein und trocknete anschliessend am HV während 2 Stunden bei RT.

Es blieben 275,3 mg Rohprodukt I, das im DC nur noch wenig

Verunreinigungen zeigte, jedoch noch nicht ganz frei von

Pyridin war (Geruch!).

Die Ätherphasen enthielten neben _13_ immer noch wenig Cetyl-phäophorbid a. Sie wurde deshalb eingeengt und die HCl-Frak¬

tionierung wurde mit den halben Lösungsmittelmengen wiederholt.

Nach Trocknen am HV blieben 80 mg Rohprodukt II, das laut DC

jedoch bedeutend mehr Nebenprodukte als Rohprodukt I enthielt.

Die 2 75,3 mg Rohprodukt I wurden chromatographiert:90 g Kieselgel; Säule: 22 x 430 mm, aufgezogen in Hexan/Aceton92:8; Substanz in ca. 2 0 ml Benzol aufgetragen; Elutionsmittel:Hexan/Aceton 92:8, 90:10, 70:30; Tropfgeschwindigkeit ca.

120 ml/h. Die Säule wurde vorsichtshalber vor Licht geschützt.

55) Hergestellt aus 100 ml konz. HCl + 19 ml f^O; die äthergesättigteLösung enthielt ca. 55 Vol-% Et2Ü.

- 139 -

Mit grösstem Rf-Wert wurde zuerst wenig 1_3 eluiert, das mit

den weiteren farblosen Fraktionen verworfen wurde. Man elu-

ierte 163,8 mg (0,20 mMol) laut DC vollständig nebenprodukt¬

freies Cetyl-phäophorbid a (2_3) . Vor- und Nachfraktionen

enthielten ebenfalls noch gewünschtes 2^3. Sie wurden mit dem

Rohprodukt II vereinigt und erneut unter den beschriebenen

Bedingungen chromatographiert. Es konnten weitere 54,4 mg

DC-einheitliches 2_3 isoliert v/erden.

Ausbeute: 209,2 mg = 0,256 mMol entspr. 62,4 %

Kristallisation:

Zu einer Lösung von 16 3,8 mg Cetyl-phäophorbid a in 3 ml

heissem Aceton* spritzte man 12 ml heisses Methanol* zu und

Hess die Lösung während ca. 4 Stunden auf 4 C abkühlen. Die

Mutterlauge wurde abgetrennt und die Kristalle erneut umkri¬

stallisiert. Nach Trocknen am HV blieben 155,3 mg _2_3 als sehr

feine, dunkelblau glitzernde Kristalle.

Analytische Daten von 23

Smp.: 132-133° C

DC: Kieselgel, Methylenchlorid/Aceton 95:5

Rf = 0,62, einheitlich

Kieselgel, Hexan/Aceton 1:1

Rf = 0,84, einheitlich (Cetyl-pyro-phäophorbid a: 0,82)

Kieselgel, Hexan/Aceton 70:30

Rf = 0,33, einheitlich (Cetyl-pyro-phäophorbid a: 0,38)

HPLC: System II, 75 ml/h, PE-LC-55, 280 nm

9,9 Min. 0,1 % ?

11,8 Min. 10,3 % 2_3S12,8 Min. 0,5 % ?

13,8 Min. 89,4 % 23R

23S und Cetyl-pyro-phäophorbid a haben identische

Retentionszeiten.

23S und 23R wurden separat aufgefangen und zeigten

nahezu identische UV/VIS-Spektren.

- 140 -

System III, PE-LC-55, 415 nm

7,4 Min.

7,8 Min.

8,4 Min.

0,1 %

14,7 %

85,1 %

23S

23R

(Cetyl-pyro-phäophorbid a: t = 9,0 Min.)

UV/VIS: 326,1 yg in 50 ml, c = 7,98-10~6 Mol/1Dioxan* 669 (53'900), 632/min (4'500), 610 (8'400), 583/min

(2'000), 561 (3'100), 551/min (2*800), 536 (10*000),524/min (4*800), 507 (12*100), 483/min (4*100), 473(4*300), 454/min (3'100), 412 (112*900), 400/Sch(92*600), 380/Sch (62'100), 331/min (19*500), 323(20'400), 295/min (12'200), 274 (15'700)

IR: 5 %, 0,1 mm

CHC1 3400w, 3000w, 2960m, 2930s, 2858m, 1735s, 1700s,1620m, 1580m, 1555w, 1540Sch, 1500m, 1467w, 1452w,1435w, 1410w, 1400w, 1380Sch, 1370w, 1347w, 1295w,1162m, 1122m, lllOw, 1090w, 1058w, 1033m, 985m,970Sch, 910w, 895w, 854w, 840w, 820w

1H-NMR: 0,10 Mol/1 in CDC1 * (Abb. 30)

ppm

9,30 s

9,27

9,12 s

9,08

8,51 s

8,45

7,79 d-d (j=18;ll7,20

6,26 s

6,14

6,16 d-d (J=18;2)6,04 d-d (J=ll;2)5,22

4,1-4,6 b

3,87 s

3,81

3,8-4,0

3,60 s

3,43 q (J =8)3,39 s

2,99 s

2,0-2,6 b

1,82 d (J=7)1,58 t (J=8)1,1-1,2 b

0,85 t (J=6)0,41 b

-1,78 bs

Anz .

beob.

0,8 H

0,7 H

0,9 H

0,7 H

2,7 H

Protonen

theor.

4,9 H

8,5 H

3

4

39,2 H

1,0 H

0,8 H

(1 H)

(1 H)

(1 H)

(1 H)

HC-10

HC-5

HC-20

HC-31

CHC13

(1 H) HC-13:

(1 H)

(1 H)

2,0 H (2 H)

(3 H)

(2 H)

(3 H)

(2 H)

(3 H)

(3 H)

(4 H)

(3 H)

(3 H)

(28 H)

(3 H)

(1 H)

(1 H)

HZC-32HEC-32

CH2C12HC-17,18

H3CO-C-I33

H2C-Ce 1

H3C-I21H2C-8lH3C~2H3C-71H2C-171,172H3C-I81H3C-82H2C-Ce 2-15

H3C-CeHN

HN

16

- 141 -

C-NMR: 0,075 Mol/1 in CDC1 *

189,6 S C-131

173,0 s C-173,16172,2 s C-19

169,7 s C-133

161,2 s C-13

155,5 s C-6

150,9 s C-9

149,6 s C-14

145,0 s C-8

142,0 s Ol

137,9 s Oll

136,4 s C-3

136,1 s C-7,4

131,7 s C-2

129,0 S+D C-12,31122,6 T C-32

105,3 s C-15

104,3 D C-10

97,4 D C-5

93,1 D C-20

Die Zuordnung der Signale erfolgte in Analogie zu

denjenigen von Methyl-phäophorbid a [131,34], die

chemische Verschiebung der C-Atome in der Seiten¬

kette wurde nach [2 34] abgeschätzt.

Abb. 30: H-NMR von Cetyl-phäophorbid a in CDC1

Analyse: OnH,oN,0c, MG = 817,13bi oo 4 b

ber.: C 74,96 H 8,39 N 6,86 %

gef.: C 75,04 H 8,47 N 6,83 %

56) 23R:23S nach Aufnahme des C-NMR-Spektrums laut HPLC 85,4:14,4;

kein Allomer.

56'

78,3

77,0 CDC1

75,7

64,8 D+T C-132,Ce 1

52,8 Q CH3O-OI3351,2 D C-17

50,1 D C-18

31,9 T C-Ce 14

31,2 T C-171

29,7 T_ C-172

29,4

29,2

TC-Ce 2,4-1

28,5

25,8 T C-Ce 3

23,1 Q C-181

22,7 T C-Ce 15

19,3

17,3

T

Q

C-81C-82

14,1 Q C-Ce 16

12,1 2Q C-21,12111,0 Q C-71

- 142 -

5.3.5. Methyl-pyro-phäophorbid a (24)

(Vorschrift nach [133])

C02CH3

24_

C34H36N4°3548,69

1,0 g 2_0 (1,65 mMol) wurden in einem 250 ml-Kolben, versehen

57)mit Magnetrührer und Rückflusskühler, mit 100 ml Collidin

versetzt und unter intensivem Rühren 3 mal während ca. 2 Min.

am WV evakuiert und mit Argon begast. Anschliessend kochteCT Q \

man während 12 Minuten am Rückfluss. Die Lösung wurde ab¬

gekühlt und das Lösungsmittel am HV abgesaugt. Reste von

Collidin entfernte man durch mehrmalige Zugabe von Benzol und

Abziehen am RV. Der Rückstand wurde in CH^Cl aufgenommen,die Lösung durch Watte filtriert, am WV partiell eingeengtund dann erwärmt. Man gab heisses Aceton zu, liess während

16 Stunden auf 4 C abkühlen und isolierte 2A_ in sehr feinen

Nadeln.

Ausbeute: 0,738 mg =1,35 mMol entspr. 82 %

57) Sym. Collidin: Fluka, puriss. p.a.

58) Vorversuche hatten gezeigt, dass schon nach 10 Min. ein vollständigerUmsatz erreicht war (Reaktionszeit nach [235] : 90 Min.) .

20

C36H38N4°5606,73

- 143 -

Die Mutterlaugen aus verschiedenen Nachschubansätzen wurden

vereinigt und erneut aus Methylenchlorid/Aceton kristalli¬

siert; es wurde so eine durchschnittliche Ausbeute an kristal¬

linem DC-reinem _2_4 von 84 % erhalten.

Analytische Daten von 2 4

Smp.: 234-235° C

DC: Kieselgel, Methylenchlorid/Aceton 92:8

Rf = 0,60, einheitlich

(_2_0: Rf - 0,53)

UV/VIS: 235,8 yg in 50 ml, c = 8,60-10~ Mol/1

Dioxan* 668 (56*100), 631/min (4*400), 610 (8*100), 581/min

(1'500), 559 (2'900), 551/min (2'600), 537,5 (9'700),

525/min (4'500), 507,5 (12'300), 484/min (4'200),

475 (4'400), 455/min (3'100), 412 (120'500), 399/

Seh (95'200), 379/Sch (62'000), 329,5/min (18'200),

319 (21'100), 293/min (13'500), 279 (15*600), 252/

min (9*000), 239 (14*000)

IR: 4 %, 0 ,1 mm

CHC13 3400w, 3005m,

1620s, 1580w,

1400w, 1366m,

1090w, 1058w,818w

2965m, 2930w, 2870w, 1730m, 1685s,

1555m, 1487s, 1450w, 1435w, 1408w,

1346m, 1305w, 1160m, 1123m, 1109w,

1025m, 980w, 923w, 910w, 893w, 850w,

- 144 -

"H-NMR: 0,16 Mol/1 in CDCl.

Anz Protonen

ppm beob. theor.

9,07 s 0,9 H (1 H) HC-109,00 s 0,9 H (1 H) HC-58,50 s 0,9 H (1 H) HC-20

HC-317,72 d- d (J=18; 11) 0,9 H (1 H)7,16

CHCI36,08 d- d (J= 18; 2)

~

1,9 H(1 H) Hzc-32

5,97 d- d (J=11; 2) _j (1 H) HEC-35,14 H

5,00_

A,

(J

B-System=20) 1,9 H (2 H) H2C-132

4,0-4, 5 b 2,0 H (2 H) HC-17,183,55 s 2,9 H (3 H) H3C-I2-1-3,42 s (3 H) H3CO-C-I3,35 q (J=8) 8,0 H (2 H) H2C-18l3,24 s

_ (3 H) H3C-2I2,93 s 3,1 H (3 H) H3C"7\2,0-2, 8 b 4,5 H (4 H) H3C-I71,1,74 d (J=7) (3 H) H3C-I811,64 s 6,1 H •?

1,51 t (J=8) (3 H) H3C-8Z-1,98 b 0,5 H (1 H) HN

Die Signale stimmen mit den bekannten Werten weit¬gehend überein [l33,10l].

13C-NMR: 0,07 Mol/1 in CDCl

196,1 S C-131C-17 ,16

103,9 D c-10173,5 S 97,0 D C-5171,2 S C-19 92,9 D C-20

160,2 S C-13 78,3157,8? 77,0 CDCl155,1 S C-6 75,7150,6

148,9

S

s

C-9

C-14 56,1 Q+DCH-,0-017

C-17144,8 s C-8 50,0 D C-18141,5 s C-l 48,0 T C-132137,7 s C-ll 31,0 T C-171136,0 s C-3 29,8 T C-172135,9

135,7

s

s ] C-7,4 23,1

19,3

Q

T

C-181C-81

131,4 s C-2 17,4 Q C-82129,2

128,1

D

S

C-31C-12

12,0

11,9

Q"

Q _j

C-21,121122,4 T C-32 11,1 Q C-71105,9 S C-15

- 145 -

5.3.6. Pyro-phäophorbid a (25)

co2ch3 C02H

24_

C34H36N4°3548,69

25

C33H34N4°5534,66

Eine Mischung von 284,3 mg (0,52 mMol) 2_4, gelöst in 5 ml

konz. HCl und 2,5 ml H„0, und 25 ml Äther wurde am WV ent¬

gast und unter Argon während 45 Min. am Rückfluss gekocht

(T = 32 ). Man kühlte ab, verdünnte mit 450 ml Eiswasser und

50 ml Phosphatpuffer und extrahierte mit CH^Cl«. Nach Wa¬

schen der organischen Phase mit H„0 filtrierte man durch Gla

watte, trocknete die Methylenchloridlösung mit Na„SO. und

engte ein.

Man kristallisierte aus heissem CH„Cl~/Aceton unter Argon

und konnte 17 3 mg Pyro-phäophorbid a (2_5) in Form feiner,

violettblau glänzender Blättchen isolieren. Aus der Mutter¬

lauge kristallisierten nochmals 72,1 mg DC-reines 25.

Ausbeute: 245,1 mg = 45,8 mMol entspr. 85,5 %

- 146 -

Analytische Daten von 25

Smp. 250

DC; Kieselgel, Aceton

Rf = 0,86, einheitlich,(24: Rf = 0,92)

-6UV/VIS: 206,0 yg in 50 ml, c = 7,71-10 Mol/1

Dioxan* 669 (53'100), 632/min (4'900), 612 (7'500)min (1'200), 561 (2'900), 552/min (2'300),(9'100), 525,5/min (3'900), 508,5 (11'700),(3'500),400/Sch

, 582,5/

537,5

485/min475 (3'900), 457/min (2'700), 413 (112'900)(88'500), 380/Sch (58'500), 331/min (17''i00)

319

min

(20'200)(ll'OOO)

294/min (12'300), 274 (15'300), 256/

IR:

KBr

3650-2800w, 3400w, 2970m, 2930m, 2870m, 1727s,1690Sch, 1670s, 1615s, 158lw, 1552m, 1537m, 1500s,1465w, 1450w, 1410m, 1400m, 1378w, 1368w, 1347m,1305w, 1220s, 1195s, 1175m, 1165m, 1123m, 1095w,1058w, 1027m, 982m, 940w, 912m, 902w, 890w, 870w,840w, 815w, 788w, 770w, 760w, 750w, 735m, 715m, 705m,680m, 600w

"H-NMR: 0,16 Mol/1 in Pyridin-dc

ppm

9,53

9,41

8,73

8,67

7,99

7,49

7,13

6,21

6,03

5,45

5,26

4,3-

3,53

3,52

3,26

3,03

2,2-

1,84

1,58

0,44

-1,6

s

s

s

Anz.

beob.

1,0 H

1,0 H

1,0 H

Protonen

theor.

(1 H)

(1 H)

(1 H)

d-d (J=18;ll) 1,3 H (1 H)

4,7

s

q

s

s

3,0 b

d

t

bs

7 bs

d'd (J=18;2)d-d (J=ll;2)

A,B-System(J=20)b

(J=7)

(J=7)

(J=8)

2.0 H

2.1 H

2,1 H

4,8 H

3,1 H

3.1 H

4.2 H

3.0 H

3.1 H

0,9 H

0,5 H

(1 H)

(1 H)

(2 H)

HC-10

HC-5

HC-20

PyridinHC-31Pyridin

PyridinHzC-32HEC-32

HoC-132

(2 H) HC-17,18(3 H) H3C-I21

H2C-8l(2 H)

(3 H) H3C-2I(3 H) H3C-71

H2C-17;SH3C-I81

(4 H)

(3 H)

(3 H) H3C-82(1 H) HN

(1 H) HN

17'

- 147 -

5.3.7. Cetyl-pyro-phäophorbid a (26)

co2h C02C16H33

2_5

C34H36N4°3548,69

2£

C49H66N4°3759,09

Zu einer entgasten Lösung von 104,6 mg (0,20 mMol) 2_5 und

241,9 mg (1,00 mMol) Cetylalkohol in 5 ml Pyridin wurde wäh¬

rend 10 Min. 1,2 ml (2,42 mMol) Phosgenlösung bei 0 C unter

massigem Rühren zugespritzt. Man liess den dickflüssigen Brei

im Eisbad während 3 Stunden stehen, nahm dann in 80 ml CH CL

auf und schüttelte mit einer Lösung aus 50 ml Phosphatpuffer

und 350 ml Eiswasser. Die organische Phase wurde mit 800 ml

Eiswasser in 3 Portionen gewaschen, die Wasserphasen mit

CH Ck extrahiert, die Methylenchloridphasen vereinigt und

nach Filtration durch Glaswatte mit Natriumsulfat getrocknet,

eingeengt und das restliche Pyridin am HV entfernt.

Man nahm das Rohprodukt in 150 ml Äther auf und extrahierte

dreimal mit 25 ml einer äthergesättigten 30-proz. Salzsäure¬

lösung (100 ml konz. HCl + 19 ml HO + 130 ml Äther), ver¬

dünnte die HCl-Phasen mit Eiswasser und zog mehrmals mit CH„C1~

aus. Die organischen Phasen wurden neutral gewaschen, mit

Na„S0. getrocknet und eingedampft.

Man chromatographierte den Rückstand an 70 g Kieselgel (ca.

500-fache Menge) mit Hexan/Aceton 90:10, vereinigte die DC-

einheitlichen Fraktionen, die laut HPLC (System II) weniger

- 148 -

als 1 % Verunreinigungen enthielten und trocknete am HV bei

RT.

Ausbeute: 82,5 mg = 0,11 mMol entspr. 56 %

Das so gereinigte _2_6 wurde zweimal aus heissem Aceton*/Metha-nol* 20:80 unter Argon umkristallisiert und ergab violett¬

blaue Kristalle in praktisch quantitativer Ausbeute.

Analytische Daten von 26:

Smp. : 99-100° C

DC: Kieselgel, Methylenchlorid/Aceton 95:5Rf = 0,62, einheitlich

(Cetyl-phäophorbid a: Rf = 0,62)

Kieselgel, Hexan/Aceton 70:30Rf = 0,38, einheitlich

(Cetyl-phäophorbid a: Rf = 0,33)

HPLC: System II, 96 ml/h, PE-LC-55, 280 nm

t = 10,3 Min., keine Verunreinigungen > 0,1

UV/VIS:

Dioxan*

IR:

CHC1.

System III, PE-LC-55, 415 nm

t =9,0 Min., keine Verunreinigungen > 0,1R

-6304,2 yg in 50 ml, c = 8,01-10 Mol/1

668,5 (55'600), 630/min (4'000), 609,5 (8'000),581,5/min (1'700), 561,5 (2'900), 550/min (2'600),537,5 (9'700), 525/min (4'500), 507,5 (12'200),484/min (4'000), 476 (4'400), 456/min (2'900),412 (119'200), 400/Sch (93'600), 380/Sch (61'900),329/min (17'900), 319 (20'800), 293,5/min (13*000),283 (16'500), 255/min (15'000)

0,1 mm

3400w,

1687s,

1453w,

1162w,

3030w,

1620m,

1410w,

1122w,

3006w,

1582w,

1400w,

lllOw,

2964m,

1554w,

1379w,

1091w,

2930s,

1535w,

1368w,

1057w,925w, 911w, 883w, 867w, 850w, 818w

2858m,

1498m,1348m,

1026m,

1726m,

1468w,

1306w,

980m,

- 149 -

1H-NMR: 0,11 Mol/1 in CDCl * (Abb, 31)

Anz Protonen

ppm beob. theor.

9,20 s 0,8 H (1 H) HC-10

9,11 s 0,9 H (1 H) HC-5

8,46 s 0,9 H (1 H) HC-20

HC-37,82 d- d (J=18, 13) 0,9 H (1 H)

7,18 CHCl 3

6,14 d- d (J=18, 2) 11/9 H

(1 H) HzC-32

6,01 d- d (J=13, 2) J (1 H) HEC-32

5,18~

5,04 _

A,

(J

B-Sys

=2 0)

tem1,9 H (2 H) H2C-132

4,1-4, 6 m 2,1 H (2 H) HC-17,18

3,95 t (J=6) 2,0 H (2 H) H2C-Ce 1

3,50 s (3 H) H3C-I213,45 q (J=8) 7,9 H (2 H) H2C-8l3,30 s (3 H) H3C"2T3,02 s 3,0 H (3 H) H3C-712,1-2, 8 b 4,4 H (4 H) H2C-171,1721,78 d (J=8) 3,1 H (3 H) H3C-I81

H3C-821,57 t (J=8)31,0 H

(3 H)

1,15 bs (28 H) H2C-Ce 2-15

0,84 (t) 3,4 H (3 H) H3C-Ce 16

0,22 b 1,1 H (1 H) HN

-1,9 b 0,8 H (1 H) HN

=p

-A

JL^jWj^

4 (Ja.

jW

mAJu"v Ju

1 0

l I

Abb. 31: H-NMR von Cetyl-pyro-phäophorbid a in CDCI3

- 150 -

13C-NMR: 0,07 Mol/1 in CDC1 *

196,1 S C-131173,2 S C-173,16171,4 S C-19

160,3 S C-13

155,1 S C-6

150,7 S C-9

149,0 S C-14

144,9 S C-8

141,5 S C-l

137,8 S C-ll

136,1 S C-3

136,0

135,7

S

S ] C-7,4

131,4 S C-2

130,5?1

129,2 D C-31

128,2 S C-12

122,4 T C-32106,1 S C-15

104,0 D C-10

97,1 D C-5

92,9 D C-20

78,3

77,0 CDC1-,

75,7J

64,8 T C-Ce 1

51,7 D C-17

50,0 D C-18

48,1 T C-13231,9 T C-Ce 14

31,2 T C-17129,8 T C-17229,6 T

~

29,4

29,2

T

TC-Ce 2,4

28,5 T_

25,8 T C-Ce 3

23,2 Q C-18122,7 T C-Ce 15

19,4 T C-8117,4 Q C-8214,1 Q C-Ce 16

12,0 2Q C-21,12111,2 Q C-71

Die Zuordnung der Signale im Porphyrinskelett erfolg¬te in Analogie zu Z4, die Signallagen der Seitenket-ten-C-Atome wurden mittels Additivitätsregeln [2 34]abgeschätzt.

Analyse: C^H^N^ber. : C 77,53 H 8,76 N 7,38gef. : C 77,50 H 8,84 N 7,32

- 151 -

5.3.8. Cetyl-chlorophyllid a (27_)

o

C02CH3C02C16H33

O

C02CH3C02C16H33

2Ä

C51H68N4°5817,13

21_

C51H66N4°5M^839,42

In einer unter 5.2.3. beschriebenen Apparatur (Abb. 18) wur¬

den 103,1 mg (0,13 mMol) Cetyl-phäophorbid a59)

in 1,4 ml

CH?C1* in der Wärme unter Argon gelöst. Anschliessend kühlte

man auf 11 C ab und spritzte dann 2,6 ml eines 0,8 3 M Mag¬

nesiumreagenzes rasch zu, wobei auch hier die Farbände¬

rung nach gelbgrün (vgl. S. 109) beobachtet wurde. Man liess

5 1/4 Min. bei 11-12 C rühren und arbeitete dann mit einer

eisgekühlten Mischung aus 200 ml Äther, 200 ml H„0 und 40 ml

Phosphatpuffer auf. Die Ätherphase wurde mit 600 ml H„0 ge¬

waschen, gegen 50 ml gesättigte NaCl-Lösung geschüttelt, mit

Na SO. getrocknet und am RV eingeengt. Anschliessend subli-

mierte man das BHT am HV bei 60-70 C ab und brachte das Pro¬

dukt in die Dry-Box.

59) Kristallisiert, laut HPLC weniger als 0,3 % Nebenprodukte, über

Nacht am HV bei RT getrocknet.

60) Grignard-Reagens aus entgastem Äthyljodid (Siegfried, purum, dest.

unter Argon) hergestellt.

- 152 -

Eine Probe der Ätherlösung wurde separat im Stickstoffström

eingeengt. Ihr UV/VTS-Spektrum (Äther) stimmte mit den Spek¬tren von Chi a (Rohprodukt) überein. DC (Silgur, Hexan/Ace-ton 70:30) und HPLC (System II, vgl. Tabelle 13) zeigten nur

wenig Verunreinigungen.

Das Produkt wurde unter den in 5.2.3. beschriebenen Bedingun¬gen zweimal aus 7+4 ml Dioxan durch Zutropfen von 3 ml H„0

gefällt und die durch Zentrifugieren gesammelte Substanz45)

gefriergetrocknet

Man isolierte 75,8 mg = 0,085 mMol entspr. 67,3 % 27 N 1

(berechnet für C,,H J O Mg • 0,5 H„0 • 0,5 Dioxan)

Aus den vereinigten Mutterlaugen wurden nochmals 19,6 mg= 0,022 mMol entspr. 17,4 % 27 N 2 isoliert.

Analytische Daten von 27 N 1

Smp.: 110-111° C (Zers.)

DC: Silgur, Hexan/Aceton 70:30Rf = 0,26, schwache Flecken bei 0,15 und 0,30

HPLC: System II, 74 ml/h, PE-LC-55, 280 nm

Tabelle 13

t relative Peakhöhe Mol-%

(Min.) roh N 1 N 2 N 1

5,0 -

-

9,4 0,4 - 2,2 -

10,4 0,5 - 0,3 -

11,0 0,5 0,1 2,2 0,111,8 0,3 0,2 0,7 0,112,8 1,1 0,3 3,8 0,214,6 1,9 9,0 66,7 6,416,0 -

- 0,3 -

17,7 -- 0,7 -

19,0 100,0 100,0 100,0 92,225,2 -

- 0,8 -

28,4 1,0 0,8 0,8 1,1

BHT

27S

27R

Allomer

- 153 -

UV/VIS: (Extinktionskoeffizienten ber. für MG = 892,48;

Äther*

Dioxan*

Aceton*

318,7 yg in 50 ml, c = 7,14-106Mol/1

658,5 (84*900), 632/min (7'700), 613 (12'600),

587,5/min (4'600), 573 (6*700), 546/min (2'500),

529,5 (3'600), 502/Sch (1'800), 466/rain (l'OOO),

427 (108'000), 412/min (67'900), 408 (68*600),

385,5/min (40'900), 380 (41'300), 337,5/min

(20'200), 323 (22'800)

364 yg in 50 ml, c 16-106Mol/1 (Abb. 32;

662 (83*200), 636,5/min (9'700), 623,5 (14'100),

615/Sch (13'100), 593,5/min (6'900), 586 (7'400),

543/Sch (3*300), 500/Sch (2'000), 475/min (1*200),

433 (119'300), 418/min (62*200), 411 (65*000),

393,5/min (38'400), 384,5 (40'300), 366/Sch (30'500),

346/min (21'200), 331 (23'700), 295/Sch (17*900),

283/Sch (16'900), 274/min (16'100), 249 (22'400)

387,7 yg in 50 ml, c = 8,69-10 Mol/1

(identische Probe für CD-Spektrum)

662 (71'400), 635/min (8*900), 616 (13*100), 590,5/

min (5*800), 578,5 (7'100), 547/min (2*600), 534

(3*200), 500/Sch (2'000), 470/min (1'300), 430

(89*400), 415,5/min (63'200), 410,5 (64*300), 385/

Seh (41*800), 343,5/min (20*400)

XJCr-

Abb. 32: UV/VIS von Cetyl-chlorophyllid a in Dioxan

CD:

Aceton*

Die Konzentration der Lösung wurde mit MG = 892,41

berechnet.

387,7 yg in 50 ml, c = 8,69-10~6 Mol/1

656 (-7,48), 631 (-0,56), 617 (-0,89), 597 (0,0),

580 (+0,56), 573-455 (<±0,05), 430 (+5,97), 413

(+2,46), 401 (+4,13), 367 (0,0), 362 (-0,50), 356

(0,0)

- 154 -

IR: %, 0,2 mm61)

CHC1 *

KBr

'H-NMR:

3000w, 2960m, 2930s, 2855s,1610s, 1552s, 1530m, 1490m,1390w, 1377w, 1345m, 1325m,1147m, 1123m, HOOw, 1080w,985w, 918w, 890w, 875m

1730s, 1676s, 1640m,1466m, 1450m, 1432w,1305w, 1285s, 1185m,1069m, 1040m, lOOOw,

3650-3100w, 2960m, 2923s, 2855s, 1736s, 1690s, 1655m,1605m, 1550m, 1532m, 1487m, 1465m, 1448m,1375w, 1345m, 1325m, 1300m, 1285m, 1256m,1180m, 1155m, 1130m, HOOw, 1068m, 1038m,970w, 915m, 869m, 850w, 840w, 815w, 796m,721w, 702w, 610w

1432m,

1238m,

995m, 985m,765w, 741m,

0,02 Mol/1 in Aceton d * (gesättigte Lösung)

Anz. Protonenppm beob. theor.

9,67 s 0,9 H (1 H) HC-109,36 s 1,0 H (1 H) HC-58,52 s 0,9 H (1 H) HC-208,07 d-d (J=18 ;ll ) 1,4 H (1 H) HC-31

HZC-36,19 d-d (J=18 ;2) (1 H)6,12 s 3,2 H (1 H) HC-1325,97 d-d (J=ll ;2) (1 H) HEC-325,58

CH2C124,3-4, 7 b

2,8 H(1 H) HC-18

4,0-4, 3 b (1 H) HC-173,78 s (3 H) H3CO-C-1333,78 b 6,2 H (2 H) H2C-Ce 13,78 q? ( J=7) (2 H) H2C-813,53 s 2,3 H (3 H) H3C-I213,44 s 3,8 H Dioxan3,30

3,24

s

s

~

S.7 H(3

(3

H)

H)

H3C-21H3C-71

2,60 bs 2,3 H H202,1-2, 5 b 4,1 H (4 H) H2C-171,1722,01 quirituple tt Aceton d51,75 d (Jr=8)

~

7,0 H(3 H) H3C-I81

1,68 t (Jr=7) (3 H) H3C-821,0-1 4 b

'_ 30,5 H(28 H) H2C-Ce 2-15

0,86 (t) (3 H) H3C-Ce 16

Die Lage der Signale des Porphyrinskeletts stimmtinnerhalb ca. 0,01 ppm mit denjenigen von Chi a (inAceton) überein. Die Signale von 27S sind nur andeu¬tungsweise sichtbar.Die Integration der Peaks ist infolge der geringenKonzentration von 27 (geringere Löslichkeit als Chi a.')

61) Laut HPLC keine messbare Zunahme des Allomergehaltes während der Auf¬nahme des Spektrums.

- 155 -

relativ ungenau. Die breiten oder stark aufgespalte¬

nen Signale ergeben gegenüber den Singletts zu hoh.

Integrationswerte. Während sich die Menge an Dioxan

ungefähr abschätzen lässt, ist es schwierig, die Menge

an Kristallwasser zu bestimmen. Vermutlich stammt ca.

die Hälfte des beobachteten H2O aus dem Aceton dg.Die geschätzten Anteile an H2O und Dioxan (je 0,5 Mol)

lassen sich mit der Elementaranalyse vereinbaren.

Die Breite des Wassersignals wird als Hinweis dafür

interpretiert, dass das H2O teilweise am Magnesium

koordiniert ist und ein relativ langsamer Austausch

zwischen koordiniertem und unkoordiniertem H2O bzw.

deren Protonen stattfindet.

Nach Aufnahme des Spektrums hatte die Lösung laut

HPLC folgende Zusammensetzung: 27S: 11,6 %, 27R:

86,9 %, Allomere: 1,5 %.

1H-NMR: 0,08 Mol/1 in CDC1 */CD OD* 88:12 (Abb. 33)

ppm

9,50

9,46

9,24

9,20

8,30

8,22

7,95

7,28

6,14

5,98

5,25

Anz. Protonen

beob. theor.

d-d (J=18;ll)

d-d (J=18;2)"

d-d (J=ll;2)

3,5-4,5 b

3,96 s

3,94

3,60 s

3,50 s

3,34 s

3,28 s

3,07 bs

1,9-2,6 b

1,79 d (J=7)

1,70 t (J=7)

1,0-1,4 b

0,87 (t)

0,8 H (1 H) HC-10

0,8 H (1 H) HC-5

0,8 H (1 H) HC-20

0,9 H (1 H) HC-31

CHCI3

1,9 H(1

(1

H)

H)

HZC-32HEC-32

CH2C12(2 H) HC-17,18

(2 H) H2C-Ce 1

11,4 H(2

(3

H)

H)

H2C-81

H3CO-C-I32(3 H) H3C-I21

3,7 H

(3 H)

Dioxan

H3C-7I7,2 H (3 H) H3C-21

CD3OH4,4 H (4 H) H2C-171,172

34,5 H

(3

(3

H)

H)

H3C-I81H3C-82

(28 H) H2C-Ce 2-15

4,6 H (3 H) H3C-Ce 16

- 156 -

Die Signale des Porphyrinskeletts stimmen mit den¬jenigen von Chlorophyll a innerhalb ca. 0,05 ppmüberein.

Laut HPLC enthielt die Lösung nach Aufnahme desSpektrums 12,1 % 27£>, 83,5 % 27R, 2,5 % Allomere.

0,02 Mol/1 0,03 Mol/1in Aceton dg in CDC1 3CD

173,4 S 173,9 s C-173172 r6? s C-16

168 ,8 s C-133,19156,7 S 155 3 s C-14155,6 s 155 ,1 Ol

152,9 s 152 8 s C-6149,1 148 ,1 s C-4

147 6 s Oll

146,8 s 146 3 s C-9

145,0 144 ,1 s C-8

139 4 s C-3

135 8 s C-2

134 6 s

] 07

134 1 s 012

131,4 D 130 4 D C-31120,2 T 120 1 T C-32108,4 D 107 9 D O10

100,6 D 100 1 D C-5

93,7 D 92 6 D C-20

67,6 67, 1 T Dioxan66,1 D C-13264,8 T 65 0 T C-Ce 152,5 Q 53 1 Q H3C0-O13351,3 D 50, 5 C-1749,9 D 49 6 C-1832,6 T? 32 0 C-Ce 1431,1 30 ,8 C-17130,4 n 29 8 C-17230,1 29 2 C-Ce 2,4-13

28, 5

26,4 T 25 9 T C-Ce 323,9 Q 23

23,

6

0?

Q C-181

(27S)??23,3 T 22 8 C-Ce 1520,0 T 19 7 T C-8118,0 Q 17 6 Q C-8214,3 14, 1 Q C-Ce 16

12,5 2Q12

12

8

4

Q

Q ] C-21,12111,1 Q 11 1 Q C-71

- 157 -

Aceton d,6

Die Signale der Chlorophyllid-C-Atome weichen höch¬

stens 0,1 ppm von denjenigen von Chi a ab. Infolge

der geringen Konzentration sind nicht alle C-Atome

sichtbar.

Zusätzliche Signale von Aceton d5: 206,1, 32,1, 31,3,

30,6, 29,9, 29,1, 28,3 und 27,5 ppm.

Während der Messung trat Allomerisierung ein, offen¬

bar von eindringendem Sauerstoff verursacht (stärkere

Allomerisierung im Hals des Probenrohres).

Zusammensetzung der Probe nach der Messung: 19,7 %

27S, 69,7 % 2_7R, 10,6 % Allomere (HPLC) .

CDC1 /CD OD 88:12

Die Signale des Porphyrinskeletts stimmen mit denje¬

nigen in Chi a innerhalb 0,1 ppm überein. C-131, C-13,

C-15 und C-13^ konnten nicht beobachtet werden.

Im Spektrum findet man zusätzlich folgende Lösungsmit¬

telsignale: 78,6, 77,3 und 76,0 von CDCI3 und 50,8,

50,0, 49,1, 48,3 und 47,4 von CD3OD.

Während der Aufnahme des off-resonance-Spektrums muss-

te starke Allomerisierung in Kauf genommen werden.

Zusammensetzung der Probe nach der Messung: 27S: 14,7 %,

27R: 64,2 %, Allomere (mit grösserer Retentionszeit

als 27R): total 17,7 % (HPLC).

Abb. 33: H-NMR von 24_, 0,1 Mol/1 in CDC13/CD OD 88:12

- 158 -

Analyse: C H N^Mg -0,5 HO • 0,5 Dioxan MG = 892,48

ber. : C 71,32 H 8,02 N 6,28 Mg 2,72 %gef.: C 71,57 H 8,25 N 6,08 Mg 2,33 % 47>

Kristallisation:

Es wurde versucht, einen zum beschriebenen analogen Ansatz

aus Aceton/H„0 unter gleichen Bedingungen wie Chi a zu kri¬

stallisieren. Man liess die Lösung (92 mg Cetyl-chlorophyllida N 1 + N 2) während 30 Tagen eindunsten (App.: Abb. 23,

Stickstoffström ca. 1,6 1/h) und erhielt nach Abpipettier^nder Mutterlauge und Trocknen während 24 Stunden am HV ein

amorph aussehendes Pulver, das im Polarisationsmikroskop(500-fache Vergrösserung) als kristallin erkannt wurde. Die

grössten Abmessungen der Kristalle betrugen jedoch nur ca.

30 pm. Das Pulverdiagramm war demjenigen von Chlorophyll ähn¬

lich, aber etwas besser aufgelöst. Laut HPLC (System II, 280

nm) enthielt das Kristallisat neben ca. 1 % 27S ca. 20 % Allo-

mere, deren Entstehung auf die Verunreinigung der Dry-Box-

Atmosphäre zurückgeführt werden muss.

Ein weiterer Kristallisationsversuch konnte ohne bedeutende

Allomerisierung durchgeführt werden, die entstandenen Kristalle

(grösste Abmessungen ca. 20 ym) waren jedoch für eine Röntgen-

strukturanalyse leider unbrauchbar.

5.4

-159 -

Beobachtungen zur Komplexierung

5.4.1. UV/VIS-Spektren des Zwischenproduktes

Für die Messung der Spektren wurde eine 0,2 mm-UV-Zelle mit

Hahn und angeschmolzenem Reaktionsgefäss, verschlossen mit

einer Serumkappe, verwendet (Abb. 34). Nach mehrmaligem Eva¬

kuieren der Apparatur am HV und Begasen mit Argon wurde im

Argon-Gegenstrom die Serumkappe aufgesetzt. Mittels Spritze

wurde nun 0,3 ml einer ca. 2,5 mM Phäophytin-Stammlosung (durch

Einfrieren entgast) eingefüllt. Um eine gute Durchmischung zu

erreichen, spritzte man in scharfem Strahl 0,7 ml eines 0,71 M

Magnesiumreagenzes zu (Endkonzentra¬

tion an "Mg-BHT-J": 0,5 Mol/1).

Durch Neigen der Apparatur liess man

anschliessend das Reaktionsgemisch in

die UV-Zelle einfliessen. Die Spektren

wurden auf dem DW 2 nach verschiedenen

Reaktionszeiten bei RT aufgenommen.

Argon

Die Extrema und Extinktionskoeffizien¬

ten sind in Tabelle 14 zusammengefasst.

Die dort angegebenen Reaktionszeiten be¬

ziehen sich auf den Beginn der Aufnahme

(gesamte Aufnahmezeit: 60 Sek.).

Reaktions¬

gefäss

\

0, 2 nrai-

Zelle

In der gleichen Apparatur wurde unter

analogen Bedingungen auch Chlorophyll a

mit dem Magnesiumreagens umgesetzt. Da¬

durch wurden im wesentlichen die glei¬

chen Spektren erhalten; die Resultate

sind in Tabelle 15 zusammengestellt.

Abb. 3 4

- 160 -

i

Cn

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cd

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- 162 -

5.4.2. Epimerenverhältnisse von J. nach partieller Komplexierung

Je ca. 5 Mol Phäophytin a (Phäo a' : Phäo a = 28,8 : 71,2)wurden unter Argon in einem mit Magnetrührer, Zweihalsaufsatzmit Serumkappe und Hahn mit Argonballon versehenen Kolben in

1,05 ml CH~C1 * unter Rühren bei RT vollständig gelöst. An¬

schliessend wurden im Argongegenstrom 2,0 ml des 0,86 M Mag-nesiumreagens zugespritzt . Die so hergestellte Lösung war

0,56 M an Mg.

Die Reaktion wurde nach der angegebenen Zeit durch möglichstrasches Zuspritzen einer Mischung aus 5 ml Phosphatpuffer/H^O1:1 und 5 ml Äther (beide Komponenten durch Einleiten von

Stickstoff partiell von Sauerstoff befreit) abgebrochen. Man

nahm in 30 ml HO, 10 ml Phosphatpuffer und 30 ml Äther auf,

extrahierte, wusch die Ätherphase mit H„0, trocknete mit Na¬

triumsulfat, filtrierte und engte ein.

Man untersuchte die Reaktionsprodukte anschliessend mittels

HPLC (Tabellen 16 und 17)

G2) Bei einer Reaktionstemperatur von 10 C wurde auch das Magnesiumreagenszuvor auf 10° C abgekühlt.

- 163 -

Tabelle 16:

T = RT; System II, 76 ml/h, LDC-Monitor

Reaktionszeit; Angaben in Mol-%

63)

R

(Min.) 5 Sek. 10 Sek. 20 Sek.

5,4 BHT

7,2 0,8 2,8 1,4 1,0 0,8 1,3

8,0 0,1 - 0,2 - 0,3 0,4

8,6 0,1 0,8 0,7 0,9 1,1 1,8

9,1 - - 0,4 0,3 0,7 0,6

9,5 - 0,4 - 0,3 0,7 1,3

10,3 3,0 8,1 0,9 0,3 0,4 1,2

11,3 26,4 9,5 4,0 3,7 3,5 4,3 IS

12,2 0,5 0,8 1,0 0,8 0,7 0,8

12,8 54,2 56,8 67,3 68,0 48,5 47,2 IR

13,9 0,9 0,6 0,1 0,5 1,4 1,5 2S_

16,4 - 4,0 1,3 1,0 0,3 1,1

18,0 13,8 15,3 22,4 22,4 41,0 36,6 2R

19,2 - 0,7 0,1 0,6 0,4 0,8

24,8 ~ _ ~~ _ 0,4 1,0

Tabelle 17:

fcR

T = 10° C; System II, 80 ml/h, LDC-Detektor;

Reaktionszeit; Angaben in Mol-%

(Min.) 2 Sek. 5 Sek. 7 Sek.

4,9 BHT

6,6 2,9 1,1 0,4 - 0,5

7,2 0,4 - 0,2 - 0,2

7,8 0,2 - 0,2 - 0,2

8.2 0,7 1,0 0,5 0,5 0,6

9.3 6,0 1,5 1,5 3,8 0,9

10,1 14,8 15,3 8,4 9,1 8,8 IS

10,9 1,0 1,3 0,9 1,0 1,1

11,4 68,9 76,6 79,2 79,5 80,4 IR

12,9 2,1 0,4 0,8 1,2

13,8 0,4 - 0,3 -

15,1 0,5 0,6 0,5 0,2 0,6

16,1 1,6 1,9 4,4 4,7 6,8 2R

17,3 0,6 0,4 0,3

63) Die beiden Kolonnen für jede Reaktionszeit beziehen sich jeweils auf

einen einzigen Ansatz, die Proben wurden jedoch separat eingeengt und

durch HPLC analysiert.

- 164 -

REAKTIONSZENTREN

136.1. Synthese von [2- Cj-ö-Aminolävulinsäure

6.1.1. 3-Jodo-2-jodmethyl-propen-l (_32) [224,225]

HoCT

31_3_2

C4H7C1 C4H6J290,55 307,90

Die Synthese wurde nach der in unserem Laboratorium von M.G.

Bonetti [226] optimierten Vorschrift ausgeführt. In der ge¬

trockneten Apparatur, bestehend aus einem mit Gaseinleitrohr,Thermometer, mechanischem Rührer und Trockeneiskühler verse¬

henen 750 ml-Sulfierkolben wurden 220 g (2,08 Mol) Natrium-64)

carbonat vorgelegt. In leichtem Argongegenstrom wurden

181 g (2,00 Mol) Methallylchlorid (_3J.)'

zugegeben. Man lei¬

tete unter Rühren durch Schwefelsäure getrocknetes Chlorgasso rasch ein, dass die Reaktionstemperatur 46-51 C betrug,wobei die Apparatur im Wasserbad gekühlt wurde. Nach 2 1/2

Stunden Reaktionszeit war der gewünschte Brechungsindex der

Lösung n = 1,467 erreicht. Die Chlorzufuhr wurde beendet,

überschüssiges Chlor durch Einleiten von Argon und anschlies¬

sendem Evakuieren im Vakuum ausgetrieben, die Lösung filtriert,das Natriumcarbonat mehrmals gut mit Äther gewaschen, die Lö¬

sungen vereinigt und eingeengt.

64) Natriumcarbonat: MERCK, zur Analyse

o65) Methallylchlorid: Fluka, purum, frisch destilliert, Sdp. 73 C

- 165 -

Man destillierte rasch bei 50 Torr, sammelte die Fraktionen mit

Siedepunkt von 50 C bis 82 C und verwarf die übrigen.

Eine zweite Destillation erfolgte über eine 40 cm lange Vigreux-

Kolonne bei 50 Torr. Die einzelnen Fraktionen wurden gaschro-

matographisch untersucht (Carbowax, 16 0 C). Die Fraktionen mit

Siedepunkt zwischen 50 C und 72 C enthielten alle mehr als

30 % des gewünschten Isomeren und ergaben zusammen 83,4 g Pro¬

duktegemisch .

In einem 2-Liter-Dreihalskolben mit Intensivkühler und mechani¬

schem Rührer legte man 3 1 Aceton und 360 g (2,17 Mol) Kalium¬

jodid vor, gab 83,1 g des Chloridgemisches zu, spülte die Lö¬

sung mit Argon und versah die Apparatur mit einem Argonballon.

Man kochte die Reaktionsmischung unter heftigem Rühren während

12 Stunden am Rückfluss. Die braune Lösung wurde abfiltriert,

der Rückstand dreimal mit ca. 250 ml Aceton gewaschen, die Lö¬

sung vereinigt und auf ca. 500 ml eingeengt .Die Lösung

wurde mit 5 00 ml Hexan verdünnt und dreimal mit je 50 0 ml H„0

und viermal mit je 400 ml gesättigter Thiosulfatlösung ge¬

schüttelt, wobei rasche Entfärbung der dunkelbraunen Lösung

eintrat. Man zog die wassrigen Phasen je zweimal mit 750 ml

Hexan aus, vereinigte die organischen Phasen, trocknete mit

Natriumsulfat, engte auf 500 ml ein und liess über Nacht im

Tiefkühlschrank kristallisieren. Dabei entstanden 31 g leicht

rosarote Kristalle. Aus der Mutterlauge kristallisierten wei¬

tere 35,4 g Substanz in zwei Fraktionen mit Schmelzpunkt über

29° C.

Das so erhaltene Produkt wurde ohne weitere Reinigung für die

nächste Stufe eingesetzt.

Ausbeute: 66,4 g = 216 mMol entspr. 10,7 % bez. ^3_1

66) Das Dijodid 3_2_ ist Sauerstoff- und lichtempfindlich, die Arbeiten wur¬

den deshalb möglichst rasch ausgeführt. Da die Substanz haut- und

stark tränenreizend ist, arbeitete man immer in gut ziehender Kapelle

und mit Handschuhen.

- 166 -

6.1.2. 3-Phthalimido-2-jodmethyl-propen-l (33)

C4H6J2 C12H10N°2J307,90 327,12

66,3 g (215 mMol) 3-Jodo-2-jodmethyl-propen-1 {32) wurden zu-

sammen mit 39,8 g (215 mMol) Phthalimidkalium in 300 ml

Dimethylacetamid während 45 Minuten bei 70 C und 20 Min.

bei 100 C gerührt, wobei sich das Phthalimidkalium fast

vollständig löste. Man kühlte die braune Reaktionslösung an¬

schliessend ab und nahm sie in 400 ml Methylenchlorid auf.

Die Lösung wurde zweimal mit je ca. 250 ml Wasser und einmal

mit 300 ml halbgesättigter Kochsalzlösung, die 1 g Natrium¬

thiosulfat enthielt, gewaschen. Die wässrigen Phasen wurden

noch zweimal mit Methylenchlorid extrahiert, die gelben or¬

ganischen Phasen mit Na„SO. getrocknet, filtriert, vereinigtund im Vakuum eingeengt. Am HV befreite man den Rückstand weit¬

gehend vom Dimethylacetamid und teilweise vom Dijodid _3_2. Der

zurückbleibende Festkörper wurde in 400 ml Methylenchlorid ge¬

löst, die Lösung mit 300 ml Tetrachlorkohlenstoff versetzt

und am RV eingeengt. Das ausgefallene 3-Phthalimido-2-phthal-imidomethyl-propen-1 (^3_4) wurde abfiltriert, das Filtrat ein¬

geengt und nochmals am HV getrocknet. Anschliessend wurde der

Eindampfrückstand in 2 00 ml Methylenchlorid aufgenommen, noch¬

mals gegen 100 ml halbkonzentrierte Kochsalzlösung mit 1 g

Natriumthiosulfat geschüttelt, auf 30 ml eingeengt, mit 50 ml

Hexan versetzt und auf ca. 3 0 ml eingeengt, wobei sich haupt¬sächlich das gewünschte 33 abschied.

67) Phthalimidkalium; Fluka purum

68) Dimethylacetamid: Fluka, puriss., destilliert über Calciumhydrid

- 167 -

Aus der überstehenden Lösung erhielt man durch Einengen, Ab-

sublimieren von 3_2 an einen mit Trockeneis gekühlten Subli¬

mationsfinger im HV und Fällung aus Methylenchlorid/Hexan wei¬

teres Jodid 33.

Die 23,2 g Rohprodukt bestanden aus ca. 80 % Jodid 3_3 (NMR).

Erneute Kristallisation bewirkte keine weitere Reinigung. Des¬

halb chromatographierte man das Gemisch an 450 g (19-fache Men-

69)ge) Kieselgel .

Um das Edukt _32_ vollständig zu entfernen,

eluierte man zuerst mit Tetrachlorkohlenstoff und gewann dann

das Jodid _3_3 mit Methylenchlorid.

Die 17,68 g DC-reines Jodid _3_3 wurden aus Methylenchlorid/

Hexan umkristallisiert, wobei sich leicht gelbliche Kristalle

abschieden.

Ausbeute: 16,51 g = 5 0,5 mMol entspr. 23,5 %

Die Analysenprobe wurde zweimal aus Äther umkristallisiert, wo¬

bei man farblose Nadeln erhielt.

Analytische Daten von 33

Smp.

DC:

UV:

EtOH

IR:

CHC1.

70)

95-96 C

Kieselgel; MethylenchloridRf = 0,61, einheitlich

-62,712 mg in 50 ml, c = 165,8*10 Mol/1

298/Sch (2'150), 291,5 (2'340), 258/min (1'480), 239/

Seh (ll'OOO), 219,5 (50'700)

5 %, 0,1 mm

3470w, 3090w, 3020w, 2930w, 1775s, 1715s, 1470w,

1425s, 1390s, 1345m, 1323m, 1190w, 1170w, 1160s,

1120w, 1087m, 1070w, 987w, 952s, 925w, 910w, 660w

69) Chromatographie und Kristallisation wurden wegen der Lichtempfindlich-

keit des Produktes möglichst unter Lichtausschluss vorgenommen. Das

Jodid ^3_3_ ist schwach hautreizend.

70) Oberhalb 250 nm: 10 mm-Zelle, unterhalb 250 nm 1 mm-Zelle

- 168 -

H-NMR: 7,62-7 82 m 4 H aroma

CDCI35,31

5,13

s

t (J=D

1 H~

1 H_ H2C-14,47 d (J=D 2 H H2C-33,99 s 2 H H2C-J

MS: 80° C

Protonen

214 (1), 202 (2), 201 (16), 200 (100), 199 (1), 182(6), 161 (8), 160 (60), 149 (7), 133 (5), 130 (9),105 (8), 104 (17), 99 (8), 77 (17), 76 (23), 75 (7),74 (5), 53 (7), 51 (7), 50 (12), 41 (6), 39 (8),18 (15)

Metastabile Peaks: 166, 126, 110,5

Analyse: C12H10NO2Jber.: C 44,06 H 3,08 N 4,28 J 38,80gef.: C 44,10 H 3,23 N 4,23 J 39,07

Das als Hauptprodukt angefallene 3-Phthalimido-2-phthalimido-methyl-propen-1 (_3_4) kristallisierte man zweimal aus Methylen¬

chlorid/Hexan 1:1.

Die Analysenprobe wurde nochmals aus CHC1. umkristallisiert.

Analytische Daten von 34

Smp.

DC:

UV:

EtOH

70)

220-221 C

Kieselgel, MethylenchloridRf = 0,24, einheitlich

-61,608 mg in 50 ml, c = 92,9-10 Mol/1

299/Sch (3'470), 293 (3'640), 257/min (1'190),250,5 (19'700), 238,5/min (^MOO), 232/Sch (29'300),224/Sch (67'600), 219,5 (81M00)

IR:

CHC1.

0 ,1 mm

3480w,

1470m,

1120m,690w

3090w, 3030w,1425m, 1390s,1100m, 1090m,

2930w, 1775s, 1720s, 1615w,1345m, 1323m, 1190w, 1170w,1070w, 960m, 937w, 920w, 713m,

H-NMR:

CDC1.

7,8-7,855,80

4,29

m 8 H

t (J=0,8) 2 H

d (J=0,8) 4 H

aromat. Protonen

H2C-1H2C-3, H2C-C-2

- 169 -

MS: 105

+ >348 (1,5), 347 (11), 34^ (49; VT), 213 (11), 200 (18

199 U00) ,186 (37), 171 (14), 160 (33), 133 (16),

130 (15), 105 (22), 104 (35), 77 (24), 76 (22)

Metastabiler Peak: 311

136.1.3. [2- c]-2-Methoxycarbonyl-4-methyliden-5-phthalimido-

valeriansäure-methylester (35a)

co2ch3

co2ch3

3_3 25a

C12H10NO2J C17H17N°6327,12 332,23

1022,8 mg (9,75 mMol) [2- 3c]-Malonsäure (91,2 Atom-%; Stohler

Isotope Chemicals) wurden in einem 250 ml-Kolben in 5 ml Metha¬

nol warm gelöst. Man kühlte den Kolben mit Eis und versetzte

die Lösung portionenweise mit 75 ml frisch hergestellter Di-

azomethanlösung [2 36], so dass die Reaktionslösung leicht ge¬

färbt blieb. Die Lösung wurde 1 1/2 Stunden stehengelassen, dann

am RV eingeengt und anschliessend 30 Minuten am WV getrocknet.

Es blieben 1248 mg (9,31 mMol) Malonester (= 96 %), zu dem man

1606,1 mg (4,91 mMol) 3-Phthalimido-2-jodmethyl-propen-1 (33)

gab. Der Kolben wurde mit einem Magnetrührer, Zweihalsaufsatz,

Hahn und Serumkappe versehen, die Apparatur zweimal am WV ent¬

lüftet, mit Argon gefüllt und der Hahn mit Argonballon verse¬

hen. Anschliessend spritzte man 48 ml THF zu und löste die Eduk-

te in der Wärme (52-54 C). Zum Reaktionsgemisch wurden 25,5 ml

einer 0,2 M benzolischen Lösung von Natriumhexamethyldisila-

zanat [227] (5,10 mMol, 6 % Oberschuss bez. 3_3) zugespritzt.

Nach ca. 15 Minuten begann sich Natriumjodid abzuscheiden. Die

Reaktionslösung wurde während 2 Stunden bei 52-54 C gerührt,

- 170 -

anschliessend abgekühlt und in 450 ml Äther aufgenommen. Die

Ätherphase wurde einmal mit einer Mischung aus 300 ml gesättig¬ter Kochsalzlösung und 2,5 ml 6 N Salzsäurelösung und zweimal

mit je 300 ml gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Man extra¬

hierte die wässrigen Phasen zweimal mit 450 ml Äther, trennte

die organischen Phasen ab, trocknete mit Natriumsulfat und

engte ein.

Der leicht braune Rückstand wurde in einen 100 ml-Kolben trans¬

feriert und dieser mit einem Destillationsbogen und einem 50 ml

Zweihalskolben mit Hahn versehen. Der Auffangkolben wurde mit

flüssigem Stickstoff gekühlt und die Apparatur kurz am HV eva¬

kuiert; anschliessend destillierte man den überschüssigen Ma-

lonester während 3 1/2 Stunden bei 85 C ab. Es blieben 1653,8

mg dickflüssiger, honigähnlicher Rückstand. Das Destillat wur¬

de in Äther gelöst, über Natriumsulfat filtriert, eingeengtund 30 Minuten am WV getrocknet: 506,3 mg (3,81 mMol) [2-13C]-Malonsäure-dimethylester.

13Der rohe [2- c]-2-Methoxycarbonyl-4-methyliden-5-phthalimido-valeriansäure-methylester (35a) wurde nicht gereinigt und di¬

rekt weiter umgesetzt. Er enthielt ca. 3,5-5 Mol-% dialkyliertesProdukt 36a (vgl. 6.1.4.).

Analytische Daten von dem analog hergestellten, unmarkierten,chromatographisch gereinigten ^3_5

Fast farbloses, leicht gelbliches öl

DC: Kieselgel, MethylenchloridRf = 0,42, einheitlich

IR: 5 %, 0,1 mm

CHC1 3470w, 3090w, 3020m, 2960m, 2850w, 1770s, 1760-1705s,1655w, 1615w, 1470m, 1445s, 1425Sch, 1390s, 1340m,1290-1250m, 1170m, 1155m, 1115m, 1105m, 1090w, 1070w,1030m, 990w, 945m, 915w, 840w, 635w

- 171 -

H-NMR:

CDC1

MS

7,7-7,9 m 4 H aromat. Protonen

5,04

4,98

s

s

1 H

1 HH2C=

4,28 s 2 H H2C-53,81 t (J=8)

7 HHC-2

3,74 s H3CO-2,70 d (J=8) 2 H H2C-3

80° C

333 (0,2), 332 (1,0), 3^1 (3,9; M )

(50), 271 (12), 268 (42), 267 (100)

300 (20), 299

254 (11), 240

(13), 239 (45), 212 (34), 211 (21)", 200 (32), 160

(45), 149 (10), 133 (10), 130 (14), 120 (10), 105

;i4), 104 (22), 92 (12), 77 (lc 76 (16) ,65 (10) ,

Analyse

59 (12), 53 (11), 39 (11), 18 (46), 15 (11)

C-.-H, -NOr; MG = 331,331 / 1 / 6

ber. : C 61,63 H 5,17 N 4,23 %

gef. : C 62,25 H 5,19 N 3,84 %

6.1.4. Bis-(2-methyliden-3-phthalimido-propyl)-malonsäure-

dimethylester (36)

In Analogie zur Synthese von _3_5_ wurden 0,40 mMol Malonsäure-

dimethylester mit 0,828 mMol Jodid J3J3 umgesetzt. Man erhielt

nach Chromatographie (Kieselgel, Methylenchlorid/Athylacetat

90:10) und Kristallisation aus Methylenchlorid/Äther 1:3

Bis-(2-methyliden-3-phthalimido-propyl)-malonsäuredimethyl-

ester (_3J5) in 67,5 % Ausbeute.

Analytische Daten von 36

Smp.

DC

UV:70)

CH-CN

184-185o

Kieselgel, Methylenchlorid/Athylacetat 90:10

Rf = 0,51, einheitlich

2,468 mg in 50 ml, c = 93,0.10~6 Mol/1

298/Sch (3'400), 292,5 (3'640), 254/min (1'090), 240

(20'300), 238/min (18'100), 236/Sch (19*700), 231,5

(30'100), 230/min (28'700), 218,5 (87'700)

- 172 -

IR: 5 %, 0,1 mm

CHC1- 3470w, 3090w, 3020w, 2960w, 2840w, 1805w, 1775s,1750-1700s, 1650w, 1615w, 1595w, 1470m, 1435m,1425s, 1390s, 1333m, 1300m, 1010m, 955m, 910w, 840m

H-NMR:

CDC1„

MS

7,8-7,94,91

4,84

4,22

3,78

2,96

130° C

m

m

m

b

s

m

8 H aromat. Protonen

4 H H2OC-2, 21

4 H H2C-5, 5'

6 H H3CO-4 H H2C-3, 3'

532 (1), 531 (3),_

370 (12), 338 (10),291 (23), 279 (12),263 (10), 251 (22),201 (11), 200 (67),160 (100), 133 (11),77 (20) ,

76 (11)

530 (7; M+)319 (12),278 (44),250 (15) ,

176 (12),130 (18)

466 (12), 438

306 (12), 292

267 (19),238 (14),127 (10),105 (16),

(10) ,

19),266 (41) ,

236 (19) ,

161 (14),104 (24) ,

136.1.5. [_2- C]-2-Methoxycarbonyl-4-oxo-5-phthalimido-valerian-

säure-methylester (37a)

o

COoCH,

C02CH3

35a

C17H17N°6332,23

37a

C16H15N07334,21

Das Rohprodukt der Kondensation (1653,8 mg) wurde in 40 ml

71)Dioxan gelöst, 27,5 mg (0,11 mMol) Osmiumtetroxid in 20 ml

Dioxan zugegeben und die Lösung mit 2 0 ml H_0 versetzt. An¬

schliessend wurde während 10 Minuten gerührt. Zu der nun grau¬

grünen Lösung fügte man 2411 mg (11,3 mMol, 15 % Überschuss)

71) Osmiumtetroxid: MERCK, zur Analyse

- 173 -

72)Natrium-meta-perjodat zu, wobei sich festes NaJO_ abzu¬

scheiden begann. Man liess die Lösung während 20 Stunden bei

RT rühren und nahm dann in 300 ml Methylenchlorid auf. Die

Methylenchlorid-Lösung wurde dreimal mit gesättigter Kochsalz¬

lösung gewaschen, die wässrigen Phasen je zweimal mit Methy¬

lenchlorid extrahiert, die organischen Phasen abgetrennt, mit

Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und dann am HV vom Dioxan

befreit. Man löste das Produktegemisch in Methylenchlorid,

filtrierte und trocknete.

Das Rohprodukt (1715,1 mg) wurde zweimal aus Methylenchlorid/

Äther 1:2 umkristallisiert, die Mutterlaugen eingeengt und

mit Methylenchlorid/Äther 90:10 an Kieselgel chromatographiert.

Die DC-reinen Fraktionen wurden vereinigt und zweimal aus

Methylenchlorid/Äther 1:2 umkristallisiert. Man erhielt gesamt-

13haft 1092 mg [2- c]-Methoxycarbonyl-4-oxo-5-phthalimido-

valeriansäure-methylester in Form farbloser Nadeln.

Ausbeute: 1092 mg = 3,27 mMol

r 13 -i

Bilanz: [2- CJ-Malonsäure eingewogen: 9,25 mMol

13[2- C]-Malonsäure zurückgewonnen: 3,81 mMol

Verbraucht: 6,13 mMol

13Ausbeute an 37a bez. verbrauchter [2- c]-Malonsäure 55 %

Analytische Daten von 37a

Smp.: 152-153° C

DC: Kieselgel, Methylenchlorid/Äthylacetat 90:10

Rf = 0,59, einheitlich

IR: 5 %, 0,1 mm

CHC1 3480w, 3020m, 2960m, 2920w, 2840w, 1780s, 1760-1710s,

1615w, 1470m, 1437s, 1415s, 1390s, 1350m, 1275s,

1190m, 1160m, 1110m, 1090w, 1065w, 1025m, 990w, 960w,

905w

72) Natrium-meta-perjodat: MERCK, zur Analyse

- 174 -

2,0 C-4', 5'

1,8 C-3', 6'

1,0 CH3-0104,9 C-2,5

D (J=40)1,11

C-3

H-NMR: 7,6-7,9 m 4,OH aromat. Protonen

CDC14'62 fc 1

2 4 Hh13c"2

CDC13 4,57 s J 2'4H

H2C-53,74 s 6,0 H H3CO-3,1-3,3 s 2,5 H H2C-3, H13C-2

13C-NMR: Breitbandentkoppeltes Spektrum

CDC1 ppm Int.

134,0

123,4

52,9

46,4

39,2

37,6

MS: 110° C

335 (0,3), 334 (1,0;M+), 305 (0,4), 304 (2,0) 303(12,0), 302 (1,4), 234 (13), 174 (100), 173 (10),161 (15), 160 (82), 146 (99), 142 (27), 114 (82),104 (18), 77 (20), 76 (16), 59 (10), 56 (14),15 (11)

Metastabile Peaks: 122,5, 110, 91,5, 89

Daten der unmarkierten Verbindung _3_7

3,416 mg in 50 ml, c = 206,2-10~6 Mol/1

298/Sch (1'770), 292 (1'930), 258/min (730), 239/Sch(8'500) , 219 (43'100)

ppm Int.

199.2 S 0,4 C-4

168,5 S 0,6 C-l

167.3 S 0,2 C-l',

8'

134,1 D 1,6 C-4', 5'

132,0 S 0,3 C-2', 7'123,5 D 1,3 C-3', 6'

52,8 Q 1,0 CH3O-4 6,4 D+T 1,4 C-2, 5

38,5 T 0,7 C-3

MS: 75° C

334 (0,3), 213 (1,1; M+), 303 (2,2), 302 (12,2),242 (12), 173 (99), 161 (12), 160 (71), 145 (100),141 (23), 113 (77), 104 (17), 77 (23), 76 (19), 59(13), 55 (17), 15 (10)

Analyse: C^H^NO ; MG = 333,30

ber.: C 57,66 H 4,54 N 4,20 %

gef.: C 57,45 H 4,56 N 4,32 %

UV:70>

EtOH

13C-NMR

CDC1

- 175 -

136.1.6. [2- c]-6-Aminolävulinsäure (30a]

J? o C02CH3 O

WSf C02CH3 HCl C°2H

O

37a 30a

C1rH1cN0_ CcHQN0. • HCl1b 1b / b y 3

332,23 168,50

1119,3 mg (3,55 mMol) Keton jT7 wurden in einem 100 ml-Kolben

mit 30 ml konz. Salzsäure/Eisessig 1:1 versetzt und der Kol¬

ben mit einem Magnetrührer, Rückflusskühler und Argonballon

versehen. Unter Rühren wurde im Ölbad (135 C) erwärmt, wobei

rasche CO~-Entwicklung eintrat, die nach ca. 15 Minuten be¬

endet war. Man kochte die farblose Lösung während 16 Stunden

am Rückfluss und engte anschliessend am HV ein. Der trockene

Rückstand wurde zweimal in ca. 30 ml Wasser gelöst und wieder

getrocknet, um von der Salzsäure zu befreien. Das farblose

Pulver wurde in 100 ml Wasser gelöst und dreimal mit 90 ml

Essigester extrahiert, die organischen Phasen dreimal mit

50 ml Wasser ausgezogen, die wässrigen Phasen filtriert, ver¬

einigt und am RV mit Trockeneis-Kühleinsatz im HV eingeengt.

Weitere Reinigung (Entfernung von Phthalsäure-Resten) gelang

durch Ionenaustauscherchromatographie an 50 g Dowex 50W X8

200/400 mesh (saure Form). Man eluierte zuerst mit ca. 250 ml

HpO, dann mit kontinuierlich bis auf 3 N steigendem Salzsäure¬

gradienten (gesamthaft ca. 450 ml). Die Fraktionen 11-14, die

das gewünschte Produkt enthielten, wurden vereinigt, einge¬

engt und am HV getrocknet, noch zweimal in ca. 2 0 ml H„0 ge¬

löst und wieder getrocknet, um von der überschüssigen Salz¬

säure zu befreien.

Das Produkt wurde erneut in ca. 30 ml Wasser aufgenommen, einge--3

froren und während 18 Stunden am HV (< 10 Torr) gefrierge-

- 176 -

trocknet. Es blieben 555,8 mg [2- C]-ö-Aminolävulin-

säure als farbloser Festkörper.

Ausbeute: 555,8 mg = 3,30 mMol entspr. 98,5 %

Analytische Daten von 30a

DC: Die Substanzflecken wurden durch Besprühen mit metha¬nolischer Ninhydrinlösung und Erhitzen sichtbar ge¬macht. Das Produkt ist in allen Trennsystemen ein¬heitlich und hat den gleichen Rf-Wert wie authenti¬sches Material 73)#

Cellulose, n-Butanol/Wasser/Essigsäure 4:1:1Rf = 0,28, länglicher Fleck

Kieselgel, Phenol/Wasser 80:20Rf = 0,21

Kieselgel, Äthanol/Wasser/Pyridin/Essigsäure 50:25:15:10Rf = 0,70

IR: 3430w, 3160Sch, 2720m, 2660m, 2620m, 1720s, 1685Sch,1585m, 1415m, 1400w, 1350m, 1300s, 1238m, 1220s,1180w, 1150s, 1100m, 1085w, 1045m, 1000m, 980m,945m, 865m, 820m, 805w, 785m, 730m

13C-NMR: Breitbandentkoppeltes Spektrum

H„0 ppm Int.

205,3

48,1

36,0

34,4

28,3

Die aufgeführten Daten beziehen sich auf Dioxan =

67,4 ppm.

Analytische Daten der auf gleiche Art hergestellten, unmarkier¬ten 6-Aminolävulinsäure (30)

Smp.: 146-149° C (Zers.)

DC: identisch mit den oben beschriebenen

IR: Das IR-Spektrum in Nujol stimmt mit dem oben beschrie¬benen überein. Wenn die Substanz vor der Aufnahme mitfeuchtem Stickstoff behandelt wurde, ergab sich fol¬gendes Spektrum:

0,3 C-4

1,0 C-5

D (J=40) 1,0 C-3

100 C-2

- 177 -

Nujol 3400s, 2540w, 2510w, 1720s, 1580m, 1560m, 1490m,

1425m, 1410m, 1380s, 1355m, 1315w, 1250m, 1215s,

1190s, 1145s, 1105m, 1085w, 1060m, 1003m, 980m,

960s, 870m, 820m, 775w

Dieses Spektrum ist identisch mit demjenigen von

authentischem Material '-*' und stimmt, mit dem publi¬

zierten [223] überein.

1H-NMR: 8,4 0 bs 3 H H3N"1"3,98 bs 2 H H2C-51,8-5,6 b HOC-1

2*51 JAA'BB,~sYstem (J=6) 4 H H2C-2, 3

Das Spektrum ist identisch mit demjenigen einer

authentischen Probe '*'.

DMSO d,

13C-NMR: ppm Int.

H20 204,6 0,1 C-4

117,6 S 0,6 Ol

48,2 T 1,0 05

35,3 T 1,7 C-3

28,3 T 2,0 02

Die Daten beziehen sich auf Dioxan = 67,4 ppm.

13Diese Synthese von [2- c]-6-Aminolävulinsäure wurde mehrfach

wiederholt. Es resultierte dabei eine durchschnittliche Aus-

13beute von 53,4 % bez. eingesetzte [2- c]-Malonsäure.

73) 6-Aminolävulinsäure-hydrochlorid, Fluka, puriss. > 99 %, HO < 1 %

- 178 -

6.2. Untersuchungen an Reaktionszentren (RC)

Die Präparationen der Reaktionszentren wurden von M. Snozzi

zur Verfügung gestellt. Da die verschiedenen Präparationenalle auf die gleiche Art (RC durch LDAO-Behandlung von den

Membranen abgelöst) aus der carotinoidarmen Mutante G9 aus

Rhodospirillum rubrum hergestellt worden waren [190,179],konnte man wenigstens annähernd vergleichbare Eigenschaftenerwarten (vgl. [2 9], S. 146). Untersuchungen solcher Proben

durch Gel-Elektrophorese zeigten nach Behandlung mit SDS die

bekannten Proteinbanden [24] sowie eine schwache Verunreini¬

gung, bei der es sich wahrscheinlich um ein Antennen-Protein

handelte [190]. Die so hergestellte Probe enthielt noch 1,02Mol Ubichinon pro Mol RC und ca. 0,5 uMol Lipophosphat pro

mg Protein (vgl. [190] und [ll9~]). Die gereinigten RC fielen

74)in einer wässrigen Lösung an, die ca. 10 mMol/1 Tris-HCl

100 mMol/1 NaCl und 0,025 % LDAO75)

enthielt. Da das Verhal¬

ten von Puffer und Detergens bei der weiteren Reinigung (Ein¬

engen durch Ultrafiltration,Dialyse gegen 10 mMol/1 Tris-Puf-

fer und erneutes Aufkonzentrieren durch Ultrafiltration,alleOperationen bei 4 C) quantitativ nicht bekannt ist, können

über die Endkonzentrationen keine zuverlässigen Angaben ge¬

macht werden.

Ausbleichung und Stabilität der RC wurden anhand der VIS- und

NIR-Spektren untersucht. Bei der Auswertung konzentrierte man

sich auf die Extinktionsmaxima bei 802, 868 und 1245 nm.

802 nm: Die optische Dichte des Maximums bei 802 nm ändert

sich bei der Oxidation höchstens geringfügig, das

Maximum verschiebt sich aber auf 800 nm. Die Abnahme

74) Tris: Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

75) LDAO: Lauryldimethylaminoxid

- 179 -

der optischen Dichte wurde als Mass für die Zer¬

setzung der RC gewertet.

868 nm: Die Extinktion bei 868 nm (längstwelliges Maximum

der reduzierten RC) wurde als Mass für den Oxidations-

grad benützt. In reduzierten Proben beträgt das Ver¬

hältnis e (802)/e (868) = 2,2 (ausgemessen an Probe

3/8.; Übereinstimmung mit [23] und [27]). Durch in¬

tensive Beleuchtung (368 nm) wurde eine maximale

Ausbleichung der Bande bei 868 nm von 88 % erzielt

(gleich starke Ausbleichung in [22] und [178] ) ,was

einem Oxidationsgrad von 100 % entspricht.

1245 nm: Wenn das Maximum bei 868 nm infolge zu hoher Konzen¬

tration nicht ausgemessen werden konnte, diente die

Abnahme der Extinktion des Maximums bei 1245 nm als

Mass für den Rückgang des Oxidationsgrades.

Die Konzentration der Lösungen an reversibel ausbleichbarem

Protein-Pigment-Komplex P870 [27] wurden aus der optischen

Dichte bei 802 nm ermittelt. Annahme: £(802) =2,2 • e(868) =

308'000 (e(868) = 140'000 [2 9], Wert für R. sphaeroides [95]).

Die bei allen Oxidations- und Beleuchtungsexperimenten beob¬

achtbare, deutliche Abnahme der optischen Dichte im Bereich

von 770 nm ist wahrscheinlich auf eine irreversible Oxidation

von Bakteriochlorophyll a zurückzuführen, das aus bei der Prä¬

paration zerstörten RC oder aus den Antennen stammt (vgl.

[29] ,S. 37) .

Für die in der Folge beschriebenen Untersuchungen wurden drei

verschiedene RC-Lösungen verwendet.

- 180 -

6.2.1. C-NMR-Spektren von Reaktionszentren (unmarkiert)

Lösung 1:

Das Spektrum (breitbandentkoppelt, 171'000 Pulse, T = 5° C)der von E. Walter vorbereiteten Probe (140-10 Mol/1 P870)

zeigte im wesentlichen die erwarteten Signallagen. Die inten¬

sivsten Signale stammen von Tris-Puffer (60,4 ppm, interner

Standard) und LDAO. Der nicht erwartete Signalhaufen bei ca.

70 ppm rührte offenbar von Zuckern her, die keine Bestandtei¬

le der RC darstellen und nachträglich bei der Isolierung oder

Reinigung eingeschleppt wurden und nicht mehr abgetrennt wer¬

den konnten [19 3]. Ein scharfes Signal bei 107 ppm konnte nicht

interpretiert werden.

Lösung 2:

Die ursprünglich 300-10 M Lösung wurde durch Zugabe von ca.

30 % DO (für Deuteriumlock) auf 230-10~ Mol/1 verdünnt (1,8ml Lösung). Das Spektrum (Abb. 8, S. 63; 340'000 Pulse, breit¬

bandentkoppelt, T ca. 1 C) stimmte relativ gut mit demjeni¬gen von Lösung 1 überein. Stark unterschiedliche Konzentratio¬

nen an Tris-Puffer und LDAO erschwerten aber den exakten Ver¬

gleich.

Durch stufenweise Oxidation mit gesamthaft 8,8 mg K~Fe(CN)fi(27 pMol, 6 5-facher Uberschuss) wurde eine Extinktionsabnahmedes Maximums bei 868 nm auf 33 % erreicht, was einem Oxidations-

grad von 76 % entspricht. Um entstandenes Kaliumferrocyanidwieder zu oxidieren und damit die Oxidation der RC zu vervoll-

761ständigen, gab man 2 pl 30-proz. H„0„ zu und erreichte da¬

durch einen Oxidationsgrad von 84 %.

76) Perhydrol: 30 % HO, MERCK, zur Analyse

- 181 -

13Während der erneuten Aufnahme des C-NMR-Spektrums (328'000

Pulse, ca. 36 Std., T ca. 1 C) sank jedoch der Oxidations-

77)grad auf weniger als 10 % (Abnahme der Bande bei 1245 nm

auf ca. 7 % des höchsten erreichten Wertes). Das so erhaltene

NMR-Differenzspektrum der beiden Zustände ist deshalb bedeu¬

tungslos .

Durch elektrochemische Oxidation der Lösung (Potential +350 mV

qegen Kalomel: Fe (CN) .

-> Fe (CN) , ) konnte wieder ein Oxi-6 6

dationsgrad von 79 % erreicht werden (optische Dichte 30 % des

Wertes der reduzierten Probe), die Extinktion des Maximums bei

1245 nm betrug jedoch nur 74 % des vorher bei 84 % Oxidations-

grad erreichten Wertes. Daraus ergäbe sich ein Oxidationsgrad

von nur 62 %. Dieser Unterschied wird durch eine partielle Zer¬

setzung der Probe erklärt. Schon innerhalb 15 Min. nach Been¬

digung der elektrochemischen Oxidation wurde eine deutliche

Abnahme des Oxidationsgrades festgestellt (Extinktionszunahme

bei 867 nm und Abnahme bei 1245 nm).

Die während 4 Tagen bei ca. 0 C aufbewahrte Lösung reduzierte

sich in dieser Zeit weiter. Die optische Dichte der Maxima bei

599 nm und 534 nm hatten wieder den ursprünglichen Wert der

reduzierten Probe angenommen, in den Minima bei 646 und 560 nm

wurde jedoch eine sehr deutliche Zunahme der Absorption (ca.

75 %!) gemessen. Diese Daten, zusammen mit der selbst von Auge

deutlich sichtbaren Trübung Hessen auf eine partielle Zer¬

setzung der Probe schliessen.

77) Eine um den Faktor 50 verdünnte Probe, die jedoch geringfügig mehr

K^FefCNjg enthielt, zeigte einen viel geringeren Rückgang der Oxida¬

tion.

- 182 -

6.2.2. Vorversuche zur chemischen Oxidation

Lösung 3:

Sämtliche in der Folge beschriebenen Proben bestanden aus Tei¬

len der RC-Lösung 3 oder wurden durch Verdünnen mit H~0 aus ihr

hergestellt. Für das UV/VIS/NIR-Spektrum vgl. Abb. 35, S. 185.

Die folgenden Versuche 1 und 2 wurden direkt mit der frischen

Lösung durchgeführt. Der Rest der Lösung 3 wurde in Portionen

von je ca. 0,3 ml in flüssigem Stickstoff sehr rasch eingefro¬ren und bis zur Verwendung bei -25 C aufbewahrt (Lagerung ohne

Zersetzung, vgl. [29], S. 145). Nach dem Auftauen wurde keine

Veränderung gegenüber der ursprünglichen Lösung beobachtet.

1. Die auf 2,6*10 Mol/1 verdünnte Probe (2,7 ml) zeigte ein

Verhältnis E(802)/E (868) = 2,24 (+ Oxidationsgrad ca. 2 %) .

Das Verhältnis E(280)/E(802) betrug 1,54 (Wert für "reine"

RC: 1,25 [190]). Man oxidierte die Lösung stufenweise mit

gesamthaft 8 yl 0,2 N K_Fe(CN) -Lösung, wobei isosbestische

Punkte bei 930, 740 und 620 nm erhalten blieben. Die Aus¬

bleichung bei 868 nm auf 24 % des ursprünglichen Wertes

zeigte einen Oxidationsgrad von 88 % an, die breite Absorp¬tionsbande von P870 bei 1245 nm war klar erkennbar.

Durch Zugabe von 2 yl 0,2 N KJ/J„-Lösung sollte das ent-II 4-

standene Fe (CN)^ wieder oxidiert werden. Man erreichte6

so eine Erhöhung des Oxidationsgrades auf 93 %. Die ent¬

standene Lösung war jedoch nicht stabil. Man beobachtete

eine Extinktionsabnahme des Maximums bei 800 nm auf ca.

96 % innerhalb 3 Std. und auf 83 % innerhalb 44 Std. be¬

zogen auf den Wert unmittelbar nach der letzten Oxidation.

Die Absorptionszunähme der Bande bei 868 nm und -Abnahme

derjenigen bei 1245 nm waren nur geringfügig.Reduktion der Lösung mit einer Spatelspitze KBH. ergab im

wesentlichen wieder das Spektrum der ursprünglichen Lösung,die Auflösung der Banden war jedoch bedeutend geringer

(Trübung!). Die Intensitäten der Maxima konnten nur zu ca.

- 183 -

90 % wieder erreicht werden (bei 802 nm nur 80 %!).

0,3 ml der 88,6-10~6 M Probe (26,6-10~9 Mol) wurden durch

portionenweise Zugabe von insgesamt 2,03 mg K.Fe(CN),.3 D

(6,17 jjMol) bis zu einem Oxidationsgrad von 87 % umge¬

setzt, wobei die isosbestischen Punkte bei 930, 730, 623

und 580 nm erhalten blieben. Durch Weiteroxidation mit 1,1

pl 1 N KJ/J„-Lösung wurde eine Abnahme der Bande bei 868

nm auf 16 % erreicht (entspricht einem Oxidationsgrad von

96 %). Erstaunlicherweise wurde gleichzeitig eine Erniedri¬

gung der Extinktion bei 1245 nm beobachtet. Die optische

Dichte bei 800 nm der instabilen Lösung verringerte sich

innerhalb 44 Std. im Eisbad auf 43 % des ursprünglichen

Wertes der reduzierten Probe. Diese starke Zersetzung der

Probe war auch von einer deutlichen Verflachung des Spek¬

trums zwischen 650 und 450 nm begleitet.

Ein ca. 100-fach verdünnter Teil der Probe zersetzte sich

weniger schnell: E(800)/E(755) = 1,54 gegenüber 1,24 in

der konzentrierten Lösung nach 44 Std. im Eisbad.

2,6 ml einer 1,85'10 M Probe wurden mit insgesamt 10 yl

(Portionen von 0,3, 0,7, 2 und 7 yl) 0,2 N K Fe(CN) -Lö¬

sung stufenweise oxidiert. Isosbestische Punkte wurden bei

9 30, 650 und 592 nm beobachtet. Anschliessende Reduktion

mit KBH. ergab im wesentlichen das Ausgangsspektrum, wenn¬

gleich die meisten Extinktionen etwas kleiner waren (vgl.

Abb. 9, S. 66).

Eine 120-10 M Probe (0,3 ml) erreicnte mit 2,14 mg

K Fe(CN) einen Oxidationsgrad von 89 %. Innerhalb 44 Std.

im Eisbad trat eine Verminderung des Oxidationsgrades auf

(Extinktionsabnahme des Maximums bei 1245 nm auf 47 % des

unmittelbar nach der Oxidation gemessenen Wertes, sowie

Absorptionszunahme der Bande bei 868 nm). Eine Abnahme der

Bande bei 800 nm konnte qualitativ nachgewiesen werden, das

Maximum liess sich jedoch wegen der zu hohen Konzentration

nicht ausmessen. Man beobachtete einen sehr schwachen Nie¬

derschlag am Boden der UV-Zelle.

- 184 -

Mit 3 pl 0,1 N KJ/J -Lösung war keine weitergehende Oxida-

tion mehr zu erreichen. Innerhalb 72 Std. (Eisbad) trat

weitere Zersetzung ein. Durch anschliessende Zugabe von

KBH. konnte das ursprüngliche Spektrum auch qualitativnicht mehr reproduziert werden.

Ein Teil der Probe wurde unmittelbar nach der K^Fe(CN) -

3 6Oxidation mit H„0 ca. 50-fach verdünnt (Oxidationsgrad78 %). Die Zersetzung der Probe innerhalb 44 Std. (0° C)war bedeutend geringer als die der konzentrierten Lösung(Abnahme des Maximums bei 800 nm um 9,5 %). Anschliessen¬

de Reduktion mit KBH. führte zu einem der Ausgangslösungähnlicnen Spektrum (u.a. Maximum bei 802 nm um ca. 13 %

verringert).

3 ml einer 4,8*10 M Probe wurden portionenweise mit ge¬

samthaft 1,1 yl KJ/J -Lösung oxidiert, wobei isosbestische

Veränderungen im Spektrum beobachtet wurden. Die Reaktions¬

geschwindigkeit war niedrig; innerhalb 2 Std. nach der

letzten Zugabe von Oxidationsmittel stieg der Oxidations¬

grad von 82 auf 87 %. Gleichzeitig nahm die optische Dich¬

te bei 800 nm um ca. 6 % ab. Weitergehende Oxidation führ¬

te zu einer raschen Zersetzung der RC, die ausser im Spek¬trum auch an der deutlichen Trübung erkennbar war.

3 ml der 1,9-10 M Probe wurden stufenweise mit insgesamt2 yl (Portionen von 0,5, 0,5 und 1 yl) einer Lösung von

0,1 N KJ/J„ und 0,1 N K,Fe(CN). umgesetzt (9-, 18-, 36-£ob

facher überschuss an J„). Die isosbestischen Punkte bei

930, 730, 630 und 580 nm deuteten auf eine einheitliche

Reaktion hin. Innerhalb von 48 Std. im Eisbad nahm der Oxi¬

dationsgrad von 88 % auf 63 % ab. (Abb. 35). Anschliessende

Reduktion mit KBH führte weitgehend wieder zum Spektrumder ursprünglichen, reduzierten Probe.

- 185 -

10-

OD

i i i i i i i i i i r

400 600 800 1000 1200 nm

Abb. 35: 1,9 M RC-Lösung

unbehandelt

nach Oxidation mit 2 ul einer Lösung von

0,1 N K Fe(CN) + 0,1 N KJ/J

nach 48 Std. im Eisbad

-•—• nach Reduktion mit KBH.

6.2.3. Lichtinduzierte Ausbleichung

Lösung 3:

— f\

7. Das Spektrum der 2,8-10 M Probe unter Beleuchtung mit

368 nm-Licht (Emissionsmaximum der Quecksilberdampflampe)

stimmt im wesentlichen mit den publizierten [26,27] Spek¬

tren bestrahlter RC überein (bei der starken Erhöhung des

Absorptionsmaximums bei 800 nm dürfte es sich um ein Ar¬

tefakt handeln!). In der Dunkelheit reduzierte sich die

Probe langsam wieder (52 % Oxidationsgrad nach 10 Min.).

Innerhalb 4 Std. war wieder vollständige Reduktion erreicht,

wobei aber eine geringfügige Zersetzung stattgefunden hatte.

Die Probe war nach der Reduktion mit KBH. (anschliessend

an erneutes Belichten) weiterhin reversibel ausbleichbar.

— fi

8. Anhaltende Beleuchtung einer 2,85*10 M Probe mit Licht

der Wellenlänge 368 nm führte schon innerhalb 3 Stunden zu

einem Rückgang der Absorption des Maximums bei 800 nm um ca.

20 %.

- 186 -

Eine 2,65*10 M Probe wurde mit der sehr schwachen Emis¬

sionsbande der Quecksilberdampflampe bei 6 90 nm bestrahlt,wobei nur sehr langsame Ausbleichung der Absorptionsbandebei 868 nm eintrat (Oxidationsgrad: 63 % nach 15 Min.,86 % nach 30 Min., 93 % nach 210 Min., 97 % nach 22 Std.).

In dieser Zeit nahm die optische Dichte bei 800 nm um 10 %

ab (Bestrahlung bei RT). Nach 24 Std. im Dunkeln bei 0° C

war die Rückreaktion noch nicht vollständig, die optischeDichte bei 868 nm erreichte nur 56 % des ursprünglichenWertes. Durch Reduktion mit KBH. wurden 88 % der Absorptionbei 868 nm reproduziert, die optische Dichte bei 802 nm

erreichte jedoch nur noch 80 % des ursprünglichen Wertes.

— 6Eine während 4 Stunden bei 6 90 nm bestrahlte 2,4*10 M

Probe reduzierte sich auch während 64 Std. bei 0 C im

Dunkeln nicht vollständig. Gleichzeitig wurde jedoch eine

Verringerung des Maximums bei 800 nm um 6 % beobachtet.

Die anschliessende Bestrahlung der Probe mit dem gesamten

Wellenlängenbereich der Quecksilberdampflampe oberhalb

540 nm (K„Cr„0_-Filter) bei RT führte zur weitgehenden

Zersetzung der Probe (Extinktionsabnahme des Maximums bei

800 nm auf 57 % des ursprünglichen Wertes).

Eine 2,6*10 M Probe wurde mehrfach während 10-30 Sek.

mit Licht der Wellenlängen oberhalb 540 nm bei 10 C be¬

leuchtet und die zeitliche Abhängigkeit der Dunkelreaktion

aufgezeichnet (Zunahme der optischen Dichte bei 868 nm).

Die Reaktionsgeschwindigkeit A[RC ]/[RC] betrug nach

-4 i -4ca. 200 Sek. Dunkelreaktion -2,5-10 Sek.-1 bis -1,3*10

Sek.. Die Reaktionsgeschwindigkeit schien mit zunehmen¬

der Zahl der Experimente eher abzunehmen.

Bestrahlung während 14 Std. mit Licht oberhalb 540 nm bei

10 C führte zu einer Extinktionsabnahme des Maximums bei

800 nm auf ca. 80 %. Aus der erneuten kurzfristigen Be¬

leuchtung und der nachfolgenden Beobachtung der Dunkel¬

reaktion liess sicn eine Reaktionsgeschwindigkeit A[RC ] /

[RC] = -1,7*10 Sek. ermitteln. Offenbar verlang¬samte sich die Dunkelreaktion nicht mehr weiter.

- 187 -

Durch Reduktion mit KBH. wurden 82 % der optischen Dicht

bei 802 nm wieder reproduziert.

12. Beleuchtung einer 2,55*10 M Probe mit dem Wellenlängen¬

bereich oberhalb 6 30 nm während 15 Stunden führte zu einer

Extinktionsabnahme des Maximums bei 800 nm um 13 %.

— fi

13. Man beleuchtete eine 120•10 M Probe mehrmals in einer

1 mm-Zelle im Wellenlängenbereich oberhalb 6 30 nm während

je ca. 30 Sek. und beobachtete anschliessend die Dunkel¬

reaktion (Zunahme der optischen Dichte bei 868 nm, vgl.

Abb. 36). Der Anteil der RC im oxidierten Zustand in Ab¬

hängigkeit von der Zeit kann am besten durch eine e-Funk-

tion beschrieben werden (Abb. 36).

-kt[RC+] = e kt[RC+]

o

mit k = 10,7, 9,7, 9,8 und 7,7-10~4 Sek.1

oo-

-0 4

-0E

-12-

-16-

(RC+)'

IRC*1,

50

I

40 30 20

__L_

10 Mm

_J

OD

-13

-09

-07

-05

-03

Abb. 36: A OD(867) in Abhängigkeit der Zeit

B In([RC+]/ [RC+] ) in Abhängigkeit der Zeit

nach Ausschalten der Lichtquelle

- 188 -

Die Probe wurde in einem 10 mm-NMR-Rohr von oben unter

gleichen Bedingungen wie unter 12. (Lichtstrahl über einen

Spiegel umgelenkt) während 15 Std. bei 0 C belichtet. Die

anschliessend gemessene Rückreaktion war gegenüber den

-4oben aufgeführten Werten weiter verlangsamt: k = 5,6*10Sek.

. Die Extinktion des Maximums hatte in dieser Zeit

um ca. 10 % abgenommen. Nach erneuter Beleuchtung unter

denselben Bedingungen während 24 Stunden wurden nur noch

7 7 % der optischen Dichte des Maximums bei 800 nm bezüg¬lich des Ausgangswertes gemessen.

14. Beleuchtung mit 368 nm-Licht und Messung des Spektrums un¬

ter Verwendung eines Gelbfilters vor dem Detektor oder an¬

schliessende Aufnahme des Spektrums unter Einstrahlung bei

690 nm (ohne Filter) ergab im wesentlichen gleiche Spektren;die Probe war unter Beleuchtung mit 6 90 nm etwas wenigerstark oxidiert als vorher. Anschliessende Reduktion mit

KBH. ergab im wesentlichen das Spektrum der unbehandelten

Probe (Extinktionsabnahme bei 802 nm auf 97 %; c =

1,85-10~6 Mol/1; Abb. 10, S. 68).

- 189 -

ZUSAMMENFASSUNG

Chlorophyll a wurde durch präparativen Magnesiumeinbau mit 2,6-

Di-tert-butyl-4-methyl-phenoxy-magnesium-Jodid in das aus einem

Pflanzenextrakt gewonnene und gereinigte Phäophytin a darge¬

stellt. Die analytischen Daten des durch Fällung aus Dioxan/H„0

gereinigten Materials stimmen mit denjenigen von natürlichem

Chlorophyll a überein.

Ausgehend von Phäophytin a wurde Cetyl-phäophorbid a dargestellt

und unter den für Phäophytin a optimierten Bedingungen in Cetyl-

chlorophyllid a übergeführt.

Leider konnten weder vom partialsynthetischen Chlorophyll a

noch von Cetyl-chlorophyllid a Kristalle erhalten werden, die

für eine Röntgenstrukturanalyse geeignet gewesen wären.

Die VIS-Spektren der Reaktionslösung beim Magnesiumeinbau deuten

auf das Vorliegen eines im ß-Ketoester-System chelierten Magne-

sium-exo-Komplexes als Zwischenprodukt hin, das bei der Aufar¬

beitung durch stereoselektive Protonierung in das Chlorophyll a

2mit der natürlichen 13 -R-Konfiguration übergeht (laut HPLC

2nur ca. 1 % 13 -S-Epimer).

Für eine spezifische Markierung der porphinoiden Pigmente von

13

Rhodospirillum rubrum wurde eine neue Synthese von [2- C]-6-

Aminolävulinsäure ausgearbeitet.

13Im Hinblick auf eine geplante C-NMR-Differenzspektroskopie an

Reaktionszentren von Rhodospirillum rubrum G-9 im reduzierten

bzw. oxidierten Zustand wurden Untersuchungen sowohl zur chemi¬

schen Oxidation als auch zur lichtinduzierten Ausbleichung

durchgeführt. Sie brachten jedoch nicht den erhofften Erfolg,

denn die entstandenen Lösungen zeigten nicht die benötigte

Stabilität.

- 190 -

ABSTRACT

Chlorophyll a was prepared through introduction of magnesiumwith 2,6-di-tert-butyl-4-phenoxy magnesium iodide into puri-fied pheophytin a acquired from plant extracts. The analyti-cal data obtained from material purified by precipitationfrom aqueous dioxane are in agreement with those from natural

Chlorophyll a.

Cetyl-pheophorbid a was prepared from pheophytin a and was then

transformed into cetyl-chlorophyllid a utilizing the same con-

ditions as for pheophytin.

Unfortunately, crystals suitable for x-ray cristallographicanalysis could not be obtained from either partially syntheticChlorophyll a or cetyl-chlorophyllid a.

The visible spectra of the reaction Solution during magnesiumintroduction indicate the presence of a ß-ketoester chelated

magnesium-exo-complex as an intermediate. This intermediate was

2converted to Chlorophyll a with the natural 13 -R-configurationduring workup by stereoselective protonation. Only ca. 1 % of

2the 13 -S-epimer was detected by HPLC.

2- Cj-6-aminolevulinic acid was realizedfor a specific labeling of the porphinoid pigments of Rhodo-

spirillum rubrum.

13With regard to a planned C-NMR difference spectroscopic in-

vestigation of the reaction centers of Rhodospirillum rubrum+

G-9 in reduced and oxidized form, various experiments were

performed involving chemical oxidation as well as photoinducedbleaching. They did not lead, however, to a useful result

since the Solutions were of insufficient stability.

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1969, 9. Aufl. S. 598

LEBENSLAUF

Am 6. Juni 1951 wurde ich als Sohn des Max und der Elsa Etter-

Akeret in Frauenfeld geboren. Nach 6 Jahren Primarschule und

3 Jahren Sekundärschule in Weinfelden trat ich in die Kantons¬

schule Frauenfeld ein. Im Herbst 1970 legte ich dort die Matu¬

ritätsprüfung (Typ C) ab. Anschliessend begann ich das Studium

an der Abteilung für Chemie an der Eidgenössischen Technischen

Hochschule in Zürich, das ich im Herbst 1974 mit dem Diplom

als Chemiker abschloss.

Seither arbeitete ich am organisch-chemischen Laboratorium der

ETH unter der Leitung von Prof. Dr. A. Eschenmoser an der vor¬

liegenden Promotionsarbeit.

April 1979 Rolf Etter